Cs-1模擬肽，利用該肽的組合物和方法
2023-04-24 07:18:31
專利名稱：Cs-1模擬肽，利用該肽的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及炎性細胞與在其表面表達纖維蛋白連接素的CS-1部分的內皮細胞的結合，更具體的說涉及由基本長度的模擬肽化合物對這種結合的抑制作用。
背景技術：
免疫應答依賴於作為宿主防禦基礎結構之一的白細胞交換和免疫監視。通常這種免疫監視不僅允許通過淋巴組織進行正常的白細胞循環，而且允許在炎症位點進行白細胞快速的補充以及外滲到鄰接組織。在這些白細胞的交換作用中，α4β1(CD49d/CD29，VLA-4)細胞粘附受體是一種活性的參加者[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8365-400(1990)；Hemler et al.，Immunol.Rev.，11445-65(1990)]。
有三個不同的研究組分別發現VLA-4整合素異型二聚體並且鑑定為淋巴細胞上的一種表面抗原[Sanchez-Madrid et al，.Eur.J.Immunol.，161343-1349(1986)；Clayberger et al.，J.Immunol.，1381510-1514(1987)；Hemler et al.，J.Biol.Chem.，26211478-11485(1987)]。在整合素族內，在下列幾點VLA-4是獨特的(i)與β1亞族的相關成員相反，VLA-4主要在造血譜系細胞上面表達[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8365-400(1990)]，並且其功能是參與細胞與細胞以及細胞與胞外基質(ECM)的粘附作用[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8365-400(1990)]；(ii)儘管與其它的整合素α亞單位有序列同源性，但是α4亞單位與亞單位族內的兩個主要結構簇不一致，因為α4失去了一個插入的I-區，並且在靠近轉膜區不進行轉譯後的切割[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8365-400(1990)；Hynes，Cell，6911-25(1992)]，和(iii)α4含有一個類似胰蛋白酶切割位點，導致至少兩個不同的結構變異體α4-150和α4-80/70在與細胞類型相特異的表面表達[Pulido et al.，FEBS Lett.，294121-124(1991)；Teixido et al.，J.Biol.Chem.，2671786-1791(1992)；Rubio et al.，Eur.J.Immunol.，21099-1102(1992)]。
VLA-4整合素可能是在表達CD34的造血幹細胞上面存在的最早的粘附受體之一[Teixido et al.，J.Clin.Invest.，90358-367(1992)]。但是VLA-4僅在成熟的T和B淋巴細胞，天然的殺傷細胞(NK)，單核細胞，嗜鹼性細胞和嗜酸性粒細胞上表達，但不在紅細胞，血小板和中性粒細胞上表達[Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8365-400(1990)；Gismondi et al.，J.Immunol.，146384-392(1991)；Walsh et al.，J.Immunol.，1463419-3423(1991)；Bochner et al.，J.Exp，Med.，1731553-1556(1992)；Dobrina et al.，J.clin.Invest..，8820-26(1991)；Weller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，887430-7433(1991)]。
至今，由VLA-4整合素和稱為細胞因子誘導性液泡細胞粘附分子-1(VCAM-1)[Elices et al.，Cell adhesion molecule-1(VCAM-1)Exp.Med.，1711369-1374(1990)；Rice et al.，J.Clin.Invest.，852019-2022(1990)；Carlos et al.，Blood，76965-970(1990)]以及一組普遍存在的ECM蛋白纖維蛋白連接素[Wayner et al.，J.Cell Biol.，1091321-1330(1989)；Guan et al.，Cell，6053-61(1990)；Ferreira et al.，J.Exp.Med.，171351-356(1990)Elices et al.，Cell，60577-584(1990)]的兩種獨立相對的受體結構之一之間的直接分子作用可以解釋由VLA-4介導的最大的粘附作用。
VCAM-1是免疫球蛋白(Ig)基因總科的一個成員[Osborn et al.，Cell，591203-1211(1989)；Rice et al.，Science，2461303-1306(1989)]，它主要在液泡內皮上表達，以應答原炎性細胞因子如IL-1，TNFα，和IL-4[Osbornet al.，Cell，591203-1211(1989)；Rice et al.Science，2461303-1306(1989)；Thornhill et al.，J.Immunol.，145865-872(1990)；Masinovsky et al.，J.Immunol.，1452886-2895(1990)；Thornhill et al.，J.Immunol.，146592-598(1991)；Schleimer et al.，J.Immunol.，1481086-1092(1992)；Birdsall et al.，J.Immunol.，1482717-2723(1992)；Swerlick et al.，J.Immunol.，149798-705(1992)；Brescoe et al.，J.Immunol.，1492954-2960(1992)]。已將VCAM-1上的VLA-4的結合位點定位至6-Ig類區VCAM-1異型的最遠N-末端(開頭)Ig類區[Taichman et al.，Cell Requl.，2347-355(1991)；Vonderheide et al.，J.Exp.Med.，1751433-1442(1992)；Osborn et al.，J.Exp.Med.，17699-107(1992)]，和7-Ig類區VCAM-1異型的第一和第四N-末端Ig類區[Vonderheide et al.，J.Exp.Med.，1751433-1442(1992)；Osborn etal.，J.Exp.Med.，17699-107(1992)]。在由VLA-4整合素識別的VCAM-1中的兩個獨立的Ig類區內的具體的胺基酸序列仍然有待定義。
相反，已經鑑別了纖維蛋白連接素(FN)內的VLA-4的高親合力的肽識別序列[Wayner et al.，J.Cell.Biol.，1091321-1330(1989)；Ferreira et al.，J.Exp.Med.，171351-356(1990)；Guan et al.，Cell，6053-61(1990)；Mouldet al.，J.Biol.Chem.，2654020-4024(1990)；Garcia-Pardo et al.，J.Immunol.，1443361-3366(1990)；Komoriya et al.，J.Biol.Chem.，26615075-15079(1991)]。該序列包括25胺基酸殘基的長度，稱為CS-1[Humphries et al.，J.Cell Biol.，1032637-2647(1986)；Humphries et al.，J.Biol.Chem.，2626886-6892(1987)]。
該FN基因含有三個隔開的外顯子稱為EIIIA，EIIIB和V或IIICS，它們適用於另一種拼接方法[Hynes，″Fibronectin″，Springer-Verlag，New York(1990)]。在IIICS區域中存在的其它的受體和供體拼接信號可以使由多個IIICS多肽變體產生的FN的差異增大，例如，五個人FN[Vibe-Pedersen et al.，FEBS Lett.，207287-291(1987)；Hershberger et al.，Mol.Cell.Biol.，10662-671(1990)]。因此，僅有這些分子變異體的一個子集合表達由VLA-4識別的25個胺基酸的CS-1序列[Wayner et al.，J.Cell.Biol.，1091321-1330(1989)；Guan et al.，Cell，6053-61(1990)]。
已經鑑別出特定的VLA-4識別的CS-1的最小基本序列為三肽Leu-Asp-Val(LDV)[Komoriya et al.，J.Biol.Chem.，26615075-15079(1991)；Wayner et al.，J.Cell.Biol.，116489-497(1992)；Wayner WO 91/03252 1991年3月21日公開；Wayner WO93/12809 1993年7月8日公開和Humphries WO 92/13887，1992年8月20日公開]，儘管VLA-4與LDV的結合親合力比與天然CS-1 25聚體的親合力至少低2個數量級。Nowlin et al.，J.Biol.Chem.，268(1)20352-20359(1993)最近描述了胱氨酸連接的環五肽可以通過Arg-Gly-Asp和纖維蛋白連接素的CS-1區抑制結合。
VLA-4與β1整合素亞族的其它成員共有促進微生物病原體結合穿透到哺乳動物細胞中的能力。因此，已經描述了β1整合素與細菌蛋白質入侵素[Isberget al.，Cell，60861-871(1990)；Ennis et al.，J.Exp.Med.，177207-212(1993)]以及與原生動物Trypanosoma cruzi[Fernandez et al.，Eur.J.Immunol.，23552-557(1993)的特異性作用。
大量的體外研究表明，VLA-4與它的兩個已知配體，VCAM-1和CS-1 FN的相互作用顯著的生物學意義。例如已經證明與VCAM-1結合的VLA-4由下列細胞粘附到細胞因子刺激的液泡內皮，這些細胞有淋巴細胞[Elices et al.，Cell，60577-584(1990)；Rice et al.，J.Exp.Med.，1711369-1374(1990)；Schwartz etal.，J.Clin.Invest.，852019-2022(1990)；Carlos et al.，Blood，76965-970(1990)；Shimizu et al.，J.Cell Biol.，1131203-1212(1991)]，單核細胞[Carlos et al.，Blood，772266-2271(1991)；Jonjic et al.，J.Immunol.，1482080-2083(1992)，天然殺傷細胞(NK)[Allavena et al.，J.Exp.Med.，173.439-448(1991)]，和嗜酸性粒細胞[Walsh et al.，J.Immunol.，1463419-3423(1991)；Bochner et al.，J.Exp.Med.，1731553-1556(1992)；Dobrina etal.，J.Clin.Invest.，8820-26(1991)；Weller et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，887430-7433(1991)]。由於這種作用介導白細胞-內皮的吸附，因而認為VLA-4/VCAM-1的相互作用是炎症產生的關鍵。
換過來說，已有大量的文獻記載在紅細胞生成作用中存在VLA-4/CS-1的相互作用，在該紅細胞生成作用中造血祖先表達的VLA-4[Hemler et al.，Immunol.Rev.，11445-65(1990)；Williams et al.，Nature，352438-441(1991)；Roldanet al.，J.Exp.Med.，1751739-1747(1992)；Sawada et al.，J.Immunol.，1493517-3524(1992)；Wadsworth et al.，J.Immunol.，150847-857(1993)]和其ECM微環境的吸附作用對前體的成熟和分化起著關鍵的作用。因此，已經證明CS-1肽可以抑制(i)鼠造血幹細胞與骨髓基質衍生的ECM的結合[Williams et al.，Nature，352438-441(1991)]，(ii)由骨髓衍生的B細胞祖先分泌免疫球蛋白[Roldan et al.，J.Exp.Med.，1751739-1747(1992)，](iii)雞B細胞的粘液囊和後粘液囊的發育[Palojoki et al.，Eur.J.Immunol.，23721-726(1993)]和(iv)由胸腺基質的細胞單層誘導的胸腺細胞的吸附和分化[Utsumi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885685-5689(1991)；Sawada et al.，J.Immunol.，1493517-3524(1991)]VLA-4/CS-1也與胚胎發育有關，因為已經證明CS-1肽幹擾鳥的中央嵴細胞的遷移[Dufour et al.，EMBO J.，72661-2671(1988)]。
除了VCAM-1以外，還證明FN和CS-1與類風溼性關節炎(RA)的病因有關[Laffon et al.，J.Clin.Invest.，88546-552(1992)]。已經確立了FN的CS-1拼接變異體在介導炎性細胞例如嗜酸性粒細胞沿表達VLA-4的白細胞的內皮細胞單層遷移的作用[Kuijpers et al.，J.Exp.Med.，178279-284(1993)]。
在各種動物模型中利用抗-VLA-4抗體進行的體內研究有力地證明了由大量的研究工作暗示的VLA-4在白細胞的交換和炎症中起作用。實質上，皮膚、腦、腎、肺和內臟是各種各樣的VLA-4依賴性炎性反應的靶，這種反應大多數是由單核白細胞和嗜酸性粒細胞的補充引起的。
更具體地說，這些體內研究如下在小鼠和大鼠中進行的接觸超敏(CH)和延遲型超敏(DTH)[Ferguson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888072-8076(1991)；Issekutz，Cell Immunol.，138300-312(1991)；Issekutz，J.Immunol.，1474178-4184(1991)；Elices et al.，Clin.Exp.Rheumatol.，11S77-80(1993)；Chisholm，et al，Eur.J.Immunol.，23682-688(1993)]；小鼠和大鼠中的實驗性自發免疫腦脊髓炎(EAE)[Yednock et al.，Nature，35663-66(1992)；Baron et al.，J.Exp.Med.，17757-68(1993)]；大鼠的腎毒性腎炎[Mulligan et al.，J.Clin.Invest.，91577-587(1993)]；豚鼠的被動皮膚過敏[Weg et al.，J.Exp.Med.，177561-566(1993)]；大鼠中免疫複合物誘導的肺損傷[Mulligan et al.，J.Immunol.，1502401-2406(1993)；Mulligan et al.，J.Immunol.，1502407-2417(1993)]；猴的自發性結腸炎[Poldolsky et al.，J.Clin.Invest.，92372-380(1993)]和羊的哮喘[Lobb，WO 92/13798 1993年7月22公開]。
