用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物及其製備方法

2023-04-23 12:18:21

專利名稱：用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物及其製備方法
技術領域：
本發明屬於材料化學技術領域，特別涉及一種用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物及其製備方法。
背景技術：
洛克沙胂(Roxarsone),化學名為:3_硝基_4_輕基-苯胂酸，與阿散酸(P-Arsanilic acid)是多年來在世界各國廣泛使用的兩種含砷飼料添加藥物,而洛克沙胂比阿散酸應用更廣。洛克沙胂是最經濟的一種多功能有機胂製劑，具有促進畜禽生長，提高飼料轉化率，促進畜色素沉積，對家禽能增加其它抗球蟲藥的效果；治療豬的痢疾及腸炎，提高蛋雞產蛋率。我國農業部1996年批准了該藥的使用，之後國內逐漸開始了大量生產，並廣泛用於養雞業和養豬業。不過後來研究發現其容易造成環境汙染，1999年歐盟已明令禁止使用洛克沙胂作為雞飼料添加用藥物。考慮動物性食品安全，我國農業部公告第235號也制定了洛克沙砷的最高殘留限量。該藥具有一定的殘留毒性，對人類具有潛在的致癌性可能，因此對其的檢測也迅速成為國內外研究的熱點。但現行所有洛克沙胂檢測的前處理方法都是採用傳統的固相萃取小柱(如MAX)淨化，缺乏選擇性，特異性不強，從而影響整個檢測方法的靈敏度和準確定量。基於類似抗原-抗體作用的分子印跡固相萃取技術具有高選擇性和特異性，是一種具有廣泛應用前景的固相萃取材料。如果能像抗體一樣，合成某些類似抗體的對洛克沙胂具有高選擇性的高分子吸附材料，可大大提高洛克沙胂檢測的靈敏度和準確性。分子印跡(molecular imprinting)是近年來基於分子識別理論而迅速發展起來的一個新的研究領域，分子印跡 技術也被稱為製造「塑料抗體」的技術。分子印跡聚合物(molecular imprinting polymers,MIP)是一類內部具有固定大小和形狀的孔穴並具有確定排列功能基團的交聯高聚物。因為MIP是根據印跡分子定做的，因此它具有特殊的分子結構和官能團，能選擇性地識別印跡分子。分子印跡聚合物的製備一般要通過如下三個步驟:(I)功能單體通過與模板分子相互作用(共價或非共價鍵)，聚集在模板分子周圍形成可逆的複合物；(2)功能單體與過量交聯劑在致孔劑存在下發生共聚生成高聚物；(3)將模板分子從高聚物中解離出來，在聚合物中就形成了能夠識別模板分子的結合位點。這種印跡聚合物可作為液相色譜的固定相、選擇性催化劑、化學傳感器的傳感元件和固相萃取材料等，在臨床藥物分析中也有廣泛的應用。

發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明的首要目的是提供一種用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物的製備方法。該製備方法成本低廉，操作簡單。
本發明的另一個目的是提供通過上述製備方法製備得到的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物。該分子印跡聚合物對洛克沙胂有高選擇性和親和性，對洛克沙胂的回收率為90%以上。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:一種用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物的製備方法，包括以下步驟:將模板、致孔劑、功能單體、交聯劑和引發劑在50 80°C聚合8 48 h，除去模板後，即得用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物；所述的模板為阿散酸或對羥基苯甲酸乙酯。所述的模板、功能單體、交聯劑、致孔劑和引發劑的比例為1:2 16:10 40:
