甲醇酵母重組表達肝再生增強因子及其突變體的製作方法
2023-04-30 06:41:16 1
專利名稱：甲醇酵母重組表達肝再生增強因子及其突變體的製作方法
技術領域：
本發明是要利用甲醇酵母(Pichia pastoris)表達系統重組人肝再生增強因子(Human Augmenter of Liver Regenerat ion，hALR)及其突變體，特別是人工合成hALR核心片段的基因序列，並對它的幾種變異體也進行表達與活性比較。
背景技術：
自上個世紀六七十年代研究者就發現，剛斷乳後大鼠的肝中，以及部分肝切除的成年大鼠和狗的再生期肝臟內、血液中都含有一類耐熱(100℃，15分鐘)並能刺激肝細胞增殖的成份，當時稱之為肝細胞再生刺激物(Hepatocyte Stimulator Substance，HSS)。隨後，大量的實驗結果都表明，這類物質廣泛存在於多種哺乳動物的再生期的肝、幼仔肝及胎肝組織中，它們與肝再生過程的調控密切相關(Tanigawa K.，etal.，JouralGastroenterol 35112-119，2000)。1994年，Hagiya M.等首先從大鼠中克隆了HSS中的一種成分的cDNA序列，初步闡明了它的基本結構，並將其定名為肝再生增強因子(Augmenter of Liver Regeneration)，簡稱ALR(Hagiya M.，etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918124-8146，1994)。隨著研究者對大鼠和人ALR基因的cDNA和染色體DNA序列研究的深入，已經先後確定了多種ALR亞型(Francavilla A.，etal，Hepatology 20(3)747-757，1994)。國內外的研究者對人和鼠的ALR的重組表達進行過比較多的研究工作，並申請了多項專利(參見美國專利5480797，5550037，5607844，5811397；中國專利97171932.0，99110801.9)。
我國研究者於1990年前後，將從乳豬肝、新生小牛肝及人胎肝組織中提取的這類因子(例如，山東威海賽諾金公司的『威佳』等)應用於臨床重症病毒性肝炎的治療，並取得了比較滿意的療效(Yao Z.，etalHepatology 121144-1151，1990；He R.，etal Hepatology 17225-229，1993)。最新研究結果表明，ALR是一種含FAD輔基的巰基氧化酶(Flavin-linked Sulfhydryl Oxidase)，它是通過遏制哺乳動物肝臟中的NK細胞的活性，從而間接地發揮促進肝細胞增殖功能的(FrancavillaA.，etal Hepatology 25(2)411-415，1997；Lisowsky T.，etal，Dig.Liver Dis.，33(2)173-80，2001)。雖然研究者對於ALR基因的轉錄、翻譯以及分泌等過程尚不完全了解，分析其蛋白的一級結構序列信息也還不能確定其信號肽序列，但是，隨著對其N-端基因測序工作的進一步深入，將有望揭開這個密。
通過對人和鼠ALR的胺基酸序列分析比較後發現，其蛋白C-端一側約118個胺基酸殘基的序列高度恆定。據此，我們推測這部分序列應該是ALR這種細胞因子發揮生理作用的關鍵性部分，通過對重組製備的這種截短的ALR分子進行活性測定後發現，它們同樣具有完整ALR的功能，所以，我們在本專利中將這種截短的ALR特稱肝再生因子(Hepatic RegenerationFactor，HRF)(圖1)。多年以來，通過對生物提取的HSS類成分的臨床應用研究，以及對hALR的動物模型試驗結果的觀察均表明，經基因工程方法製備的hALR及其各種亞型，對肝切除手術(Hepatectomy)後的模型動物的肝再生有很好的促進作用。因此，重組製備的ALR對治療急性肝功能衰竭、重症肝炎和肝纖維化等適應症方面可望有一定的臨床應用價值。
目前，所有國內重組ALR的工作都是在原核表達系統E.coli中完成的，目的蛋白以包涵體的方式產生，需要複雜的變性、復性過程。(參見賀福初等的中國專利97171932.0)。本專利描述了用甲醇酵母表達系統，以分泌表達的方式，成功地表達出了一種完整的hALR和它的兩種突變體HRF和hmALR，其中hALR的Pichia pastoris菌株於2003年3月3日保藏，編號CCTCC NoM203012；HRF的Pichia pastoris菌株於2003年1月20日保藏，編號CCTCC NoM203007。
