基因工程生產用原核表達質粒載體——pKpL5及其構建方法
2023-04-24 08:13:46 2
專利名稱：基因工程生產用原核表達質粒載體——pKpL5及其構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體地講是一種基因工程生產用原核表達質粒載體——pKpL5及其構建方法。
背景技術：
眾所周知，近年來興起的基因工程方法可以生產天然方法難以大量製備的目的蛋白質，廣泛地用於人類醫療等方面，由於質粒載體對目的基因進行表達時受多種因素影響而呈現表達效率高低不一，下遊純化難易程度不一樣，因而國內外學者紛紛通過強啟動子、強轉錄終止子、強翻譯終止密碼、合理的SD區及引導序列等元件改進來提高表達目的蛋白效率，或者使用原核生物細胞偏好密碼子重新改造目的基因，或改造終止密碼下遊序列，增強mRNA的穩定性來提高目的蛋白表達效率，上述工作雖都取得一定效果，但仍不盡如人意。同時，現有的目的蛋白純化、收集程序繁鎖複雜，得率較低，運行成本偏高。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術不足，通過在原有基因工程生產用原核細胞表達質粒的起始密碼下遊選擇性嵌入3個接頭，改變其結構，而提供一新的高效原核表達質粒載體——pKpL5，該質粒載體能大大提高目的基因的表達效率，從而提高目的蛋白的產量，同時本發明還能簡化重組蛋白的純化程序，降低生產成本，且重組蛋白很容易還原成天然蛋白。本發明的目的通過下述技術方案來實現在含有雙啟動子、雙SD區、rrnb轉錄終止子的pKpL4原核質粒載體的起始碼下遊嵌入人工合成的六聚組氨酸編碼區、16s rRNA 3』端互補區、凝血酶識別位點編碼區接頭，三個接頭的5』端分別含限制性核酸內切酶Nco I、Bam HI、Bam HI殘存鹼基。
所說的六組氨酸編碼區接頭接正鏈序列為CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，負鏈為CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六組氨酸接頭N端和C端分別含有甘氨酸，六組氨酸編碼區下遊含Bam HI識別位點。
16s rRNA3』端匹配序列接頭正鏈序列為GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，負鏈序列為CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG為16s rRNA3』端互補區，3』端含有Bam HI和Xba I識別位點。
所說的凝血酶識別位點編碼區序列接頭正鏈序列為CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，負鏈序列為CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA編碼的Val-Pro-Arg-Gly為凝血酶識別位點，序列的3』端含有Bam HI識別點。
原核表達質粒載體pKpL5的構建方法如下(1)分別將六組氨酸接頭的正、負鏈，16s rRNA3』端匹配接頭正、負鏈和凝血酶識別位點編碼區序列接頭正負鏈各自混合後在100℃變性與復性後，組裝成構成三個接頭，3個接頭的5』端分別含Nco I、BamHI、Bam HI殘存鹼基備用；(2)製備pKpL4.1取pKpL4質粒DNA，經Bam HI消化後，以Klenow酶和dNTP修飾成平端，再以Nco I消化，1.0％瓊脂糖凝膠電泳後回收載體臂DNA，再用CIP脫磷酸化後，加入的六聚組氨酸接頭，用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化經CaCL2法製備的感受態大腸桿菌pop2136細胞，以六聚組氨酸接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選重組陽性克隆，陽性重組子即為pKpL4.1，以限制性核酸內切酶消化驗證插入序列的正確性。