I 200:10 60,所述的比例為 mmol:mmo1:mmo1:mL:mg。所述的功能單體為2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸、丙烯酸、4-乙烯基吡唆、對乙烯苯甲酸或丙烯醯胺。所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或二乙烯苯;所述的致孔劑為甲醇、乙腈、氯仿、丙酮中的一種以上；優選的致孔劑為單純的乙腈或者體積比為1:1的甲醇與乙腈的混合液。致孔劑一方面要保證模板的充分溶解，另一方面致孔劑用量對製備的分子印跡聚合物強度、表面特性具有重要影響，同時致孔劑對印跡聚合物在使用介質體系中洛克沙胂的識別也非常關鍵，當致孔劑選擇甲醇-乙腈(1:1，V/V)時，能夠製備出對洛克沙胂具有高度特異性識別的分子印跡聚合物。

所述的引發劑為水溶性引發劑或油溶性引發劑；所述的油溶性引發劑為偶氮二異丁腈；所述的水溶性引發劑為過硫酸銨。一種用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物的製備方法，其優選的具體步驟為:(I)預聚物的製備:向模板中加入致孔劑，渦旋至模板溶解，加入功能單體，超聲，靜置，得到預聚物；(2)聚合固化:向預聚物中加入交聯劑和引發劑，超聲，冰浴下通氮氣，密封，真空乾燥箱中聚合，得到塊狀聚合物；(3)用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物的製備:將塊狀聚合物處理為細小顆粒，溶劑A洗滌去模板，溶劑B洗滌後，真空乾燥，即得用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物。步驟(I)中所述的超聲時間為5min ;靜置時間為Ih ；步驟(2)中所述的超聲時間為5min ;所述的冰浴通氮氣時間為5min ;所述的真空乾燥箱中聚合的溫度為50 80°C，時間為8 48h。步驟(3)中所述的溶劑A為乙酸與甲醇的混合溶液，混合溶液中乙酸與甲醇的體積比為1:9 ;所述的溶劑A洗滌的流速為lmL/min以下；所述的溶劑B為甲醇，體積為40mL ；所述的真空乾燥的溫度為60°C，時間為12h。根據上述所述的製備方法製備得到的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物，該分子印跡聚合物對洛克沙胂的回收率為90%以上。本發明的分子印跡聚合物，經試驗檢測發現:將該聚合物用於固相萃取淨化(50mg/柱)，聚合物結合洛克沙胂的吸附量約為930μ g/g聚合物；在水溶液(自來水、地下和地表水)中添加洛克沙胂回收率試驗表明，在1.0 50 μ g/mL濃度添加水平範圍內，洛克沙胂回收率大於90% ;本發明分子印跡聚合物裝填的固相萃取小柱，重複使用10次後，洛克沙胂的回收率仍然大於80%。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果:( I)本發明製備分子印跡聚合物時，採用的致孔劑為甲醇-乙腈(1: 1，V/V)，有利於模板的溶解，使製備的印跡聚合物特異性識別能力強。(2)本發明的製備方法可以直接往預聚合物中加入交聯劑和引發劑然後進行50 80°C熱聚合固化，還可以先進行低溫光聚合後再進行50 80°C熱聚合固化，這樣可以進一步提高分子印跡聚合物的特異性。(3)本發明的分子印跡聚合物在甲醇和乙腈中對洛克沙胂呈現高的親和性和選擇性，回收率大於90%。(4)本發明以對羥基苯甲酸乙酯或阿散酸為模板製得的MIP對洛克沙胂顯示高的交叉反應，具有高的選擇性和特異性，與以洛克沙胂本身為模板合成的MIP相比，可以防止因洛克沙胂洗脫不完全，使用時因MIP中「模板洩露」(殘留的洛克沙胂模板)造成對洛克沙胂檢測結果的影響，作為分析飼料、動物組織及環境水等基質中洛克沙胂的樣品淨化前處理材料有著廣泛的應用前景。


圖1:洛克沙胂乙腈溶液過MIPl和NIPl固相萃取柱的色譜圖(10 μ g/mL)；其中，a:洛克沙胂乙腈溶液過MIPl固相萃取的色譜圖；b:洛克沙胂乙腈溶液過NIPl固相萃取的色譜圖。圖2:洛克沙胂乙腈溶液過MIP2和NIP2固相萃取柱的色譜圖(10 μ g/mL)；其中，c:洛克沙 胂乙腈溶液過MIP2固相萃取的色譜圖；d:洛克沙胂乙腈溶液過NIP2固相萃取的色譜圖。圖3:洛克沙胂自來水溶液過MIPl和NIPl固相萃取柱的色譜圖(5 μ g/mL)；其中，e:洛克沙胂自來水溶液過MIPl固相萃取柱的色譜圖；f:洛克沙胂自來水溶液過NIPl固相萃取柱的色譜圖。圖4:洛克沙胂地表水溶液過MIP2和NIP2固相萃取柱的色譜圖；(0.5 μ g/mL)；其中，g:洛克沙胂地表水溶液過MIPl固相萃取柱的色譜圖；h:洛克沙胂地表水溶液過NIPl固相萃取柱的色譜圖。圖5:洛克沙胂地下水溶液過MIP2和NIP2固相萃取柱的色譜圖；(50 μ g/mL)；其中，1:洛克沙胂地下水溶液過MIP2固相萃取柱的色譜圖；j:洛克沙胂地下水溶液過NIP2固相萃取柱的色譜圖。圖6:洛克沙胂的色譜圖的標準曲線。圖7:洛克沙胂25°C下的等溫吸附線。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1