發明內容
1.hALR蛋白的核心功能區(HRF)及hrf基因的人工合成比較分析了現在已經發現的人和大鼠ALR的胺基酸序列(圖1)，確認ALR分子C-端的118個胺基酸序列組成的肽段是相對恆定的部分，特稱之為HRF。通過全基因合成的方法人工合成hrf基因。
2.基因hALR的和hmALR獲得最近公布人的一種ALR的基因序列(GenBank XM_034465)同另一種先前發現的人ALR相比較(GenBank AF146394)，僅在N-端7~12個胺基酸殘基部分有明顯的差別，而其餘部分完全相同。因而，以hrf為模板，通過PCR法在hrf的5`-端添加這種12肽對應的DNA序列，就可以得到這種ALR亞型(XM_034465)，簡稱hALR。通過對hALR基因定點缺失突變，就可以得到hALR第12位缺失的突變體基因hmALR。
3.表達載體的構建無論是hrf或者是hALR、hmALR，均可以通過PCR的方法在其5`-端增加XhoI酶切位點和Kex2酶切信號位點，在3`-端添加終止密碼TAG和NotI酶切位點，將它們插入到表達載體pPICZαA的XhoI和NotI位點之間，這樣就構建出了表達載體pPICZαA-hrf和表達載體pPICZαA-hALR，pPICZαA-hmALR(圖2)。將這三種表達載體均用SacI酶切線性化處理，電轉化甲醇酵母宿主菌X-33，在含抗生素Zeocin(500ug/ml)的YPD平板上篩選陽性克隆，進行增殖和表達篩選，得到高表達的工程菌(圖3)。
4.表達產物的活性測定參照Nakamura，T等的方法(Nakamura，T.，Araki，R. Ichihara，AExp.Cell Res.179，488-497，1988)，通過同位素標記，用體外細胞培養試驗來判定hALR及其突變體對肝癌細胞株(SMMC-7712)增殖情況的影響。根據刺激指數值(刺激指數＝實驗組CPM/空白組CPM)來比較活性的差別。
本專利正文中的ALR代表肝再生增強因子蛋白，hALR代表重組人的肝再生增強因子蛋白，其序列同GeneBank XM 034465公布的胺基酸序列組成，hmALR代表hALR的第12位精氨酸(R)缺失的突變體，HRF代表hALR的前12個胺基酸殘基缺失的ALR蛋白，特稱為肝再生因子蛋白，而採用斜體的hALR，hmALR和hrf分別代表這三種蛋白所對應的基因。
圖1.人和鼠的幾種ALR胺基酸序列比較Hu代表人(Homo sapiens)的ALR，其中Hul是人的一種ALR(GenBankXM_034465)，而Hu2是人的另外一種ALR(GeneBank AF146394)序列；HM代表小家鼠(Mus musculus)的ALR序列(GeneBank NM_023040)。NR代表挪威大鼠(Rattus norvegicus)的ALR序列(GenBank D30735)。方形框中的為人、鼠之間有所不同胺基酸殘基。
圖2.pPICZaA-hrf表達載體的構建圖3.發酵液中HRF的SDS-PAGE電泳圖譜A).非還原型SDS-PAGE電泳；B).還原型SDS-PAGE電泳1.未經甲醇誘導時的發酵上清液；2.甲醇誘導60小時後的發酵上清液；3.經過離子交換和分子篩純化處理後的HRF蛋白；M.蛋白質中分子量標準(LMW Marker Kit，Amersham Pharmacia Biotech)。
具體實施例方式
實施例1基因hrf的合成及表達載體pPICZaA-hrf的構建根據最新公布(2002年)的一種人肝再生增強因子的胺基酸序列(GenBank XM_034465)，並參考早期(1999年)發現的人ALR胺基酸序列和基因序列(GenBank AF146394)，委託上海生物工程公司(Sangon)人工合成ALR分子後面118個胺基酸的共同序列對應的DNA片段，得到這種截短的ALR基因，特命名為基因hrf。通過PCR，在其5`-端增加XhoI酶切位點和Kex2酶切信號位點，在3`-端增加終止密碼子TAG和NotI酶切位點，將該基因用XhoI、NotI雙切後插入到pPICZαA載體的XhoI、NotI酶切位點之間，經DNA測序後，得到含正確hrf基因序列的表達載體pPICZαA-hrf(圖2)。將表達載體pPICZαA-hrf用SacI酶切線性化處理，根據Pichia methanolica Expression Kit中的方法，電轉化畢氏酵母宿主菌(Pichia pastoris)X-33，在含Zeocin(500ug/ml)的平板上篩選陽性轉化子。
