篩選用於預防感染或致病性的化合物的方法

2023-04-24 09:23:26

專利名稱：篩選用於預防感染或致病性的化合物的方法
背景技術：
本申請是申請日為1997年5月8日的待批美國專利申請流水號08/852,927的部分繼續申請，而後者又是申請日為1995年5月28日的待批美國專利申請流水號08/411,560的部分繼續申請。
本發明涉及鑑定用於抑制真核宿主生物中感染或疾病的化合物的篩選方法，或者該化合物能誘導或刺激宿主致病防禦機制。本發明還涉及將所述化合物用作抗病原體。另外，本發明涉及鑑定致病性毒力因子的方法。
諸如細菌、原蟲、真菌、線蟲、和病毒的微生物病原體包括眾多各種各樣類型的能夠感染動物和植物的生物。當感染生物是致病性的，而且宿主對致病性入侵易感時，會開始發生感染。在與所述宿主的易感細胞或組織形成接觸時，所述病原體由其宿主獲取營養，以利於其自身生長。在所述感染過程中，所述病原體會激活一連串的分子、生化、和生理學過程，其結果是釋放出對宿主有害的物質，並發生疾病(例如，參見美國醫學科學，W.H.Freeman和Co.，加利弗尼亞，舊金山，1995；Agrios，J.N.，植物病理學，學術出版社，1988)。微生物的所述致病作用是以多種方式產生的。
某些病原體通過分泌的產物起作用。例如，白喉是由芽孢桿菌白喉棒桿菌(Cornynebacterium diptheriae)引起的。這種生物被宿主吸入，並在上呼吸道形成感染。儘管所述細菌本身不會侵入血液，但其強效的毒素會侵入血液。這些毒素隨後被身體的細胞吸收，酶的功能受到損害，並破壞宿主細胞。
其它疾病是身體對病原體的反應的結果。例如，對肺炎來說(一種由肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)引起的疾病)，感染會導致體液和細胞瀉出進入肺泡，影響呼吸。皮膚的真菌感染同樣是由這種炎性反應所致。
另一種細菌是機會病原體。例如，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)會感染熱灼傷患者或免疫缺陷型或有其它免疫學損傷的患者。銅綠假單胞菌感染可以是急性的並可以如角膜潰瘍和中耳炎般的是局部的，在囊性纖維化患者的肺中是慢性的，或在侵入血液以後是系統性的。
植物病原性疾病同樣受到關注，因為它會對植物和植物產品造成破壞。植物病原體可通過多種方法中的任一種在植物中產生疾病，這些方法包括(1)消耗宿主細胞養分；(2)通過毒素、酶、或生長調節劑殺滅或破壞宿主細胞代謝；(3)通過誘導缺氯症影響光合作用(例如，通過降解葉綠體)；和(4)抑制導電組織並幹擾正常生理學過程。
作物、觀賞植物、樹木和灌木特別易感由細菌、真菌、病毒和線蟲引起的疾病。植物病原性細菌會導致許多病害症狀的發生，包括葉斑病和葉枯病，軟腐病，枯萎病，過度生長，斑點病，和潰瘍病。細菌性病害最常見發生在具有肉質儲藏組織的蔬菜(和某些觀賞植物上)，如馬鈴薯、胡蘿蔔、洋蔥、鳶尾、或風信子。細菌性病害還可發生在具有肉質果實的植物上(如黃瓜、南瓜、茄子、或番茄)以及發生在多葉植物上(如甘藍、芹菜、萵苣、或菠菜)。植物細菌性病害出現在世界範圍內，並會在大田中、在運輸中、和在儲存中對作物造成嚴重損害。
植物致病的機理是多種多樣各不相同的。例如，一種細菌性植物病原體歐文氏菌屬可通過由傷口或可進入的天然開口滲透到植物中的方式導致諸如軟腐病和火疫病的植物病害。所述細菌一旦進入植物，就會分泌能降解植物胞間層的酶，導致組織的浸解，並最終導致細胞死亡。其它細菌，如假單胞菌屬的某些菌株可通過破壞植物裡的木質部幹擾水的轉運。假單胞菌能侵入根和莖的木質部，一旦進入木質部，就會分泌能破壞植物的酶和毒素。諸如土壤桿菌屬和棒桿菌屬的其它植物病原性細菌會刺激受感染的組織中細胞分裂和細胞膨大。這一般會導致在根、莖、或其它器官上或者在受感染的器官的增殖中(例如由髮根農桿菌(Agrobacterium rhizogemes)引起的毛根病)形成無定型過度生長，冠癭、或腫瘤的形成(例如由根癌農桿菌引起的冠癭)。
病原生物的快速鑑定對於抗病原劑的合適選擇與臨床和農業感染的控制來說是至關重要的。不過，諸如氨磺醯、四環素、氨苄青黴素、頭孢菌素、和氨基糖苷的抗病原劑在醫學和農業上的廣泛應用十分有利於抗性微生物種的選擇。對於含有可傳遞的抗性質粒的細菌菌株來說尤其如此。例如，由沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、和鏈球菌屬的高抗菌株引起的醫院感染的爆發業已成為重要的和復發的問題。篩選抗性菌株的一個結果是，在過去幾十年裡，銅綠假單胞菌業已成為一種重要的並且會造成麻煩的臨床病原體，會在醫院中導致10-20％的感染。目前，有幾種氨基糖苷和第三代頭孢菌素能有效抗銅綠假單胞菌，但是，由於銅綠假單胞菌容易獲得抗性，使得有必要尋找新的化合物作為潛在的替代品或作為其它治療劑。
發明概述我們業已發現，常見的致病性毒力因子參與了植物和動物宿主的感染和致病性。這種宿主獨立型毒力因子的鑑定有利於設計來評價和鑑定治療劑的篩選方法的改進，所述治療劑可用於抑制動物或植物宿主或二者的致病性。另外，我們的發現提供了用於鑑定多種新型毒力因子的篩選方法的基礎。所述毒力因子的鑑定還有利於開發抗病原體的定向製劑。
因此，第一方面，本發明公開了一種用於鑑定能夠抑制真核宿主生物上的病原體的化合物的方法。該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓至少兩種不同的真核宿主生物接觸(依次或同時)一種病原體，至少一種生物是非嚙齒類；和(b)鑑定能在所述每一種真核宿主生物中抑制所述病原體的化合物。
在優選實施方案中，所述病原體是細菌(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)；所述真核宿主生物包括脊椎動物(例如非嚙齒類動物)和植物，脊椎動物和無脊椎動物；或無脊椎動物和植物。優選地，所述無脊椎動物是線蟲(例如，新杆線蟲屬的一員)或昆蟲(例如，鱗翅目或雙翅目)；而所述植物是十字花科(例如，擬南芥屬的一員)。在其它優選實施方案中，所述真核宿主生物的每一種是植物；是脊椎動物；或是無脊椎動物。
第二方面，本發明公開了一種用於鑑定能在非嚙齒類真核宿主生物中抑制病原體的化合物的方法。該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓一種非嚙齒類真核宿主生物接觸一種病原體；和(b)鑑定能在所述真核宿主生物中抑制所述病原體的化合物。
在一種優選實施方案中，所述病原體是細菌(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)；所述非嚙齒類整合宿主生物是線蟲(例如，新杆線蟲屬的一員)；而所述植物是十字花科(例如，擬南芥屬的一員)。在第二個優選實施方案中，所述病原體是細菌(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)；而所述非嚙齒類真核宿主生物是植物(例如，擬南芥屬的一員)。
在第三方面，本發明公開了一種用於鑑定致病性毒力因子的方法。該方法包括(a)鑑定一種能夠感染至少兩種不同真核宿主生物的病原體，所述生物的至少一種是非嚙齒類；(b)製備所述病原體的突變型；(c)讓所述生物的每一種接觸(依次或同時)所述突變型病原體；(d)測定所述突變型病原體是否能在所述每一種生物中導致發病，在以上兩種生物中的發病相對由野生型病原體引起的發病的減輕表明在病原性毒力因子上發生了突變；和(e)將所述突變用作鑑定所述病原性毒力因子的標記。
第四方面，本發明公開了一種用於誘變一種病原性毒力因子的方法。該方法包括(a)鑑定一種能夠感染至少兩種不同真核宿主生物的病原體，所述生物的至少一種是非嚙齒類；(b)製備所述病原體的突變型；(c)讓所述生物的每一種接觸(依次或同時)所述突變型病原體；和(d)測定所述突變型病原體是否能在所述每一種生物中導致發病，在以上兩種生物中的發病相對由野生型病原體引起的發病的減輕表明在病原性毒力因子上發生了突變。
第五方面，本發明公開了一種減弱一種病原體的毒力的方法。該方法包括(a)鑑定一種能夠感染至少兩種不同真核宿主生物的病原體，所述生物的至少一種是非嚙齒類；(b)製備所述病原體的突變型；(c)讓所述生物的每一種接觸(依次或同時)所述突變型病原體；和(d)測定所述突變型病原體是否能在所述每一種生物中導致發病，以上兩種生物中的發病相對由野生型病原體引起的發病的減輕表明病原體毒力的減弱。
在本發明上述任何方面的優選實施方案中，本發明的方法可以使用線蟲快速殺滅分析。另外，所述分析可能包括使用對一種化合物具有高滲透性的線蟲，例如，具有P-糖蛋白突變的秀麗新杆線蟲。
第六方面，本發明公開了一種利用昆蟲(例如，蛾或蠅)鑑定病原性毒力因子的方法。該方法包括(a)選擇一種能夠感染昆蟲的病原體；(b)製備一種病原體的突變型；(c)讓所述昆蟲接觸所述突變的病原體；和(d)測定所述突變型病原體是否能在所述昆蟲上導致發病，在所述昆蟲上的發病相對由野生型病原體引起的發病的減弱表明在所述病原性毒力因子上有一個突變。在優選實施方案中，所述突變的鑑定被用作鑑定所述病原性毒力因子的標記；而所述病原體是細菌(例如假單胞菌屬)或真菌(例如，鐮菌屬)。在其它優選實施方案中，本發明還包括計算一種病原體的LD50，在小鼠殺滅試驗中試驗所述突變型病原體，或同時包括這兩者。
「抑制病原體」是指一種候選化合物降低、抑制、減弱、減輕、或阻止由病原體介導的疾病或感染在真核宿主生物中發生或發展的能力。優選地，與在任何合適的致病性試驗(例如，本文所披露的試驗)中缺少候選化合物時的症狀相比，所述抑制能降低致病性至少5％，更優選至少25％，最優選至少50％。在一種具體的例子中，可以通過監測接觸一種試驗化合物或提取物的宿主生物上的致病性症狀測定抑制作用，症狀水平相對未用所述化合物處理過的宿主生物上的致病性症狀的水平降低表明了化合物介導的對所述病原體的抑制。
「非嚙齒類」是指除小鼠、大鼠、豚鼠、或倉鼠之外的任何生物。
「快速殺滅」試驗是指這樣的試驗試驗群體中超過50％的線蟲會在低於大約36小時內殺滅。在優選實施方案中，所述殺滅是在大約12-大約24小時內完成的。在更優選的實施方案中，殺滅是在大約4小時內完成的。
「致病性毒力因子」是指一種細胞成分(例如，一種諸如轉錄因子蛋白)，沒有這種成分，病原體就不能夠在真核宿主生物中導致發病或感染。
本發明提供了用於區別和評價一種化合物對微生物病原體的效力的多種標準篩選方法的長期期待的優點。例如，本文所披露的篩選方法可以通過簡單的體內篩選同時評價宿主毒性以及抗病原體效力。另外，本發明方法還可用於評價一種化合物抑制微生物致病性的能力，與此同時，可以評價該化合物促進和加強宿主對致病性侵襲的反應的能力。
因此，本發明的方法提供了一種鑑定能夠安全用於真核宿主生物(即不會對所述生物的正常發育和生理學造成不利影響)，並能有效抗致病性微生物(即，通過抑制一種病原體的毒力)的化合物的簡便方式。另外，本發明的方法提供了一種用於分析實際上為任意數量的化合物的抗致病性作用的途徑，該途徑具有大的容積通過量，高靈敏性，和低複雜性。該方法實施起來還比較廉價，並能分析以純化或粗製提取物形式存在的少量活性物質。另外，本文所述的方法提供了一種用於鑑定抗致病性化合物的方法，所述化合物具有穿過真核細胞膜的能力，並能在體內給藥方法中保持其治療效力。
從以下對優選實施方案的說明和權利要求書中可以了解本發明的其它特徵和優點。
詳細說明首先說明附圖。
附1是表示由丁香假單胞菌和銅綠假單胞菌在擬南芥(生態型Llagostera(L1))葉片上引起的症狀的彩色照片。Mock-接種(左)；丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326(中)；銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(右)。
圖2A-D是表示丁香假單胞菌和銅綠假單胞菌在擬南芥屬葉上生長的曲線。圖2A是表示丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326(空心方框)、銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(空心圓形)，和銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA29(空心三角形)在生態型Llagostera中生長的曲線。圖2B是表示銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14在三種擬南芥屬生態型中生長的曲線Columbia(實心方框)；Argentat(實心圓形)；和Bensheim(實心三角形)。圖2C是表示銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(實心圓形)和同種型plcS(空心方框)，和toxA(空心菱形)突變體的生長曲線。圖2D是表示銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(實心圓形)，同種型gacA(空心菱形)，和degP(空心方框)突變型在生態型Llagostera中生長的曲線。按本文披露的方法計數擬南芥屬葉片中的細菌數。示出了四個樣品的平均值±SD。三個獨立的實驗得到了類似結果。所述植株的培養條件與下文的表I中所給出的實驗相同。
圖3是表示生長在野生型銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14和同種型degP突變型上的秀麗新杆線蟲殺滅性比較的曲線。圖4是表示生長在野生型銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14和同種型gacA突變型上的秀麗新杆線蟲殺滅性比較的曲線。
圖5表示線蟲快速和緩慢殺滅試驗的動力學。生長在低磷蛋白腖-葡萄糖(PG)瓊脂上的銅綠假單胞菌比生長在NGM瓊脂上的銅綠假單胞菌能更快地殺滅L4蠕蟲。讓40條L4蠕蟲接觸生長在PG(圓形)或NGM(方形)上的PA14，所示出的殺滅蠕蟲的百分比是三次重複的平均值。