(3)製備pKpL-4.2質粒DNA取pKpL4.1質粒DNA用Xba I消化後，以klenow和dNTP修飾成平端，再以Bam HI消化製成載體臂，用T4 DNA連接酶與16s rRNA3』端匹配序列接頭，以16s rRNA3』端匹配序列接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選陽性重組克隆，陽性重組子即為pKpL4.2，並以相應限制性核酸內切酶法驗證插入序列的正確性。(4)製備pKpL5質粒DNA以構建pKpL4.2相同的方法製備pKpL4.2質粒載體臂，與凝血酶識別位點編碼區接頭連接，並以凝血酶識別位點編碼區接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選陽性重組子，陽性重組子即為pKpL5，並以相應限制性核酸內切酶法驗證插入序列的正確性。
pKpL5構建過程中，在起始密碼下遊嵌入六聚組氨酸接頭，使目的蛋白與金屬鋰鹽能特異結合，僅通過含金屬鋰鹽的凝膠或其它基質一步法進行親和純化，不僅減少純化步驟，而且能顯著提高目的蛋白的純度，並且在六聚組氨酸上遊引入兩個甘氨酸，保護六聚組氨酸的完整性，在六聚組氨酸下遊亦嵌入大量甘氨酸，這不僅能使六聚組氨酸基因更好地形成獨立結構域，而且能暴露於目的蛋白分子的表面，增強基團的電荷和消除空間阻礙，有利於目的蛋白與金屬鋰鹽層析柱間緊密結合。在六聚組氨酸接頭下遊，嵌入16s rRNA3』端匹配序列接頭，該接頭能顯著提高mRNA與核糖體間的結合力，從而顯著增強目的基因的翻譯。在16s rRNA3』端匹配序列接頭下遊嵌入了凝血酶識別位點編碼區接頭，並在下遊嵌入了Bam HI識別位點用於目的基因克隆，目的蛋白純化後，使用凝血酶進行消化，使目的蛋白胺基酸序列還原，與天然蛋白比較，N端僅增添了Gly-Ser，這兩個胺基酸不含側鏈，難與下遊胺基酸間形成氫鍵，對目的蛋白的生物活性影響較小。
與現有技術相比，本發明技術增強了目的基因的表達，提高目的蛋白產量，性能穩定可靠，為生物工程下遊產品的純化提取提供了簡捷措施。基因表達試驗取得令人滿意的效果，具體試驗結果如下(1)篩選重組陽性克隆試驗本發明pKpL4載體臂與六聚組合氨酸接頭連接產物、pKpL4.1載體臂與16s rRNA3』端匹配序列接頭連接物及pKpL4.2載體臂與凝血酶識別位點編碼區接頭連接產物分別轉化感受態大腸桿菌pop2136細胞後，在含氨苄青黴素LB平板上生長的細菌克隆進行小量擴增培養，飽和酚、氯仿一步法製備DNA模板，經PCR擴增篩選，並且以限制性核酸內切酶鑑定相應接頭的重組方向，pKpK4.1以限制性內切酶Bam HI、KpnI進行消化，具有Bam HI而不含KpnI識別位點者正確。pKpL4.2以限制性內切酶Bam HI、XbaI消化，同時具備Bam HI與XbaI識別位點者為正確。pKpL5以限制性內切酶Bam HI、XbaI消化，僅具備Bam HI識別位者為正確。結果在每次重組後均可篩選到重組陽性克隆。
(2)目的基因的表達試驗參考本研究所保存的pT survivin、pT-surviving double、pT-LACK質粒內人生存素單體、雙體和利什曼原蟲LACK抗原基因編碼區序列(生存素單體基因編碼區長429nt，編碼142個胺基酸；人生存素雙體編碼區長為900nt，編碼299個胺基酸；利什曼原蟲LACK抗原基因編碼區長為948nt，編碼315個胺基酸)，分別設計目的基因引物進行PCR擴增，並在目的基因上遊引物中嵌入Bam HI位點，在下遊引物中嵌入Hind III位點，將這3個目的基因編碼區分別克隆入原核表達質粒pQE32、pKpL4和pKpL5內Bam HI和Hind III位點間，pQE32-survivin、pQE32-surviving double、pQE32-LACK分別轉化感受態大腸桿菌M15，分別挑取單個菌落，以含氨苄青黴素的LB培養液於37℃培養致對數生長中期，加入IPTG至終濃度1mM，高速振蕩培養4小時(300轉/分)，離心收集細菌，裂解後以SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達量。pKpL4-survivin、pKpL4-surviving double、pKpL4-LACK、pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double及pKpL5-LACK分別轉化感受態大腸桿菌pop2136，於32℃擴增培養至對數生長中期，於42℃高速震蕩培養誘導目的基因表達4小時後，離心收集細菌，分析相應目的蛋白的表達量。並超聲粉碎細菌，製備包涵體，進一步確認目的蛋白表達。