以pPICZαA-hrf為模板，通過PCR在基因hrf的5`-端添加12肽MNSLSVGLLPQR-或11肽MNSLSVGLLPQ-對應的DNA序列，從而得到基因hALR或hmALR，構造pPICZaA-hALR或pPICZaA-hmALR載體的過程同pPICZαA-hrf。
實施例2HRF的表達及電泳檢測按照Invitrogen公司發酵操作手冊中的方法對篩選出的工程菌上罐發酵。當用甲醇誘導後，工程菌分泌了大量的HRF進入發酵上清液中。將誘導前、誘導後的發酵液同純化製備的HRF蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測。從表達產物在還原和非還原電泳條件下的目的蛋白的差別，可見，酵母分泌出的HRF能夠形成同源二聚體(圖2)。
實施例3HRF、hALR和hmALR的活性(刺激指數)比較用SMMC-7712細胞株，根據Nakamura的方法測定HRF、hmALR和hALR蛋白對細胞增殖情況的影響。將待測的HRF、hALR和hmALR樣品和陽性對照品(注射用肝細胞生長因子，商品名威佳，山東威海賽洛金公司產)均用RPMI-1640培養液稀釋成40ug/ml，空白對照用RPMI-1640。
取SMMC-7712細胞懸液(4×105/ml)100ul，接種於96孔細胞培養板，以含5％小牛血清的RPMI-1640培養液在37℃，5％CO2的條件下培養6小時後，每孔加入待測樣品(每份待測樣、陽性和陰性對照各四孔)，繼續培養20小時後，每孔加5uCi(185 GBq)的3H-TdR進行標記，24小時後，再收集細胞用冰冷的三氯乙酸(10％，w/v)抽提處理，點於濾紙上，並進行液閃計數，樣品的活性用3H-TdR參入細胞DNA的量，也就是cpm值表示。結果表明重組製備的三種ALR(HRF、hmALR和hALR)能顯著促進SMMC-7712肝癌細胞DNA合成，三種ALR之間無顯著差別，但其活性比陽性對照品高8~10倍。
蛋白質和DNA序列描述SEQ-1序列的資料(1).序列特徵
a.長度119胺基酸b.類型胺基酸c.拓撲學未知(2).分子類型多肽(3).序列描述SEQ-11 XDTKFREDCP PDREELGRHS WAVLHTLAAY YPDLPTPEQQ QDMAQFIHLF 5051 SKFYPCEECA EDLRKRLCRN HPDTRTRACF TQWLCHLHNE VNRKLGKPDF 100101 DCSKVDERWR DGWKDGSCD 119SEQ-2序列的資料(1).序列特徵a.長度118胺基酸b.類型胺基酸c.拓撲學未知(2).分子類型多肽(3).序列描述SEQ-21 DTKFREDCPP DREELGRHSW AVLHTLAAYY PDLPTPEQQQ DMAQFIHLFS5051 KFYPCEECAE DLRKRLCRNH PDTRTRACFT QWLCHLHNEV NRKLGKPDFD100101 CSKVDERWRD GWKDGSCD 118SEQ-3序列的資料
(1).序列特徵a.長度130胺基酸b.類型胺基酸c.拓撲學未知(2).分子類型多肽(3).序列描述SEQ-31 MNSLSVGLLP QRDTKFREDC PPDREELGRH SWAVLHTLAA YYPDLPTPEQ5051 QQDMAQFIHL FSKFYPCEEC AEDLRKRLCR NHPDTRTRAC FTQWLCHLHN100101 EVNRKLGKPD FDCSKVDERW RDGWKDGSCD 130SEQ-4序列的資料(1).序列特徵a.長度129胺基酸b.類型胺基酸c.拓撲學未知(2).分子類型多肽(3).序列描述SEQ-41 MNSLSVGLLP QDTKFREDCP PDREELGRHS WAVLHTLAAY YPDLPTPEQQ5051 QDMAQFIHLF SKFYPCEECA EDLRKRLCRN HPDTRTRACF TQWLCHLHNE100101 VNRKLGKPDF DCSKVDERWR DGWKDGSCD 129SEQ-5序列的資料
