增強的多重fish的製作方法

2023-04-24 02:20:36

專利名稱：增強的多重fish的製作方法
增強的多重FISH 說明本發明涉及螢光原位雜交的髮夾環的多重應用和實驗的重複性、特異性和速度的增強。本發明的第一個方面是能與靶標核酸序列雜交的核酸分子的組合，其中所述組合包含(a)包含能形成髮夾環(如分子信標)的序列的至少一種核酸，和(b)第二核酸分子、第三核酸分子和可選地至少一個稱為輔助核酸的其他核酸分子。臨床樣品中致病生物體的快速鑑定越來越重要，用以降低發病率和致死率以及治療感染疾病的成本。在應用DNA-信標技術進行原位雜交應用方面的突破(I)使FISH技術能與PCR系統和微陣列技術在速度方面競爭並在成本效率上超越。本發明的目標是找到解決FISH已經經歷的重複性問題並且進一步增加實驗時間的速度。為了增加實驗的速度，需要分析實驗動力學(2)。在PCR實驗中，所有參與雜交的成分在均一溶液中並且採用二級動力學。微陣列採用準一級反應速率，因為捕獲的寡核苷酸固定在固相而分析物在溶液中(3)。FISH中，互換不同作用(B卩，分析物固定在固相，而寡核苷酸在溶液中)，然而，從動力學方面看，所述構型相似。當探針附著在固相時，測量的速率常比溶液中所測低多至三個數量級(3)。因此，不能期望原位雜交動力學產生與均一溶液相同的數量級。本領域現有的雜交實驗的動力學屬性能概括如下
權利要求
1.ー種能與靶標核酸序列雜交的核酸分子的組合，其中所述組合包含 (a)至少ー個第一核酸分子，包含 (i)能與靶標序列雜交的序列， ( )能形成莖幹的兩段互補序列，和 (iii)發光基團和淬滅基團，如果核酸形成莖環結構，淬滅基團使螢光基團淬滅；如果寡核苷酸與靶標序列雜交，螢光基團能在激發後發射發光信號， (b)第二核酸分子，第三核酸分子和可選的至少ー個其他核酸分子， 其中，所述第二核酸分子、第三核酸分子和可選的至少ー個其他核酸分子與靶標序列在位於第一核酸雜交序列5』或/和3』的序列雜交。
2.如權利要求I所述的組合，其特徵在於，所述核酸適用於原位雜交，特別是FISH。
3.如權利要求I或2所述的組合，其特徵在於，所述靶標核酸序列選自DNA序列和RNA序列，並且其中所述靶標核酸序列優選rRNA序列或mRNA序列。
4.如權利要求1-3中任ー項所述的組合，其特徵在於，所述各核酸分子與靶標序列的雜交位點彼此直接相鄰，或其中至少兩個核酸分子與靶標序列的雜交位點相隔至少ー個核苷 酸。
5.如前述權利要求中任ー項所述的組合，其特徵在幹，至少ー個與所述靶標序列雜交的核酸分子序列長16-26核苷酸。
6.如前述權利要求任ー項所述的組合，其特徵在幹，所述組合的各核酸分子與靶標序列獨立雜交 (i)AG 範圍為-15-25kcal/mol，(ii)總AG 範圍為-60- -150kcal/mol、-80- _150kcal/mol 或-100- _120kcal/mol,或/和 (iii)比靶標序列自然重新摺疊所產生AG更負的AG。
7.如前述權利要求中任ー項所述的組合，其特徵在於，所述組合用於診斷應用，特別是診斷細胞存在。
8.如前述權利要求中任ー項所述的組合，其特徵在於，所述組合用於測定抗生素抗性、毒素生產或/和癌基因表達。
9.包含如前述權利要求中任一項所述組合的試劑盒或晶片。
10.一種鑑定樣品中細胞的方法，所述方法包含步驟 (a)提供樣品， (b)將(a)樣品與權利要求1-8中任一項所述的核酸分子組合在允許寡核苷酸與細胞中靶標序列雜交的條件下接觸，和 (C)測定第一核酸分子的發光基團的發光， 其中，第一寡核苷酸的螢光指示靶標序列的出現。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述樣品選自生物樣品，特別是臨床樣品O
12.如權利要求10或11所述的方法，其特徵在於，所述步驟(b)和(c)在原位完成，特定通過FISH。
13.如前述權利要求10-11中任一項所述的方法，其特徵在於，所述步驟(b)中使用的雜交緩衝液不含二價陽離子。
14.如前述權利要求1-8中任一項所述的組合或如權利要求9所述的試劑盒或晶片在鑑定細胞中的應用。
15.如前述權利要求1-8中任一項所述的組合或如權利要求9所述的試劑盒或晶片在診斷細胞存在的藥物組合物生產中的應用。
全文摘要
本發明的目標是能與靶標核酸序列雜交的核酸分子的組合。為了克服FISH實驗的重複性問題和減少實驗時間，聯用髮夾探針和毗鄰所述髮夾探針靶位點退火的輔助探針。
文檔編號C12Q1/68GK102844445SQ201180012360
公開日2012年12月26日 申請日期2011年3月4日 優先權日2010年3月4日
發明者I·P·斯裡普頓, W·斯坦·弗雷赫馮 申請人:米阿科姆診斷有限公司