因此，從體內研究得到的初步結果是VLA-4引起仿效人的慢性狀態的炎性應答。在鼠的接觸超敏的體內模型中，CS-1肽部分地抑制T淋巴細胞補充到皮膚的炎性位點[Ferguson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888072-8076(1991)]，因為從FN的細胞吸附區得到的Arg-Gly-Asp肽也在該動物模型中具有抑制作用，作者總結出由白細胞整合素與ECM蛋白例如FN的相互作用可以促進免疫T細胞遷移到組織中的抗原激發位點[Ferguson et al.，Proc.Natl.，Acad.Sci.USA，888072-8076(1991)]。
在最近的研究中Elices及其同事們[Elices et al.，Clin.Exp.Rheumatol.，11S77-80(1993)]不能夠重複產生天然的CS-1肽對接觸超敏性的抑制作用。相反，他們發現通過蛋白質的降解CS-1肽快速地從血液循環中被清除。
已經確立了VLA-4和CS-1肽在各種慢性和急性免疫炎症中的作用，因此，找到這樣的化合物是至關重要的，即能夠抑制VLA-4-淋巴細胞的相互作用、並且與由重複給藥而可誘導免疫應答的抗VLA-4抗體不同的、或者不同於巨大的並且製備成本高的並且快速降解的CS-1肽的化合物。下文中描述了比CS-1本身更有效力的這樣的小分子。發明簡述本發明涉及模擬CS-1的抑制肽，使用該抑制肽的組合物和方法。
一種有關的肽對應於通式A的序列X-B-Asp-Z A其中B是一種α-疏水胺基酸殘基，它的側鏈具有約2-5個亞甲基的長度，優選的是亮氨酸；X是一個以醯胺鍵連接到Bα-胺的氮原子上的基團，所說X基團具有鍵合到所說醯胺鍵的羰基碳上的環結構，所說的鍵合通過一個具有0-約2個亞甲基長度的間隔基連接，包括所說間隔基和羰基碳的X的長度是約3-喹啉羰基的長度或者更小，所說的環結構是5-和6-元環或者一個融合的6，6-或者6，5-元環；和Z選自於下列基團(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者芳香胺基酸殘基；即具有一個含1或者2個融合的芳香環的側鏈的胺基酸殘基，NCy1是一個含有環的基團，該基團具有一個位於環上的氮原子，該氮原子與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，並且NCy1的環含有5-或6-個原子包括所說環上氮原子；和(b)NCy2，其中所說的氮原子是環基團的胺取代基，該氮原子與所說Asp的α-羧基基團形成一醯胺鍵，該胺取代基與一個6-或者7-元環鍵合，或者與一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環體系鍵合，其中所說攜帶胺取代基的環是飽和的並且在所說內醯胺的羰基的α位上含有胺取代基。
優選的所說肽對應於通式I的序列X-Leu-Asp-ZI其中X是一個以醯胺鍵連接到Leuα-胺的氮原子上的基團，所說X基團具有鍵合到所說醯胺鍵的羰基碳上的環結構，所說的鍵合通過一個具有0-約2個亞甲基長度的間隔基連接，包括所說間隔基和羰基碳的X的長度是約3-喹啉羰基的長度或者更小，所說的環結構是5-和6-元環或者一個融合的6，6-或者6，5-元環；Z選自於下列基團(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者芳香胺基酸殘基；即具有一個含1或者2個融合的芳香環的側鏈的胺基酸殘基，NCy1是一個含有環的基團，該基團具有一個位於環上的氮原子，該氮原子與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，並且NCy1的環含有5-或6-個原子包括所說環上氮原子；和(b)NCy2，其中所說的氮原子是環基團的胺取代基，該氮原子與所說Asp的α-羧基基團形成一醯胺鍵，該胺取代基與一個6-或者7-元環鍵合，或者與一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環體系鍵合，其中所說攜帶胺取代基的環是飽和的並且在所說內醯胺的羰基的α位上含有胺取代基。
通式I和下文中的通式II和通式III的肽是水溶性的，並且在一個體外檢測試驗中所說的肽抑制Jurkat細胞(ATCC TIB 152)與固相結合的SEQ ID NO1的肽結合，所說的檢測試驗是在pH值為7.2-7.4的含水緩衝液中進行的，其抑制程度比由SEQ ID NO3的肽顯示的對所說結合的抑制程度高約10-3000倍。
在一個更優選的實施方案中，X基團具有通式Ar-Y-C(O)-，並且該肽對應於下面的通式II的序列；Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1II其中Ar是吡唑基，苯基，吡啶基，或者3-喹啉基；Y是一個間隔基，它可以不存在，或是-CH2-，-CH(NH)-，-O-或者-NH-；或者Ar-Y-C(O)-與所說Leu的氮原子一起形成一個苯二甲醯亞氨基，1，2，3，4-四氫喹唑啉-2，4-二酮-3-基或者5-phenyldantoin-3-基，和Ar-Y-C(O)-具有約3-喹啉羰基的長度或者更短；Xaa是一個芳香族胺基酸殘基；即具有一個芳香側鏈的胺基酸殘基。
NCy1是一個含有胺的5-或6-元環的基團，其中所說的氮原子位於環上並且與Xaa的α-羧基形成一個如前所討論的醯胺鍵。
Ar-Y-C(O)-最優選的是苯乙醯基，因此，在最優選的實施方案中，所說的肽對應於下面的通式III序列，N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-NCy3III其中NCy3優選的是選自於下列組的NCy1嗎啉醯氨基，硫代嗎啉醯氨基，4-(噻二氧代)哌啶醯氨基，D-2-(羧醯胺)-吡咯烷醯氨基，哌啶醯氨基，和取代的哌啶氨基其取代基選自於下列組4-羥基，4-甲氨醯和4-羧基，哌嗪醯氨基和取代的哌嗪醯氨基其取代基選自於下列組4-N-羧甲基，4-N-羧醯氨基甲基，4-N-(5-羥基乙烯氧基乙基)，和吡咯烷醯氨基。
還涉及含有上述抑制肽的組合物。所說組合物含有分散或溶於一種藥物學上可接受的稀釋劑，優選為水的肽。該組合物中含有的肽的量為降低炎症的量。有時，該量也稱作為抑制CS-1/VLA-4結合所需的量。在一個優選或者最優選組合物中利用了上文中討論的優選的或最優選的肽。
還涉及用於治療纖維蛋白連接素CS-1/VLA-4介導的炎症的方法。該方法包括給具有炎症或者為預防目的需要進行治療的哺乳動物施用降低炎症所需量的前面所說的抑制肽。在該方法中使用更優選的或最優選的抑制肽是更優選的或最優選的。
本文中顯示的所有肽的通式或者序列都是從左到右書寫的，並且是從氨基末端到羧基末端的方向。下面的表中重複了本文中使用的20個天然胺基酸的衍生物和殘基的縮寫通用表縮寫 胺基酸1-字母3-字母Y Tyr酪氨酸G Gly甘氨酸F Phe苯丙氨酸M Met甲硫氨酸A Ala丙氨酸S Ser絲氨酸I Ile異亮氨酸L Leu亮氨酸T Thr蘇氨酸V Val纈氨酸P Pro脯氨酸K Lys賴氨酸H His組氨酸Q Gln穀氨醯胺E Glu穀氨酸W Trp色氨酸R Arg精氨酸DAsp 天冬氨酸NAsn 天冬醯胺CCys 半胱氨酸XXaa 另一個殘基或者幾個殘基之一本發明有幾點益處和優點。
一個突出的益處是所說的抑制肽比CS-1本身具有更大的抑制VLA-4/CS-1結合作用的效力。
本發明的另一個益處是已經證明典型的抑制肽可以有效地降低在宿主哺乳動物中的各種典型的免疫炎症疾病。
本發明的一個優點是在實驗哺乳動物宿主中以高達600毫克/kg/天的濃度給藥時沒有觀察到毒副作用。
本發明的另一個優點是所說的抑制肽具有相對小的分子量，容易以高產率和純度製備。
本發明的其它的益處和優點對本領域內技術人員而言，根據下面公開的內容是顯而易見的。附圖簡述下面的附圖是公開內容的一部分
圖1示出用CS-1肽本身和具有其部分序列的較短的肽，對攜帶VLA-4的Jurkat細胞與固相結合的CS-1肽(SEQ ID NO1)的結合的體外抑制情況。顯示的數據為相對於所給出的「標準」(SEQ ID NO3)的百分數。在標準物的左面顯示了在肽B12(SEQ ID NO2)的「N-末端」有缺失的肽的資料，在標準物的右面顯示了在肽B12「C末端」有缺失的肽的數據。肽序列以單字母密碼表示。
圖2是以類似於圖1所述獲得的和表示的數據。在這裡，進一步描述了更短的缺失肽的抑制作用。
圖3是圖1中討論的結合數據的另一個圖。該圖利用了以log值為標尺的座標。這些數據排列在五個組中，並且以相對於所指定的標準肽(SEQ ID NO3)的位置顯示，其中D-脯氨酸以「p」表示。最右手的兩組數字表明，三個不同的X組對單個指定肽的作用和三個Z組的作用，其中X是苯乙醯基(Ac)，Z則如圖所示。
圖4顯示為圖4A和圖4B兩組，表示所說肽在治療兔的哮喘中的效果。圖4A顯示在誘導哮喘攻擊之後6個小時內動力學慣量(Cdyn)的變化百分數。在空心圈顯示由含有抑制肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-嗎啉醯胺的噴霧組合物治療兔的數據，用塗黑的圈表示未治療的兔的數據；兩種圈當中包括誤差線。該縱座標的單位為起始動力學慣量值的變化百分數，橫座標的單位為攻擊之後的小時數。
圖4B顯示用圖4A中提供的數據進行的同樣的研究得到的肺抗性(LR)變化的百分數。縱座標是原始的肺抗性值變化的百分數，橫座標表示時間。
圖5顯示在14隻鼠的耳朵檢測的抑制肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2對延遲型超敏性的作用的研究結果。在免疫接種之後，用一個移植泵在24小時內給有七隻老鼠的組僅提供鹽水溶液進行處理並且攻擊。對其它免疫接種的七隻老鼠的組進行同樣的攻擊，但是每隻老鼠用含有上述抑制肽的水性藥物組合物處理同樣的24小時，所說的藥物組合物也是採用一個移植泵供應給老鼠。縱座標的單位為在攻擊位點膨脹直徑的英寸數。
圖6顯示對實驗性的自動免疫腦脊髓炎(EAE)進行治療的兩次研究中，每次治療的六隻老鼠得到的平均臨床分數。塗黑的圈是利用抑制肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2進行治療的結果，塗黑的方框顯示的是用實施例6無規序列肽進行治療的結果。縱座標顯示在每次研究中六隻老鼠的平均分數，橫座標表示EAE起始的天數。
圖7顯示在圖4中描述的患有哮喘的羊模型中相對於基底的肺抗性SRL的變化百分數。空心圈的噴霧組合物含有N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2，塗黑的圈表示的是無規序列的該肽(實施例6)，在合適處包括誤差線。發明詳述本發明涉及一種抑制肽，含有所說肽的組合物以及使用該肽的方法。所說肽抑制纖維蛋白連接素的CS-1肽與炎性細胞VLA-4表面受體的結合，因此，本文中有時將該肽稱為抑制肽。A肽所說肽被認為是整個纖維蛋白連接素分子的模擬體，或者至少是結合到VLA-4受體上的纖維蛋白連接素的25個殘基(25-聚體)CS-1部分(SEQ ID NO1)。從下述討論可以看出，所說肽與VLA-4受體的結合比存在於纖維蛋白連接素中的CS-1 25聚體肽與VLA-4受體的結合更緊密。
廣義上說，所說的抑制肽可定義為具有下列通式A的結構X-B-Asp-Z A其中B是一種α-疏水胺基酸殘基，它的側鏈具有約2-5個亞甲基的長度；X是一個以醯胺鍵連接到Bα-胺的氮原子上的基團，所說X基團具有鍵合到所說醯胺鍵的羰基碳上的環結構，所說的鍵合通過一個具有0-約2個亞甲基長度的間隔基連接，包括所說間隔基和羰基碳的X的長度是約3-喹啉羰基的長度或者更小，所說的環結構是5-和6-元環或者一個融合的6，6-或者6，5-元環；和Z選自於下列基團(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者芳香胺基酸殘基；即具有一個含1或者2個融合的芳香環的側鏈的胺基酸殘基，NCy1是一個含有環的基團，該基團具有一個位於環上的氮原子，該氮原子與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，並且NCy1的環含有5-或6-個原子包括所說環上氮原子；和(b)NCy2，其中所說的氮原子是環基團的胺取代基，該氮原子與所說Asp的α-羧基基團形成一醯胺鍵，該胺取代基與一個6-或者7-元環鍵合，或者與一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環體系鍵合，其中所說攜帶胺取代基的環是飽和的並且在所說內醯胺的羰基的α位上含有胺取代基。
通式A的肽是水溶性的並且在一個體外檢測試驗中所說的肽抑制Jurkat細胞(ATCC TIB 152)與固相結合的SEQ ID NO1的肽結合，所說的檢測試驗是在pH值為7.2-7.4的含水緩衝液中進行的，其抑制程度與由SEQ ID NO3的肽顯示的抑制所說結合的程度相等或者高至約3000倍。
通式A的肽序列可能需要CS-1(SEQ ID NO1)和B12(SEQ ID NO3)纖維蛋白連接素肽提供的Asp。除了該Asp以外，由於Glu和其它殘基幾乎不能抑制結合，所以似乎需要Asp的大小和電荷以便於結合，在選擇B殘基時考慮大小和相對疏水性似乎是最重要的。對其它殘基的要求將在下文中討論。
B殘基側鏈的長度是約2-5個亞甲基。利用商業上可購買的原子模型或電腦程式可以很方便地從標準鍵長度Van der Waals半徑確定所說長度。利用該側鏈長度可以看到環己丙氨酸和苯丙氨酸有一個長約五個亞甲基的側鏈；即一個亞甲基加上側鏈中的四個環碳。一個具有甲基，硫和兩個亞甲基的甲硫氨酸側鏈還要更短。
典型的B殘基如胺基酸選自於下列組，亮氨酸(Leu)，環己丙氨酸，正亮氨酸(Nle)，甲硫氨酸(Met)，高絲氨酸，蘇氨酸(Thr)，苯丙氨酸(Phe)，纈氨酸(Val)，正纈氨酸(Nva)和異亮氨酸(Ile)。B最優選的是Leu。
優選的所說的抑制肽具有相應於下列通式I的結構X-Leu-Asp-Z IX是一個以醯胺鍵連接到Leu的氮原子上的基團，所說X基團具有鍵合到所說醯胺鍵的羰基碳上的環結構，所說的鍵合通過一個具有0-約2個亞甲基長度的間隔基連接，包括所說間隔基和羰基碳的X的長度是約3-喹啉羰基的長度或者更小，所說的環結構是5-和6-元環或者一個融合的6，6-或者6，5-元環；和Z選自於下列基團(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者一個具有一個含1或者2個融合的芳香環的側鏈的胺基酸殘基，NCy1是一個含有環的基團，該基團具有一個位於環上的氮原子，該氮原子與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，並且NCy1的環含有5-或6-個原子包括所說環上氮原子；和(b)NCy2，其中所說的氮原子是環基團的胺取代基，該氮原子與所說Asp的α-羧基基團形成一醯胺鍵，該胺取代基與一個6-或者7-元環鍵合，或者與一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環體系鍵合，其中所說攜帶胺取代基的環是飽和的並且在所說內醯胺的羰基的α位上含有胺取代基。
通式I以及下文中通式II和通式III的肽是水溶性的並且在一個體外檢測試驗中所說的肽抑制Jurkat細胞(ATCC TIB 152)與固相結合的SEQ ID NO1的肽結合，所說的檢測試驗是在pH值為7.2-7.4的含水緩衝液中進行的，其抑制程度比由SEQ ID NO3的肽顯示的抑制所說結合的程度高10至約3000倍。
檢驗通式I，可以看到至少存在CS-1(SEQ ID NO1)和B12(SEQ ID NO2)纖維蛋白連接素肽的Leu和Asp。除去這兩個殘基，所述抑制肽的序列/結構和CS-1或B12部分完全不同。