圖6A-6H是表示利用不同機制快速和緩慢殺滅的曲線。比較銅綠假單胞菌突變型lasR(圖6A和6B)，gacA(圖6C和6D)，degP(圖6E和6F)和49H2(圖6G和6H)和親代野生型PA14的快速(左圖)和慢速(右圖)殺滅作用。在緩慢殺滅方面(圖6B和6D)，lasR(三角形)和gacA(圓形)突變型殺滅蠕蟲的能力較其野生型PA14(三角形)弱，但在快速殺滅條件下其致病性未受損害(圖6A和6C)。相反，發現degP基因上的突變(菱形)能延遲緩慢殺滅(圖6F)並減弱快速殺滅(圖6E)。突變型49H2(倒三角形)起著與gacA和lasR突變型相反的作用；在緩慢殺滅方面它與野生型無法區分(圖6H)，但在快速殺滅方面急劇下降(圖6G)。每一個數據點表示三次重複的平均值±SD。對於快速殺滅實驗而言，細菌生長在PGS(圖6A和6G)或PG(圖6C和6E)瓊脂上。所有的緩慢殺滅實驗是在NGM瓊脂上進行的。
圖7A-7C是表示快速殺滅的效力是種和菌株決定型的。圖7A比較了密切相關的螢光假單胞菌的快速殺滅。螢光假單胞菌菌株2-79(空心菱形)是與銅綠假單胞菌PA14(空心方框)具有相同的致病性，但丁香假單胞菌丁香變種菌株4326是無致病性的。圖7B比較了不同銅綠假單胞菌菌株的毒力。PA14在試驗過的菌株中是毒性最大的接觸PA14的蠕蟲80％在12小時以後死亡。在12小時的時間點上菌株PAK、PAO1-R、PA37和PA29佔不到20％的蠕蟲殺滅。圖7C比較了PAO1變體的致病性。在PAO1的不同實驗室收集物之間無明顯差別。每一個數據點表示三次重複的平均值±SD。以上實驗進行兩次得到類似的結果。
圖8A-8F是表示影響銅綠假單胞菌介導的秀麗新杆線蟲殺滅的因素的曲線蠕蟲發育階段(圖8A)和環境因素(圖8B-8F)。除非另有說明，所有試驗是使用生長於20℃下的L4階段野生型N2秀麗新杆線蟲的同步培養物進行的。殺滅蠕蟲的百分比是4次重複的平均值±SD。所有平板均接種40個蠕蟲，並保持在25℃下。圖8A是表示接觸生長在PGS瓊脂上的PA14的L4(方形)或1日齡成體(菱形)的殺滅動力學的曲線。圖8B是表示滲透壓摩爾對快速殺滅反應的影響的曲線。接觸生長在含有0.15M山梨醇(實心方形)，0.1M山梨醇(實心三角形)，或無山梨醇(實心圓形)的蛋白腖-葡萄糖培養基上的PA14的L4蠕蟲的殺滅動力學。與0.1M或無山梨醇相比，添加0.15M山梨醇可明顯提高殺滅速度。測定4次重複的平均值±SD。圖8C是表示鐵濃度對快速殺滅反應的影響的曲線。在PGS上試驗L4蠕蟲，所述PGS不添加鐵(實心方形)，添加100μMFeCl3(空心圓形)，或添加400μM的鐵螯合劑EDDA(空心方形)。與不添加鐵或添加鐵螯合劑的平板相比，在添加了鐵的平板上的殺滅速度明顯降低。該試驗共進行三次，得到類似的結果。圖8D是表示溫度對快速殺滅反應的影響的曲線。在添加1日齡成體蠕蟲之前，在PGS瓊脂平板上在20℃(空心方形)，25℃(空心菱形)，30℃(空心圓形)，或37℃(空心三角形)的溫度下培養PA14 36小時。與較低溫度相比，發現在37℃下生長可降低殺滅速度。讓PA14在上述溫度下生長24小時的第二個試驗表現出類似趨勢。圖8E和8F是表示碳源對快速殺滅反應的影響的曲線。用1％的甘油(實心方形)取代PGS培養基中的1％的葡萄糖(半實心的方形)，會導致野生型PA14的殺滅速度的降低(圖8E)。不過，當甘油被用作取代葡萄糖的碳源時，發現菌株rpn7-lasR(實心圓型)能比野生型PA14更迅速地殺滅(圖8F)。還發現當甘油被用作碳源時，rpn7-lasR能比野生型PA14產生更多的綠膿素。
圖9A-9B是表示由熱穩定性擴散因子介導的快速殺滅的直方圖。在實驗處理之前，讓PA14培養物在PGS瓊脂平板上生長24小時。將生長於20℃下的L4階段野生型N2動物的同步培養物用於所有實驗。所示出的蠕蟲殺滅百分比是三次重複的平均值±SD。圖9A表示快速殺滅反應不需要活的細菌。在處理之後4小時(HPE)測定含有活的PA14細菌的平板和含有死細菌的平板上的L4蠕蟲的殺滅率。將活的或氯仿殺滅大腸桿菌DH5α用於控制氯仿處理的效果。含有活的PA14或氯仿殺滅的PA14的平板表現出相同的殺滅效力。在活的或氯仿殺滅的大腸桿菌平板上沒有蠕蟲是殺滅死亡的。圖9B表示介導蠕蟲殺滅的主要因素是熱穩定性。將未加熱平板(0分鐘)的4小時HPE的殺滅效力與在65℃下加熱30分鐘或60分鐘的含有PA14的平板加以比較。在添加蠕蟲之前，讓以上兩種加熱處理的平板冷卻至室溫。在三種處理中未發現殺滅效力方面的明顯差別，這表明決定殺滅的因子在65℃下穩定至少1小時。


圖10A-10B是表示P-糖蛋白蠕蟲突變型對快速殺滅高度敏感，而對緩慢殺滅不敏感的曲線。在快速殺滅PG培養基(圖10A)和慢速殺滅NGM培養基(圖10B)上L4階段P-糖蛋白雙缺失菌株NL130[pgp-1(pk17)；pgp-3(pk18)](圓形)與其親代N2菌株(方形)的存活率加以比較。在以上兩種實驗中，使用生長於20℃下的L4階段蠕蟲的同步培養物。所示出的蠕蟲的殺滅百分比是三次重複的平均值±SD。向每一個平板上添加大約40個L4蠕蟲，並在25℃下培養所有的平板。在二組獨立的實驗中獲得了類似結果。
圖11A-11B是表示藻酸鹽對快速殺滅不重要的曲線。在快速殺滅條件(圖11A)和慢速殺滅條件(圖11B)下比較degP插入突變型PA14degP(實心方形)，algD框內缺失突變型PA14 algDΔ4(實心圓形)，和雙突變型PA14degP algDΔ4(實心三角形)與野生型PA14(空心方形)的殺滅速度。向每一個平板上添加大約40個L4 N2蠕蟲。將PGS瓊脂用於快速殺滅，而將NGM瓊脂用於慢速殺滅。殺滅蠕蟲的百分比是三次重複的平均值±SD。
圖12是表示磷酸鹽降低快速殺滅的速度的曲線。比較生長在添加了20mM無機磷酸鹽(Pi)的PYS瓊脂上(菱形)或生長在不添加Pi的PYS瓊脂上(方形)上的PA14的殺滅速度。在磷酸鹽限制的條件下，在接觸PA14 8小時之後殺滅L4蠕蟲的百分比(三次重複的平均值±SD)較高。兩個獨立的實驗得到了類似的結果。
圖13A-13B是表示對快速殺滅的抗性的曲線，所述抗性與對百草枯的抗性相關。在快速殺滅條件下，比較秀麗新杆線蟲株系TJ1052，age-1(hx546)II；TK22，mev-1(kn1)III；PH13；和rad-8(mn163)I與野生型N2株系的抗性或易感性。所示存活百分比為三次重複的平均值±SD。圖13A表示發生在age-1基因上的一個突變可產生對PA14快速殺滅的抗性。L4 age-1(hx546)(空心三角形)蠕蟲的存活率明顯高於N2(空心方形)的。圖13B表示發生在mev-1和rad-8基因上的突變可導致PA14快速殺滅敏感性的提高。在PA14和OP50上試驗成體mev-1(kn1)和rad-8(mn163)的存活率。將OP50對照用於控制由於氧的毒性導致的所有死亡率；業已證實以上突變型對氧的敏感性增強。兩種株系在OP50上的死亡(實心菱形和圓形)可忽略不計。與其親代野生型N2株系相比(空心方形)發現mev-1(kn1)(空心菱形)和rad-8(mn163)(空心圓形)突變型成體更容易快速殺滅。
圖14是表示尖鐮胞(F.oxysporum)在蠟螟上的殺滅曲線的曲線圖。
圖15是表示OrR果蠅被PA14殺滅的曲線。
下面我們將說明證實一種細菌病原體能在植物、動物、和線蟲中導致發病的實驗證據，在決定導致植物、動物、和線蟲上的微生物病原性疾病的毒力因子方面存在著重疊。這些實驗實施例是用於說明目的的，而不是用於限定本發明的範圍。鑑定銅綠假單胞菌在植物和動物中的致病性所需的共同的毒力因子為了鑑定多宿主毒力因子，我們首先在植物和動物致病模型中尋找能致病的細菌病原體。用擬南芥葉片致病滲透系統篩選一種銅綠假單胞菌提取物。然後將能在擬南芥屬中誘導發病症狀的提取物用於在小鼠完整厚度皮膚灼傷模型和線蟲採食試驗中檢驗致病力。
具體地講，我們首先篩選了一組銅綠假單胞菌菌株，其中包括30個人類臨床提取物，20個土壤提取物，和25個植物提取物(獲自加利弗尼亞大學伯克萊分校，植物病理學系)。將以上提取物分別注射到4種不同擬南芥屬生態型(陸地小種或野生發病)的葉片中，以測定該提取物是否是植物病原體。試驗了幾種擬南芥屬生態型，以提高鑑定到合適的病原體的可能性，因為包括擬南芥屬病原體在內的植物病原體通常表現出高水平的宿主載培種或生態型專一性。還要進行多個宿主試驗，因為具有生態型專一性的銅綠假單胞菌菌株更有可能是真實的植物病原體(而不是假象病原體，這種病原體僅能在試驗室創造的人工環境下感染植株)。
篩選實驗是按如下方法用擬南芥屬葉片致病滲透系統進行的。在37℃下讓銅綠假單胞菌菌株生長於Luria Broth(LB)培養基中，在10mM MgSO4洗滌2次，以光密度600[OD600]＝0.2的密度重新懸浮於10mM MgSO4中，以1∶100的比例稀釋(相當於細菌密度為103cfu/cm2)，並注射到6周齡擬南芥屬植株的葉片中。在實驗過程中，將植株以28-30℃的溫度和90-100％的相對溼度保持在生長箱中。每天監測發病症狀和生長，共監測5天。注射後5天所誘發的症狀被規定為「無」，無症狀；「弱」，所述注射位點周圍組織的局部弱的水浸和缺氯(黃化)；「中度」，中度水浸和缺氯，接種部位周圍的大部分組織軟化；或「嚴重」，整個接種葉片嚴重軟腐，其特徵是在注射之後2-3天，在注射部位周圍出現水浸反應區和缺氯。在注射後4-5天，軟腐症狀蔓延到整個葉片。在第5天收穫含有細菌的葉片胞間液，並按照標準方法測定細菌數(例如，參見Dong等(1991)植物細胞361)。採集4種不同樣品，每個樣品用2個葉片。3個獨立實驗得到了類似的結果。用10mM MgSO4接種的對照植株在實驗期間未表現出症狀。在其它對照實驗中，遺傳學上限定的銅綠假單胞菌菌株PAK，PAO1，或PO37中任一個都沒有在試驗過的任一種擬南芥屬生態型上導致明顯的症狀。這種菌株被證實在試驗過的生態型上是非致病性的，但在培養物中是致病性的。
儘管篩選過的75種銅綠假單胞菌菌株的大部分不會在擬南芥屬葉片上產生症狀，但有幾種菌株能誘發弱的至中等軟腐症狀，其特徵是在注射部位周圍組織上出現缺氯和水浸。有兩個菌株UCBPP-PA14(人類臨床提取物)和UCBPP-PA29(植物提取物)能在試驗過的某些生態型上引起嚴重軟腐症狀，這是高毒力植物細菌病原體的典型症狀。表I表示在感染5天後銅綠假單胞菌UCBPP-PA14和UCBPP-PA29的生長，以及由這些銅綠假單胞菌菌株在不同擬南芥屬生態型上引發的發病症狀。具體地講，菌株UCBPP-PA14能在Llagostera(L1)和Columbia(Co1)擬南芥屬生態型上引起嚴重軟腐，但在生態型Argentat(Ag)上不會出現症狀，在生態型Bensheim(Be)上僅能產生中度症狀。表I還表明菌株UCBPP-PA29能在L1上導致嚴重症狀，在Co1上引起弱的症狀，但在Ag或Be上不會引起症狀。
表I銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌UCBPP-PA14 UCBPP-PA29<
如圖1所示，由UCBPP-PA14引起的嚴重症狀(最右邊)以水浸反應區和缺氯為特徵，在感染後4-5天可導致葉片的完全浸解和萎縮(與最左邊的對照比較)。這些症狀與由高毒力擬南芥屬病原體丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326引起的症狀基本上是無法區分的(中圖)。
為了證實發病症狀的嚴重程度與細菌增殖相關，在為期數日的時間內，按上述方法在擬南芥屬葉片上測定菌株UCBPP-PA14和UCBPP-PA29中每一種的的生長。如圖2A所示，在生態型L1中，在第5天上菌株UCBPP-PA14(空心圓形)和UCBPP-PA29(空心三角形)達到大約為107細胞/cm2葉面積的最大細菌密度，這相當於比原始接種物增加了104倍。所述菌株在L1上的生長特徵類似於毒性擬南芥屬病原體丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326的生長特徵(圖2A，空心方形)，UCBPP-PA14在生態型Co1中也增殖了104倍(圖2B，實心方形；表I)。相反，菌株UCBPP-PA14在Be和Ag葉片中分別增加了103和102倍(圖2B，分別為實心三角形和實心圓形；表I)，菌株UCBPP-PA29在生態型Co1、Ag、Be中僅增加了102-6×102倍(表I)。在每一種情況下，葉片中細菌數量的減少反映了較輕症狀的形成。因此，所述銅綠假單胞菌菌株的每一種在其以生態型專一方式導致發病的能力方面與其它植物病原體細菌相似。
然後在小鼠完整厚度皮膚灼傷試驗中檢驗被證實能在擬南芥屬中引起發病症狀的UCBPP-PA14和UCBPP-PA29提取物。該試驗涉及5％的鼠類體表面積，形成於腹部皮膚的伸展部分(Stevens等(1994)燒傷護理和恢復雜誌15232)。在該模型中受損傷的表皮和真皮凝固壞死，但下面的腹直肌(RA)未受損傷。在沒有感染的情況下，所有動物均存活下來。
為了進行該致病試驗，通過皮內方式將銅綠假單胞菌接種物注射到燒傷結痂的中線皺摺中。所述細菌在燒傷的傷口中增殖，某些菌株可以侵入正常的下部RA肌。高致病性菌株還能侵入維管結構。24小時之後存在於所述燒傷下部和接近該燒傷部位的RA肌中的細菌數提供了一種局部侵襲力的定量指標，而殺滅率同時表明了局部和系統性侵襲率。
按如下方法進行小鼠完整厚度皮膚灼傷研究。在所有實驗中均使用體重為25-35克的6周齡雌性CD-1小鼠(Charles River動物飼養場)，按照動物燒傷模型進行(Stevens等，同上)。用大約5×103細胞注射小鼠。從剛注射過細菌之後的下部RA肌或在其它研究中接收了假傷害的動物中未挽救到活的細菌細胞。在死亡率研究中，在燒傷之後馬上給小鼠注射102細胞，每天監測因膿毒而死亡的動物數量，共監測10天。兩組對照動物包括(i)燒傷的小鼠，但不注射，和(ii)注射熱殺滅UCBPP-PA14的小鼠，導致0％的死亡率。