結果含pQE32、pQE32-survivin、pQE32-surviving double、pQE32-LACK的大腸桿菌M15進行IPTG誘導表達4小時後，SDS-PAGE電泳檢測未見明顯的目的蛋白條帶，再將含pKpL4-survivin、pKpL4-surviving double、pKpL4-LACK的大腸桿菌pop2136進行熱誘導表達4小時，與含pKpL4的大腸桿菌pop2136相比較，亦未見明顯的目的蛋白表達條帶，而pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double、pKpL5-LACK的大腸桿菌pop2136經熱誘導表達4小時後，均可見明顯的目的蛋白表達條帶，經Quantity ONE(Bio-Rab公司)軟體分析，目的蛋白的表達量分別佔全菌總蛋白量的5.1％，19％和35％。將pKpL5-survivin、pKpL5-surviving double、pKpL5-LACK進行大量表達後，超聲粉碎細菌製備包涵體，將包涵體進行SDS-PAGE電泳分析，可見相應目的蛋白條帶進一步增強，一方面說明目的蛋白表達的真實性，另一方面證明了相應目的蛋白以包涵體形式表達，詳見圖2。如圖2所示，通過SDS-PAGE電泳蛋白質檢測，本發明的原核載體pKpL5對目的基因的表達真實可靠，可大大提高目的蛋白質的產量，圖2中MS豎向為分子量，橫向數字說明如下1、蛋白質分子量；2、pQE32對照；3、pQE32-Survivin；4、pQE32-Survivin double；5、pQE32-LACK；6、pKpL4對照；7、pKpL4-Survivin；8、pKpL4-Survivin double；9、pKpL4-LACK；10、pKpL5-Survivin；11、pKpL5-Survivin包涵體；12、pKpL5-Survivin double；13、pKpL5-Survivindouble包涵體；14、pKpL5-LACK；15、pKpL5-LACK包涵體。
原核表達質粒載體——pKpL5可用作通用原核高效表達質粒載體表達各種目的的基因。
圖1為本發明原核表達載體pKpL5構建流程圖圖2為本發明目的基因表達效果圖
具體實施例方式實施例1如圖1所示，按下列步驟進行原核表達質粒載體——pKpL5構建，(1)首先根據發明目的設計並人工合成出六聚組氨酸編碼區、16s rRNA3』端互補區、凝血酶識別位點編碼區接頭，三個接頭的5』端分別含限制性核酸內切酶Nco I、Bam HI、Bam HI殘存鹼基，上述三個接頭可以自行合成，也可委託相關生物工程公司合成，本實施例三個接頭均系委託上海生工公司人工合成。
所說的六組氨酸編碼區接頭接正鏈序列為CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，負鏈為CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六組氨酸接頭N端和C端分別含有甘氨酸，六組氨酸編碼區下遊含Bam HI識別位點。
16s rRNA3』端匹配序列接頭正鏈序列為GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，負鏈序列為CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG為16s rRNA3』端互補區，3』端含有Bam HI和Xba I識別位點。
所說的凝血酶識別位點編碼區序列接頭正鏈序列為CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，負鏈序列為CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA編碼的Val-Pro-Arg-Gly為凝血酶識別位點，序列的3』端含有Bam HI識別點；(2)分別將六組氨酸接頭的正、負鏈，16s rRNA3』端匹配接頭正、負鏈和凝血酶識別位點編碼區序列接頭正負鏈各自混合後在100℃變性與復性後，組裝構成三個接頭，3個接頭的5』端分別含NcoI、Bam