因此，在CS-1和天然蛋白質中有一個以肽-(醯胺-)鍵合到Leu殘基的α-胺基團上的異亮氨酸(Ile；I)，一個含有環形結構的基團或者成分X是藉助由含有環形結構的基團提供的羧基以醯胺鍵鍵合到B或者Leu殘基α-氨基(分別是通式A或者I)的氮原子上。所提供的醯胺鍵可以作為含有羧基醯胺[-C(O)NH-]，尿烷[-O-C(O)NH-]或者脲[-NH-C(O)NH-]的間隔基團的一部分存在，該間隔基團將含有環結構的基團連接到Leu殘基。
從廣義上說該環結構可以是任何五或者六元環，該環是飽和的或者含有不飽和的烯鍵。該環結構可以含有除碳以外的一個或多個原子，例如氮，氧或硫。該環結構也可以是融合的環系統，其中兩個六元環融合在一起(6，6-)或者一個六元環與一個五元環融合(6，5-)。該環狀結構的環優選的是芳香環。
典型的環結構包括四氫呋喃，四氫吡喃，環戊基，環己基，苯基，吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，吡唑基，吡咯烷基，呋喃基，哌啶基，萘基，喹啉醯基，萘烷基，喹唑啉基，咪唑基，苯硫基等等，苯基和吡啶基的環狀結構是特別優選的。
一個環結構可以直接鍵合到醯胺鍵的羰基[-C(O)-]，該醯胺鍵鍵合到B或者Leu殘基上。該環與羰基之間也可以由高至約2個亞甲基(-CH2-)或者一個亞乙基(-CH2-CH2-)的長度間隔開。
一個亞甲基的Van der Waals半徑(約2.0)比一個氧基(-O-；約1.40)或者一個亞氨基(-NH-；約150)稍微長一些，在亞甲基，氧基和亞氨基之間的足夠相似性使得含有-CH2-O-，-CH2-NH-，-NH-NH-，或者-O-NH-的間隔基團具有類似的長度並且是在亞乙基-CH2-CH2-的長度範圍內。如果利用鍵長度(距離)則獲得類似的結果。所說的間隔包括-HC(CH3)-CH2-，-CH2-CH2-，-NH-O-，-HN-NH-，-CH2-O-和-CH2-NH-，並且優選的是沒有不飽和鍵。
利用苯環作為典型的芳香環結構，可以看到所說的X基團包括3-甲基-3-苯基丙醯基，3-苯基丙醯基，苯基羥氨基羰基，[Ph-NH-O-C(O)-]，苯醯肼羰基[Ph-NH-NH-C(O)-]，苄氧基羰基[Ph-CH2-O-C(O)-]，苯氧基乙醯基[Ph-O-CH2-C(O)-]，苄基氨基羰基[Ph-CH2-NH-C(O)-]，和苯胺乙醯基[Ph-NH-CH2-C(O)-]，其中「Ph」是一個苯基。
因此，合乎需要的是前面描述的環結構藉助於一個具有長度為0個亞甲基(直接鍵合)，一個或兩個亞甲基的間隔基鍵合到B-或者Leu-連接的醯胺基的羰基碳上。但是不同的，該間隔基具有約一個亞乙基或更短的長度。
鍵合到B或者Leu α氨基的氮原子上的苯乙醯基，苯氧羰基或者苯胺基羰基含有一個具有約1個亞甲基長度的間隔基。苯基(苄氧基)，1-或者2-萘基(1-或者2-萘羰基)，2-，3-或者4-吡啶基(2-，3-或者4-吡啶羰基)，2-或者3-苯硫基(2-或者3-噻吩基；2-或者3-噻吩羰基)和2-或者3-呋喃基(2-或者3-呋喃羰基)環結構直接鍵合到醯胺的羰基碳上，因此，利用具有長度為0個亞甲基的間隔基定義一個X基團。由是苄酯基[Ph-CH2-O-C(O)-]，苄氨基羰基[Ph-CH2-NH-C(O)-]，苯氧甲基羰基[Ph-O-CH2-C(O)-]等等的X基團提供長度為約2個亞甲基的間隔基。
也可以用C1-C2烷基或者羥基取代所說的5-或者6元環結構。因此，以苯基為例典型的取代的環結構包括2-，3-或者4-乙基苯基，2，6-，3，4-或者2，3-二甲基苯基，2-，3-或者4-羥基苯基，2，6-，2，-4-，3，4-和3，5-二羥基苯基，等等。
據認為X取代基的環結構在所說的抑制劑中以某種方式將抑制肽固定到VLA-4受體的結合區以便使B或者Leu和Asp基團處於合適的構型。由於具有所假定的將該肽固定到其受體中的作用，除了在前面說明的有關間隔基團長度以外，對於含有環結構的和間隔基的X的大小有某些限制。因此從鍵合到B或者Leu上的醯胺鍵的羰基含有的碳，到環的末端或者與羰基最遠的取代基，間隔基加上含環結構部分的X的總長度為約3-喹啉羰基的大小或者更小。
由於3-喹啉羰基是所說的最長的含環結構的X取代基，所以3-喹啉羰基沒有加到其長度上的上面討論的取代基。
按照前面討論的方法，可容易地確定一個給定的X取代基的長度。例如可以利用空間填充模型構造典型的含環結構的X基團，然後比較所製備的模型的相對大小。也可以利用公開的鍵長度和鍵角度製備該尺寸的2維圖形。計算機作圖程序也是公知的和可以獲得的，可用於製備與3-喹啉醯基進行長度比較的X基團模型。
包括間隔基，環狀結構，羰基的X取代基和B或者Leu的α-氨基氮一起可以形成一個芳香環取代的環亞氨基。所說的環亞氨基的例子是苯二甲醯亞氨基(優選的)，2，3-和3，4-吡啶二羧亞氨基，高苯二甲醯亞氨基和1，2，3，4-四氫喹唑啉-2，4二酮-3-基中的任一種，其中芳香環和環亞氨基融合在一起。
在另一個典型的化合物中，B或者亮氨酸氮原子是一個在5-苯海因-3-基的環內的亞氨基氮原子，所以芳香苯環是環間隔基的取代基並且與連接到亮氨酸殘基上的羰基約有一個亞氨基的間隔。在B或者Leu氮原子上形成的2-苯基琥珀醯亞氨基中存在含有類似結構的亞氨基氮的X基團。
因此，可將上述討論的X基團的含有環狀亞氨基和海因的部分認作為特定的間隔基團，該基團限制了環狀結構的構型的自由度。因此，例如一個苯基乙醯基的羰基、亞甲基和苯基部分每個都是游離的並可以有一個或多個構型，一個苯二甲醯亞氨基X基團僅圍繞亮氨酸氮-次甲基鍵的軸旋轉。
值得注意的是雖然X取代基必須含有可如前面所討論的被取代的環結構，該X取代基也可包括除在環結構以外的部位的取代基。如果存在其它的取代基則X優選的是一個具有環狀側鏈的胺基酸殘基，因此包括伯胺或仲胺。這裡，X優選的為脯氨醯基，苯丙氨醯基，酪氨醯基或者苯基甘氨醯基殘基，其α氨基的氮原子鍵合到該進一步的取代基上。
該進一步的取代基可以是一個胺基酸殘基，所說殘基為CS-1多肽序列的殘留部分到其N末端，它具有從SEQ ID NO1的N末端的第19位異亮氨酸開始的多肽序列。由此，限定了一個單個的殘基或者18個單獨的胺基酸殘基的取代序列。
藉助一個X的胺基團連接的另一個典型的進一步取代基是生物素。在一個特定的實施例中以醯胺鍵鍵合到ε-氨基癸酸上的生物素是以醯胺鍵鍵合到作為X基團的苯丙氨酸(Phe)的α胺上。得到的化合物含有藉助一個十二原子的鏈連接到Phe X基團上的生物素融合的環。
還應明白具有環狀側鏈的X基團胺基酸殘基也可以不含有取代基。還可以用C1-C6醯基，例如甲醯基，乙醯基，異丁醯基或者己醯基，將該殘基的α胺的氮原子醯基化。鍵合到α胺基團的氮原子上的C1-C6醯基在該氮原子上形成一個醯胺鍵，並且與未取代的游離α胺提供的正電荷相比，在pH7.2-7.4沒有給該肽提供離子電荷。
前面討論的通式中的Z基團可以是兩種類型的基團之一。在一個實施方案(A)中Z基團是以肽鍵鍵合到Asp羧基上的一個疏水胺基酸殘基Xaa，並且該殘基連接到含有環的NCy1基團，該NCy1具有與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵的環上氮原子(NCy1的氮)。NCy1的環含有5-或者6-原子，包括所說的氮原子(NCy1的氮)。所說的疏水胺基酸殘基是那些具有脂族側鏈的胺基酸例如纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸。更優選的Xaa含有一個疏水的芳香族胺基酸殘基；即Xaa是具有含一個或兩個融合芳香環的芳香側鏈的胺基酸。所說芳香族胺基酸的例子是天然存在(遺傳編碼的)的苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸，以及苯基甘氨酸，高苯丙氨酸，對-硝基苯丙氨酸，苯硫基甘氨酸(噻吩基甘氨酸)等等。
典型的NCy1基團包括嗎啉基，硫代嗎啉基，硫代嗎啉基碸[4-(噻二氧代)哌啶基]，哌啶基，哌嗪基，吡咯烷基，吡唑基，吡唑啉基，惡唑烷基和例如它們各自相應的醯胺。一個NCy1環也可以被選自於下列基團的一個或兩個取代基所取代，所說取代基為羧基，羧醯胺，C1-C4亞烷基羧基，C1-C4亞烷基羧醯胺，羥基，羥甲基，(CH2CH2O)nH，其中n是1，2或3，以及C1-C4烷基。吡咯烷2位上的羧基取代基提供脯氨酸，其D-和L-形式是本文中所說的兩種類型。當是嗎啉基，哌啶基，哌嗪基和4-羥基哌啶基時特別優選的是D-脯氨醯基(有時以黑體小寫單字母胺基酸密碼顯示為「p」或D-Pro)的醯氨基衍生物(D-Pro-NH2)。
典型的C1-C4烷基包括甲基，乙基異丙基，正丁基和t-丁基。C1-C4烷基還可以與NCy1例如哌嗪的第二個氮原子形成一個季銨基。當C1-C4的烷基是甲基時，碘是陰離子並且典型的NCy1基團是4，4-N，N-二甲基哌嗪鎓基碘化物。
典型的C1-C4亞烷基羧基和C1-C4亞烷基羧醯胺基團包括亞甲基羧基(-CH2CO2H；羧甲基)和亞甲基羧醯氨基(-CH2CONH2；羧醯氨甲基)，亞乙基羧基(-CH2CH2CO2H；羧乙基)和亞乙基羧醯氨基(-CH2CH2CONH2；羧醯氨基乙基)以及亞丁基羧基(-C4H8CO2H；羧丁基)和亞丁基羧醯氨基(-C4H8CONH2；羧醯氨基丁基)。其中n是1，2或3的典型的(CH2CH2O)nH基團，包括2-羥乙基(n＝1)，5-羥基乙烯氧基-乙烯(乙烯氧基乙醇；5-羥基-3-氧雜戊基；n＝2)和8-羥基-3，5-二氧雜-癸基(n＝3)。
當NCy1包括哌嗪基時，第二個(四位的)氮原子不僅被烷基化作用而季銨化，還被醯胺化。哌嗪基-4-N-醯胺的典型的醯基部分包括C1-C7醯基例如甲醯基，乙醯基，丙醯基，異丁醯基，己醯基和苯甲醯基，而且包括氨磺醯例如苯基亞磺醯氨基，甲苯基氨磺醯(甲苯磺醯基)，甲基亞磺醯氨基(甲磺醯)和三氟甲基亞磺醯氨基(三氟甲磺醯基)。
因此，在這些Z是Xaa-NCy1的實施方案中，Xaa是一個特定的胺基酸殘基，它的氨基與所指定的Asp殘基的α-羧基形成一個醯胺(肽)鍵，並且它的羧基與NCy1的5或6元環內存在的氮原子形成醯胺鍵。
在Z是NCy2的另一個實施方案(B)中，所說的氮原子(NCy1的氮)是一個環基(Cy2)的胺取代基，它的取代氮原子與所說Asp殘基的α-羧基形成一個醯胺鍵。該胺取代基鍵合到一個環基上面，該環基是(i)一個六或七元環或者(ii)一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環系統，其中攜帶有胺取代基的環是飽和的(沒有不飽和烯烴)並且含有在內醯胺的羧基上α位取代的胺。
將環系統連接到該肽的其餘部分上的氮原子是一個環結構的取代基，而不是一個如在NCy1中的環原子。另外以氮作為取代基的環是兩種類型，6-或7-元環或者6，6-或者6，7-員融合環系統，所說環之一是內醯胺。在每種情況下，在該實施例中沒有Xaa胺基酸殘基。
典型的所說類型的含有胺取代基的6-和7-元環NCy2基團包括苄胺，苯乙胺，2-(N-嗎啉)-乙胺，N-[1-(羧醯氨基甲基)-己內醯氨-3-基]胺，N-(己內醯胺-3-基)胺和N-(戊內醯胺-3-基)胺基團，所說的胺基與Asp的α-羧基形成相應的醯胺。典型的含有氨基取代的6，6-和6，7-融合的環內醯胺的NCy2包括在表1基團的腳註7顯示的N-[1-(2-N-嗎啉乙基)-2-氧代-四氫喹啉-3-基]胺，N-(2-氧代-四氫喹啉-3-基)胺和6，7-融合的環的三環化合物，所說的胺與Asp的α-羧基形成相應的醯胺。
通常已經發現一旦(i)上面討論的通式的X基團由含有芳香環的部分佔據，該部分與羰基間隔基一個亞甲基的距離或者間隔基小於一個亞甲基的距離，(ii)Z是一個芳香胺基酸，和(iii)NCy1是L-或D-脯氨醯胺或者如上討論的5或6員的含氮環，基本上說還可以存在連接到肽的任一末端不損害所說肽的抑制活性的其它取代基，只要所說的肽是水溶性的。
因此，例如具有連接到序列Leu-Asp-Phe-Pro上的一個N末端苯乙醯基的SEQID NO5的肽進一步包括以醯胺鍵鍵合到Pro上的取代的四亞乙基二胺基團，其中，四個苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-Pro基團是以醯胺鍵鍵合到四亞乙基二胺氮原子上，並且還具有VLA-4結合抑制作用，所說抑制作用比標準SEQ ID NO3的10聚體肽高約210倍。
同樣，PheLeuAspPhe-D-Pro-NH2肽在其N末端含有一個含銪的螯合劑，所說螯合劑鍵合到N末端Phe的氮原子上。該肽顯示出比SEQ ID NO3肽的結合抑制作用高約120倍。
預測SEQ ID NO12肽，苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-Pro-NH(CH2)5C(O)NHC18H37是一個良好的抑制劑。但是該肽不是水溶性的並且形成一個混濁的懸液而不是一個溶液。該肽顯示的結合抑制作用類似於由標準的SEQ ID NO3 10聚體肽的作用。
雖然一旦掌握了如下文中討論的足夠的資料，熟練的技術人員通常可以對所說肽的預期的效力進行準確的預測，但是與結合現象有關的結構-功能關係如本文中討論的還沒有完全弄明白。的確，基本上所有由前面討論的通式定義的化合物均抑制CS-1肽和VLA-4受體的結合。而且，由於直接鍵合到通式1的Leu和Asp上的取代基變化很大並且影響對VLA-4的結合抑制作用，因此，在標準的體外檢測中與已知的標準10聚體肽抑制劑相比，優選的所說抑制肽不僅由其結構限制，而且由其作為抑制劑的效力所限制，從而所說的抑制劑僅包括那些比已知的10聚體抑制劑的結合抑制作用高一個數量級或多個數量級的抑制肽。
因此，所說的抑制肽在PH7.2-7.4的含水緩衝液中可以抑制含有VLA-4受體的炎性細胞[Jurkat細胞(美國典型培養物收集中心，Rockville，MD 20852，ATCCTIB 152)]與固相結合CS-1肽(SEQ ID NO1)的結合，其抑制程度比標準的SEQ ID NO3的10聚體肽[GPEILDVPST，單字母表示]的抑制作用高約10倍到1000倍並且更優選的是3000倍。更優選的是所述結合被抑制約50-3000倍，最優選的是約100-3000倍。
按照肽的濃度檢測結合抑制率，即該肽抑制標準數目的Jurkat細胞與標準量的結合到微滴板孔表面的CS-1肽的結合作用的一半所需的濃度。該濃度通常以IC50值表示，較小的數目表示抑制50％的結合需要較低的濃度，因此，具有更強的效力。下文中進一步提供了具體的檢測方法。
簡而言之，通式A或I的肽抑制纖維蛋白連接素的CS-1肽區與VLA-4受體的結合。但是，優選的是具有至少比SEQ ID NO3的肽高10倍的抑制作用的抑制劑。
更優選的是下面通式II的肽
Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1II其中Ar是吡唑基，苯基，吡啶基(2-，3-或4-)，或者3-喹啉基；Y是一個間隔基，它可以不存在，或是-CH2-，-CH(NH)-，-O-或者-NH-；或者Ar-Y-C(O)-與所說Leu的氮原子形成一個苯二甲醯亞氨基，1，2，3，4-四氫喹唑啉-2，4-二酮-3-基或者5-苯海因-3-基基團，和Ar-Y-C(O)-具有約3-喹啉羰基的長度或者更短；Xaa是一個芳香族胺基酸殘基；即具有芳香側鏈的胺基酸殘基，例如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，高苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸，噻吩基甘氨酸和苯基甘氨酸，和NCy1是一個含有胺的5-或6元環，其中所說的氮原子位於環上並且與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，如前面討論的。
因此，進一步對通式II的水溶性化合物檢查顯示，其結合抑制作用比SEQID NO3肽的抑制作用至少高10倍，因此，不需要體外研究以完全鑑定，儘管該檢測可用於所有優選的抑制肽。