表II所示數據(見下文)表明，銅綠假單胞菌菌株能在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型中增殖。表II表明菌株UCBPP-PA14和UCBPP-PA29在增殖和侵入RA肌方面與業已鑑定過的銅綠假單胞菌人類提取物PO37、PAK、PAO1相當。在直接從燒傷和感染部位下面採集的RA肌活組織樣品的每克組織中所有菌株均達到1.8×108-3.6×108cfu的滴度。另外，在從接近燒傷部位採集的RA肌活組織樣品的每克組織中所有菌株均達到4.0×107-8.2×107cfu的滴度。另外，組織樣品的常規組織學處理揭示了菌株UCBPP-PA14侵入肌肉的程度與菌株PO37相同。
表II平均滴度±SD 平均滴度±SD在活組織檢查中 在活組織檢查中銅綠假單胞菌菌株在燒傷之下 接近燒傷
通過按上述方法在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型中進行死亡率研究試驗菌株UCBPP-PA14和UCBPP-PA29與PO37的毒力比較。在燒傷和感染之後第10天，菌株UCBPP-PA14、UCBPP-PA29、和PO37分別能導致77％(17/22)、6％(1/16)、和22％(2/9)的死亡率(表III)。其它實驗表明，菌株PAO1和PAK在該模型中引起的死亡率明顯低於UCBPP-PA14。
然後選擇菌株UCBPP-PA14用於其它研究，因為它能感染植物和動物致病模型，其中，可以對致病結果進行定量，還由於在這些模型中的毒力水平與已知植物和動物病原體的相當。具體地講，我們試圖確定是否在菌株UCBPP-PA14存在在以上兩種宿主中致病所需的共同的毒力決定子。我們的策略是利用一種標記交換方法製備在4個不同基因上帶有插入突變的UCBPP-PA14突變體，已知其中的兩個在動物宿主中是銅綠假單胞菌的毒力決定子，已知一種在植物宿主中是植物病原性細菌的毒力決定子，已知一種在動物宿主中是若干動物細菌病原體的毒力決定子。銅綠假單胞菌的兩個動物毒力基因是分別編碼外泌蛋白磷脂酶C和外毒素A的plcS和toxA(Ohman等(1990)感染與免疫28899；Ostroff等(1987)細菌學雜誌1694597)。外毒素A核糖基化G蛋白和磷脂酶C優先降解真核細胞的磷脂(Iglewski等(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.722284；Berka等(1982)細菌學雜誌152239)。植物病原體毒力決定子是gacA，它被鑑定為非致病性土壤桿菌螢光假單胞菌的外泌抗真菌因子的全球性調節物(Laville等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891562；Gaffney等(1994)分子植物-微生物相互作用7455)。在植物病原體丁香假單胞菌丁香變種和菊苣假單胞菌(P.cichorii)中，gacA似乎起著編碼與致病性有關的胞外產物的基因的轉錄調節物的作用(Rich等(1994)細菌學雜誌1767468)。其它動物毒力決定子degP(也被稱為htrA)業已被證實為一種脅迫反應蛋白酶，它決定在布魯氏菌屬和沙門氏菌屬中不正確摺疊的周質蛋白的降解(Elzer等(1994)感染與免疫學624135；Johnson等(1991)分子微生物學5410)。
用相當於銅綠假單胞菌菌株PAK的plcS和toxA基因的克隆DNA片段作為雜交探針在菌株UCBPP-PA14的基因組粘粒文庫中鑑定plcS和toxA的UCBPP-PA14同系物。按照標準方法在粘粒克隆載體pJSR1中製備菌株UCBPP-PA14的基因組文庫，而載體pJSR1本身是通過將一個含有源於pHC79的噬菌體λcos位點的1.6kb BglII片段(例如，參見Hohn等(1980)基因11291)連接到pRR54的BglII位點上而構建的(例如，參見Roberts等(1990)細菌學雜誌1726204)。將一個從質粒pMS150中分離的含有toxA基因的1.7kb BamHI片段(例如，參見Lory等(1983)基因2295)和一個從質粒pSL2(例如，參見Lory等(1988)細菌學雜誌170714)中分離的含有plcS基因的3.0kb BamHI-PstI片段用於檢測在pJSR1中構建的UCBPP-PA14基因組文庫。
按照標準方法用相當於螢光假單胞菌gacA基因的保守區的PCR擴增產物在相同的粘粒文庫中鑑定gacA的UCBPP-PA14同系物。根據gacA基因的序列(Laville等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891562)設計寡核苷酸5』-GCTAGTAGTCGATGACC-3』(序列1)和5』-GCTGGCATCAACCATGC-3』(序列2)，並用於擴增一種含有螢光假單胞菌gacA基因的625個鹼基對的產物，在將該寡核苷酸用於檢測上述構建於pJSR1中的UCBPP-PA14基因組文庫。用丁香假單胞菌斑生致病變種的degP基因作為探針在UCBPP-PA14粘粒文庫中鑑定degP基因的UCBPP-PA14同系物。
對所有4個基因進行亞克隆，並用標準方法通過插入編碼慶大黴素抗性的框進行誘變。
另外將從含有菌株UCBPP-PA14的plcS基因的粘粒克隆中分離的6kb BamHI片段由pJSR1衍生的粘粒亞克隆到pBR322的BamHI位點。通過將一個慶大黴素編碼DNA框插入plcS基因的XohI位點誘變所得到的克隆pLGR101，以構建pLGR201。所述慶大黴素抗性基因框是一個源於質粒pH1JI的1.8kb BamHI片段(例如，參見Rubin(1987)質粒18，84)。將一個含有toxA基因的1.6kb BamHI片段由pJSR1衍生的粘粒克隆到pBR322，以構建pLGR102，隨後通過將所述慶大黴素框插入toxA基因的BglII位點進行誘變，構建質粒pLGR202。將一個含有銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14 gacA基因的2.5kbHindIII-EcoRI片段由pJSR1衍生的粘粒亞克隆到pBR322中，構建pLGR103。對推測的gacA基因進行部分測序，以證實UCBPP-PA14 gacA業已被克隆。通過將所述慶大黴素框插入gacA基因的SalI誘變pLGR103，以構建質粒pLGR203。將含有部分degP基因的1.6 PstI片段由菌株UCBPP-PA14的粘粒克隆pH126的衍生物pPY201亞克隆到pUC19的PstI位點，構建pNAS。將含有所述慶大黴素框的1.6kb SalI片段插入pNAS上的degP基因的XhoI位點，構建pNASGm。接著，從pNASGm載體中分離一個3.2kb的SphI/XhoI片段，並亞克隆到pCVD442的SphI/XhoI位點，構建pPY206，它含有突變的degP基因。
用標準標記交換技術將所述突變基因轉移到UCBPP-PA14基因組，通過DNA印跡分析證實所得到的標記交換突變的結構，因此，通過Rahme等所披露的方法(細菌學雜誌170575，1991)將質粒pLGR201、pLGR202、pLGR203和pPY206用於置換基因plcS、toxA、gacA和degP，用濃度為30mg/ml的慶大黴素篩選雙交換事件，濃度為300mg/ml的羧苄青黴素用於篩選所述載體的丟失。在加富或基本培養基中，與野生型相比，以上4種突變對細菌生長都沒有任何可檢測的影響。
通過將所述突變型菌株滲透到擬南芥屬生態型Ll中試驗plcS、toxA、gacA和degP突變對UCBPP-PA14在擬南芥屬模型中的致病性的影響。與野生型UCBPP-PA14不同，所述突變型無一能導致葉片浸解或萎縮。具體地講，等基因toxA突變型能引起減弱的軟腐和缺氯症狀，沒有伴隨的UCBPP-PA14所特有的受影響組織的浸解。plcS、gacA和degP突變能引起更弱的症狀，僅僅會導致缺氯。與減弱的症狀一致，5天之後toxA、plcS、gacA和degP突變型的生長分別比野生型的生長低大約10倍、102倍、5×103倍和102(圖2C和2D)。
當為所述突變型補充攜帶在質粒上的相應的野生型基因時，3種試驗過的突變型(plcS、toxA、和gacA)在植物中的生長和症狀完全恢復到野生型水平。這一目的是通過將一個6kb BamHI片段由含有菌株UCBPP-PA14的plcSR操縱子的基因組文庫的粘粒克隆pB85亞克隆到質粒pRR54的BamHI位點構建pLGR301而實現的。然後將質粒pLGR301用於plcS突變型的遺傳互補研究。將從含有菌株PAK的toxA基因的質粒pMS150中分離的2.4kb的EcolRI/EcolRV片段亞克隆到質粒pBR322的EcolRI/EcolRV位點，構建pLGR106。將來自pLGR106的一個含有toxA的SphI/PstI片段克隆到pRR54的SphI/PstI位點，構建pLGR206。從粘粒克隆pH106中分離含有gacA基因的1.2kbHindIII/XhoI片段，並亞克隆到pRR54的HindIII/SalI位點上，構建pLGR204。然後將pLGR206和pLGR204用於toxA和gacA突變型的遺傳互補研究。
表III表示相當於以上3種銅綠假單胞菌菌株突變型在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型中的死亡率研究。在該死亡率研究中，燒傷並感染plcS或toxA突變型的小鼠與感染野生型菌株的小鼠(77％)相比表現出明顯較低的死亡率(兩種突變型均為40％)。gacA和degP突變型不會導殺滅亡(表III)。突變型和野生型之間的死亡率差別在從統計學上講是顯著的，其置信水平為95％或者更高。通過用卡方測試和Yates』校正測定死亡率數據的統計學顯著性。P≤0.05的組被示為統計學上顯著的。所有突變型均達到統計學顯著水平(plcS和toxA，P＝0.05gacA，P＝0.00005)。
表III
以上結果表明，plcS、toxA、gacA、和degP參與了植物和動物致病，並表明了發病所需要的一部分病原體機制在動物和植物宿主中是共同的或共有的。一種共有的毒力因子gacA在調控水平上是有活性的，表明了調控毒力因子的機制在植物和動物病原體之間是保守的。plcS和toxA基因產物是特殊的毒力決定子，它們有可能攻擊細胞膜，並抑制植物和動物細胞中的蛋白合成。
為了將以上結果擴展到第三種宿主系統，在線蟲採食試驗中測定銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的致病性。所述採食試驗的設置如下。首先，將銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的5μl過夜培養物或攜帶degP或gacA突變的銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的等基因菌株接種到NGM瓊脂平板的中央，並在37℃下培養24小時。在室溫下冷卻數小時之後，用8個秀麗新杆線蟲L4-期蠕蟲接種所述平板。然後在黑暗中在25℃下培養平板，每隔6小時統計死去的蠕蟲。具有以下症狀的蠕蟲為死亡它不再活動，不再表現出任何咽泵活動，不再表現出排糞行為。
圖3和4表示分別使用野生型UCBPP-PA14及其degP和gacA等基因突變型進行的線蟲採食殺滅試驗結果。圖3和圖4所示結果表明，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14能殺滅秀麗新杆線蟲。以上結果還表明，攜帶能從功能上使degP或gacA基因失效的插入的銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的等基因突變型能明顯降低在線蟲和小鼠完整厚度皮膚燒傷試驗中的毒力(圖3和4；表III)。已知gacA基因是丁香假單胞菌在植物宿主中的毒力決定子，degP是丁香假單胞菌和鼠傷寒桿菌的毒力因子。如下文所述，我們業已將所述篩選方法用於鑑定在線蟲和擬南芥屬中具有減弱的致病性的若干突變型；發現我們所分離到的三種突變型在小鼠中的致病性較弱。
本文所披露的多宿主動物/植物病原體系統具有若干實際分歧。例如，以上結果表明致病的分子基礎在植物和動物中是明顯相似的。因此，如下文所述，所述多宿主系統可用於新型毒力因子的鑑定和研究。具體地講，可以通過在不同宿主生物中試驗單一的誘變銅綠假單胞菌篩選整個銅綠假單胞菌基因組中的致病相關基因，例如使用本文所披露的擬南芥屬或線蟲試驗。然後可將以這種方式鑑定的基因在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型中進行試驗。該系統還有利於闡明細菌病原體的宿主專一性的分子基礎。用該模型系統鑑定的毒力因子，提供了新一代化學治療劑的開發目標，所述治療劑可用於臨床和農業微生物疾病。鑑定共同毒力基因的篩選系統根據以上結果表明，一系列銅綠假單胞菌毒力因子參與了三種不同宿主的致病，並且這些共同的毒力決定子確定了細菌致病性的功能特徵，它是不依賴於宿主的，我們業已開發了一種用於鑑定對植物和動物致病性重要的毒力決定子。所述篩選使用多宿主動物/植物病原體(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)並利用其便於在實際上任何宿主生物中篩選數以千計的隨機產生的微生物突變型的能力。有用的真核宿主生物包括，但不限於線蟲(例如秀麗新杆線蟲)、植物(例如擬南芥屬的種子或葉片)、酵母或其它真菌、魚(例如，蓑魷)、蠅(例如，黑尾果蠅)、小鼠等。一般，按照本領域眾所周知的標準方法誘變微生物病原體，然後評價其在宿主生物中誘發疾病的能力。將發現其具有減弱的致病性的誘變病原體或已變成無致病性的病原體用於本發明方法。然後按照本領域公知方法將所述突變型病原體用於鑑定決定致病性的宿主依賴型或宿主非依賴型毒力因子。