HI、Bam HI殘存鹼基備用；(3)製備pKpL4.1取pKpL4質粒DNA(含雙啟動子、雙SD區、rrnb轉錄終止子，由北京大學醫學部分子免疫室提供，中華基因網2004.06.12曾予報導)，經Bam HI消化後，以Klenow酶和dNTP修飾成平端，再以Nco I消化，1.0％瓊脂糖凝膠電泳後，以美國生命技術公司產DNA凝膠回收試劑盒，按操作說明回收載體臂DNA，再用小牛腸磷酸脂酶(CIP)脫磷酸化後，加入的六聚組氨酸接頭，用T4DNA連接酶連接，連接產物轉化經CaCL2法製備的感受態大腸桿菌pop2136細胞，以六聚組氨酸接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選重組陽性克隆，陽性重組子即為pKpL4.1，以限制性核酸內切酶消化試驗驗證插入序列的正確性；(4)製備pKpL-4.2質粒DNA取pKpL4.1質粒DNA用Xba I消化後，以大腸桿菌大片段聚合酶(klenow)和dNTP修飾成平端，再以Bam HI消化製成載體臂，用T4DNA連接酶與16s rRNA3』端匹配序列接頭，以16srRNA3』端匹配序列接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選陽性重組克隆，陽性重組子即為pKpL4.2，並以相應限制性核酸內切酶消化實驗驗證插入序列的正確性；(5)製備pKpL5質粒DNA以構建pKpL4.2相同的方法製備pKpL4.2質粒載體臂，與凝血酶識別位點編碼區接頭連接，並以凝血酶識別位點編碼區接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選陽性重組子，陽性重組子即為pKpL5，並以相應限制性核酸內切酶法驗證插入序列的正確性。本發明中插入的3個接頭拼接後的核酸序列及編碼蛋白質序列為ATG GGC CAT CAT CAT CAC CAT CAC AGC AGCGGA TCC CAT GCC TTA CAA AGC GGA TCC AGC GGA CTG GTTCCG CGTGGA TCCGBamH IMet Gly His His His His His His Ser Ser Gly Ser HisPro Leu Glu Ser Gly Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser本發明所用酶如內切酶、Taq酶和連接酶等，購自美國基因公司和美國Invitrogen公司，大腸桿菌pop2136(含C1857溫度敏感阻遏子)由北京大學醫學部分子免疫室提供。
核苷酸胺基酸序列表110川北醫學院120基因工程生產用原核表達質粒載體pKpL及其構建方法1604210121138212DNA213人工序列220
221CDS4001catgggccat catcatcacc atcacagcag cggatccg38210221133212DNA213人工序列220
221RBS4002gatcgcatgc cttacaaagc ggatcctcta gag 33210321130212DNA
213人工序列220
221CDS4003catcgagcgg actggttccg cgtggatccg30210421151212DNA213人工序列220
221CDS222(37...57)4004atg ggc cat cat cat cac cat cac agc agc ggatcc cat gcc tta caa agc gga tcc agc gga ctggtt ccg cgtgga tccgBamH IMet Gly His His His His His His Ser Ser Gly Ser His1 5 10Pro Leu Glu Ser Gly Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser15 20 2權利要求
1.一種基因工程生產用原核表達質粒載體——pKpL5，其特徵在於在含有雙啟動子、雙SD區、rrnb轉錄終止子的pKpL4原核質粒載體的起始碼下遊嵌入人工合成的六聚組氨酸編碼區、16s rRNA3』端互補區、凝血酶識別位點編碼區接頭，三個接頭的5』端分別含限制性核酸內切酶Nco I、Bam HI、Bam HI殘存鹼基。