結合上述考慮，Ar-Y-C(O)，通式I的更優選的X基團是優選為苯甲醯基，苯乙醯基，4-吡啶羰基(異煙醯基)，3-吡啶羰基(煙醯基)，3-吡啶乙醯基，苯胺基羰基，3-喹啉醯基，吡唑羰基，色氨醯基和3，4-二羥基苯甲醯基，最優選的是苯乙醯基(苄羰基)，或者Ar-Y-C(O)與亮氨酸的氮原子一起形成苯二甲醯亞氨基。Xaa優選的是Phe，Tyr或者Trp，最優選的是Phe。NCy1優選的是嗎啉醯胺；哌啶醯胺；或者取代的哌啶醯胺，其中的取代基選自於下列組，羥基，羧基，羧醯氨基；哌嗪基或者4-取代的哌嗪基，其中4-取代選自於下列組C1-C4烷基，C1-C4亞烷基羧基，C1-C4亞烷基羧醯胺，(CH2CH2O)nH其中n是1，2或3；硫代嗎啉基；L或D-脯氨醯氨基；吡咯烷基；3，4-二羥基吡咯烷基；2-(羥甲基)吡咯烷基和4-(噻二氧代)哌啶基，最優選的是嗎啉醯胺，D-脯氨醯胺，哌啶基，上面所說取代的哌啶基，哌嗪基，上面所說取代的哌嗪基和吡咯烷基。
最優選的肽對應於下面通式III的肽的序列，
苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-NCy3III其中NCy3是最優選的NCy1基團並且選自於下列組嗎啉醯氨基，硫代嗎啉醯氨基，4-(噻二氧代)哌啶醯氨基，D-2-(羧醯氨基)吡咯烷醯氨基，哌嗪醯氨基，取代的哌嗪醯氨基其取代基選自於下列組4-N-羧甲基，4-N羧醯氨基甲基，4-N-(5-羥基乙烯氧基乙烯)和4-N-p-甲苯氨磺醯，吡咯烷醯氨基，哌啶醯氨基和取代的哌啶醯氨基其中取代基選自於下面組4-羥基，4-氨甲醯，4-羧基。
下面的表1中列出了典型的抑制肽以及相對於SEQ ID NO3標準肽而言，這些肽的結合抑制作用效力。
表1對結合VLA-4的CS-1的相對肽抑制作用ID NO通式1X Z2相對效力6XLDFZ 苯乙醯基4-N(羧甲基)哌嗪醯胺82579XLDFZ 苯乙醯基4-(噻二氧代)哌啶醯胺91060XLDFZ 苯乙醯基4-(氨基甲醯)哌啶醯胺10933XLDFZ 苯乙醯基嗎啉醯胺 844XLDFZ 苯乙醯基4-(羧基)哌啶醯胺 828XLDFp 吡啶-4-羰基 醯胺 656XLDYp 苯乙醯基醯胺 640XLDFZ 苯乙醯基4-羥基哌啶醯胺603XLDFZ 苯乙醯基哌嗪醯胺 506XLDFZ 苯乙醯基4-N-(5-羥乙基氧基亞乙基)-哌嗪醯胺11505XLDFZ 苯乙醯基硫代嗎啉醯胺 493XLDFp 吡啶-3-乙醯基 醯胺 469XLDFP 苯乙醯基醯胺 405XLDFP 苯乙醯基4-N-(甲苯氨磺醯)-哌啶醯胺 360XLDFZ 苯乙醯基4-N-(羧醯氨基甲基)哌嗪醯胺319XLDFZ 苯乙醯基嗎啉醯胺 313XLDFZ 苯乙醯基4，4-N，N-(二甲基)-哌嗪鎓碘化物12313XLDFp 苯乙醯基醯胺 313XLDFZ 苯乙醯基嗎啉醯胺 291XLDFZ 苯乙醯基吡咯烷醯胺 250XLDFZ 苯乙醯基哌啶醯胺 231XLDFp 苯胺基羰基 醯胺 227XJDFp 苯乙醯基醯胺 J＝環己基-Ala5217XLDFPZ 苯乙醯基肽取代的四亞乙基-戊胺3209XLDFp 吡啶-3-羰基 醯胺 201XLDFZ 苯乙醯基3，4-二羥基吡咯烷醯胺 194XLDFZ 苯乙醯基2-(羥甲基)脯氨醯胺 184XLDWp 苯乙醯基醯胺 184BZFLDFp B＝生物素醯胺 Z＝ε-醯氨基己醯 醯胺150XLDVp 苯二甲醯亞氨基 醯胺 140ZXFLDFp ε-醯氨基己醯 Z＝銪標記4醯胺118XLDVp 苯乙醯基醯胺 106XLDZ 苯乙醯基N-[1-(羧醯氨基甲基)己內醯胺-3-基]醯胺 97XLDJp 苯乙醯基醯胺J＝高-Phe594XLDFZ 3，4-二羥基 哌啶醯胺81苯乙醯基XLDFp 苯甲醯基醯胺75XLDVp 吡啶-3-羰基 醯胺71XLDJp 苯乙醯基醯胺 J＝苯基-Gly561XLDFp 3-喹啉羰基 醯胺56XLDFp 1，2，3，4-四氫喹 醯胺56唑啉-2，4-二酮-3-基XLDZ 苯乙醯基6，7-融合的環內醯胺750XKDFp 苯乙醯基醯胺 J＝Nle549PLDFp 游離胺 醯胺47XLDZ 苯乙醯基N-[(1-羧醯氨基甲基)-2-氧代- 45四氫喹啉-3-基]醯胺XFLDLZ GlcNAc-O- 哌啶醯胺41(CH2)5-C(O)XLDJp 苯乙醯基醯胺 J＝對硝基-Phe540XLDVP 苯甲醯基醯胺37FLDFp乙醯基 醯胺 35XLDFp苄氧羰基 醯胺 34XLDFZ(5-苯基)海因基 哌啶醯胺 34XLDFp吡唑羰基 醯胺 35FLDFp乙醯基 醯胺 33XLDZ 苯乙醯基 N-(2-氧代-四氫喹啉-3-基)醯胺 31XLDZ 苯乙醯基 N-(己內醯胺-3-基)-醯胺 27XLDFZ苯乙醯基 丙醇醯胺 25XLDYZ4-吡啶羰基 哌啶醯胺 24XLDZ 苯乙醯基 N-[1-(2-N-嗎啉乙基)2-氧代- 20四氫喹啉-3-基]醯胺XLDVp特戊醯 醯胺 20XLDVp苯甲醯基 醯胺 20XLDZ 苯乙醯基 苄基醯胺 19XLDZ 苯乙醯基 苯乙醯胺 19XJDFp苯甲醯基 醯胺 J＝環己基-Ala517XLDZ 苯乙醯基 N-D-(己內醯胺-3-基)醯胺 17XLDSp苯乙醯基 醯胺 17XLDYZ苯乙醯基 t-丁酯 15XLDVp苯丙醯基 醯胺 14XLDZ 苯乙醯基 N-(2-N-嗎啉)乙醯胺 13XJDVp苯甲醯基 醯胺 J＝環己基-Ala511FLDVp游離胺 醯胺 10XLDFp2-哌嗪羰基 醯胺 9XLDGZ苯乙醯基 嗎啉醯胺 9XLDVp2，3-二甲基醯胺 9苯甲醯基XLDVp3，4-二甲基醯胺 8苯甲醯基XLDVp吡啶-2-羰基醯胺 8XLDZ 苯乙醯基 Z＝N-[1(N-環己基)丁內醯胺 7-3-基]醯胺XLDZ 苯乙醯基 N-(1-異丁基-2-氧代-四氫喹啉 6-3-基)醯胺XLDFZ苄基 哌啶醯胺 6fLDVp游離胺 醯胺 5XLDVp 環己羰基 醯胺 5XLDVp 2，6-二甲基 醯胺 5苯甲醯基XLDFp 2-喹啉羰基 醯胺 4XLDVp 3-甲基戊醯基 醯胺 3XLDZ 苯乙醯基 N-(四氫異喹啉-3-基)醯胺 3pLDFp 游離胺 醯胺 3XLDFp 8-喹啉磺醯基 醯胺 3XLDFZ 苯乙醯基 正丁醯胺 3XLDVp 四甲基戊醯基 醯胺 3XLDY 苯乙醯基 正丁酯 3XLDZ 苯乙醯基 苄基羥醯胺 3XLDFp 對-溴苯乙醯基醯胺 3ILDFp 游離胺 醯胺 2XLDFPZ 苯乙醯基 癸醯胺 2ILDVPILDVp 游離胺 醯胺 2XJDFp 苄醯胺 醯胺 J＝二羧基-Leu52XLDVp 環己乙醯基 醯胺 2XLDZ 苯乙醯基 N′-t-Boc-醯肼 2ILDFP 游離胺 醯胺 2XLDVp 1-萘醯 醯胺 1XLDVp 環己丙基 醯胺 1XLDZ 苯乙醯基 N′-苄基-N′-環戊羰基醯肼1FJDFp 游離胺 醯胺 環己基-Ala51iLDVp 游離胺 醯胺 1ILDVp 游離胺 醯胺 1IJDFp 游離胺 醯胺 環己基-Ala51XLDVp 肉桂醯 醯胺 1GPEILDVPST 游離胺 游離酸 1XLDFPZ 苯乙醯基 HN(CH2)5C(O)NHC10H171XLDVp 金剛烷羰基 醯胺 1XLDVp 2-萘醯 醯胺 1ILDVP 游離胺 醯胺 1ILDVP 游離胺 游離酸 1XLDF 苯乙醯基 醯胺 ＜1XLDFZ 苯乙醯基 N-(4-辛醯氧基)哌啶醯胺 ＜1
XLDFZ 苯乙醯基 N-(4-硬脂醯氧基)哌啶醯胺＜1XLDZ 苯乙醯基 醯肼＜1SFDFS 乙醯基 醯胺＜1IJDVp 游離胺 醯胺 J＝環己基-Ala5＜1XLDFp 4-溴苯磺醯基 醯胺＜1LDFZ 游離胺 哌啶醯胺 0JDFZ J＝異丁氧基羰基哌啶醯胺 0XLDZ 苯乙醯基 N′，N′-二苄基醯肼 0XLDZ 苯乙醯基 N-(1，3-二苯基丙-2-基醯胺 0XLDZ 苯乙醯基 二苄基醯胺0XLDFp 苯磺醯基 醯胺 0LDV 乙醯基 醯胺 0LDF 乙醯基 醯胺 0LDF 游離胺 醯胺 0LDV 游離胺 醯胺 0fLDVp 游離胺 游離酸0XLDFp 苯乙醯基 醯胺 無規 0注1用相同的單字母密碼的小寫字母表示L-胺基酸殘基的D-異構體，因此，p＝D-脯氨酸；f＝D-苯丙氨酸；i＝D-異亮氨酸。
N-末端α-胺如所示被取代，或者指示為「游離胺」2Z的C-末端羧基的狀態合適地表示為「醯胺」(-NH2)或「游離酸」。
3Z是C-末端Pro羧基與含有以醯胺鍵與之鍵合的4個N-苯乙醯基-LDFP肽的四亞乙基戊胺之間形成的醯胺。
4以醯胺鍵與Z鍵合的二亞乙基三胺五乙酸銪(II)。
5「高-Phe」＝高苯丙氨酸；「苯基-Gly」＝苯基甘氨酸；「對硝基-Phe」＝對硝基苯丙氨酸；「β-羧基-Asp」＝β-羧基精氨酸；「環己基-Ala」＝環己基丙氨酸；「二羧基-Leu」＝二羧基亮氨酸；「Nle」＝正亮氨酸。
6相對活性約為SEQ ID NO3的肽顯示的活性的1/10或更小定義為相對效力為0。 表1數據可用於預測一種被改變的或者另一種抑制肽的結合抑制效力。因此，可以檢驗表1的結構並且利用所觀察到的相對抑制效力計算單個殘基或者末端基團的相對作用。利用這種計算，可以預測另一個所說肽的效力高約5-10倍。
例如，將由N-苯乙醯基-Leu-Asp-Val-D-Pro-NH2顯示的抑制作用和N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2顯示的抑制作用進行比較，可以看出用Phe替代Val使得抑制作用加強3倍，其它類似的吡啶-3-羰基衍生物之間的不同同樣為3倍。
因此可以預測剛才上面所說的肽的N-苯甲醯基衍生物，同樣地其效力約有3倍的不同。表1的數據指明所觀察的不同點是約3.8倍，從而證明了預測的結果。
進一步利用這些簡單化的程序，從肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2和N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-哌啶醯胺可以計算出D-Pro-NH2提供的活性比哌啶醯胺高約1.3倍。將後一肽的活性與具有嗎啉醯胺基團的肽的活性進行比較，可以計算出嗎啉醯胺活性比哌啶醯胺基團的活性加強了約3.6倍。將肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-Tyr-嗎啉醯胺和N-苯乙醯基-Leu-Asp-Tyr-D-Pro-NH2進行比較，發現嗎啉醯胺的活性比D-Pro-NH2強約2.05倍。利用這兩種計算，可以計算出嗎啉醯胺提供的活性比哌啶醯胺活性強約7.4倍(2.05×3.6倍)。預測的加強作用是用開頭的兩個肽(7.4/1.3)得到的作用的5.7倍，但是在前面預測的範圍內。
表1的數據還說明與本領域內其它的肽相比，本文所說的抑制肽顯示的結合抑制作用有未預料到的加強。例如，在WO93/12809報導的作為與VLA-4受體結合所需的基本肽的Leu-Asp-Val(LDV)肽顯示，與SEQ ID NO3的肽相比，作為N-乙醯基C-醯胺衍生物時其相對抑制結合活性為約1，作為N-游離胺C-醯胺時為0。用Leu-Asp-Phe(LDF)觀察到類似的結果(在那篇公開的申請中未公開該肽，但是，它是本文中的重要的核心肽)。相反，如果將本文定義的X和Z基團加到任一個肽的末端，觀察到抑制作用加強了約1-3個數量極。
圖1，2和3顯示的數據還證明相對於本領域內的其它肽而言，所說的肽所顯示的未預料到的結合抑制作用。利用單字母密碼顯示肽序列。
例如，圖1說明利用CS-1(SEQ ID NO1)肽，CS-1肽B12區(CS-1 B12；SEQID NO2)，本文中上述和其它地方以及本領域內所說的標準的10聚體肽肽(SEQ ID NO3)，和B12肽的幾個缺失類似物(每一個都含有Leu-Asp序列)完成的體外相對抑制作用的研究結果。在標準的10-聚體的左邊顯示N末端缺失類似物，該10聚體右邊顯示C末端缺失類似物。正如所看到的，CS-1肽比B12，10聚體或者該10聚體的九聚體缺失類似物的抑制效力高約3倍。後三種肽都比其它的B12相關肽的效力高。
圖2的類似方法獲得的數據說明了利用標準的10聚體肽的缺失類似物獲得的結合抑制效果。在標準的10聚體的左邊顯示N和C末端的缺失，用以分離出C末端的Leu-Asp-Val序列，而標準的10聚體右邊顯示的缺失用以分離出Asp-Val-Pro序列。這些肽和圖1的肽都具有游離的N末端氨基和C末端羧基。
圖3的數據是用類似的方法獲得的，但是以log值表示，以便容納所有的數據。圖3顯示的數據分成從左至右五個組。
第一組顯示CS-1肽和10聚體標準物的數據，接著的三條顯示具有天然CS-1肽的Leu-Asp-Vlal序列的5聚體C醯胺的數據，利用D-脯氨酸代替天然L-脯氨酸得到的加強作用，然後是利用苯丙氨酸和D-脯氨酸代替纈氨酸和D-脯氨酸得到的加強效果。接著的兩條顯示當含有環結構的X基團(這裡苯丙氨酸作為游離胺)用於替代天然序列的異亮氨酸時獲得的三個前面所說的肽獲得的進一步的加強作用。第四組說明利用兩個相鄰序列[XLDFp-NH2]的較好的肽序列，與苯丙氨酸基團相比，通式I的三個X基團的效果。在最後的三種肽中以苯乙醯基(Ac)作為X基團，其中利用三個環狀胺(NCy1)使通式I的D-脯氨酸Z基團發生改變。正如所看到的，利用嗎啉醯胺基團作為Z基團，並且利用苯乙醯基作為X基團以及利用苯丙氨酸作為通式I的Xaa，在這些研究中能夠提供最大的效力。
因此，表3的數據顯示與標準的10聚體和本領域的肽相比，本發明所說的肽抑制效果的變化約為三個數量級，本發明所說的肽的效果比這些肽的標準物的效力增加約10倍，增加約50-100倍，增加約1000倍。
除了比CS-1或者標準的10聚體肽具有更強的效力以外，本發明所說的抑制肽，尤其是具有非天然存在的末端基團例如N-苯乙醯基和C-嗎啉醯胺或者D-Pro-NH2的肽，在血清中比CS-1肽相對的更穩定。因此，在7.2-7.4的PBS(也含有百分之十的鼠或人血清)中經過24小時之後抑制肽N-苯乙醯基Leu-Asp-Phe-嗎啉醯胺和N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2的效力沒有損失。相反，在同樣的條件下，在不到一小時的時間內，CS-1肽失去了其效力。B合成本發明所說的抑制劑是肽或肽衍生物，並且同樣可以利用公知的合成方法很方便的合成。下文中提供了具體的合成實施例。
對於具有C末端胺基酸醯胺或者游離酸殘基的材料，可以利用固相合成法。因此，將N末端受保護的C末端殘基連接到具有二苯甲基胺取代基的固相載體上。儘管t-Boc，CBZ或者其它的封阻基團也可與其它的固相載體一起使用，但是在這些合成中使用了Fmoc胺封阻基團。在用哌啶除去Fmoc基團的封阻後，結合另一個殘基。在結合之後進一步去封阻，結合，去封阻等等步驟直到製備出一個固相連接的所需序列的肽。對於每種肽都合適的是，在最後的N-去封阻步驟後加上一個N末端X基團或者有時預結合到N-末端殘基。通過與三氟乙酸(TFA)發生反應，從固相載體上除去所需的肽和任何伴隨的功能性保護基團。當利用二苯甲基胺固相載體時該操作步驟得到C-醯胺作為末端的肽。
也可以利用t-Boc N-保護基團或者另一個固相載體或者苄基氨基-取代的固相載體(其中對羥基甲基苯基羧基(PAM)首先與載體上的胺發生反應形成一個羧醯胺)製備所需的肽。然後用羥基形成一個連接到第一個肽上的酯，此後利用標準的t-Boc合成技術。合成完的去保護的固相連接的肽與氨水發生反應以提供前面討論的C末端醯胺肽，而其與另一種胺例如嗎啉或者哌啶或者其它的NCy1或者NCy2胺發生反應提供了下述一種肽，該肽的C末端殘基是以醯胺鍵鍵合到NCy1或NCy2基團。去保護的PAM連接的肽與氫氧化物發生反應提供了相應的C末端羧基。
在其它的實施例中，利用液相肽合成法。例如在一種溶液中利用碳化二亞胺將嗎啉或者其它的NCy1或者NCy2基團偶合到本發明所說的C末端t-Boc保護的殘基上。用酸除去t-Boc保護基，進一步加上t-Boc保護殘基，隨後去封阻並進一步疊加。在最後的t-Boc去除步驟完成之後加上N末端X基團例如苯乙酸，完成合成，所不同的是對Asp殘基去保護。利用一個苄基酯保護基團進行催化脫氫，完成該步驟。