以下是毒力因子線蟲篩選系統的工作實例，該系統使用人類臨床提取物銅綠假單胞菌UCBPP-PA14，發現其能感染三種不同模型小鼠皮膚完整厚度燒傷模型，秀麗新杆線蟲採食模型，和擬南芥葉片滲透模型。將線蟲用作研究諸如假單胞菌屬的人類或植物病原體的優點是，在線蟲中鑑定非致病性假單胞菌屬突變型相對簡單。例如，秀麗新杆線蟲篩選包括將兩個L4階段蠕蟲放置在銅綠假單胞菌突變體的菌苔上，並在5天後觀察存活的蠕蟲。按照任何標準方法誘變諸如銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的病原體，例如標準的體內或體外插入誘變方法(例如，參見Kleckner等(1977)分子生物學雜誌116125)。還可使用其它方法，例如化學誘變。在第5天，在接種野生型病原體細菌的平板上很少有或沒有活的蠕蟲，而在接種大腸桿菌或非致病性突變體的平板上存在以上兩個起始兩性蠕蟲的數以百計或千計的活的後代。因此，在有突變型銅綠假單胞菌的條件下生長的蠕蟲是決定致病性的基因業已失活的證據。對失活突變的位置進行作圖，導致了突變毒力因子的克隆和鑑定(例如，通過核苷酸測序)。
為了鑑定參與致病的基因，我們用轉座子誘變的標準技術製備了銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的突變體(例如，參見Manoil等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.8129；Taylor等(1989)細菌學1711870)；製備了8000以上的突變體。然後利用上述秀麗新杆線蟲採食試驗評價上述突變體中1900個的致病性。如表IV所示，我們分離到了在秀麗新杆線蟲中表現出減弱的致病性的8個UCBPP-PA14突變體。
另外，我們還檢查了另一類突變體的致病性，這類突變體是用標準方法在萵苣葉致病試驗中通過轉座子誘變製備的(例如，參見Cho等(1975)植物病理學65425)。利用該試驗，我們分離到了2900個在萵苣葉上具有減弱的致病性的UCBPP-PA14突變體。然後按照上述方法在擬南芥屬葉片致病分析試驗中試驗這些突變體。如表IV所示，我們分離到了在擬南芥屬中具有減弱的致病性的12個UCBPP-PA14突變體。
表IV
然後在秀麗新杆線蟲採食試驗和小鼠完整厚度皮膚燒傷試驗中試驗在擬南芥屬滲透試驗中鑑定的一個UCBPP-PA14突變體的致病性。我們發現與野生型UCBPP-PA14菌株相比，該UCBPP-PA14突變體在以上兩種系統中的致病性都較低。另外，我們還試驗了在擬南芥屬生物活組織檢查中鑑定的兩種突變體在小鼠完整厚度燒傷試驗中的致病性。還發現這些突變體與野生型UCBPP-PA14菌株相比在小鼠中具有較低的致病性。與這些結果一起還提供了用於證實在植物和動物中決定致病性的共同毒力因子存在的證據。
上述結果表明，在銅綠假單胞菌UCBPP-PA14和秀麗新杆線蟲之間存在致病性相互作用。菌株UCBPP-PA14能殺滅秀麗新杆線蟲。在擬南芥葉滲透試驗中(圖1和2；表I)和在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型(表2和3)中，UCBPP-PA14也具有感染力。另外，我們業已證實在UCBPP-PA14 degP和gacA基因中發生的無效突變可顯著降低在所有三種模型中的致病性。因此，我們業已提供了在植物和動物中存在決定致病性的其同毒力因子的第一個證據。所述毒力因子使得分離能影響毒力因子的功能的化合物成為可能(例如，通過直接降低致病性或增強宿主的反應)，還有可能在簡單的實驗系統(例如，Caenorhabitis)中鑑定這些化合物。利用線蟲「快速殺滅」試驗鑑定共同毒力基因的篩選系統上述證據表明，當PA14菌株生長在NGM瓊脂上時，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14能在為期2.5-5天的時間內殺滅秀麗新杆線蟲。在這種條件下觀察到的殺滅速度被定義為「慢速殺滅」。簡單地講，在慢速殺滅條件下，將5μl PA14的過夜液體培養物展開到一個NGM(或M9)瓊脂平板的中央，並在37℃下生長24小時。然後用數小時將這些平板冷卻到室溫。將第四幼蟲期(L4)的蠕蟲加到所述瓊脂上，但不接觸所述菌苔。所述蠕蟲通常會向著所述菌苔移動並開始採食。相反，當PA14蠕蟲生長在蛋白腖-葡萄糖-山梨醇(PGS(一種具有較高滲透摩爾數的加富培養基))上時，獲得了不同結果。當L4蠕蟲被放置在PGS平板上時，所述蠕蟲變得遲緩、然後麻痺、接著在4-24小時內死亡(圖5)。某些蠕蟲甚至在與所述菌苔發生直接接觸之前就已死亡。這種在PGS瓊脂上的較快速的殺滅被稱為「快速殺滅」。為了證實快速和慢速殺滅之間動力學的差別是否是由於內在機制的差別引起的，或者快速殺滅僅僅是在慢速殺滅中出現的過程的一種加速，在以上條件下試驗PA14細菌突變體的效果。篩選的殺滅曲線示於圖6A-6H中，並將數據歸納於表V中。
表V在以下條件下殺滅秀麗新杆線蟲的能力菌株 快速 慢速基因PA14 + +在快速和慢速殺滅中的致病性PA14plcS + + PlcSPA14algDΔ4 + + algD16G12+ + 無匹配25A12+ + 無匹配33A9 + + 無匹配33C7 + + 無匹配僅在慢速殺滅中延遲PA14toxA + ± toxA35A9 + ± 無匹配44B1 + ± 未測序25F1 + ± 無匹配41A5 + ± 無匹配41C1 + ± 未測序34H4 無匹配僅在慢速殺滅中受傷害PA14gacA + - gacA50E12+ - invA的dst*rpn7-lasR+ - lasR僅在快速殺滅中受傷害49H2 - + 未測序在快速殺滅中受傷害並在在慢速殺滅中受延遲PA14degP - ± egPpho15- ± dsbA34B12- ± phnB的dst*在快速和慢速殺滅中受傷害pho23- - 無匹配如圖6A-6H所示，發生在PA14的gacA或lasR基因上的突變能完全消除慢速殺滅，但對快速殺滅沒有影響(圖6A-6D)，以上兩個基因是胞外毒力因子的轉錄調節物(Galbello等(1993)感染與免疫611180-1184；Rahme等(1995)，科學2681899-1902)。相反，發生在編碼周質蛋白酶的PA14degP基因上的突變以及TnphoA插入未鑑定的基因(TnphoA突變型49H2)明顯減弱快速殺滅，但僅能延緩慢速殺滅(圖6E-6H)。6A-6H和表V所示數據與以下假說最為一致PA14採用不同的機制殺滅秀麗新杆線蟲，這取決於細菌生長的培養基。
假單胞菌屬的其它種和菌株的致病性業已發現，與大腸桿菌類似，螢光假單胞菌(菌株55，2-79和WCS365)和丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326在上述慢速殺滅條件下不能殺滅秀麗新杆線蟲；菌苔被完全消耗，而線蟲發育和繁殖正常。然而大腸桿菌、丁香假單胞菌斑生致病變種菌株E4326和螢光假單胞菌55在快速殺滅條件下也是非致病性的，但螢光假單胞菌2-79(圖7A)和螢光假單胞菌WCS365(數據未顯示)在快速殺滅條件下具有與銅綠假單胞菌PA14相同的毒力。有趣的是，銅綠假單胞菌2-79和WCS365是有效的根部寄居菌，並對其抑制真菌感染的能力作了深入的研究(Mazzola等(1992)應用環境微生物學582616-2624)。
由於不同的銅綠假單胞菌菌株能產生不同量的胞外毒力因子(Hamood等(1992)感染與免疫60510-517)，還要在所述快速殺滅條件下試驗不同銅綠假單胞菌菌株的毒力，如圖7B所示，在快速殺滅條件下，試驗過的其它銅綠假單胞菌菌株無一與PA14一樣有毒。Preston等(感染與免疫633497-3501，1995)證實，在不同實驗室保持的相同親代PAO1的變體在小鼠角膜感染的毒力方面表現出顯著差異，因此，我們還試驗了PAO1菌株的不同實驗室收集物。不過，所有試驗過的PAO1變體的毒力均低於PA14，並且在它們之間沒有明顯差別(圖7C)。由於其它銅綠假單胞菌菌株的毒力不如PA14，我們提出將PA14用於下述所有其它試驗。
影響銅綠假單胞菌介導的秀麗新杆線蟲快速殺滅的因素蠕蟲的發育時期。我們已經證實，在慢速殺滅條件下，成體蠕蟲的死亡快於L4蠕蟲。因此，我們試驗了蠕蟲發育時期對快速殺滅的敏感性的影響。如圖8A所示，L4蠕蟲比1日齡兩性成體更容易被快速殺滅。例如，在接觸銅綠假單胞菌PA14 12小時之後，超過90％的L4蠕蟲死亡，而相同條件下僅有不到10％的1日齡成體(圖8A)。
細菌因素。細菌具有另人難以置信的根據環境刺激變化調節基因表達的能力。這種類型的調節對於適應物理環境和/或毒力因子的表達的改變可能是必須的。在細菌中調節基因表達的某些已知因素有滲透性、溫度、鐵和磷酸的濃度，和碳源。慢速殺滅培養基(NGM或M9)的磷酸含量高，而快速殺滅培養基的磷酸含量低。我們試驗了改變M9瓊脂的滲透壓、生長溫度、鐵濃度、和碳源對慢速殺滅動力學的影響。除了生長培養基的鐵濃度之外，其它參數無一能明顯影響慢速殺滅，鐵濃度的提高會導致微弱的殺滅延遲。這並不奇怪，因為慢速殺滅是細菌在蠕蟲腹腔建立並繁殖的結果，並且體內條件比體外生長條件更能影響銅綠假單胞菌的致病性。
滲透壓。在蛋白腖-葡萄糖培養基(PS)上的殺滅速度明顯高於在乾燥平板上的殺滅速度。為了證實這種在殺滅速度方面的提高是否是由較高滲透壓引起的，用山梨醇提高滲透壓，而不提高電解質濃度。在缺少(PG)或存在0.1M和0.15M山梨醇(PGS)的條件下使用蛋白腖葡萄糖培養基。在PG和PGS培養基上，PA14的生長速度相同。不過，如圖8B所示，隨著培養基滲透壓的提高，觀察到了明顯較高的秀麗新杆線蟲死亡率，和更快的殺滅速度，這表明了滲透壓-調節的毒力因子的生產的增加。與所述假設一致，即滲透壓能影響細菌毒力因子的分泌，業已在另一種人類機會病原體嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)上證實，在高滲透壓下生長的細胞表現出比較低滲透壓的培養基中生長的細胞較高的溶解性、細胞毒性、和解酪蛋白活性，並且在魚和小鼠致病模型中毒性更大(Aguilanr等(1997)感染與免疫651245-1250)。另一種假說是，在高滲透壓培養基中快速殺滅的加強是由於線蟲耐受力的降低。事實上，我們觀察到當把L4秀麗新杆線蟲放置在含有大腸桿菌或非致病性PA14菌株的高滲透壓瓊脂培養基(PG含有0.15M山梨醇)上時，線蟲首先變得麻痺，但然後恢復。
鐵。鐵的可得性是被許多致病性細菌用於誘導毒力因子表達的一個重要刺激物。鐵限制的條件能促進毒素A、鹼性蛋白酶、和彈性蛋白酶合成的增加(Bjorn等(1978)感染與免疫19785-791；Bjorn等(1979)細菌學雜誌138193-200)。很多這些胞外產物產生銅綠假單胞菌致病性的毒力。與該結果一致，與生長在高鐵培養基中時產生的損傷相比，生長在低鐵培養基中的銅綠假單胞菌菌株PAO1能產生明顯更大的角膜損傷(Woods等(1982)感染與免疫35461-464)，然而，有關的毒力因子尚未披露，為了證實是否所有參與秀麗新杆線蟲快速殺滅的毒力因子是由鐵調節的，在鐵限制和含鐵條件下試驗PA14的殺滅效力。如圖8C所示，添加鐵螯合劑(400μM的EDDA)不會明顯影響快速殺滅，而添加100μM的FeCl3可明顯減弱殺滅。從以上發現可以得出若干結論。首先，由於PGS培養基可能是鐵限制的，添加鐵螯合劑對可利用的鐵的濃度沒有明顯影響。其次，在含鐵條件下殺滅的減弱表明，一小類參與秀麗新杆線蟲殺滅的因子的產生是鐵抑制的(轉錄調節)，或者在高鐵濃度下一種或幾種因子的活性被減弱(翻譯後調節)。
溫度。通過讓野生型PA14的菌苔分別在20、25、30和37℃下生長36小時試驗生長溫度對PGS培養基上快速殺滅的影響。在接種1日齡成體蠕蟲之後，將所有平板在25℃下培養。如圖8D所示，對於生長在20、25、或30℃下的細菌來說未發現蠕蟲死亡率方面有明顯差別；不過，在以上三種溫度下生長的PA14比在37℃下生長的PA14明顯更有毒性。當使用更易感L4期時，溫度的差別對死亡率的影響不明顯(數據未示出)。還報導了嗜水氣單胞菌在毒力方面的類似的提高。與在37℃下培養的細胞相比，在20℃下生長對魚和小鼠的毒力更大，並表現出較高的胞外活性(Merino等(1992)感染與免疫604343-4349)。在銅綠假單胞菌菌株PA103中已知至少一種毒力因子是由溫度調節的。在用整合到PA103染色體的toxA基因座上的toxA-lacZ啟動子融合體進行的研究中，β-半乳糖苷酶的最大產量出現在25℃，並且隨著溫度的提高而降低(Vasil等(1989)分子微生物學3371-381)。不過，一般，尚有待於證實銅綠假單胞菌的特定毒力因子在20-30℃下的產量是否高於在37℃下的產量。對於秀麗新杆線蟲模型來說，在37℃下生長的細胞的毒性降低的機制的闡明，可以提供令人困惑的事實的線索，儘管人類和其它最適體溫為37℃的哺乳動物具有許多毒力因子，但銅綠假單胞菌仍然是一種機會感染者。
碳源。由許多致病性細菌表達的毒力決定子是由用於生長的碳源控制的。在試驗碳源對PA14毒力的影響時，通過用相同濃度的甘油(PYS)取代總的最終體積為1％的葡萄糖(PGS)改進PGS培養基。如圖8E所示，當PA14生長在用葡萄糖(PGS)取代甘油(PYS)作為碳源的蛋白腖-山梨醇上時，PA14對秀麗新杆線蟲的快速殺滅更加有效。殺滅效力的差別並非由於在不同碳源上細菌生長速度的不同造成的，因為在兩種培養基條件下PA14生長的同樣好(數據未顯示)。
儘管野生型PA14在葡萄糖培養基上的殺滅比在甘油培養基上的殺滅更有效，但在用甘油而不是用葡萄糖作為碳源的PYS上，在lasR基因上含有TnphoA插入片段的PA14突變型(菌株rpn7-lasR)能比其親代PA14更迅速地殺滅(圖8F)。在PGS上，菌株rpn7-lasR和野生型PA14之間的殺滅動力學無法分辨。有趣的是，生長在PYS上的rpn7-lasR表現出加強了的瓊脂藍-綠色素生成。我們在PYS液體培養基中生長rpn7-lasR和PA14，並證實了rpn7-lasR的綠膿素產量相對野生型PA14的3-5倍的提高。儘管我們不排除其它色素或化合物過量產生的可能性，這一結果建立了提高了的殺滅速度與提高了的綠膿素產量之間的關係。