(I)稱取0.166g (ImmoL)對羥基苯甲酸乙酯於試管中，加入ImL乙腈，渦旋溶解後，再加入0.434mL (4mmoL) 2-乙烯批唳功能單體,超聲5min,靜置Ih,形成預聚合物。(2)向上述預聚合物中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯4mL (20mmoL)和偶氮二異丁腈60mg(0.365mmol),超聲5min,冰浴下通氮氣5min,密封,60°C真空乾燥箱中聚合24h,得到塊狀聚合物。(3)將上述塊狀聚合物磨碎、過200目篩，用甲醇反覆沉降除去細小顆粒，裝入15mL固相萃取柱中，先用乙酸與甲醇混合溶液(乙酸與甲醇的體積比為1:9) 200mL洗滌除去模板對羥基苯甲酸乙酯，流速控制在lmL/min以下，再用40mL甲醇洗滌除去乙酸，置60°C真空乾燥箱中乾燥12 h，得到用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物，置乾燥器中保存備用。製備好的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物(MIP1)與合成的塊狀聚合物相比，平均收率達 64.5%ο非印跡聚合物(NIPl)的製備除不加模板分子外，均按上述方法製備和處理。實施例2(I)稱取0.217g (ImmoL)阿散酸於試管中，加入6mL甲醇-乙腈溶液(甲醇與乙腈的體積比為1:1)，潤旋溶解後，加入0.434mL (4mmoL) 2-乙烯卩比唳功能單體,超聲5min,靜置Ih，形成預聚合物。(2)向上述預聚合物中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯4mL (20mmoL)和偶氮二異丁腈60mg(0.365mmol),超聲5min,冰浴下通氮氣5min,密封,60°C真空乾燥箱中聚合24h,得到塊狀聚合物。(3)將上述塊狀聚合物磨碎、過200目篩，用甲醇反覆沉降除去細小顆粒，裝入15mL固相萃取柱中，先用乙酸與甲醇混合溶液(乙酸與甲醇的體積比為1:9) 200mL洗滌除去模板阿散酸，流速控制在lmL/min以下，再用40mL甲醇洗滌除去乙酸，置60°C真空乾燥箱中乾燥12 h，得到用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物，置乾燥器中保存備用。製備好的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物(MIP2)與合成的塊狀聚合物相比，平均收率達58.2%。非印跡聚合物(NIP2)的製備除不加模板分子外，均按上述方法製備和處理。實施例3(I)稱取0.217g (ImmoL)阿散酸於試管中，加入6mL甲醇-乙腈(1: 1，V/V)溶液，潤旋溶解後，加入0.17ImL (2mmoL)甲基丙烯酸功能單體,超聲5min,靜置Ih,形成預聚合物。(2)向上述預聚合物中加入三輕甲基丙燒三甲基丙烯酸酯3.19mL (IOmmoL)和偶氮二異丁腈10mg(0.06mmoL),超聲5min,冰浴下通氮氣5min,密封,50°C真空乾燥箱中聚合48h，得到塊狀聚合物。(3)將上述塊狀聚合物磨碎、過200目篩，用甲醇反覆沉降除去細小顆粒，裝入15HiL固相萃取柱中，先用乙酸與甲醇混合溶液(I:9,V/V)200mL洗滌除去模板阿散酸，流速控制在lmL/min以下，再用40mL甲醇洗滌除去乙酸，置60°C真空乾燥箱中乾燥12h，得到用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物，置乾燥器中保存備用。製備好的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物與合成的塊狀聚合物相比，平均收率達52.6%。實施例4