2.根據權利要求1所述的一種基因工程生產用原核表達質粒載體——pKpL5，其特徵在於所說的六組氨酸編碼區接頭接正鏈序列為CATGGGCCATCATCATCACCATCACAGCAGCGGATCCG，負鏈為CGGATCCGCTGCTGTGATGGTGATGATGGCC，六組氨酸接頭N端和C端分別含有甘氨酸，六組氨酸編碼區，其下遊含Bam HI識別位點。
3.根據權利要求1所述的一種基因工程生產用原核表達質粒載體——pKpL5，其特徵在於16s rRNA3』端匹配序列接頭正鏈序列為GATCGCATGCCTTACAAAGCGGATCCTCTAGAG，負鏈序列為CGGATCCGCTGCTTTGTAAGGCATGC，其中CATGCCTTACAAAG為16srRNA3』端互補區，3』端含有Bam HI和Xba I識別位點。
4.根據權利要求1所述的一種基因工程生產用原核表達質粒載體——pKpL5，其特徵在於所說的凝血酶識別位點編碼區序列接頭正鏈序列為CATCGAGCGGACTGGTTCCGCGTGGATCCG，負鏈序列為CGGATCCACGCGGAACCAGTCCGCTC，其中GTTCCGCGTGGA編碼的Val-Pro-Arg-Gly為凝血酶識別位點，序列的3』端含有Bam HI識別點。
5.權利1所述的一種基因工程生產用原核表達質粒載體—pKpL5構建方法，其特徵在於按下列步驟進行；(1)分別將六組氨酸接頭的正、負鏈，16s rRNA3』端匹配接頭正、負鏈和凝血酶識別位點編碼區序列接頭正負鏈各自混合後在100℃變性與復性後，組裝成構成三個接頭，3個接頭的5』端分別含Nco I、Bam HI、Bam HI殘存鹼基備用；(2)製備pKpL4.1取pKpL4質粒DNA，經Bam HI消化後，以Klenow酶和dNTP修飾成平端，再以Nco I消化，1.0％瓊脂糖凝膠電泳後回收載體臂DNA，再用CIP脫磷酸化後，加入的六聚組氨酸接頭，用T4DNA連接酶連接，連接產物轉化經CaCL2法製備的感受態大腸桿菌pop2136細胞，以六聚組氨酸接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選重組陽性克隆，陽性重組子即為pKpL4.1，以限制性核酸內切酶消化驗證插入序列的正確性；(3)製備pKpL-4.2質粒DNA取pKpL4.1質粒DNA用Xba I消化後，以klenow和dNTP修飾成平端，再以Bam HI消化製成載體臂，用T4DNA連接酶與16s rRNA3』端匹配序列接頭，以16srRNA3』端匹配序列接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選陽性重組克隆，陽性重組子即為pKpL4.2，並以相應限制性核酸內切酶法驗證插入序列的正確性；(4)製備pKpL5質粒DNA以構建pKpL4.2相同的方法製備pKpL4.2質粒載體臂，與凝血酶識別位點編碼區接頭連接，並以凝血酶識別位點編碼區接頭正鏈和rrnb轉錄終止子負鏈為引物，PCR法篩選陽性重組子，陽性重組子即為pKpL5，並以相應限制性核酸內切酶法驗證插入序列的正確性。
全文摘要
本發明公開了一種基因工程生產用原核表達質粒載體——pKpL5及其構建方法，其特徵在於在含有雙啟動子、雙SD區、rrnb轉錄終止子的pKpL4原核質粒載體的起始碼下遊嵌入人工合成的六聚組氨酸編碼區、16s rRNA3』端互補區、凝血酶識別位點編碼區接頭，三個接頭的5』端分別含限制性核酸內切酶Nco I、Bam HI、Bam HI殘存鹼基。該質粒載體能大大提高目的基因的表達效率，從而提高目的蛋白的產量，我們使用該質粒載體表達人生存素單體、雙體和利什曼原蟲LACK抗原，經SDS－PAGE電泳後用Quantity ONE(Bio－Rad公司)軟體分析，目的蛋白的表達量分別佔全菌總蛋白量的5.1％，19％和35％。同時本發明還能簡化目的蛋白的純化程序，降低目的蛋白的生產成本。原核表達質粒載體——pKpL5可用作原核高效表達通用質粒載體表達各種目的的基因。
文檔編號C12N15/63GK1966690SQ20061002154
公開日2007年5月23日 申請日期2006年8月5日 優先權日2006年8月5日
發明者敬保遷, 馬大龍, 張潔 申請人:川北醫學院