參與PA14介導的快速殺滅的細菌因子所述快速殺滅以及某些蠕蟲甚至在直接接觸細菌之前死亡的發現促使我們試驗可擴散的毒素是否在快速殺滅中起著重要作用。在與上述試驗類似的條件下讓銅綠假單胞菌生長在PGS瓊脂培養基上，所不同的是，生長之後，將菌苔從瓊脂表面上刮掉，並通過讓其與氯仿蒸汽接觸殺死其餘的細菌。在添加蠕蟲之前，通過在通風櫥中對所述平板進行1小時的通風，除去殘留的氯仿。將大腸桿菌菌株DH5α用於控制對蠕蟲的處理效果。如圖9A所示，有或沒有活的PA14細菌的殺滅效力相同。氯仿處理對線蟲沒有不利影響，因為在氯仿處理的DH5α平板上蠕蟲無一死亡。通過用UV輻射殺滅PA14獲得了類似結果(數據未顯示)。以上結果表明，當細菌在PGS瓊脂上生長一段時間之後，業已擴散到瓊脂中的一種或幾種化合物足以支持快速殺滅。用生長在慢速殺滅培養基NG瓊脂上的細菌進行相同的氯仿試驗，蠕蟲無一死亡。這表明可擴散的毒素如果在NGM瓊脂中存在的話，其濃度是如此之低，以至於在慢速殺滅條件下對蠕蟲的殺滅沒有作用。
為了測定高溫是否能使決定快速殺滅的化合物失活，我們在65℃下對含有PA14菌苔的平板加熱30分鐘或60分鐘。如圖9B所示，在加熱過的平板或未加熱過的對照之間殺滅沒有明顯差別，這表明決定快速殺滅的主要因子的熱穩定性較高。
為了進一步支持所述假說，即可擴散的毒素與快速殺滅有關，我們試驗了秀麗新杆線蟲P-糖蛋白突變型(株系NL130[pgp-1(pk17)；pgp-3(pk18)])對PA14介導的快速殺滅的易感性。P-糖蛋白屬於ATP結合膜轉運蛋白的進化上的保守家族，並且被認為能通過將外源毒素從細胞中有效排除而保護細胞免受外源毒素損傷(Higgins(1995)細胞82693-696)。株系NL130缺失了pgp-1和pgp-3基因，並且業已證實對細胞毒性劑秋水仙素和抗瘧/抗原生動物劑氯喹更敏感(Broeks等(1995)EMBO雜誌141858-1866)。NL130還對真菌毒素串珠鐮胞菌素B1更敏感。比較株系NL130的L4期蠕蟲對生長在PGS瓊脂上的PA14的易感性和親代野生型株系N2的易感性。與此同時，我們還在慢速殺滅條件下試驗了NL130和N2。如圖10A所示，與快速殺滅是由可擴散的毒素介導的假說一致，在快速殺滅條件下，在接觸PA14四小時之後，70％的N2蠕蟲仍然存活，而只有不足5％的NL130蠕蟲存活。相反，在慢速殺滅條件下沒有發現NL130在易感性方面的明顯提高，而殺滅的機制似乎與細菌在蠕蟲腹腔的寄居和繁殖相關(如圖10B)。
藻酸鹽對於快速殺滅來說不重要如上文所述，PA14 degP突變型在其導致快速殺滅的能力方面受到明顯損傷。除了減弱的致病性表現型之外，由於胞外多糖藻酸鹽的過量產生，在PGS瓊脂上PA14 degP突變型明顯比野生型更粘。與粘性表型一致，UCBPP-PA14 degP基因的DNA測序以及由Boucher等在不同的銅綠假單胞菌菌株中進行的獨立DNA序列分析(細菌學雜誌178511-523，1996)證實了degP與其它4個業已證實為與藻酸鹽調節有關的基因為緊密相關的一簇。為了解釋PA14 degP突變型的減弱的致病性表型是否是由於藻酸鹽的過量產生，構建了PA14 degPalgD雙突變型，並在快速和慢速秀麗新杆線蟲殺滅條件下試驗。algD基因編碼GDP甘露糖脫氫酶，這種酶能催化藻酸鹽生物合成的早期步驟(Deretic等(1987)核酸研究154567-4581；Lightfoot和J.L.(1993)分子微生物學8771-782)。通過讓algD框內缺失與PA14上的野生型algD基因進行標誌交換構建菌株PA14algDΔ4。PA14algDΔ4在假單胞菌屬分離瓊脂(PIA)上不是粘性的，證實了藻酸鹽的缺乏(Yorgey和Ausubel，未發表)。如圖11A和11B所示，在快速和慢速殺滅試驗中，PA14algDΔ4殺滅秀麗新杆線蟲的速度與野生型PA14相同，這表明快速或慢速殺滅都不需要藻酸鹽。而且，PA14algDD4雙突變在快速和慢速殺滅試驗中與degP突變型具有相同的減弱的致病性表型，這表明degP有可能參與除了在藻酸鹽之外的其它毒力相關因子的調節。
除了以上數據之外，在快速殺滅試驗中，兩種其它的PA14突變型toxA和plcS同樣無法與野生型區分(表5)。因此，溶血磷脂酶C(由plcS編碼)和外毒素A(由toxA編碼)也不是快速殺滅所必須的。
吩嗪造成的快速殺滅過程正如在下文的材料和方法部分所詳細講述的，我們進行了一種篩選，以便分離PA14TnphoA轉座子插入突變型，該突變型在快速殺滅中是無效的。這導致了從篩選過的總共2400個菌株中鑑定到5個突變型(頻率為0.21％)，這些突變型表現出相對野生型PA14親代對照的減弱的快速殺滅表型。對這些以及若干其它PA14突變型進行的分析表明，由PA14實現的快速殺滅是多因素的，這些因素之一屬於總體上被稱為吩嗪的一類色素。
業已克隆並測定了獲自800bp IPGR產物的DNA序列，該產物位於所述突變型之一3E8的TnphoA插入片段的3』末端。對所述DNA序列的初步分析表明，突變型3E8在一個phzB-樣基因中形成一個TnphoA插入片段；緊接著TnphoA插入片段下遊的177bp的序列在核苷酸水平上表現出與phzB基因具有69％的同源性，phzB基因是參與密切相關的螢光假單胞菌菌株2-79(NRRLB-15132)中吩嗪生物合成的基因之一。銅綠假單胞菌也是一種吩嗪生產菌，並且由銅綠假單胞菌產生的鑑定得最清楚的吩嗪綠膿素業已被證實在動物致病中起著重要作用(Sorensen和Joseph(1993)銅綠假單胞菌感染中的吩嗪色素。參見作為機會病原體的銅綠假單胞菌，Campa，Bendenelli和Friedman著(紐約Plenum出版社)，pp.43-57)。重要的是，在快速殺滅方面減弱了的PA14突變型3E8在綠膿素生產方面也是缺陷的，僅能合成50％的野生型水平(表VI)。
表VI菌株 突變基因 綠膿素a殺滅蠕蟲％b(PA14比例)PA14野生型 1.00 87PA14phnAphnB phnAphnB 0.50 503E8 phzB-樣0.50 1034B12 不知道 0.03 5049H2 不知道 0.11 0a綠膿素定量基於在酸性溶液中，在520nm下測定的吸收值(OD520)，根據Essar等1990年披露的方法(具體參見第2章方法)改進而來。給出的值是在校正每毫升培養物的細胞數之後OD520讀數相對野生型PA14的比例；3次測定的平均值。b殺滅蠕蟲％是3次重複的平均值。快速殺滅條件詳細披露於所述方法中。
有關吩嗪參與快速殺滅過程的數據進一步來自對另外兩種PA14TnphoA突變型34B12和49H2的分析。在篩選PA14突變型中分離到的PA14 TnphoA突變型34B12所能產生的綠膿素僅為野生型水平的3％，它在植物致病性方面減弱，並且在快速殺滅方面明顯受損(表V)。突變型34B12能在PGS培養基上形成特有無色素菌落。能產生野生型水平的11％的綠膿素的TnphoA突變型49H2是通過以下事實鑑定的它也能在萵苣上產生無色素的菌落並表現出減弱的症狀。重要的是，49H2也能損害快速殺滅(表V)在接觸3E8、34B12、49H2和野生型PA14之後12小時死亡蠕蟲的平均百分比分別為10％、5％、0％和87％(表VI)。
為了進一步證實綠膿素(以及其它吩嗪)在快速殺滅中起著重要作用的結論，構建菌株PA14 phnAphnB，它具有一個插入共轉錄的phnA和phnB基因的重疊區的慶大黴素框。所述phnA和phnB基因編碼氨茴酸合酶的α和β亞基，這種酶是綠膿素合成所必需的(Essar(1990)細菌學雜誌172884-900)。PA14phnAphnB能產生中等水平的綠膿素，並且也表現出中等快速殺滅表型(表VI)。
最後，還了解到磷酸缺陷能引發銅綠假單胞菌的綠膿素合成，而高濃度的磷酸能抑制綠膿素的產生(Ingledew和Campbell(1969)加拿大微生物學雜誌15595-598)。因此，我們在有或沒有添加20mM磷酸(Pi)的PY瓊脂中試驗了PA14快速殺滅。在兩種培養基中PA14的生長速度沒有差別。與以前的報導一致，在含磷酸的培養基中產生較少的綠膿素，這相應於快速殺滅的減弱；在16HPE，生長在Pi-缺乏的培養基上的PA14的死亡率為62％，與此對應的是在含Pi的培養基上的PA14的死亡率為24％(圖13A和13B)。對快速殺滅的宿主反應對快速殺滅的抗性與對氧化脅迫的抗性相關我們業已用以前已知的對氧化脅迫有抗性或更易感的秀麗新杆線蟲突變體提供吩嗪是PA14介導的快速殺滅中的重要毒素的其它證據。諸如綠膿素和吩嗪-1-羧酸的某些吩嗪是氧化還原活性化合物。例如，在需氧條件下，綠膿素能自發進行一個電子的還原和以複合單價還原的形式將O2再氧化成·O2-(超氧陰離子)(Hassan和Fridovich(1990)細菌學雜誌1411556-163；Hassett等(1992)感染與免疫60328-336)。因此，在有合適的還原源的條件下，綠膿素能在宿主組織中產生連續流通的細胞毒性·O2-和H2O2。在有鐵載體-鐵複合物高鐵綠膿菌螯鐵蛋白的條件下，這種類型的活性氧(ROS)可進一步轉化成毒性大的羥基基團(Coffman等(1990)臨床研究雜誌861030-1037；Britigan等(1992)臨床研究雜誌902187-2196)。若干研究(Hassan和Fridovich(1980)細菌學雜誌1411556-163；Hassett等(1992)感染與免疫60328-336)但不是所有的研究(參見Baron等(1989)現代微生物學18223)業已表明，綠膿菌素通過其在靶細胞中誘導ROS形成的能力產生細胞毒性，與另一種超氧化物發生劑百草枯(甲基紫精)的細胞毒性作用屬於同類。
秀麗新杆線蟲的age-1(hx546)突變型因為其長的生命表型而首先得到鑑定(Johnson，1990，科學249908-912)，隨後證實其對H2O2有抗性，因為過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的產量提高(Larsen(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908905-8909；Vanfleteren(1993)生物化學雜誌292605-608)。業已鑑定了對甲基紫精高度敏感的突變型，其中包括mev-1和rad-8(Ishii等(1990)突變研究237165-171；Ishii等(1993)老化和發育機制681-10)。我們推測，如果銅綠假單胞菌快速殺滅是由綠膿素或其它氧化還原活性吩嗪介導的話，age-1突變型應當由於其對氧化脅迫耐受性的提高而具有抗性。如圖13A所示，age-1(hx546)對PA14的殺滅力的耐受性明顯高於其親代N2菌株。相反，甲基紫精敏感突變型mev-1(kn-1)和rad-8(mn163)對PA14殺滅高度敏感(圖13B)。以上結果證實，對銅綠假單胞菌的殺滅敏感的線蟲與抗產ROS化合物的線蟲高度相關。快速殺滅試驗結果的概述銅綠假單胞菌具有給人以深刻印象的宿主範圍，並且在單一的宿主內，它可以根據所感染的組織導致多種疾病。在人類中，銅綠假單胞菌可以感染燒傷或手術創口，尿道，胃腸道，呼吸道，眼，耳和腦膜(Baltch和Smith(1994)銅綠假單胞菌感染和治療。紐約MarcelDekker公司)。要在任何特定組織中表現疾病，需要許多不同的毒力決定子，不過不同組織類型之間的毒力因子的類型可以不同。例如，溶血磷脂酶C是導致燒傷的小鼠死亡的一個重要毒力因子(Rahme等(1995)科學2681899-1902)，但並不是小鼠中角膜感染所必需的(Preston等(1995)感染與免疫633497-3501)。分析不同的細菌突變體，表明銅綠假單胞菌對秀麗新杆線蟲的殺滅也是多因素的。快速殺滅所需因子的表達似乎是由鐵、碳源、溫度和滲透壓調控的。
對於快速殺滅來說，上述數據表明，至少某些毒力決定子是熱穩定性的可擴散毒素。不過，通過試驗PA14的同基因toxA、plcS和algD突變型，證實了兩種已知毒素溶血磷脂酶C和外毒素A以及胞外多糖藻酸鹽在快速殺滅條件下並不是殺滅蠕蟲所必需的。另外，由於證實了lasR上攜帶突變的菌株在快速殺滅條件下仍然具有充分的毒力(所述基因是胞外毒力表達的重要轉錄調節子)，這表明鹼性蛋白酶(Jambello等(1993)感染與免疫611180-4)，溶葡萄球菌蛋白酶(Toder等(1991)分子微生物學52003-10)和彈性蛋白酶(Jambello和Iglewski(1991)細菌學雜誌1733000-9)對於快速殺滅來說也不是必需的，以上酶是由lasR正調控的。另外，已證實通過在65℃下加熱60分鐘，使用氯仿，或通過UV輻射都不能使所述毒力因子失活，這表明與小的非蛋白類分子相關。吩嗪參與快速殺滅的證據上述結果表明，參與快速殺滅的毒素之一是吩嗪。所述結果如下。
PA14突變體影響綠膿素產生。分析在快速殺滅方面減弱了的突變型之一菌株3E8，證實在phzB-樣基因的中間插入了一個TnphoA。所述phzB基因被認為編碼一種在銅綠假單胞菌菌株2-79中參與吩嗪生物合成的酶。與此一致，我們證實了在菌株3E8的phzB-樣基因中插入TnphoA會導致綠膿素產量降低50％，綠膿素是在銅綠假單胞菌中鑑定得最清楚的吩嗪。類似地，將TnphoA插入菌株34B12上的一個不連鎖的基因上，可同時導致快速殺滅的減弱，和綠膿素產量的明顯降低。還在菌株49H2上證實了綠膿素缺陷和快速殺滅減弱之間的關係；不過，尚未排除在49H2上發生的突變是與34B12或3E8中的突變等位的可能性。
磷酸鹽影響綠膿素生產和快速殺滅。除了證實生長培養基中的高濃度磷酸鹽可抑制綠膿素產生之外，還證實了在含磷酸鹽的培養基中快速殺滅相對磷酸鹽限制培養基的減弱。
毒素的熱穩定性。快速殺滅所需要的可擴散化合物是熱穩定的並且不能被氯仿或UV失活這一事實與所述毒素是一種吩嗪成分或具有一種吩嗪成分的結論一致。吩嗪是耐熱的(Dakhama等(1993)應用藻類學雜誌5297-306)。