不論使用哪一種合成方法，通常按照以前用的方法回收和純化抑制肽。回收和純化技術是公知的在本文中不再詳述。C組合物和方法如在別處說明的，免疫系統白細胞效應細胞或者炎性細胞，例如單核細胞，T細胞和嗜酸性粒細胞在細胞表面攜帶有VLA-4受體。在炎性細胞從血遷移(交換)到組織的早期階段，這些細胞結合到血管內皮細胞表面存在的纖維蛋白連接素的CS-1區。這些炎性細胞與單克隆抗體P4C2(Wayner et al.，J.Cell.Biol.，1091321-1330(1989)，Wayner WO 98/12809，Hemler et al，J.Biol.Chem.，262(24)11478-11485(1987))和單克隆抗體HP1/2(Lobb WO 93/13798，1993年7月22日出版)發生免疫反應。
一旦進入組織中，炎性細胞通過一到多種機理加強炎性應答。在一種機理中，由炎性細胞釋放細胞因子，化學引誘反應劑例如，白細胞介素-1β(IL-1β)，IL-2，腫瘤壞死因子α(TNFα)和淋巴細胞衍生的趨化因子，進一步導致炎性細胞遷移至該區。在另一種機理中，炎性細胞錯誤地將患有炎症的哺乳動物細胞識別為非自我細胞並攻擊這些細胞，將它們殺死。這些和其它的免疫炎性應答加強機理是熟練的技術人員公知的並且不需要進一步闡述。因此通過幫助炎性加強效應細胞從血遷移到組織中，纖維蛋白連接素CS-1肽如此介導炎性疾病。
所說的抑制肽阻礙CS-1和VLA-4的結合，並且抑制隨後的攜帶VLA-4受體的炎性細胞遷移到組織中，並且抑制加重了的炎性狀態。對炎性細胞遷移的抑制導致由這些炎性細胞引起的纖維蛋白連接素CS-1/VLA-4介導的炎性應答降低，從而降低了所觀察到的炎症。
由CS-1和VLA-4介導的並且可由所說的抑制肽降低炎症的特定的炎性疾病是非常多的。這些炎症類型的舉例包括哮喘，關節炎例如類風溼關節炎和骨關節炎，異體移植排斥，各種類型皮膚炎症和中央神經系統脫髓鞘疾病。
特定的病理性炎性狀態(其中已經觀察到了所說的CS-1的表達並且如不處於病理狀態(即正常組織)則沒有觀察到所說的表達)包括類風溼關節炎(滑膜)，骨關節炎(滑膜)，牛皮癬，腎臟移植，肺哮喘，人類和感染SIV的猴子的內臟的淋巴結高內皮小靜脈(HEV)以及患有炎性內臟疾病的人或者動物，具有哮喘肺的和心臟移植的兔，在實驗性自身免疫的腦脊髓炎(EAE)的鼠腦和延遲型超敏性(DTH)的皮膚，以及患有誘導性關節炎的大鼠的關節。
本發明還涉及含有溶解於或分散於一種藥物學上可接受的載體或稀釋劑(優選的是水)中的本發明所說的抑制肽的藥物組合物，所說的組合物用於治療如前面討論的CS-1/VLA-4介導的炎性疾病。所說組合物含有前面所討論的抑制CS-1/VLA-4結合(降低炎症)所需量的抑制肽。
因此，本發明還涉及一種藥物組合物，可用於治療一種或多種上文中所說的疾病。所說的藥物組合物由前面描述的抑制肽組成，該肽以抑制結合所需量(降低炎症)分散於或溶於一種藥物學上的可接受的稀釋劑中，其中所說的肽抑制劑抑制含有VLA-4的白細胞和在內皮細胞表面表達的纖維蛋白連接素肽CS-1區之間的結合作用。所說的藥物組合物適用於在各種各樣的藥物釋放系統中使用。適用於本發明方法的藥物釋放系統的簡述可參見Langer，Science，2491527-1533(1990)。
對於本發明所說的藥物組合物，該肽的使用劑量為根據例如特定的肽，給藥方式，所治療的特定的疾病和其嚴重程度患者的總的健康狀況和患病狀態以及指定的內科醫生或者獸醫的判斷的不同而變化。可採用非腸道的，局部的，口服的或者定位的方式給藥，例如噴霧或者經皮膚的途徑將本發明的藥物組合物用於預防和/或者治療。根據給藥方法的不同可採用各種各樣的單位劑量形式使用本發明的藥物組合物。例如，適用於口服給藥的單位劑量形式包括粉劑，片劑，丸劑，膠囊，糖衣藥丸。
優選的是採用靜脈注射的方法使用本發明的藥物組合物。因此本發明特別涉及適用於靜脈給藥的組合物，該組合物包括所說的抑制肽溶於或分散於藥物學上可接受的稀釋劑(載體)，優選的是水性載體而得到的一種溶液。可使用各種各樣的水性載體，例如，水，緩衝的水，0.9％的鹽水，緩衝的含水乙醇溶液等等。可採用常規的公知的滅菌技術對這些組合物進行滅菌或者過濾滅菌。可將得到的水溶液包裝或者凍幹，在給藥以前將該凍幹的製劑與無菌水溶液結合使用。該組合物可以含有藥物學上可接受的輔助物質如調節物理狀態所需要的物質，例如pH調節劑和緩衝試劑，毒性調節劑，增溼劑等等，例如乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，單月桂酸山梨酯，油酸三乙醇胺等等。
所使用的抑制肽的濃度通常為或者至少是約0.0001％，高至約0.1％(重量)並且主要是由體液的量，粘度等根據選定的特定的給藥方法來選擇。
因此，可以將用於靜脈輸注的典型的藥物組合物製備成含有250ml的無菌的林格氏溶液普通鹽水或PBS並且含有約0.25mg到約25mg的抑制肽。製備非腸道給藥的化合物的實際的方法是已知的或者是本領域內的技術人員顯而易見的並且在例如Reminqton′sPharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1985)(引入本文作為參考)中詳細描述了該方法。
對於固體組合物，可以使用常規的無毒性的固體稀釋劑(載體)，包括例如藥物級的甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂等等。對於口服給藥的組合物，通過摻用任何通常使用的賦形劑，例如前面那些列出的那些載體，和通常10-95％的活性成分，即前面描述的肽抑制劑(優選的是約20％)(參見Remington′s，見上文)，優選的是利用將該固體劑量穿過胃並且進入腸的腸包衣，形成一種藥物學上可接受的無毒的組合物。
對於噴霧用的組合物，優選的是將本發明所說的抑制肽與一種表面活性劑和助劑一起加到一種溶液中例如，含水乙醇或者DMSO溶液。該抑制肽的通常的百分數為約0.0001％到約0.1％(重量)，並且優選的是0.0001％到約0.001％。當然所使用的表面活性劑是無毒的，並且優選的是在助劑中是可溶的。典型的所說試劑是含有6-22個碳原子脂肪酸或其環狀酸酐，例如己酸，辛酸，月桂酸，棕櫚酸，硬脂酸，亞油酸，亞麻酸，olesteric和油酸，與脂族多羥基醇的的酯或部分酯，所說的醇為例如聚乙二醇，甘油，赤癬醇，阿拉伯醇，甘露醇，山梨醇，由山梨醇衍生的己糖醇水合物，以及這些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。可以使用混合的酯，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性劑的重量可以為佔組合物重量的0.1到約20％，並且優選的是0.25-5％。通常採用助劑來補充組合物的其餘重量。能液化的助劑通常在環境條件下為氣體，並且在加壓下可濃縮。合適的能液化的助劑是含有高至5個碳原子的低級鏈烷，例如丁烷和丙烷，優選的是氟化的或者氟氯化的鏈烷。也可以使用上述物質的混合物。在生產噴霧劑時，用合適的助劑充滿裝備有合適的閥門的容器，該容器含有細分的化合物和表面活性劑。因此將成分保持於高壓下直到通過閥門的作用釋放。還可以使用以空氣作為助劑，用泵刺激噴霧(原子化的或者霧化)。
例如，對於治療兔的哮喘，本發明所說肽的劑量是對於2-3公斤的動物約1-100mg/天的範圍，對於人哮喘的患者其劑量為對於70公斤的患者使用約1-100mg/天的範圍。通常採用有一個霧化器噴霧的方式給哮喘患者給藥。實際上治療應該在發病開始之後儘可能快地給藥。
含有抑制肽的藥物組合物可用於預防和/或治療。在用於治療時將該藥物組合物施用到患有上面所說疾病的患者，其用量為足於抑制表達VLA-4的白細胞與表達CS-1肽區的內皮細胞結合；即降低炎症並從而至少部分抑制疾病的症狀和其併發症所需的量。適用於達到上述目的量定義為「治療有效劑量」或者「抑制結合的量」或者「降低炎症所需量」。上述使用的有效量依據疾病的嚴重程度，患者重量和總體狀態而定，但是通常使用抑制肽的量為每天約1mg/kg-約500mg/kg，最通常使用的劑量為約1mg/kg到約10mg/kg的化合物/天。
在用於預防時，將含有所說肽的組合物施用到對特定的疾病敏感的患者或者處以該特定病的危險之中。將該量定義為預防有效劑量並且是足於抑制表達VLA-4的白細胞與表達CS-1肽內皮細胞的結合。在這種情況下使用，精確的量還依據患者的健康和體重狀況而定，但通常為約1mg/kg/天到約500mg/kg/天的範圍，最通常使用的是約1mg/kg/天到約20mg/kg/天。
用於測算本發明所說的抑制肽抑制結合所需的量的另一種方法是在一個體外研究中將該肽顯示的抑制作用與由CS-1提供的或者10聚體標準物提供的抑制作用進行比較。進行所說比較簡便的方法是利用兩種被比較物質的IC50值以及達到IC50值所需的CS-1或者標準的10聚體肽的量和抑制肽的量，抑制肽的量是幾個參考化合物的IC50值的幾倍。
通常對於其IC50值至少是標準10聚體的IC50值的1/10的化合物(效力高10倍)，當以標準10聚體的摩爾量的1/10使用時，該量為有效結合抑制作用的量。更優選的該量是10聚體量的1/50。還要優選的是該量相當於10聚體量的1/100。只要該量將結合作用抑制50％，能夠進一步抑制結合的更大的濃度是優選的。
因此，對於體外使用，最小的CS-1/VLA-4抑制量是IC50值。對於體內使用，通常使用的CS-1/VLA-4抑制量首先是IC50值濃度，並且按照需要可以降低或者可以增加該肽在所用的水性介質，即pH為7.2-7.4的水性介質中的溶解度極限值，其中使用非腸道給藥方法時該水性介質為普通鹽水，或者當口服給藥時，介質為胃腸液。
採用由治療的內科醫生或者獸醫選定的劑量水平和使用方法可以進行單次或多次使用本發明的組合物。在任何情況下，所配製的藥物組合物可以提供足於有效治療病人的抑制肽的量。
本發明還涉及治療纖維蛋白連接素CS-1/VLA-4介導的炎症的方法。在這樣一種方法中，將前面討論的抑制肽施用到需要所說治療的哺乳動物中，例如具有炎症或者在異體移植之前需要預防的哺乳動物。優選的是以上面討論的藥物組合物給藥。所使用的該肽的量為降低炎症(CS-1/VLA-4結合抑制)的量。維持哺乳動物例如小鼠，大鼠，兔，猴或人成活直到由天然的體內過程除去該肽。在一天或幾天或幾個星期可多次給藥，對於哺乳動物是異體移植的受體在其整個生活期內多次給藥，也可以是單次給藥。
用於測定足於抑制CS-1和VLA-4之間的結合作用的所需量的方法已經討論過，其特別是用於體外研究中。對於體內使用，可用許多公開的檢測方法測定經過特定的治療是否可以降低炎症。例如可以估算在治療前、後關節炎患者疼痛的關節的數目或者患者的活動能力。通過測量已知的實驗動物的動力學慣量或者肺抗性可以測算關節炎發作的減少。也可以方便的檢測在DTH觀察到的腫脹的量，採用同樣的方法可檢測與標準對照相比，異體移植排斥的情況或者沒有排斥作用。實施本發明的最好的模式實施例1 X-Leu-Asp-Phe-Z的合成從NOVA Biochem Co.，La Jolla，CA購買被保護的胺基酸，Boc-Phe-OH，Boc-Asp(OBn)-OH和Boc-Leu-OH，不用進一步純化可直接使用。苯乙酸，嗎啉，二異丙基乙胺(DIEA)和1-羥基苯並三唑(HOBt)可從Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI獲得。乙基-3-(3-二甲基氨基)-丙基碳化二亞胺·HCl(EDC)可從Bachem Co.，Torrance，CA.獲得。溶於二噁烷中的4N HCl可從Pierce Co.，Pockford，IL獲得，按照收到的形式使用。
在一個GE QE-300，300MHz NMR分光光度計記錄1HNMR光譜。A Boc-Phe-嗎啉醯胺的製備將溶於100ml乾燥的二甲基甲醯胺(DMF)中的Boc-Phe-OH(10g，38mmol)，嗎啉(3.3g，38mmol)和1-羥基苯並三唑(5.1g，38mmol)裝入250ml燒瓶中。在0℃向該溶液中加入二異丙基乙胺(DIEA)直到pH達到8，然後加入EDC(8.8g，46mmol)。將該溶液慢慢地加溫到室溫，在室溫下(約22℃)攪拌該混合物8小時。通過真空蒸發除去DMF，加入乙酸乙酯和水，將各層分離。用乙酸乙酯(50ml×2)提取水層，用1N HCl洗滌合併的提取物，再用飽和的NaHCO3，水和鹽水洗滌，用MgSO4乾燥，過濾並濃縮得到無色的液體(12.8g，37.3mmol，99％的產率)，根據1HNMR對該液體進行定性為Boc-Phe-嗎啉。B HCl-Phe-嗎啉醯胺鹽的製備將Boc-Phe-嗎啉醯胺(12.8g，38mmol)置於250ml燒瓶中，然後加入溶於二惡烷中的4N HCl(30ml)。將該混合物攪拌六小時，此時TLC(矽膠；CHCl3∶MeOH∶乙酸，90∶8∶2)顯示反應完成。除去二惡烷和過量的鹽酸。以100％的產率獲得了一種白色的固體，由1HNMR鑑別為HCl-Phe-嗎啉醯胺(10.3g，38mmol)。C N-苯乙醯基-Leu-Asp(β-O-苄基)-Phe-嗎啉醯胺的製備利用上文中描述的偶合和去保護操作法將Boc-Asp(β-OBn)-OH，Boc-Leu-OH和苯乙酸依次加入到HCl-Phe-嗎啉醯胺中。從乙酸乙酯和己烷中結晶出由此獲得的白色固體，其產率為95％，經1HNMR鑑別為所需的酯。D N-苯乙醯基-Leu-Asp(β-O-Bn)-Phe-嗎啉醯胺的合成向上述苄基酯(10g，15mmol)的甲醇(100ml)溶液中加入10％的鈀-炭(2.0g)。蒸發含有該混合物的燒瓶並且三次補充氫氣。然後在氫氣的條件下劇烈的攪拌該混合物約5小時直到完全氫解，由TLC(CHCl3∶MeOH∶乙酸，90∶8∶2)顯示結果。用硅藻土過濾該反應混合物，除去甲醇得到一種白色固體，由1HNMR鑑別97％的產率為XLDFZ(8.4g，14.5mmol)。
用同樣的方法製備具有不同於碳化二亞胺[C(O)-NH2]C末端醯胺連接的Z基團的肽。實施例2典型的固相肽合成法從Nova Biochem，La Jolla，CA獲得Fmoc保護的胺基酸，羥基苯並三唑(HOBt)和Rink醯胺NBHA樹脂。從Chem Impex Inc.，Chicago，IL獲得二異丙基碳化二亞胺(DIC)。從Aldrich Chemical Company，St.Louis，MO獲得哌啶。從Burdick andJackson，Muskegon，MI獲得二甲基甲醯胺(DMF)，異丙醇(IPA)，二氯甲烷(DCM)，和二甲基乙醯胺(DMA)。上述所有試劑都按製造商的說明使用，不需進一步純化。
根據Fmoc-Pro與Rink醯胺MBHA樹脂的第一次偶合反應描述在合成期間重複的標準去保護/偶合循環用溶於DMF(130ml)中的20％哌啶將Fmoc-MBHA樹脂(10.6g.，5mmol)處理3分鐘。通過過濾除去該溶液，再用溶於DMF(130ml)中的20％哌啶將該樹脂處理17分鐘。通過過濾除去該溶液，用DMF(各130ml)洗滌樹脂五次，用IPA(130ml)洗滌兩次，用DMF(130ml)洗滌兩次。向樹脂中加入溶於DMA(50ml)中的Fmoc-D-脯氨酸的HOBt酯(在室溫下由溶於50ml DMA中的10mmoles Fmoc-D-脯氨酸和10mmoles HOBt的溶液與12mmoles DIC反應20分鐘形成的)並且使之反應2小時。用DMF(130ml)洗滌樹脂五次以及用DCM(130ml)洗滌兩次。由標準的Kaiser′s檢測法檢測結合到樹脂上的胺基酸。