(1).序列特徵a.長度354bpb.類型核苷酸c.拓撲學線性(2).分子類型人工合成的DNA(3).序列描述SEQ-51 GACACCAAGT TTAGGGAGGA CTGCCCGCCG GATCGCGAGG AACTGGGCCG 5051 CCACAGCTGG GCTGTCCTCC ACACCCTGGC CGCCTACTAC CCCGACCTGC 100101 CCACCCCAGA ACAGCAGCAA GACATGGCCC AGTTCATACA TTTATTTTCT 150151 AAGTTTTACC CCTGTGAGGA GTGTGCTGAA GACCTAAGAA AAAGGTTGTG 200201 CAGGAACCAC CCAGACACCC GCACCCGGGC ATGCTTCACA CAGTGGCTGT 250251 GCCACCTGCA CAATGAAGTG AACCGCAAGC TGGGCAAGCC TGACTTCGAC 300301 TGCTCAAAAG TGGATGAGCG CTGGCGCGAC GGCTGGAAGG ATGGCTCCTG 350351 TGAC 354SEQ-6的資料(1).序列特徵a.長度36bpb.類型核苷酸c.拓撲學線性(2).分子類型人工合成的DNA
(3).序列描述SEQ-61 ATGAACTCTT TGTCTGTTGG TTTGTTGCCA CAAGACAGA 36SEQ-7的資料(1).序列特徵a.長度33bpb.類型核苷酸c.拓撲學線性(2).分子類型人工合成的DNA(3).序列描述SEQ-71 ATGAACTCTT TGTCTGTTGG TTTGTTGCCA CAAGAC 3權利要求
1.一種通過基因重組方法生產的同源二聚體蛋白，它具有加速肝細胞增殖，促進受損肝臟再生的功能；
2.根據權利要求1，這種同源二聚體蛋白的組成亞基是一條多肽鏈，其胺基酸序列如SEQ-1所描述，其中的X-可以無，可以為MNSLSVGLLPQR-或MNSLSVGLLPQ-等短肽，也可以是人或其他哺乳動物的血清白蛋白分子；
3.根據權利要求2，這條多肽鏈可以無X-部分，而是僅由118個胺基酸組成的序列SEQ-2，其特徵是肽鏈N-端前7個胺基酸為DTKFRED-，C-端是以-SCD結尾；
4.根據權利要求2，這條多肽鏈的X-可以是12肽MNSLSVGLLPQR-，由它同後面的118胺基酸組成一個含130個胺基酸殘基的多肽鏈SEQ-3；
5.根據權利要求2，這條多肽鏈的X-可以是11肽MNSLSVGLLPQ-，由它同後面的118胺基酸組成一種含129個胺基酸的多肽鏈SEQ-4；
6.根據權利要求2，這條多肽鏈的X-可以是血清白蛋白，特別是人的血清白蛋白分子；
7.根據權利要求3，由118個胺基酸組成的多肽所對應的DNA序列SEQ-5；
8.根據權利要求4，這種12肽所對應的DNA序列SEQ-6；
9.根據權利要求5，這種11肽所對應的DNA序列SEQ-7；
10.根據權利要求7，可以將該段DNA序列插入到甲醇酵母表達載體中，在重組甲醇酵母工程菌X3301HRF(菌種保藏號M203007)中以分泌表達的方式生產權利要求3中所描述的多肽。
11.根據權利要求7、8，可以將該段DNA序列插入到甲醇酵母表達載體中，實現在重組甲醇酵母工程菌X3302hALR(菌種保藏號M203012)中以分泌表達的方式生產權利要求4中所描述的多肽。
12.根據權利要求10、11，重組甲醇酵母工程菌中可以自然表達出有生物學活性的HRF或hALR同源二聚體蛋白，並分泌至發酵上清液中，經純化製備後作為醫藥用途。
13.根據權利要求12，其中所描述的醫藥用途是指治療各種原因導致的肝損傷、急性肝功能衰竭、重症肝炎和肝纖維化等。
全文摘要
參考已經發現的人和鼠的幾種肝再生增強因子(ALR，Augmenter of Liver Regeneration)的胺基酸序列和基因序列，人工合成人ALR基因的關鍵性區段，並將其插入到甲醇酵母(Pichia pastoris)表達載體pPICZaA中。實現在甲醇酵母中以分泌表達的方式生產具有醫藥用途的同源二聚體ALR蛋白及其突變體HRF等，所構造的甲醇酵母工程菌菌株上罐發酵時的表達產量不低於1.5g/L。
文檔編號C12N15/81GK1532285SQ0311598
公開日2004年9月29日 申請日期2003年3月25日 優先權日2003年3月25日
發明者黃秀東, 談珉, 陳佩新, 肖建國, 阮振興, 潘學工, 曹之舫 申請人:上海萬興生物製藥有限公司