秀麗新杆線蟲突變型。綠膿素被認為能通過誘導超氧化物的產生而導致細胞毒性(Hassan和Fridovich(1980)細菌學雜誌1411556-163；Hassett等(1992)感染與免疫60328-336)。如上文所述，蠕蟲突變型age-1(hx546)對超氧化物發生劑百草枯的抗性更強，同樣它對由PA14導致的快速殺滅的抗性也更強。相反，在不連鎖的秀麗新杆線蟲基因mev-1(kn-1)或rad-8(mn163)上發生的突變會導致對百草枯的敏感性加強(Ishii等(1990)突變研究237165-171；Ishii等(1993)老化和發育的機制681-10)，並能增強PA14快速殺滅。除綠膿素之外的吩嗪在快速殺滅中的作用總而言之，以上歸納的結果提供了令人信服的證據，即至少一種吩嗪綠膿素在快速殺滅中起著重要作用。不過，綠膿素是在銅綠假單胞菌中吩嗪生物合成的最終產物(Byng等(1979)細菌學雜誌138846-852)。除了綠膿素之外，由銅綠假單胞菌產生的其它吩嗪有氧氯菌素、吩嗪-1-羧酸、氯菌素、1-羥基吩嗪、和膿玉紅素(或銅綠菌素A和B)(Turner和Messenger(1986)微生物生理學進展27211-273)。業已報導多種銅綠假單胞菌的菌株能產生一種以上的吩嗪(Byng等(1979)細菌學雜誌138846-852)，並且所產生的相對數量受生長條件的影響(Chang和Blackwood(1969)加拿大細菌學雜誌15439-444)。由於在上述所有試驗中都未能測定由PA14產生的其它吩嗪和其數量，其它吩嗪獨立或與綠膿素一起參與蠕蟲殺滅是可能的。另外，對綠膿素的所有測定都是在KA培養基中進行的，但用於殺滅蠕蟲的培養基是PGS。由於所產生的綠膿素和其它吩嗪的數量是受多種因素影響的，培養基的變化有可能導致以上結果。
對於秀麗新杆線蟲來說其它吩嗪可能也是重要的。首先，如上文所述，除了綠膿素之外銅綠假單胞菌能產生其它吩嗪。前面已經證實，在快速殺滅條件下，銅綠假單胞菌菌株PAO1的毒力顯著低於PA14，但它所產生的綠膿素和膿玉紅素的量與PA14類似。由於已知銅綠假單胞菌能產生幾種其它吩嗪，如吩嗪-1羧酸和1-羥基吩嗪，PA01的減弱了的毒性可能是由於缺少或具有較少量的其它吩嗪。另外，證實螢光假單胞菌菌株2-79和WCS365能殺滅秀麗新杆線蟲，但這些菌株不能產生綠膿素。這些菌株是抗鐮孢屬枯萎病和小麥全蝕病(分別由尖鐮孢(S.oxysporum F.sp.lini)和禾頂囊鞘小麥變種(Gaeumannomyces graminis var.tritici))的有效生物控制劑。螢光假單胞菌菌株2-79作為生物控制劑的效果是由於所述吩嗪抗生素吩嗪-1羧酸(Thomashaw和Weller(1988)細菌學雜誌1703499-3508)，它是由銅綠假單胞菌產生的吩嗪之一。有趣的是，吩嗪-1羧酸與綠膿素一樣也具有氧化還原循環能力(Turner和Messenger(1986)微生物生理學進展27211-273)，並因此可能對於針對秀麗新杆線蟲的細胞毒性有重要作用。
秀麗新杆線蟲和細菌之間的相互作用是拮抗型的。由於秀麗新杆線蟲使用細菌作為食物，某些細菌種進化出保護自身免受該捕食者捕食的機制並不令人吃驚。上述結果表明，一般來講吩嗪，具體地講綠膿素是被銅綠假單胞菌用於對付秀麗新杆線蟲的某些可擴散的毒素。吩嗪作為化學武器的形成可能進化的更早一些，以便對付其它微生物和對付諸如變形蟲的原生動物。綠膿素的抗微生物作用可能還有助於消除其天然環境中的競爭性微生物(Hassan和Fridovich(1980)細菌學雜誌1411556-163)。由產生吩嗪所獲得的選擇性優勢是如此之大，以至於在某些種中以犧牲生長為代價而得以保持。例如，與其非生產突變型相比，生產吩嗪的吩嗪假單胞菌能形成較小的菌落和較低的最大細胞密度(但不具有較低的生長速度)。另外，在營養限制環境中，非生產突變型與其生產親本相比具有更大的存活率。而且，當它們生長在一起時，所述生產親本競爭不過其非生產突變型(Messenger和Turner(1981)社會遺傳微生物學季刊82263-264)，並且推而廣之，也競爭不過其它種的其它非生產競爭者。使用能產生綠膿素和其它吩嗪的銅綠假單胞菌菌株所作的若干研究證實了吞食了所述細菌的變形蟲要麼包囊化要麼死亡。在某些情況下，所述吩嗪細菌不被吞食(Singh(1945)不列顛試驗病理學雜誌46316-325；Groscop和Brent(1964)加拿大微生物學雜誌10579-584)。通過本文所披露的結果，即殺線蟲作用需要吩嗪還表明由螢光假單胞菌和銅綠假單胞菌所產生的吩嗪可能有助於抗細菌採食線蟲的存活。有可能一種次級代謝物最初是為了對付簡單的真核生物生存而發明的，隨後支配著進化過程，以保護銅綠假單胞菌免受諸如秀麗新杆線蟲的細菌採食線蟲的侵害並在哺乳動物感染期間避免吞食細胞的侵害。事實上綠膿素缺陷突變型49H2、34B12和3E8在小鼠燒傷感染模型中的致病性也被減弱。材料和方法菌株和質粒。所使用的細菌菌株和質粒列於表VII
表VII菌株或質粒相關特徵 來源或參考文獻銅綠假單胞菌PA14 Rifr野生型Rahme等，1995PAO1-R野生型 Rahme等，1995PAO1-G野生型 J.GoldbergPAO1-V野生型 M.PrestonPAO1-I野生型 M.PrestonPAO1-J野生型 K.JargerPAK 野生型 S.LoryPA29 野生型 Rahme等，1995PO37 野生型 Stevens等，1994PA14toxA PA14的GmrtoxA插入突變型 Rahme等，1995PA14plcS PA14的GmrplcS插入突變型 Rahme等，1995PA14gacA PA14的GmrgacA插入突變型 Rahme等，1995PA14degP PA14的GmrdegP插入突變型 本研究PA14algDΔ4 PA14的algD框內缺陷突變型 本研究PA14degPalgDΔ4 PA14的algD框內缺失和degP 本研究插入雙突變型PA14phnAphnB Kmr，PA14的氨茴酸合酶突變 L.Rahme螢光假單胞菌 型2-79(NRRL E.SchottB15132) Phz+野生型55E.SchottWCS365野生型 G.O』Toole丁香假單胞菌斑生致野生型 Davis等，1991病變種ES4326 Smr野生型線蟲菌株和培養條件。在以大腸桿菌OP50作為食物來源的NG瓊脂上保持並處理菌株(Sulston和Hodgkin(1988)方法。參見線蟲秀麗新杆線蟲，Wood著(冷泉港，紐約冷泉港實驗室)，pp.587-606；Lewis和Fleming(1995)基本培養方法。參見秀麗新杆線蟲生物的現代生物學分析，48卷，Epstein和Shakes著(聖地牙哥，加州學術出版社)，pp.4-31)。遺傳命名按照由Horvitz等所披露的原則進行(分子和普通遺傳學175129-133，1979)。本發明所使用的Bristol線蟲株系包括野生型株系N2(Brenner(1974)遺傳學7771-94)和以下株系TJ1052，age-1(hx546)II；TK22，mev-1(kn1)III；PH13，rad-8(mn163)I。以上株系是由Caenolhabditis遺傳學中心提供的。
培養基和抗生素。用於細菌培養和保持的完全培養基有Luria培養液(LB)和King’s培養液(KB)(King等(1954)實驗室臨床醫學雜誌44301-307；Miller，1972，分子遺傳學實驗(冷泉港，紐約冷泉港實驗室))，而基本培養基是M9(Miller(1972)分子遺傳學實驗(冷泉港，紐約冷泉港實驗室))。假單胞菌分離瓊脂(PIA)獲自Difco。所述NGM培養基是由Sulston和Hodgkin披露的(1988，線蟲秀麗新杆線蟲方法，Wood著(冷泉港，紐約冷泉港實驗室)，pp.587-606)。除非另有說明，蛋白腖-山梨醇(PGS)是用於快速殺滅的培養基；它包括1％的細菌用蛋白腖(Difco)，1％氯化鈉，1％的葡萄糖，0.15M山梨醇(Fischer Scientific)和1.7％的細菌用瓊脂(Difco)。用於銅綠假單胞菌PA14的抗生素濃度為利福平100μg/ml，新黴素200μg/ml，和羧苄青黴素300μg/ml。
線蟲殺滅試驗。在平板試驗中進行銅綠假單胞菌殺滅蠕蟲。對於快速殺滅試驗來說，將5μl PA14或試驗菌株的過夜King’s B(King等(1954)實驗室臨床醫學雜誌301-307)培養物展開在含有PGS或PG瓊脂的3.5cm直徑的平板上。在37℃下培養24小時之後，在所述平板的中央長出大約2cm直徑的菌苔。冷卻至室溫(在從37℃的培養箱中取出之後4-12小時)，然後將40個蠕蟲加入所述瓊脂中。除非另有說明，所有蠕蟲菌株是在20℃下培養的，並使用第四幼蟲(L4)期。每個菌株進行3-4次重複的實驗。將Bristol N2用作野生型菌株，並將大腸桿菌OP50用作負對照。在25℃培養接種了蠕蟲的平板。在各個時間點上統計蠕蟲的死亡率。在用睫毛針輕輕觸動蠕蟲時不再有可檢測的運動，即視為死亡。大體上按上述方法進行慢速殺滅試驗。影響殺滅的因素。
A.滲透壓的影響。將PA14的過夜培養物鋪平板於含有蛋白腖-葡萄糖(PG)培養基的瓊脂平板上或含有添加了0.1M和0.15M山梨醇(Fisher)的高滲透壓PG培養基上。
B.鐵的影響。對於鐵限制條件來說，將400μM EDDA(Ankenbauer等(1986)細菌學雜誌1677-11)添加到PGS中，以便螯合仍然可以利用的游離鐵，而在含鐵條件下將100μM的三氯化鐵(Meyer等(1996)感染與免疫64518-523)作為鐵添加劑添加。用PGS作為對照進行試驗。
C.生長溫度的影響。將PA14的過夜培養物鋪平板於PGS瓊脂上，並在20、25、30和37℃下生長36小時，在接種蠕蟲之後將所有平板放置在25℃下。
D.碳源的影響。PGS含有1％葡萄糖(v/v)。僅僅用1％(v/v)的甘油取代該培養基中的葡萄糖成分，以形成蛋白腖-甘油-山梨醇瓊脂(PYS)。
篩選在快速殺滅中無效的PA14TnphoA突變型。在大腸桿菌菌株SM101pri中用寬宿主範圍羧苄青黴素抗性(Cbr)自殺載體pRT733(Taylor(1989)細菌學雜誌1711870-1878)製備兩個獨立的PA14TnphoA突變型文庫，所述載體攜帶TnphoA(它能產生新黴素抗性，Nmr)。利用該菌株將TnphoA轉移到PA14中。在KB培養基上進行接合(King等(1954)實驗室臨床醫學雜誌301-307)，得到高於LB培養基的轉接合頻率。為了試驗候選突變型，使用類似於快速殺滅試驗的條件，但以下不同。將單一的PA14TnphoA突變型克隆鋪平板，並向每一個平板上添加5隻L4蠕蟲。將野生型PA14用作正對照。在24小時之後仍然含有3-5個存活蠕蟲的突變型被確定為推測的減弱突變型，並進行上文所述的快速殺滅試驗。選擇一致地得到明顯低於野生型親代PA14的殺滅力的突變株用於進一步的鑑定。線蟲快速殺滅試驗的使用線蟲快速殺滅試驗與慢速殺滅試驗一樣被用於鑑定導致疾病的微生物毒力因子。另外，所述試驗可用於鑑定能夠抑制致病性或增強生物對病原體的抵抗能力的治療劑。在優選實施方案中，快速殺滅試驗是用一種對諸如秋水仙素的毒素的化合物具有較大滲透性的線蟲菌株進行的。具有這種增強的滲透性的線蟲的例子包括，但不限於在P-糖蛋白上具有突變的動物，例如PGP-1，PGP-3或MRP-1。所述突變型線蟲可用於快速殺滅試驗，因為其具有對毒素的較高的敏感性，這種敏感性是由於膜滲透性的提高所致。這一特點會導致一種在對毒性化合物的完全易感性和完全抗性之間的差別提高的試驗。
在一種工作實施例中，利用一種F2誘變篩選鑑定在秀麗新杆線蟲基因中的突變，該突變能產生對快速殺滅的抗性。通過篩選大約5000個單倍體基因組鑑定了6個突變型。所述突變體不僅可用於提供有關快速殺滅的機制的信息，還可用於提供有關秀麗新杆線蟲免疫的信息。
用於鑑定致病性毒力因子的其它宿主蠟螟(Greater Wax Moth)我們業已發現蠟螟(Greater Wax Moth)的幼蟲也可用於鑑定代表性生物銅綠假單胞菌和尖鐮孢的致病毒力因子，用於單獨使用或與上述篩選試驗的任一種組合進行。銅綠假單胞菌為了測定銅綠假單胞菌在蠟螟上的致病性，按如下方法將細菌注射到蠟螟幼蟲體內，讓銅綠假單胞菌的培養物在KB培養基(King等(1954)實驗室臨床醫學雜誌301-307)上生長過夜。然後以1100的比例將該培養物稀釋在相同培養基中，並培養。在生長2小時之後，通過離心收集培養物，並將細胞重新懸浮在等體積的10mM硫酸鎂中。然後將每一種培養物稀釋到OD600為0.1(大約108細胞/ml)。用Hamilton注射器將5μl體積的一系列10倍稀釋液(100-10-6)注射到蠟螟的腹部側足之一中(Lysenko(1963)昆蟲病理學雜誌578-82)。通過按照標準方法鋪平板測定細菌數。蠟螟幼蟲購自Van derHorst Wholesale，St.May’s，OH。
在注射細菌之後，將蠟螟幼蟲放置在培養皿中並在25℃下培養。48小時之後通過監測每一個幼蟲的顏色變化(由白變黑)，並通過確定幼蟲活動性目測確定殺滅率。每一個不運動的黑色幼蟲被統計為死亡。48小時之後仍然活著的幼蟲一般不會死亡，即使延長試驗時間也是如此。
為了測定LD50，用一系列細菌稀釋液注射10條幼蟲。測定幼蟲死亡數，並將測得的數據繪製在一條曲線上(殺滅幼蟲百分比與注射的細菌數量)。用Systat 5.2版電腦程式將所述數據代入下列形式的曲線殺滅百分比＝A+(1-A)/(1+exp(B-G×log(細菌數量)))，其中A是採用對照注射的幼蟲死亡分數，而B和G是為了適應所述曲線而變化的參數(Systat 5.2版，用於Macintosh計算機，Systat公司，1992，Evanston，Illinois)。使用該程序利用計算機計算的推導最佳適合度確定B和G，然後用以下公式計算LD50LD50＝exp(B/G)×(1-2×A)^(1/G)。
我們業已將突變型銅綠假單胞菌(是用上述植物和線蟲篩選分離的，或者是用預先克隆的基因構建的)注射到蠟螟幼蟲體內，並計算了LD50值。所述實驗的結果在表VIII(見下文)中給出，該表比較了蠟螟中的LD50值，以及兩種不同的細菌濃度對小鼠的殺滅百分比。
表VIII銅綠假單胞菌在蠟螟中的LD50PA14菌株蠟螟中的LD50在所述劑量下的小鼠死亡率％突變型來源5×1035×105PA141 53 100野生型41A51 NT1100秀麗新杆線蟲41C11 NT 85 秀麗新杆線蟲35A91 NT 55 秀麗新杆線蟲16G12 2 20 100植物篩選34H42 0 33 植物篩選toxA2 40 NT 構建34B12 3 0 56 植物篩選lasR4 NT 50 秀麗新杆線蟲49H28 NT 50 秀麗新杆線蟲3E8 10 NT 6 秀麗新杆線蟲25A12 10 11 87 植物篩選degP10 0 63 構建35H710 NT NT 秀麗新杆線蟲36A420 NT NT 秀麗新杆線蟲ID7(gacA) 20 0 50 植物篩選23A230 NT NT 秀麗新杆線蟲33A940 0 0 植物篩選13C980 NT NT 秀麗新杆線蟲gacA100 0 50 秀麗新杆線蟲44B1500 NT 70 秀麗新杆線蟲50E12 600 NT NT 植物篩選33C72,000 0 0 植物篩選25F12,000 0 20 植物篩選dsbA6,000 0 62 植物篩選pho23 50,000 0 10 植物篩選1NT-未測定表VIII中所示的結果揭示了在較高的蠟螟LD50和小鼠模型系統的較低殺滅力方面存在著明顯相關性。