將上述循環重複進行，每次循環用下列的胺基酸Fmoc-Phe，Fmoc-Asp(β-OBn)，Fmoc-Leu和苯乙酸。將樹脂在真空下乾燥24小時，然後在室溫下與95％的TFN/5％水(60ml)反應2小時。通過過濾從樹脂上分離該肽的TFA溶液，真空蒸發TFA。從含水乙醇中結晶出固相殘留物得到1.8g的產物N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2。在HP Amino Quant 1090和NMR通過胺基酸分析鑑定該肽的特性，由HPLC(WATER HPLC系統)檢測該肽的純度。實施例3體外結合檢測法將用51鉻標記的人T成淋巴細胞系，Jurkat細胞(ATCC TIB 152)用於檢測由上文中討論的各種肽所提供的體外結合抑制作用。在這些檢測中發現CostarTM96孔平底微滴板(catalog No.9050，Cambridge，MA)能提供最好的結果。
按如下所述製備平板以0.5-1μg/ml的濃度將25聚體CS-1肽(SEQ ID NO1)溶於0.1M NaHCO3pH9.5的緩衝液中(該緩衝液還含有10μg/ml牛血清白蛋白(BSA))，或者以1-2.5μg/ml的濃度將連接到卵白蛋白上的CS-1肽的結合物(CS-1-OVA)溶於相同緩衝液中，以二者之一作為底物。用50μl底物或者僅用作為對照的緩衝液包被微滴板的每個孔。將這些孔完全乾燥並用pH為7.4的PBS洗兩次。然後在室溫下用每孔200μl的PRMI/1％BSA封阻每個孔的非特異性結合位點2小時。兩種固相固定的底物提供同樣的結果。
將Jurkat細胞(3-5×106細胞)置於帶有蓋的15mlFalconTM圓底試管。將試管離心，然後去除多餘的培養基。
向離心過的細胞中加入200μl的51Cr標記的溶液並且在溫暖的房間裡與細胞接觸90-120分鐘。通常該步驟提供50,000-100,000cpm/孔，每孔的存活率為約80-100％細胞。更長的接觸時間提供更大的標記量，但細胞存活性較低。
用(i)完全培養基，(ii)1mM EDTA/PBS和然後(iii)無血清成分的RPM1/1％BSA洗滌標記的細胞。每次洗滌之後，將細胞離心。最後以1×106活細胞/ml的濃度將細胞重新懸浮於無血清的RPMI/1％BSA，將提供的濃度稀釋1倍。
在裝入1.5ml cryogenic帶螺絲帽的試管中將抑制肽製備成濃度為20mg/mlDMSO的原液，貯存於-70℃。利用FlowTM圓底或者V形底微滴板，以60μl/孔的濃度在RPMI/1％BSA中製備兩倍於檢測濃度的抑制肽。
通常利用四個起始的稀釋液。對於效力低的肽例如標準的10聚體SEQ ID NO3，起始稀釋液濃度為500μg/ml，100μg/ml，20μg/ml，和4μg/ml。對於效力高的肽例如N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2，通常的起始濃度為10μg/ml，2μg/ml，0.4μg/ml和0.08μg/ml。
然後，將51Cr標記的細胞(每孔60μl，1×106的細胞)與稀釋的肽溶液混合。將該混合物於室溫下(約22℃)保持30分鐘。
將100ml的各種抑制肽/細胞混合物轉移到底物包被的孔中。對於每個稀釋度同樣的試驗重複三次。在37℃將得到的平板培養30分鐘，然後用RPMI/1％BSA以200μl/孔的量緩慢地洗滌三次。用顯微鏡觀察結合情況，尤其是在第二次洗滌之後。
然後通過向每個孔中加入100μl溶於水中的0.5％的十二烷基硫酸鈉溶液將結合的細胞裂解。然後對得到的溶液進行處理，利用通常的操作進行計數和計算IC50值。在每個平板上設置合適的陽性和陰性對照，以便將單獨檢測的結果標準化並進行比較。
表1的結果即是如此標準化。對於肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-嗎啉醯胺的絕對的IC50值為0.18-0.30μM。實施例4小鼠的延遲型超敏性A起始研究Chisholm et al.，Eur.J.Immunol.，23682-688(1993)報導了在鼠接觸型超敏性模型中利用大鼠抗小鼠α-4-抗體封阻VLA-4作用的體內結果。這些研究者注意到設計為幹擾VLA-4介導的吸附的治療劑是體內炎性過程的有效的阻斷劑。
利用灌注了惡唑酮的脾T細胞研製了過繼性轉移延遲型超敏性鼠模型。在Elices et al.，Clin.Exp.Rheum.，11(Suppl.8)577-580(1993)中描述了該模型，其操作步驟在下文中描述。
將BALB/c小鼠的腹部剃光並且在0和1天用溶於丙酮/棕櫚油(4∶1)中的3％的噁唑酮塗覆(在腹部塗50μl，在每個腳掌塗5μl)。在第5天將該鼠殺死，取出脾臟，尼龍羊毛柱獲得脾T細胞。
分別將普通鹽水或含有25×106/動物的噁唑酮-免疫T細胞的鹽水注射到裸鼠中。然後通過在每個耳朵上塗10μl的2％噁唑酮攻擊該鼠。所有的操作在無菌條件和沒有內毒素的緩衝液中進行。
在進行攻擊或者鹽水注射以前，將泵移植到鼠中，該泵可以將普通鹽水，含有肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2的普通鹽水或者含有具有無規序列的肽的普通鹽水以6mg/kg/天連續地供應24小時。此後用微型遊標測徑器在24小時內檢測攻擊位點或鹽水注射位點腫脹的直徑。
圖5中顯示用鹽水和所說的抑制肽進行治療的研究結果。儘管由於可能是非CS-1介導的炎症導致獲得的數據中有稍微的重疊，但是可以清楚地看到與未治療的對照相比，以本發明的抑制肽給藥可以降低這種類型的CS-1/VLA-4介導的免疫炎症。利用無規的肽沒有降低炎症。利用600mg/kg/天的相同的肽進行的另一項研究沒有顯示由該肽產生的毒性。B擴大研究按照上面所說完成擴大研究，所不同的是沒有利用無規肽對照，該研究中使用了表1的其它的抑制肽以及更大的小鼠組。相對於僅用載體注射的結果進行統計學分析。結果顯示於下面的表2中。
表2*肽 抑制百分數p值 nAc-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2360.0002 30Ac-Leu-Asp-Phe290.0158Ac-Leu-Asp-Phe30＜0.0001 24.Phth-Leu-Asp-Val-D-Pro-NH2--N.S. 8Ac-Leu-Asp-Phe--N.S. 22*Ac＝N-苯乙醯基；Phth＝N-苯二甲醯亞氨基；和N.S.＝與載體沒有顯著的差異。
對於所研究的五種抑制肽中的四種注意到攻擊以後腫脹減少，其中三種肽抑制劑從統計學上說可以顯著地降低腫脹。第四種肽可以重複地產生抑制作用，但是不是統計學上的顯著水平。該第四種化合物對水分十分敏感。因此可以相信實際上供應的藥劑量低於所說的6mg/kg/天劑量，因為存在著吸水性，並且劑量的降低導致沒有統計學意義上顯著的結果。
在本文檢測的過繼性免疫應答中轉移的T細胞是效應細胞。在炎性免疫應答期間T細胞表達分別與纖維蛋白連接素的CS-1和RGD發生作用的VLA-4和VLA-5。Ferguson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，888072-8076(1991)證明將約50μg/ml的標準肽(SEQ ID NO3)與免疫T細胞混合後可以消除轉移的免疫應答例如本文研究的應答。這些研究者還告訴我們將肽和T細胞分別給藥不會導致所說的消除作用。
本文可以看到將6μg/ml的所說抑制肽單獨給藥，可以基本上抑制免疫應答。還可以看到抑制肽和T細胞不需要預先混合，在Ferguson et al.的結果中需要混合。
N-苯二甲醯亞氨基衍生物顯示的平均腫脹程度稍微高於僅用載體顯示的程度，原因目前還不清楚，儘管僅利用一個濃度，在表1所說的體外研究中該N-苯二甲醯亞氨基衍生物顯示約1/5-1/6的Ac-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2的活性，所以在活性範圍的低末端值該低活性的化合物沒有顯示活性作用是可以預料到的。實施例5 哮喘兔的治療用屋塵蟎抗原對剛出生的到四月齡的六隻紐西蘭白兔免疫接種。接種後，三隻兔接受以100mg/kg的量溶於50％乙醇水溶液(作為稀釋劑)的肽抑制劑N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-嗎啉醯胺的單次給藥的霧化組合物，另三隻兔僅接受稀釋劑本身。在以肽給藥之後用屋塵蟎抗原攻擊所有的兔約15-30分鐘，與沒有接受肽的動物作為對照。
一旦進行免疫接種和攻擊之後，在約3個星期內炎性狀態退至基礎水平。此後利用作為對照的三隻動物作為接受抑制肽的患者，並且用最初接受該肽的三隻兔子用作為對照。
這裡進行了所說的交叉研究。因此，在上面的研究之後，在三個多星期時間後用溶於上述稀釋劑的上述抑制肽處理三隻最初的對照兔，三隻前面接受該肽的兔僅以稀釋劑給藥。然後再攻擊所有六隻兔。
在該交叉研究中兩部分以肽或稀釋劑給藥之前，根據動力學慣量(Cdyn)和肺抗性(RL)和支氣管肺泡灌洗(BAL)檢測起始的肺功能從而獲得效應細胞數，這裡為嗜酸粒細胞。然後對該研究的兩部分，在攻擊之後每半小時進行同樣的檢測，共檢測6小時(早期過敏反應)，以及攻擊之後24小時內進行同樣的研究(晚期過敏反應)。
由Dr.W.J.Metzger of East Carolina University，Greenville，N.C.，按照W.J.Metzger in CRC Handbook of Late Phase Reactions，W.Dorsch，ed.，Chapter 35，CRc Press，Boca Raton，FL(1990)pages 347-362描述的方法完成這些研究。
圖4A和4B顯示了肺功能參數研究的結果。其中受攻擊的、抑制肽治療的動物的數據顯示於空心環，受攻擊的、未治療的對照動物的數據顯示於實心環中。得自該研究的兩部分的平均值為所說的數據。
從圖4A中可以看到，在整個6小時內受攻擊的和被治療的動物的Cdyn值約停留在起始值。受攻擊的未治療的動物的Cdyn值在整個6小時內快速地降至起始值的40％，然後停留在該值。
圖4B的數據顯示受攻擊的並由抑制肽治療的動物的RL值在整個6小時內停留在起始值和該值的200％之間，在該時間即將結束的時候有稍微的升高。在攻擊以後起始的兩小時內，受攻擊的但是未治療的動物的RL值上升至200-300％，在後4小時之內上升到約400-1200％。
在下面的表2中提供了在炎性免疫應答的早期(2-4小時)和晚期(24小時)與受攻擊的對照動物相比，用抑制劑治療的受攻擊的動物的平均數據的總和。
表2Ac-Leu-Asp-Phe-嗎啉醯胺*的體內效力參數 階段 降低的百分數Cdyn早期 94.4晚期 86.6RL早期 80.1晚期 82.6*N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-嗎啉醯胺從這些研究得到的BAL數顯示在該交叉研究中，與未治療的受攻擊的動物相比，在24小時之後抑制肽治療的受攻擊的動物的嗜酸性細胞降低88.1％。
從上述數據和圖4A和4B可以看出與未接受治療的動物相比，在治療的動物中以降低炎性有效量的本發明的肽霧化給藥可以大大地降低哮喘反應。實施例6 兔心臟移植模型將紐西蘭白兔SPF的心臟移植到類似兔的頸部以分析外植體-宿主的免疫排斥模型，以及所說肽對該免疫炎性應答的影響。這些研究由Dr.M.Rabinovitch ofthe Hospital for Sick Children，Toronto，Ontario，Canada完成。實驗動物模型按照以前描述的試驗方案[Alonso et al.，Am.J.Pathol.，87415-442(1977)；Clausell et al.，Circulation，892768-2779(1994)]，以及得到了在多倫多的病殘兒童醫院的關心動物委員會批准利用3.5-4公斤的紐西蘭雌性白兔(Charles River Lab.，Saint Laurent，Quebec)用於進行異體心臟移植。未對動物進行選擇以有利於HLA-錯配，宿主兔是沒有巴斯德桿菌感染的並且供體是遠系繁殖的動物。給宿主和供體兔餵養Purina 5321-0.5％膽固醇飼料((ResearchDiets Inc.，Nwe Brunswick，NJ)並且利用已經證明可用於加速異體移植心臟治療過程的方案[Alonso et al.，Am.J.Pathol.，87415-442(1977)]。用該飼料餵養4天然後進行移植，在移植後的受體繼續用該飼料餵養直到完成整個實驗。
以前有人描述了異體心臟移植的技術[Clausell et al.，Circulation，89P2768-2779(1994)]。簡單的說，在受體兔的頸部的靠前部位垂直切開分離出左邊的普通頸動脈以及同側的外部頸靜脈。通過將主動脈末端到受體頸動脈側面以及肺的末端到受體的外部頸靜肺側面解剖而將異體心臟放在頸部，然後在約30分鐘的時間內供體心臟局部缺血。根據由加拿大國家社會醫療研究制定的照顧實驗動物的原則照顧手術後的動物。
所說的治療包括從Leu-Asp-Val(LDV)序列衍生的四肽抑制劑，N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2(治療用的)[Komoriya et al.，J.Biol.Chem.，26615075-15079(1991；Wayner et al.J.cell Biol.，116489-497(1992)](在體外研究中該肽加強抑制)和同樣的合成四肽N-苯乙醯基-Asp-Leu-Phe-D-Pro-NH2的無規形式(對照)(不產生對VLA-4的抑制)。兩種肽都是由Cytel Corporation，San Diego.CA合成。
在移植開始的那一天，隨機的挑選動物並且用約1mg/kg s.c.的無規肽(對照組)治療或者用1mg/kg s.c.的抑制肽進行治療。肽的使用量是根據表1中預先的體外研究憑經驗推斷出適用於體內模型的量。不進行其它的免疫抑制治療。通過觸診每天監測移植體並且堅持7-8天，即監測前面描述的與心肌排斥(受損傷的心臟收縮)有關的終點，並在該模型中研究異體心臟治療[Clausell et al.，Circulation，892768-2779(1994)]。在對照組(n＝7)和治療組(n＝7)共研究了14隻動物。心臟的準備用致死劑量的乙醇(480mg i.V.)(MTC Pharmaceutical，Cambridge，ON)殺死動物，取出宿主和供體的心臟並且用鹽水穿過主動脈灌注到冠狀動脈，隨後通過用2％的多聚甲醛(Sigma，St，Louis，MO)進行光固定。由於前面的描述指明在兔中異體心臟移植治療同樣分配到整個冠狀動脈循環[Foegh et al.，TransplantProc.，213674-3676(1989)]以及Dr.Rabinovitch和其同事們的工作[Clausell et al.，Circulation，892668-2779(1994)]，從心臟的基底到頂點的方向橫向切開。不同的心臟切片保存於10％的福馬林(BDH Inc.，Toronto，ON)用於進行光學顯微鏡研究或者立即冷凍到O.T.C Compound Tissue Tek(MilesInc.，Elkart，IN)中用於特定的免疫組織化學研究。排斥等級根據修改的Billingham′s標準將從供體心臟獲得的樣本用蘇木精曙紅進行染色以便進行排斥的組織學等級分析。對切片進行等級分析的工作是由病殘兒童醫院的高級病理學家(Dr.G.J.Wilson)進行的，他們不了解供體心臟是從對照或者從抑制肽治療的動物獲得的。用光學顯微鏡對宿主和供體冠狀動脈進行定量的估測利用Movat pentachrome方法對來自於對照和治療兔的宿主和供體的心臟的三個不同的用烷烴包埋的組織切片進行染色以用光學顯微鏡觀察。用結合了計算機控制的圖像分析系統的Zeiss顯微鏡(Perceptics Inc.，NuVision software)進行形態測量分析，所說方法描述於Clause ll et al.，Circulation，892768-2779(1994)。在來自各個研究動物的所有的三個心臟切片中計算具有內部損傷的脈管的數目並且以佔脈管總數的百分數表示。