觀察到的銅綠假單胞菌在蠟螟和小鼠上的毒力之間的統計學相關性表明，通過篩選在蠟螟中具有減弱的LD50的細菌分離物可以鑑定哺乳動物毒力決定子，這種篩選可以由銅綠假單胞菌擴展到包括其它在昆蟲和哺乳動物中有毒性的病原體。兩種可能的候選病原體是沙雷氏菌屬和變形桿菌屬的細菌，它們不僅是醫院感染的重要原因，而且還是蠟螟的高效病原體(Chadwick(1967)FederationProceedints261675-1679)。在粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的臨床提取物中，在對人上皮細胞粘附的降低和在蠟螟中的LD50提高之間存在著相關(Chadwick等(1990)非脊椎動物病理學雜誌55133-134)。
與上文所述的線蟲和植物篩選系統相似，可將蠟螟幼蟲篩選系統用於鑑定銅綠假單胞菌的毒力因子，該因子是感染哺乳動物所必需的。在一種工作實施例中，用上述注射方法鑑定了在蠟螟中具有減弱的毒力的銅綠假單胞菌突變型分離物。按照標準方法製備了具有減弱的毒力的突變型細菌的文庫，然後將突變型分離物的培養物稀釋到在5μl體積中含有100-1000個細菌。然後將該體積的細菌注射到蠟螟幼蟲體內。如果特定突變型分離物在該濃度下不能殺滅蠟螟，再進行其它注射，以確定所述突變型菌株蠟螟中的LD50。在所述昆蟲模型系統中具有減弱的毒力的細菌分離物被用作進一步研究的候選物，以便鑑定銅綠假單胞菌的哺乳動物毒力因子。
還可將蠟蛾篩選系統用於其它能感染昆蟲和哺乳動物的病原體。例如，在蠟螟中測定一種特定病原體的野生形式的LD50。然後將該病原體的誘變分離物以明顯高於其野生型分離物的LD50的濃度注射。在較高劑量下不能殺滅的突變型是鑑定病原體毒力因子的候選者。尖鐮孢將蠟螟幼蟲用作銅綠假單胞菌感染模型的成功促使我們又試驗了真菌尖鐮孢在該系統中的感染性。
按如下方法測定尖鐮孢在蠟螟上的致病性。將單一的尖鐮孢孢子用於按照標準方法在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上(Difco)上開始尖鐮孢的培養。用2ml Armstrong鐮孢屬培養基(Armstrong和Armstrong(1948)植物病理學38808-826)洗滌所述平板的表面，並將這2ml培養基與25ml其它相同培養基一起加入小的燒瓶中。在室溫下培養2天之後，形成了尖鐮孢的渾濁孢子培養物，並將其用於注射實驗。在離心機中沉澱該孢子培養物的樣品，然後將孢子重新懸浮在含有5mg/ml羧苄青黴素的10mM硫酸鎂中。添加羧苄青黴素是為了使蠟螟在感染尖鐮孢之前因為細菌感染而死亡。用相同培養基製備所述孢子培養物的10倍系列稀釋液，並用Hamilton注射器將該稀釋液的5μl樣品(100，10-1，10-2，和10-3)注射到蠟螟體內。用標準方法測定每一種稀釋液中的孢子數，例如，通過將所述稀釋液系列的一個等分試樣鋪平板於Armstrong鐮孢屬培養基上，並統計萌發孢子的數量。作為對照，將含有5mg/ml羧苄青黴素的10mM硫酸鎂同樣注射到另一組幼蟲體內。將注射的幼蟲放置在培養皿中(每個培養皿10條)。在25℃下放置7天之後，統計死亡幼蟲。死亡的幼蟲其顏色變黑，並且通常具有模糊的白色真菌包衣。
通過用Systat程序將幼蟲殺滅數據的曲線代入上述公式計算尖鐮孢在蠟螟中的LD50。將兩個獨立注射實驗的結果示於下面的表IX中，並將典型的殺滅曲線示於圖14中。將所述Systat電腦程式用於使一個曲線適合所述數據點，如上文所述(其中b＝4.51，g＝1.11)，並計算得到尖鐮孢在蠟螟中的LD50為60個孢子。
表IX注射的孢子數殺滅幼蟲(佔20條中的比例)170020(100％)170 13(650％)17 2(10％)1.7 1(5％)0 0(0％)180020(100％)180 18(90％)18 6(30％)1.8 2(10％)0 0(0％)在以上實驗中所測定的尖鐮孢在蠟螟中的LD50(大約為60個孢子)表明，該系統可用於為了鑑定尖鐮孢毒力因子而設計的篩選中。在一種工作實施例中，通過用標準方法進行的限制酶介導的整合(REMI)誘變尖鐮孢(Kuspa和Loomis(1994)遺傳學138665-674；Tang等(1992)分子微生物學61663-1671，1992；Lu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9112649-12653，1994；和Bolker(1995)分子基因遺傳學248547-552)。然後通過注射到蠟螟幼蟲體內篩選用上述方式誘變的真菌文庫的減弱的毒力，並按照標準方法鑑定影響毒力的真菌基因，例如通過用插入的DNA進行反向PCR，然後再對相鄰的真菌DNA進行測序。然後試驗在蠟螟中具有減弱的毒力的尖鐮孢在植物和高等動物中的減弱的毒力，並鑑定共同的毒力因子。用蠟螟作為篩選系統可以較快速地並且花費較少地鑑定重要的真菌毒力因子。蠟螟篩選系統的優點將蠟螟用作鑑定銅綠假單胞菌、尖鐮孢、和其它病原體的哺乳動物毒力因子的宿主系統是有利的，如上文所述，該系統所具有的一個重要優點是可以快速並低投入地篩選出突變型病原體分離物。在各種實驗中，每小時為多達250個蠟螟注射銅綠假單胞菌樣品。這種快速處理使得有可能在較短時間內實驗大量的突變型病原體。另外，還有可能用蠟螟測定一種病原體的LD50。這種測定有利於評價不同病原體分離物的相對毒力。在另一個優點中，銅綠假單胞菌對小鼠的殺滅表現出在蠟螟中與毒力的相關性好於使用過的其它模型生物。因此，用該系統篩選病原體突變體很有可能鑑定哺乳動物(例如人)毒力決定子。最後，使用蠟螟有可能鑑定不存在於其它多宿主篩選中的毒力因子。
菜蛾(Plutella xylostella)我們業已發現菜蛾的幼蟲可用於鑑定銅綠假單胞菌的致病性毒力因子。
利用幼蟲芥菜綠色採食試驗測定銅綠假單胞菌對菜蛾的致病性。按如下方法用由銅綠假單胞菌滲透過的芥菜葉餵飼菜蛾幼蟲。在King’s B培養基(King等(1954)實驗室臨床醫學雜誌301-307)中培養銅綠假單胞菌。在離心機中沉澱過夜培養物，然後用10mM硫酸鎂洗滌2次，然後將細胞重新懸浮在10mM硫酸鎂中，並稀釋至OD600為0.1。按照標準方法將菜蛾幼蟲保持在半合成小麥胚乳基食物上(Shelton等(1991)環境科學雜誌2617-26)。
將綠色芥菜(獲自劍橋天然食品，劍橋MA)切成大約10cm2的碎片，並浸泡在含有銅綠假單胞菌的10mM硫酸鎂中。將浸泡過的葉片放在真空下，並突然解除真空，以使細菌溶液滲透到葉片中。作為對照，僅用10mM硫酸鎂滲透葉片。在培養皿中將滲透過的葉片材料與20個菜蛾幼蟲一起在23℃下培養，讓這些幼蟲自由採食。48小時後統計死亡的幼蟲。在用移液管頭觸動之後不再活動的幼蟲被統計為死亡。
野生型銅綠假單胞菌菌株PA14和PA01導致的死亡率接近100％殺滅菜蛾幼蟲。不過，PA14的三種突變型分離物表現出大大減弱了的殺滅力。這些結果表明(1)銅綠假單胞菌在由昆蟲幼蟲攝取之後是殺滅性的，(2)在該模型系統中銅綠假單胞菌菌株PA14的突變型分離物具有減弱的毒力。在下面的表X中給出了以上結果的總結(將下文)。
表X菌株N 48小時死亡幼蟲數PA1480 79(99％)PAO180 76(95％)PA14 dsbA 40 10(25％)PA14 pho23 40 3(8％)PA14 lasR 40 8(20％)MgSO4對照 80 2(3％)黑尾果蠅在另一種實施方案中，我們業已發現黑尾果蠅可用於評價銅綠假單胞菌的致病性。
用以下腹部穿刺試驗測定銅綠假單胞菌在黑尾果蠅上的致病性。在標準條件下在玉米粉培養基上培養黑尾果蠅原種OregonR或標記株黃白(yw)株。之所以試驗兩種不同的遺傳背景，是因為業已證實某些株系對細菌攻擊更敏感(Lemaitre等(1996)細胞86973-983)。讓銅綠假單胞菌菌株PA14和對照大腸桿菌DH5α的培養物在King’s B培養基(King等(1954)實驗室臨床醫學雜誌301-307)中生長過夜。在培養過夜之後，以1/10的比例稀釋所述細胞，並再生長4-5小時。然後將所述細胞洗滌2次，重新懸浮在蒸餾水中，並用於以以下4種濃度進行腹部穿刺未稀釋，稀釋1/10，濃縮10倍，以及濃縮100倍。
用浸泡在不同濃度的PA14或DH5α中的細針穿刺麻醉過的成體果蠅的腹部，進行細菌接種。在細菌接種之後，將果蠅放置在28℃下，並通過運動的缺乏監測果蠅的死亡。用每一種濃度的細菌試驗18-20隻果蠅，並計算果蠅死亡的平均值和標準誤。我們發現PA14能以劑量依賴方式有效殺滅黑尾果蠅成體。在用對照DH5α菌株進行的試驗中觀察到了較小的殺滅力。用OrR菌株進行的所述試驗的結果歸納於圖15中。在yw遺傳背景中觀察到了類似結果。
如上文所述，在涉及通過簡單的針頭穿刺將銅綠假單胞菌導入成體果蠅的腹部的試驗中，發現銅綠假單胞菌能有效殺滅黑尾果蠅。用於導入特定量的銅綠假單胞菌的其它方法包括，但不限於直接注射和攝食(例如，通過將銅綠假單胞菌添加到果蠅生長培養基中)。如果需要，可將果蠅幼蟲用於致病試驗。
使用黑尾果蠅的一個優點是，可以用該模型生物適應的多種分子和遺傳方法研究細菌致病性。黑尾果蠅是用於研究天然免疫反應的良好模型，並且參與該反應的很多基因業已由這種昆蟲中得到克隆(Hoffmann(1995)現代生物學74-10)。以上基因上的突變可用於與細菌毒力因子上的突變進行組合，以便提供有關這些毒力因子作用模式的有價值的信息，所述細菌毒力因子是從各種銅綠假單胞菌的宿主篩選中分離得到的。
用於鑑定治療劑或植物保護劑的篩選系統如上文所述，我們的試驗結果證實一類銅綠假單胞菌毒力因子參與了在三種不同宿主中的致病性，並且這些共同的毒力因子構成了細菌致病性的基本特徵，即其致病性是不依賴於宿主的。根據這一發現，我們業已開發了一種用於鑑定治療化合物的(例如，抗致病性藥物)方法，所述化合物可用於抑制能獨立地感染動物(例如，人類患者)或植物(例如，商品作物)的病原體。一般，所述方法涉及通過使用本文所披露的多宿主動物/植物病原體(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)系統篩選任意數量的化合物，以便用作治療上的或農業上的活性劑。根據我們的結論，即在植物、小鼠和線蟲上存在共同的致病毒力因子，容易理解的是，能影響這種毒力因子在線蟲中的功能的化合物同樣可以作為哺乳動物(例如，人類患者)或植物的有效治療劑。儘管目前用於醫學或農業上的大部分抗生素是殺菌的或抑菌的，因此有利於能抗這些抗生素的菌株或突變型，在本文所披露的篩選方法中(例如線蟲系統)鑑定的化合物不能殺滅細菌，但能使其無致病性。而且，由於本發明的篩選方法是在體內進行的，所鑑定的化合物也不可能對真核宿主生物具有很高的毒性。
因此，本發明的方法簡化了諸如用於治療病原體疾病的藥物和植物保護劑的活性劑的評價、鑑定、和開發，所述病原體疾病包括由細菌、真菌、病毒、環節動物、線蟲、扁蟲動物、和原蟲引起的疾病。一般，本發明的篩選方法提供了從大的群體中篩選感興趣的天然產物提取物或化合物的簡便方法，還可對其作進一步的評價並濃縮成活性較少的選擇性材料。然後對該材料來源的成分進行純化，並在本發明的方法中進行評價，以測定其抗致病活性。
下面我們將披露評價作為抗致病劑的化合物的效力的方法。這些實施例是用於說明目的的，而不是限定本發明的範圍。試驗提取物和化合物一般，新型抗病原體藥物或植物保護劑是按照本領域公知的方法從天然產物或合成(或半合成)提取物的大型文庫或化學文庫中鑑定的。藥物發現和開發領域的技術人員可以理解，試驗提取物或化合物的確切來源對於本發明的篩選方法來說不是至關重要的。因此，實際上可以用本文所披露的方法篩選任意數量的化學提取物或化合物。所述提取物或化合物的例子包括，但不限於植物、真菌、原核生物或動物提取物，發酵液或合成化合物，以及現有化合物的修飾物。還存在多種用於任意數量化合物的隨機或定向合成的(例如，半合成或全合成的眾多方法，所述化合物包括，但不限於糖、脂、肽、和核酸基化合物。合成的化合物文庫可以從Brandon Associate(Merrimack，NH)和Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)購買。另外，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物的文庫可以從包括Biotics(Sussex，UK)，Xenova(Slough，UK)，Harbor BranchOceangraphics Institute(Ft.Pierc，FL)和PharmaMar，U.S.A.(劍橋，MA)在內的多個來源購買。另外，如果必要，用本領域已知方法，例如用標準提取和分離方法生產天然和合成產生的文庫。而且，如果需要，可以用標準化學、物理、或生物化學方法對任何文庫或化合物方便地進行修飾。
另外，藥物發現和開發領域的技術人員很容易理解的是，如果可能的話應當使用對已知其抗病原體活性的材料進行脫複製(例如，分類學脫複製、生物學脫複製、和化學脫複製，或其任意組合)或消除複製或重複的方法。
當發現一種粗製提取物具有抗致病活性時，有必要對正導向提取物作進一步的分離，以便提取決定所觀察的作用的化學成分。因此，所述提取、分離和純化方法的目的是在具有抗病原體活性的粗製提取物中仔細鑑定並確認一種化學實體。分離並純化所述異源提取物的方法在本領域中是公知的。如果必要，可以按照本領域公知方法化學修飾被證實為可用於治療致病性的試劑的化合物。