在宿主心臟中共分析了對照組999個脈管，治療組1054個脈管。在供體心臟中，共分析了對照組827個脈管，治療組617個脈管。為了測定內部加厚的程度的嚴重性，在所有的三個切片中間檢測每一個可追蹤的脈管的直徑，將冠狀動脈劃分為小(直徑＜100μm)，中等(直徑＞100＜500μm)以及大(直徑＞500μm)。然後按照前面描述的Eich et al.，Circulation，87261-269(1993)的方法在每一個脈管的大小分類級別中對內部加厚的程度進行定量測算。在每個受影響的脈管中測算由外部的中央層(ML)，內部的彈性薄層(IEL)和腔包圍的面積，由通式IT＝IEL-腔面積/ML-腔面積×100計算出內部加厚的面積(IT)相對於脈管面積的值。免疫組織化學研究在所有的免疫組織化學分析中，對宿主和供體的心臟的冠狀動脈進行比較，比較對照和治療組的內部加厚的不同的大小範圍和有無加厚。在Rabinovitch實驗室由兩名有經驗的研究者對在所檢查的切片中研究的每個特定抗原相對豐度進行半定量的分級，即最低限度的(+/-)，很少的(+)，中等豐度(++)到高豐度的(+++)。最後的評分標準是按照達到90％的一致性的單個的分類級別。(1)炎性細胞的定性為鑑定兩個研究組中異體移植冠狀動脈中存在免疫炎性反應，用抗兔MHC II型抗原和兔T細胞的單克隆抗體(由Dr.peter Libby，Brigham and Women′sHospital，Boston，MA提供的禮物)以及還抗兔巨噬細胞的單克隆抗體(RAM 11，Dako Corp.，Carpinteria，CA)進行免疫過氧化物酶染色。將切片在空氣中風乾2小時，在丙酮中固定20分鐘，浸於D-PBS(Gibco，Burlington，ON)/0.1％BSA(Boehringer-Manneim，Germany)。通過在PBS/0.1％BSA+3％過氧化氫(BDH)將切片浸30分鐘封阻內源性過氧化物酶的活性。在利用10％普通的羊血清(Sigma)進行非特異性的封阻步驟之後，在室溫下以1∶10的稀釋度將抗體加到切片上保持一小時。然後清洗切片，在室溫下以1∶50的稀釋度用羊抗鼠過氧化物酶結合的二級抗體(Bio-Rad，Richmond，cA)保溫45分鐘並用3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)(Sigma)顯色10分鐘。用普通的鼠異型IgG(Dako Corp.)處理對照切片。(2)免疫檢測細胞粘附分子為了評價所說的治療對異體移植冠狀動脈表達吸附分子的影響，對來自對照和治療組的宿主和供體心臟的冷凍切片進行ICAM-1和VCAM-1的免疫過氧化物酶染色。抗ICAM-1(mAb Rb2/3)和抗VCAM-1(mAb Rb1/9)的單克隆抗體是由Dr.MyronCybulsky(Brigham and Women′s Hospital，Boston，MA)熱情提供的，並且在室溫下以1∶10的濃度使用1小時。基本上按照上面的描述完成免疫染色。(3)纖維蛋白連接素的評價通過對冰凍切片進行免疫過氧化物酶的染色確定在來自對照和治療組的宿主和供體心臟的冠狀動脈上表達的纖維蛋白連接素。在室溫下以1∶100的稀釋度使用抗細胞纖維蛋白連接素的單克隆抗體(Chemicon Int.Inc.，Temecula，CA)1小時，基本上按照上面所述完成餘下的免疫組織化學程序。該抗體並不識別血漿纖維蛋白連接素。統計學分析得到的數據以平均值+/-SE表示。在有關對照和治療組的損傷的影響和嚴重程度的分析中，利用Student′s的t試驗檢測顯著性。利用Fisher′s的精確檢測法分析從免疫組織化學得到的分類變量值之間的相關性，如果兩個組(對照和治療)＞+認為是陽性。如果p＜0.05則認為差異顯著。
上述研究的結果概括於下面的表3中。
表3在冠狀動脈上的表達 抑制肽抑制肽MHC II型 ±c++T細胞 ±++巨噬細胞 ±+ICAM-1 ±+VCAM-1 ±+總的纖維蛋白連接素 ±++脈管的內部增厚脈管百分數a35d88嚴重程度(脈管面積的百分數)b16e36a對於抑制劑和對照肽組發生的基底(兔本身宿主心臟)分別是12％和10％。b對於抑制劑和對照肽組嚴重程度的基底(兔本身宿主心臟)分別是12％和12％。c評分標準-，陰性；±最小值；+，小；++，中等豐度；+++，高豐度。d p＜0.001。e p＜0.001。
從上述結果可以看出，利用本發明的抑制肽可以大大降低在心臟移植中看到的炎性誘導的損害。從脈管內壁加厚的結果中尤其可以證明這種對損害的降低作用，在有關由MHC II抗原顯示的炎性標記的表達，T細胞和巨噬細胞，和總纖維蛋白連接素的存在增加的結果中也可間接看到這種損壞作用大大降低。實施例7 體外豬異體移植模型利用豬冠狀動脈內皮細胞(EC；如在IEL中存在的)和平滑肌細胞(SMC；如在動脈的中央層中存在的)在體外進行同樣的研究。利用一個轉膜系統，在M-199培養基(Gibco Labs.)中培養兩種類型的細胞，其中SMC位於底層。在開始檢測以前用100ng/ml白細胞介素-1β(IL-1β)刺激SMC 24小時。用Ficoll-Hypaque分離豬周圍血淋巴細胞，放射性標記和在EC上面培養過夜(約18小時)。
與未受刺激的SMC相比，可觀察到轉內皮淋巴細胞在IL-1β-刺激的SMC中遷移。在該培養基中存在10μg/ml的實施例6的抑制肽，苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2可以將淋巴細胞的遷移降低約30％(p＜0.05)，而相同量的無規序列的對照肽沒有降低遷移。
EC和SMC纖維蛋白連接素和IL-1β的表達增加是免疫炎性應答的特徵，所說應答與小豬的異位心臟移植之後快速的移植動脈治療有關。上述結果表明在該體外模型中IL-1β可誘導纖維蛋白連接素的產生，從而導致轉內皮淋巴細胞的遷移。上述結果還顯示可用所說的抑制肽降低這種免疫炎性應答。實施例8 小鼠中的實驗性自身免疫腦脊髓炎實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)是一種中央神經系統的脫髓鞘疾病，在小鼠和大鼠的敏感性品種中可誘導該疾病，該大鼠和小鼠是用髓磷脂鹼性蛋白，蛋白脂蛋白(PLP)或它們的免疫顯性T細胞決定蔟免疫接種的，或者注射了與這些決定蔟相特異的CD4-陽性T細胞克隆。EAE用作為人多種硬化的動物模型。在兩種疾病中，循環中的白細胞例如T細胞和單核細胞穿透血/腦障礙層並且損害髓磷脂，導致癱瘓。
通過在0天時用對應於PLP139-151位的50μg的肽(在PBS和完全佛氏佐劑(CFA)的1∶1的混合物中乳化)免疫接種雌性的SJL/J小鼠(8-14周齡)可誘導EAE。在每隻鼠的後脅腹的兩個位點皮下注射0.2ml的佐劑乳液。24-72小時之後給所有的小鼠靜脈注射107滅活的百日咳博德特氏桿菌單位/100μl。
每天觀察小鼠，從第8天開始出現EAE臨床症狀，並且將疾病分為0-5個等級，即0＝沒有疾病；1＝尾巴鬆軟；2＝後肢中等無力；3＝後肢輕癱；4＝前肢中等無力的截癱；5＝四肢癱瘓或者瀕死前狀態。
在第8和第9天用溶於0.2ml不完全佛氏佐劑中的1mg/小鼠的抑制肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-phe-D-Pro-NH2腹膜注射。同樣的方法將具有無規序列的肽[N-苯乙醯基-Asp-Leu-Phe-D-Pro-NH2]注射到小鼠內作為對照。在表1中顯示了該對照肽的相對效力為＜1。
將臨床症狀的總分或平均分相對於時間作圖。計算出第8-35天之間相應的曲線下面的面積，從而計算出抑制肽對EAE的抑制百分數。按如下方法計算抑制百分數％抑制率＝100-(抑制肽的面積+對照的面積)×100
在圖6中顯示了經過31天以後兩個典型的曲線，其中黑圈為用抑制肽治療的六隻鼠的平均分，黑框為接受了無規序列對照肽的六隻鼠平均分。正如所看到的，與對照肽治療的動物相比，用本發明的抑制肽治療的動物顯示臨床症狀明顯改善。實施例9 在人類風溼關節炎中表達CS-1用顯微鏡檢查從人類風溼性關節炎(RA)患者經外科手術獲得的滑膜標本表達的纖維蛋白連接素CS-1肽。利用抗CS-1抗體採用免疫過氧化物酶技術對組織的超薄切片進行染色，並用透射電子顯微鏡進行研究，這些研究顯示在血管內皮的腔和腔漿膜上表達CS-1。將關節空間的界面處的滑膜內層的漿膜的滑液細胞進行染色，未發現在正常的滑液中所表達的CS-1肽。
利用Jurkat T細胞系和冷凍的RA滑液切片進行結合研究。採用抗VLA-4抗體或者用作為標準的10聚體CS-1肽(500μg/ml)(SEQ ID NO3)可以抑制Jurkat細胞吸附，但用抗VLA-5，VCAM-1-A或者VCAM-1-B的抗體或者無規的10聚體序列的肽不能抑制。受刺激的MOLT-4細胞產生類似的結果。在Elices et al.，J.Clin.Invest.，93405-416(January 1994)中報導了這些結果。
利用抑制肽N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH-2可觀察到對Jurkat細胞與人RA滑膜切片的結合產生同樣的抑制作用，而對與正常的滑膜切片的結合沒有產生抑制作用。當使用該肽時顯示於表1中的其IC50值比標準10聚體的IC50值低312倍。其IC50值的絕對值是約0.5μmol。
這些結果顯示在人慢性免疫炎症類風溼性關節炎中CS-1肽部分和VLA-4的重要性。這些結果還顯示所說的抑制肽能夠抑制人免疫炎症中炎性細胞的結合。實施例10 哮喘羊的治療由Dr.William M.Abraham of the Department of Research，Mount SinaiMedical Center，4300 Alton Road，Miami Beach，FL 33140在雙重隱蔽的交叉研究治療六隻哮喘羊。已經證明羊對吸入的Ascuris suum抗原產生早期和晚期支氣管炎反應。通常該項研究按照Abraham et al.，J.Clin.Invest.，93776-787(1994)的描述進行。
本文所用的抑制肽是N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-D-Pro-NH2，對照肽含由前面描述的具有相同殘基而序列無規的肽。用於霧化肽的載體是磷酸緩衝鹽水。在攻擊以前三天每天施用肽兩次，每次劑量為1mg/kg，在第4天在攻擊前0.5小時以及攻擊後4小時使用同樣的劑量。由於這是一個交叉研究，每隻動物接受一種或另一種治療，隨後休息，然後進行另一種治療。因此，每隻動物都可作為其自身的對照。
從圖7可看到，用抑制肽治療的動物顯示在攻擊時產生與基礎的特異性肺抗性(SRL)相比較小的變化，然後以比用對照肽處理的動物更快的速度恢復其本來的肺功能。另外，從攻擊後3-4小時到研究結束(攻擊後8小時)肺功能保留在基礎值，而對照肽處理的動物其肺功能(SRL)增加。
還對攻擊後應答的波長進行分析。這裡攻擊後24小時特異性的肺抗性SRL恢復到基礎值，但是在這段時間內羊對吸入的氨基甲醯膽鹼產生高度應答。將攻擊前和攻擊後24小時氨基甲醯膽鹼吸入的PC400值進行比較，表明與肽抑制劑治療的組所需的量相比(約27BU)，對照肽治療的動物將SRL值提高至鹽水對照值的4倍所需的氨基甲醯膽鹼的劑量要小的多[約12個呼吸單位(BU)]。在這裡攻擊前的值為約20-23BU，因此，抑制肽使動物的SRL值比攻擊前的值更大，表明與攻擊前的應答相比，其產生的對氨基甲醯膽鹼的應答降低。
雖然已對本發明的優選實施方案進行的描述，並且僅作為舉例，本領域內技術人員能夠認識到對其進行各種修改，變化，刪改和替代仍在本發明的範圍內。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名Cytel Corporation(B)街道3525 John Hopkins Court(C)城市San Diego(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵編92121(G)電話619-552-2794(H)傳真619-552-8801(ii)發明名稱CS-1模擬肽，利用該肽的組合物和方法(iii)序列數15(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)目前的申請資料(A)申請號PCT/US94/(B)申請日1994年12月5日(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度25個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly1 5 10 15Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr20 25(2)SEQ ID NO2的資料(A)長度12個胺基酸
(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr1 5 10(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr1 5 10(2)SEQ ID NO4的資料(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝苯乙醯基-Leu」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Pro-NH2」(xi)序列描述SEQ ID NO4Xaa Asp Tyr Xaa1(2)SEQ ID NO5的資料(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝苯乙醯基-Leu」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝在C末端Pro羧基和含有4個與之結合的N-苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-Pro肽的四亞乙基戊胺之間形成的醯胺」(xi)序列描述SEQ ID NO5Xaa Asp Phe Xaa1(2)SEQ ID NO6的資料(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝GlcNAc-O-(CH2)5-C(O)-Phe」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它資料/標記＝Xaa
/注釋＝「Xaa＝Leu-哌啶醯胺」(xi)序列描述SEQ ID NO6Xaa Leu Asp Xaa1(2)SEQ ID NO7的資料(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝苯甲醯-Leu」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Pro-NH2」(xi)序列描述SEQ ID NO7Xaa Asp Val Xaa1(2)SEQ ID NO8的資料(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝特戊醯-Leu」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點
(B)位置4(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Pro-NH2」(xi)序列描述SEQ ID NO8Xaa Asp Val Xaa1(2)SEQ ID NO9的資料(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝苯乙醯基-Leu」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Pro-癸醯胺」(xi)序列描述SEQ ID NO9Xaa Asp Phe Xaa1(2)SEQ ID NO10的資料(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置10(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Pro-NH2」(xi)序列描述SEQ ID NO10Ile Leu Asp Val Pro Ile Leu Asp Val Xaa1 5 10(2)SEQ ID NO11的資料(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置5(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Pro-NH2」(xi)序列描述SEQ ID NO11Ile Leu Asp Phe Xaa1 5(2)SEQ ID NO12的資料(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝苯乙醯基-Leu」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Pro-NH(CH2)5-C(O)NHC18H37」(xi)序列描述SEQ ID NO12Xaa Asp Phe Xaa1(2)SEQ ID NO13的資料(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置5(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Pro-NH2」(xi)序列描述SEQ ID NO13Ile Leu Asp Val Xaa1 5(2)SEQ ID NO14的資料(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Ile Leu Asp Val Pro1 5(2)SEQ ID NO15的資料(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝乙醯基-Ser」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點
(B)位置5(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝「Xaa＝Ser-NH2」(xi)序列描述SEQ ID NO15Xaa Phe Asp Phe Xaa1 權利要求
1.一種通式A的肽X-B-Asp-ZA其中B是一種α-疏水胺基酸殘基，它的側鏈具有約2-5個亞甲基的長度；X是一個以醯胺鍵連接到B的氮原子上的基團，所說X基團具有鍵合到所說醯胺鍵的羰基碳上的環結構，所說的鍵合通過一個具有0-約2個亞甲基長度的間隔基連接，包括所說間隔基和羰基碳的X的長度是約3-喹啉羰基的長度或者更小，所說的環結構是5-和6-元環或者一個融合的6，6-或者6，5-元環；和Z選自於下列基團(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者具有一個含1或者2個融合的芳香環的側鏈的胺基酸殘基，NCy1是一個含有環的基團，該基團具有一個位於環上的氮原子，該氮原子與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，並且NCy1的環包括所說環上氮原子在內含有5-或6-個原子；和(b)NCy2，其中所說的氮原子是環基團的胺取代基，該氮原子與所說Asp的α-羧基基團形成一醯胺鍵，該胺取代基與一個6-或者7-元環鍵合，或者與一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環體系鍵合，其中所說攜帶胺取代基的環是飽和的並且在所說內醯胺的羰基的α位上含有胺取代基；在一個體外檢測試驗中，所說的肽抑制Jurkat細胞(ATCC TIB 152)與固相結合的SEQ ID NO1的肽結合，所說的檢測試驗是在pH值為7.2-7.4的含水緩衝液中進行的，其抑制程度與由SEQ ID NO3的肽顯示的抑制所說結合的程度相等或者高至約3000倍。
2.根據權利要求1所說的肽，其中B選自於下列組亮氨酸，環己丙氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸，高絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸，纈氨酸，正纈氨酸和異亮氨酸。
3.根據權利要求2所說的肽，其中所說X基團的環結構含有一個芳香環。
4.根據權利要求3所說的肽，其中Z是Xaa-NCy1。
5.根據權利要求4所說的肽，其中Xaa是具有一個側鏈的胺基酸殘基，該側鏈含有一或二個融合的芳香環。
6.根據權利要求5所說的肽，其中NCy1的環被一或二個選自下列基團的取代基所取代，所說取代基包括羧基，C1-C4亞烷基羧基，羧醯胺，C1-C4亞烷基羧醯胺，羥基，羥甲基，(CH2CH2O)nH，其中n是1，2或3，和C1-C4烷基。
7.通式I的肽X-Leu-Asp-Z I其中X是一個以醯胺鍵連接到Leu的氮原子上的基團，所說X基團具有鍵合到所說醯胺鍵的羰基碳上的環結構，所說的鍵合通過一個具有0-約2個亞甲基長度的間隔基連接，包括所說間隔基和羰基碳的X的長度是約3-喹啉羰基的長度或者更小，所說的環結構是5-和6-元環或者一個融合的6，6-或者6，5-元環；和Z選自於下列基團(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者具有一個含1或者2個融合的芳香環的側鏈的胺基酸殘基，NCy1是一個含有環的基團，該基團具有一個位於環上的氮原子，該氮原子與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，並且NCy1的環包括所說環上氮原子在內含有5-或6-個原子；和(b)NCy2，其中所說的氮原子是環基團的胺取代基，該氮原子與所說Asp的α-羧基基團形成一醯胺鍵，該胺取代基與一個6-或者7-元環鍵合，或者與一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環體系鍵合，其中所說攜帶胺取代基的環是飽和的並且在所說內醯胺的羰基的α位上含有胺取代基；在一個體外檢測試驗中，所說的通式I的肽抑制Jurkat細胞(ATCC TIB 152)與固相結合的SEQ ID NO1的肽結合，所說的檢測試驗是在pH值為7.2-7.4的含水緩衝液中進行的，其抑制程度是由SEQ ID NO3的肽顯示的抑制所說結合的程度約10至約3000倍。
8.根據權利要求7所說的肽，其中所說X基團的環結構含有一個芳香環。
9.根據權利要求8所說的肽，其中所說芳香環被一個C1-C2烷基或者羥基基團所取代。
10.根據權利要求8所說的肽，其中Z是Xaa-NCy1。
11.根據權利要求10所說的肽，其中Xaa是具有一個側鏈的胺基酸殘基，該側鏈含有一或二個融合的芳香環。
12.根據權利要求7所說的肽，其中Z是Xaa-NCy1，Xaa是其側鏈有一或二個融合的芳香環的胺基酸殘基。
13.根據權利要求12所說的肽，其中NCy1的環被一或二個選自下列基團的取代基所取代，所說取代基包括羧基，C1-C4亞烷基羧基，羧醯胺，C1-C4亞烷基羧醯胺，羥基，羥甲基，(CH2CH2O)nH，其中n是1，2或3，和C1-C4烷基。
14.根據權利要求7所說的肽，其中Z是NCy2。
15.根據權利要求12所說的肽，其中NCy2選自於下列組苄基醯氨基，苯乙基醯氨基，2-(N-嗎啉基)-乙基醯氨基，N-羧醯氨基甲基-N-(3-己內醯氨基]醯氨基，N-(3-己內醯氨基)醯氨基，N-(3-戊內醯氨基)醯氨基，N-2-(4-嗎啉基)乙基-N-(2-氧代-四氫喹啉-3-基]醯氨基，以及N-(2-氧代-四氫喹啉-3-基)醯氨基基團。
16.根據權利要求7所說的肽，其中X是具有一個環狀側鏈的胺基酸殘基。
17.根據權利要求16所說的肽，其中X胺基酸殘基的α氨基的氮原子被C1-C6醯基基團醯基化。
18.如下通式的肽Ar-Y-C(O)-Leu-Asp-Xaa-NCy1其中Ar是吡唑基，苯基，吡啶基，或者3-喹啉基；Y是一個間隔基，它可以不存在，或是-CH2-，-CH(NH)-，-O-或者-NH-；或者Ar-Y-C(O)-與所說Leu的氮原子一起形成一個苯二甲醯亞氨基，1，2，3，4-四氫喹唑啉-2，4-二酮-3-基或者5-phenyldantoin-3-基，和Ar-Y-C(O)-具有約3-喹啉羰基的長度或者更短；Xaa是一個芳香族胺基酸殘基；和NCy1是一個含有胺的5-或6元環基團，其中所說的氮原子位於環上並且與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵。
19.根據權利要求18所說的肽，其中Y為不存在。
20.根據權利要求18所說的肽，其中Xaa選自下列組苯丙氨醯基，色氨醯基，酪氨醯基。
21.根據權利要求18所說的肽，其中Ar-Y-C(O)-是選自於下列基團的取代基，苯甲醯基，苯乙醯基，3-吡啶羰基，4-吡啶羰基，3-吡啶乙醯基，苯氧基羰基，苯胺基羰基，吡唑羰基，色氨醯基和3，4-二羥基苯甲醯基。
22.根據權利要求18所說的肽，其中NCy1選自於下列基團嗎啉醯氨基，硫代嗎啉醯氨基，4-(噻二氧代)哌啶醯胺，哌啶醯氨基，4-取代的哌啶醯氨基其取代基選自於下列組羥基，氨甲醯基和羧基，L-2-(羧醯胺)吡咯烷醯氨基，D-2-(羧醯胺)吡咯烷醯氨基，吡咯烷醯氨基，3，4-二羥基-吡咯烷醯氨基，2-(羥甲基)吡咯烷醯氨基，哌嗪醯氨基和4-取代的哌嗪醯氨基其取代基選自於下列組羧甲基，羧醯氨基甲基，(5-羥乙烯氧基-亞乙基)和p-甲苯亞磺醯氨基。
23.根據權利要求22所說的肽，其中Ar-Y-C(O)-與所說Leu的氮原子形成一個苯二甲醯亞氨基。
24.下列通式的肽苯乙醯基-Leu-Asp-Phe-NCy3其中NCy3選自於下列組嗎啉醯氨基，硫代嗎啉醯氨基，4-(噻二氧代)哌啶醯胺，D-2-(羧醯氨基)-吡咯烷醯氨基，哌啶醯氨基，4-取代的哌啶醯氨基其取代基選自於下列組羥基，氨甲醯基和羧基，哌嗪醯氨基和4-取代的哌嗪醯氨基其取代基選自於下列組羧甲基，羧醯氨基甲基，(5-羥乙烯氧基亞乙基)和p-甲苯亞磺醯氨基，以及吡咯烷醯氨基。
25.一種治療纖維蛋白連接素CS-1/VLA-4-介導的炎症的方法，該方法包括給具有所說炎症的哺乳動物施用減少炎症所需量的下列通式的肽X-Leu-Asp-Z其中X是一個以醯胺鍵連接到Leu的氮原子上的基團，所說X基團具有鍵合到所說醯胺鍵的羰基碳上的環結構，所說的鍵合通過一個具有0-約2個亞甲基長度的間隔基連接，包括所說間隔基和羰基碳的X的長度是約3-喹啉羰基的長度或者更小，所說的環結構是5-和6-元環或者一個融合的6，6-或者6，5-元環；和Z選自於下列基團(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者具有一個含1或者2個融合的芳香環的側鏈的胺基酸殘基，NCy1是一個含有環的基團，該基團具有一個位於環上的氮原子，該氮原子與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，並且NCy1的環包括所說環上氮原子在內含有5-或6-個原子；和(b)NCy2，其中所說的氮原子是環基團的胺取代基，該氮原子與所說Asp的α-羧基基團形成一醯胺鍵，該胺取代基與一個6-或者7-元環鍵合，或者與一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環體系鍵合，其中所說攜帶胺取代基的環是飽和的並且在所說內醯胺的羰基的α位上含有胺取代基；在一個體外檢測試驗中，所說的通式I的肽抑制Jurkat細胞(ATCC TIB 152)與固相結合的SEQ ID NO1的肽結合，所說的檢測試驗是在pH值為7.2-7.4的含水緩衝液中進行的，其抑制程度是由SEQ ID NO3的肽顯示的抑制所說結合的程度約10至約3000倍。
26.根據權利要求25所說的方法，其中所說的CS-1介導的炎症是哮喘。
27.根據權利要求26所說的方法，其中所說的給藥是吸入方法。
28.根據權利要求25所說的方法，其中所說的給藥是通過非腸道的方法。
29.根據權利要求25所說的方法，其中所說的CS-1介導的炎症是類風溼性關節炎或者骨關節炎。
30.根據權利要求25所說的方法，其中所說的CS-1介導的炎症是同體移植排異性。
31.根據權利要求25所說的方法，其中所說的CS-1介導的炎症是皮膚炎症。
32.根據權利要求25所說的方法，其中所說的CS-1介導的炎症是中樞神經系統脫髓鞘疾病。
33.一種藥物組合物，包括溶於或分散於藥物學上可接受的稀釋劑中的減少炎症所需量的一種肽，所說的肽具有下列的通式X-Leu-Asp-Z其中X是一個以醯胺鍵連接到Leu的氮原子上的基團，所說X基團具有鍵合到所說醯胺鍵的羰基碳上的環結構，所說的鍵合通過一個具有0-約2個亞甲基長度的間隔基連接，包括所說間隔基和羰基碳的X的長度是約3-喹啉羰基的長度或者更小，所說的環結構是5-和6-元環或者一個融合的6，6-或者6，5-元環；和Z選自於下列基團(a)Xaa-NCy1，其中Xaa是Val，Ile，Leu或者具有一個含1或者2個融合的芳香環的側鏈的胺基酸殘基，NCy1是一個含有環的基團，該基團具有一個位於環上的氮原子，該氮原子與Xaa的α-羧基形成一個醯胺鍵，並且NCy1的環包括所說環上氮原子在內含有5-或6-個原子；和(b)NCy2，其中所說的氮原子是環基團的胺取代基，該氮原子與所說Asp的α-羧基基團形成一醯胺鍵，該胺取代基與一個6-或者7-元環鍵合，或者與一個融合的6，6-或者6，7-員內醯胺環體系鍵合，其中所說攜帶胺取代基的環是飽和的並且在所說內醯胺的羰基的α位上含有胺取代基；在一個體外檢測試驗中，所說的通式I的肽抑制Jurkat細胞(ATCC TIB 152)與固相結合的SEQ ID NO1的肽結合，所說的檢測試驗是在pH值為7.2-7.4的含水緩衝液中進行的，其抑制程度是由SEQ ID NO3的肽顯示的抑制所說結合的程度約10至約3000倍。
34.根據權利要求33所說的藥物組合物，其中所說的X基團的環結構含有一個芳香環。
35.根據權利要求33所說的藥物組合物，其中Z是Xaa-NCy1。
36.根據權利要求33所說的藥物組合物，其中Z是Xaa-NCy1，Xaa是其側鏈有一或者二個融合芳香環的胺基酸殘基。
37.根據權利要求36所說的藥物組合物，其中X具有下列通式Ar-Y-C(CO)-其中Ar是吡唑基，苯基，吡啶基，或者3-喹啉基；Y是一個間隔基，它可以不存在，或是-CH2-，-CH(NH)-，-O-或者-NH-；或者Ar-Y-C(O)-與所說Leu的氮原子一起形成一個苯二甲醯亞氨基，1，2，3，4-四氫喹唑啉-2，4-二酮-3-基或者5-phenyldantoin-3-基，和Ar-Y-C(O)-具有約3-喹啉羰基的長度或者更短；
38.根據權利要求37所說的藥物組合物，其中Ar-Y-C(O)-是苯乙醯基，Xaa是Phe，NCy1是選自於下列組的基團的NCy3嗎啉醯氨基，硫代嗎啉醯氨基，4-(噻二氧代)哌啶醯胺，D-2-(羧醯氨基)-吡咯烷醯氨基，哌啶醯氨基，4-取代的哌啶醯氨基其取代基選自於下列組羥基，氨甲醯基和羧基，哌嗪醯氨基和4-取代的哌嗪醯氨基其取代基選自於下列組羧甲基，羧醯氨基甲基，(5-羥乙烯氧基亞乙基)和p-甲苯亞磺醯氨基，以及吡咯烷醯氨基。
全文摘要
本發明涉及能夠抑制在炎性白細胞上表達的VLA-4受體和在內皮細胞上表達的纖維蛋白連接素CS-1肽之間的結合的一種肽，所說的結合與免疫炎性疾病有關。還公開了含有所說肽的藥物組合物以及利用該結合抑制肽治療免疫炎性狀態的方法。
文檔編號C07K5/10GK1142832SQ94194969
公開日1997年2月12日 申請日期1994年12月5日 優先權日1993年12月6日
發明者託馬斯·S·阿列紐斯, 馬裡亞諾·J·埃利塞斯, 費德裡科·C·加埃塔 申請人:賽特爾公司