以下是用於評價一種分子或化合物改善對病原體的抗性或抑制病原體的效力的高流通量系統的實施例。這些實施例是用於說明目的的，而不是限定本發明。線蟲生物試驗系統為了能夠以有效和系統的方式大規模篩選大量的天然產物、提取物、或化合物，在微量滴定板的孔中培養秀麗新杆線蟲L4兩性幼蟲，進行半自動化控制和全自動化數據採集。如上文所述，我們業已發現銅綠假單胞菌UCBPP-PA14能感染並殺滅秀麗新杆線蟲，而銅綠假單胞菌UCBPP-PA14所攜帶的誘變過的毒力基因是非致病性的。如果一種病原體具有較小的致病性，則L4蠕蟲可以存活，發育成成體兩性幼蟲，並產生數以千計的活的後代。因此，如果秀麗新杆線蟲與所述病原體一起培養，所述蠕蟲將會死亡，除非存在一種能減弱銅綠假單胞菌的致病性的化合物。這種活的後代的存在便於用多種方法監測，包括用標準顯微鏡進行目測篩選。
為了評價一種試驗化合物或提取物改善宿主對一種病原體的抗性或者抑制一種病原體的致病性的能力，以合適劑量將試驗化合物或提取物接種到接種有合適數量的諸如銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的病原體的過夜培養物的NGM瓊脂上。如果必要，可以接種各種濃度的試驗化合物或提取物，以測定作用於宿主和病原體上的劑量效應。對照孔接種非致病性細菌(負對照)或在缺少試驗化合物或提取物的條件下接種病原體(正對照)，然後在37℃下將平板培養24小時，以便於所述病原體生長。然後將微量滴定板冷卻到25℃，並將兩個秀麗新杆線蟲L4兩性幼蟲添加到所述平板上，並在25℃下培養，該溫度是秀麗新杆線蟲的正常生理完整性的上限。以合適的時間間隔，例如4-5天，檢查孔中的存活後代，例如通過用活動監測儀監測蠕蟲的活動。
利用處理和對照幼蟲之間的比較研究測定試驗分子或化合物在改善宿主對所述病原體的抗性或抑制該病原體的毒力方面的相對效力。能夠有效刺激、加強、提高、增強、或改善宿主對所述病原體的抗性或抑制、滅活、阻止、遏制、或控制所述病原體的致病性、並且不會對所述蠕蟲的正常生理、生殖、或發育造成不利影響的試驗化合物被視為可用於本發明。植物生物試驗系統為了能夠以有效和系統的方式大規模篩選大量的天然產物、提取物、或化合物，在微量滴定板的孔中或任何其它合適容器中培養宿主植物(例如，種子、幼苗、小植株、胚胎、成熟植株、或葉片)，進行半自動化操作和全自動數據採集。用於該生物試驗的合適植物宿主的具體例子包括，但不限於矮牽牛、番茄、馬鈴薯、菸草、擬南芥屬、大豆、玉米、小麥、黑麥、稻、大麥或任何其它在商業上或農業上重要的植物。培養植物的方法是本領域眾所周知的，例如，參見Vasil，I.K.，植物細胞培養和體細胞遺傳學，第I、II、III卷，試驗室方法及其應用，學術出版社，紐約，1984；DixonR.A.，植物細胞培養-實踐方法，IRL出版社，牛津大學，1985)。如上文所述，我們業已發現銅綠假單胞菌UCBPP-PA14能感染並殺滅擬南芥，而攜帶誘變過的毒力基因的銅綠假單胞菌UCBPP-PA14是非致病性的。因此，如果一種病原體具有減弱的致病性，所述植物將不會出現症狀，或者會出現比對照植株輕的症狀。如果擬南芥植物與所述病原體一起培養，該植物將會死亡或者具有多種疾病症狀(例如，缺氯或軟腐)，除非添加一種化合物以降低銅綠假單胞菌的致病性。用多種方法，包括目測篩選可以方便地測定活的幼苗及其相關疾病症狀的存在。
為了評價一種試驗化合物或提取物改善宿主(例如，擬南芥)對一種病原體的抗性或抑制一種病原體的致病性的能力，以合適的劑量將一種試驗化合物或提取物接種到組織培養基中(例如，固化瓊脂基培養基)。另外，如果必要，可以通過任何常規方法用所述候選植物保護劑或抗病原體化合物對所述宿主植物進行預處理，例如，用含有所述試驗化合物的溶液噴灑幼苗或小植株。用任何標準致病篩選系統試驗宿主植物，例如，上文所述的擬南芥屬和萵苣葉滲透試驗，或通過標準真空滲透技術。例如，按照標準方法用所述病原體對宿主幼苗進行真空滲透。在真空滲透之後按照本領域已知方法培養幼苗(例如，培養擬南芥屬的方法可以參見擬南芥屬研究方法，Koncz，C.，Chua，N.-H.，Schell，J.，著，世界科學出版公司Pte.Ltd.，新加坡，1992)。如果必要，可以接種各種濃度的試驗化合物或提取物，以便評價劑量對所述宿主和所述病原體的影響。對照幼苗用非致病性細菌滲透(負對照)或在沒有試驗化合物或提取物的條件下用病原體滲透(正對照)。以合適的時間間隔，例如3-5天，檢查幼苗的發病症狀。將處理和對照幼苗之間的比較研究用於測定所述試驗分子或化合物在改善宿主對所述病原體的抗性或抑制所述病原體的毒力方面的相對效力。能夠有效刺激、加強、提高、增強、或改善宿主對所述病原體的抗性或抑制、滅活、阻止、遏制、或控制所述病原體的致病性、並且不會對所述幼苗的正常生理、生殖、或發育造成不利影響的試驗化合物被視為可用於本發明。用途本發明的方法提供了一種用於鑑定微生物毒力因子和能夠抑制致病性或加強一種生物對一種病原體的抗性能力的化合物的簡單方法。因此，用本文所述方法發現的具有醫學或農業價值的化合物可用作藥物、植物保護劑或作為對現有的抗病原體化合物進行結構修飾的信息，例如，通過合理化藥物設計。所述方法可用於篩選對多種病原體具有作用的化合物，所述病原體包括，但不限於細菌、病毒、真菌、環節動物、線蟲、扁蟲動物和原蟲。病原體細菌的例子包括，但不限於氣桿菌屬、氣單胞菌屬、不動桿菌屬、土壤桿菌屬、芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、巴爾通氏體屬、Bortella、布魯氏菌屬、鞘桿菌屬、彎曲桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、梭菌屬、棒桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、弗朗西絲斯菌屬、嗜血菌屬、哈夫尼菌屬、螺桿菌屬、克雷伯氏菌屬、軍團菌屬、李斯特氏菌屬、莫根氏菌屬、穆爾氏菌屬、變形菌屬、普羅成登斯菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬、黃單胞菌屬、弧菌屬、耶爾森氏菌屬。
對於治療用途來說，用本文所披露的方法鑑定的組合物或製劑可以全身給藥。例如配製在可以藥用的緩衝液，如生理鹽水中。例如優選的給藥途徑包括皮下、靜脈內、腹膜內、肌內、或皮內注射，它可以在患者體內提供連續的、可持續水平的藥物。人類患者或其它動物的治療可以用包含在生理上可以接受的載體中的治療有效量的抗病原體劑進行。例如，合適的載體及其配製由E.W.Martin披露於Remington’s藥物科學中。給予的抗病原體劑的量根據給藥方式、患者的年齡和體重以及疾病的類型和疾病的嚴重程度而改變。一般，其用量落在用於治療其它微生物疾病的其它製劑的用量範圍之內，不過，在某些場合下，因為該化合物較高的專一性而需要較低的用量。以能抑制微生物繁殖的劑量給予化合物。例如，對於全身給藥來說，一種化合物的給藥量通常為0.1ng-10g/kg體重。
對於農業用途來說，用本文所披露的方法鑑定的組合物或製劑可以作為農藥以噴霧或噴粉的形式施加在植物的葉面上。通常，在所述病原體出現之前將所述製劑使用在植物表面上，以避免感染。還可以處理種子、鱗莖、根、塊莖、和球莖，以便在種植之後控制由其所攜帶的或存在於種植位點的土壤中的病原體預防病原體侵襲。還可以用化合燻蒸劑處理待種植蔬菜、觀賞植物、灌木、或樹木的土壤。處理優選在種植之前數日或數周進行。所述化合物可以通過機械途徑，例如拖拉機或用手動裝置使用。另外，用該試驗方法鑑定的化合物可以用作消毒劑。
本說明書中所提及的所有出版物和專利均被以相同的程度收作參考文獻，如同每一件出版物或專利被專門和單獨指明為收作參考文獻一樣。
通過以上說明，本領域技術人員可以方便地確定本發明的實質特徵，可以對本發明進行各種改變和改進，使其適應各種用途和條件。因此，其它實施方案也屬於本發明權利要求書的範圍。
保藏業已將銅綠假單胞菌UBCPP-PA14於1995年3月22日交由美國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為ATCC No.55664.申請人明白，在該授權專利終止之前若該菌株失去活力，其負有更換該菌株的責任，並在該專利授權時負有通知美國典型培養物保藏中心的責任，此後公眾可以獲得以上保藏物。在此之前，根據CFR§1.14和35 USC§112的規定專利局局長可以獲得所述保藏物。
序列表(1)一般資料(i)申請人The General Hospital Corporation等(ii)發明名稱篩選用於預防感染或致病性的化合物的方法(iii)序列數2(iv)通訊地址(A)收件人Clark Elbing，LLP(B)街道176 Federal Street(C)城市Boston(D)州MA(E)國家美國(F)郵編02110-2214(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統Windows 95(D)軟體FastSeq for Windows version2.0(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類號(vii)在先申請數據(A)申請號08/852,927(B)申請日1997年5月8日(vii)在先申請數據(A)申請號08/962,750(B)申請日1997年11月3日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Elbing，Karen L.
(B)註冊號35,238(C)文件/擋案號00786/263WO3(ix)通信資料
(A)電話(617)428-0200(B)傳真(617)428-7045(C)電傳(2)序列1資料(i)序列特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列1GCTAGTAGTC GATGACC(2)序列2資料(i)序列特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲結構線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列2GCTGGCATCA ACCATGC
權利要求
1.一種用於鑑定能在真核生物中抑制病原體的化合物的方法，該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓至少兩種不同的真核宿主生物接觸一種病原體，所述生物中至少一種是線蟲，其中，所述線蟲與所述病原體和候選化合物在快速殺滅條件下接觸；和(b)鑑定能在所述每一種真核宿主生物中抑制所述病原體的化合物。
2.如權利要求1的方法，其中，所述真核生物包括(a)線蟲和植物；(b)線蟲和脊椎動物；(c)線蟲和無脊椎動物；或(d)線蟲和昆蟲。
3.一種用於鑑定能在真核生物中抑制病原體的化合物的方法，該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓一種線蟲接觸一種病原體，其中，所述線蟲與所述病原體和候選化合物在快速殺滅條件下接觸；和(b)鑑定能抑制所述病原體的化合物，其中，所述化合物的鑑定是以能在一種真核生物中抑制所述病原體為指標。
4.如權利要求1或3的方法，其中，所述病原體是細菌。
5.如權利要求4的方法，其中，所述細菌是銅綠假單胞菌UCBPP-PA14。
6.如權利要求1或3的方法，其中，所述線蟲是秀麗新杆線蟲。
7.如權利要求1或3的方法，其中，所述兩種真核生物中的第二種是植物或哺乳動物。
8.如權利要求7的方法，其中，所述植物是擬南芥屬。
9.一種用於鑑定致病性毒力因子的方法，該方法包括(a)鑑定一種能夠感染至少兩種不同真核宿主生物的病原體，所述生物中至少一種是線蟲；(b)製備所述病原體的突變型；(c)讓所述真核生物和所述線蟲的每一種接觸所述突變型病原體，其中，所述線蟲是在快速殺滅條件下接觸所述病原體；(d)確定所述突變型病原體是否能在所述每一種生物中導致發病，在以上兩種生物中的疾病相對由野生型病原體引起的疾病減輕表明在病原性毒力因子上發生了突變；和(e)將所述突變用作鑑定所述病原性毒力因子的標記。
10.如權利要求1、3、或9的方法，其中，所述快速殺滅條件使用具有P-糖蛋白突變的線蟲。
11.一種用於鑑定致病性毒力因子的方法，該方法包括(a)選擇一種能夠感染昆蟲的病原體；(b)製備一種病原體的突變型；(c)讓所述昆蟲接觸所述突變的病原體；和(d)確定所述突變型病原體是否能在所述昆蟲上導致發病，在所述昆蟲上的疾病相對由野生型病原體引起的疾病減輕表明在所述病原性毒力因子上發生了突變。
12.如權利要求11的方法，其中，鑑定的所述突變被用作鑑定所述致病性毒力因子的標記。
13.如權利要求12的方法，其中，所述昆蟲是蛾或蠅。
14.如權利要求13的方法，其中，所述蛾是蠟螟或菜蛾，或者所述蠅是黑尾果蠅。
15.如權利要求11的方法，其中，所述病原體是細菌或真菌。
16.如權利要求15的方法，其中，所述細菌是假單胞菌屬的一員，或者所述真菌是鐮孢屬的一員。
17.如權利要求11的方法，其中，步驟(d)還包括計算病原體的LD50。
18.如權利要求11的方法，還包括在小鼠殺滅試驗中試驗所述突變的病原體。
19.一種用於鑑定能在真核生物中抑制病原體的化合物的方法，該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓一種昆蟲接觸一種病原體；和(b)鑑定能抑制所述病原體的化合物，其中，所述化合物的鑑定是以能在一種真核生物中抑制所述病原體為指標。
20.如權利要求19的方法，其中，所述昆蟲是蛾或蠅。
21.如權利要求20的方法，其中，所述蛾是蠟螟或菜蛾，或者所述蠅是黑尾果蠅。
22.如權利要求19的方法，其中，所述病原體是細菌或真菌。
23.如權利要求22的方法，其中，所述細菌是假單胞菌屬的一員，或者所述真菌是鐮孢屬的一員。
全文摘要
本發明公開了用於鑑定可用於抑制感染或致病性的化合物的篩選方法。還公開了用於鑑定致病性毒力因子的方法。
文檔編號A61K49/00GK1261810SQ98806928
公開日2000年8月2日 申請日期1998年5月8日 優先權日1997年5月8日
發明者F·M·奧蘇貝爾, L·G·拉梅, M－W·譚, G·B·魯夫昆, S·馬哈楊－米克洛斯, A·布勒克斯, R·H·A·普拉斯特克, G·楊德, J·赫爾德 申請人:綜合醫院公司, 荷蘭癌症協會