(I)稱取0.166g (ImmoL)對羥基苯甲酸乙酯於試管中，加入10.5mL乙腈，渦旋溶解後，再加入1.82mL (16mmoL)對乙烯苯甲酸功能單體,超聲5min,靜置Ih,形成預聚合物。(2)向上述預聚合物中加入二乙烯苯5.60mL (40mmoL)和偶氮二異丁腈60mg(0.365mmoL),超聲5min,冰浴下通氮氣5min,密封,50°C真空乾燥箱中聚合48h,得到塊狀聚合物。(3)將上述塊狀聚合物磨碎、過200目篩，用甲醇反覆沉降除去細小顆粒，裝入15mL固相萃取柱中，先用乙酸與甲醇混合溶液(乙酸與甲醇的體積比為1:9) 200mL洗滌除去模板對羥基苯甲酸乙酯，流速控制在lmL/min以下，再用40mL甲醇洗滌除去乙酸，置80°C真空乾燥箱中乾燥8h，得到用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物，置乾燥器中保存備用。製備好的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物與合成的塊狀聚合物相比，平均收率達48.3%。實施例5(I)稱取0.217 g (I mmoL)阿散酸於試管中，加入9.3 mL甲醇-乙腈(1: 1，V/V)溶液，潤旋溶解後，加入1.42 mL (16 mmoL)甲基丙烯酸功能單體,超聲5 min,靜置I h,形成預聚合物。(2)向上述預聚合物中加入 三輕甲基丙燒三甲基丙烯酸酯12.8 mL (40mmoL)和偶氮二異丁腈60mg (0.365mmoL),超聲5 min,冰浴下通氮氣5 min,密封,50°C真空乾燥箱中聚合48 h，得到塊狀聚合物。(3)將上述塊狀聚合物磨碎、過200目篩，用甲醇反覆沉降除去細小顆粒，裝入15mL固相萃取柱中，先用乙酸與甲醇混合溶液(1:9，V/V)200 mL洗滌除去模板阿散酸，流速控制在I mL/min以下，再用40 mL甲醇洗滌除去乙酸，置60°C真空乾燥箱中乾燥12 h，得到用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物，置乾燥器中保存備用。製備好的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物與合成的塊狀聚合物相比，平均收率達46.7%實施例6(I)稱取0.166g (I mmoL)對羥基苯甲酸乙酯於試管中，加入3mL乙腈，渦旋溶解後，再加入0.23 mL (2mmoL)對乙烯苯甲酸功能單體,超聲5 min,靜置I h,形成預聚合物。(2)向上述預聚合物中加入二乙烯苯1.4mL (IOmmoL)和偶氮二異丁腈IOmg (0.06mmoL),超聲5 min,冰浴下通氮氣5 min,密封,50°C真空乾燥箱中聚合48 h,得到塊狀聚合物。(3)將上述塊狀聚合物磨碎、過200目篩，用甲醇反覆沉降除去細小顆粒，裝入15mL固相萃取柱中，先用乙酸與甲醇混合溶液(乙酸與甲醇的體積比為1:9) 200 mL洗滌除去模板對羥基苯甲酸乙酯，流速控制在I mL/min以下，再用40 mL甲醇洗滌除去乙酸，置80°C真空乾燥箱中乾燥8 h，得到用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物，置乾燥器中保存備用。製備好的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物與合成的塊狀聚合物相比，平均收率達54.2%ο實施例7將實施例1和2製備的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物MIPl和MIP2 (粒度為54 75 μ m)裝填於ImL固相萃取空小柱(50mg/柱)中，依次用2mL甲醇、2 mL去離子水平衡活化。分別取0.5、5、20及50 μ g/mL系列濃度的洛克沙胂乙腈溶液I mL過柱，依次用2mL水、2mL甲醇洗滌，壓幹，再用氨水和甲醇混合液(氨水與甲醇的體積比為5:95) 2mL洗脫。氮氣吹乾洗脫液，用50mmoL/L的磷酸二氫鉀溶液溶解，離心，用高效液相色譜紫外檢測。洛克沙胂乙腈溶液過NIPl和NIP2固相萃取柱的操作步驟同上。具體計算回收率過程:根據保留時間定性，外標法定量，測定系列濃度(0.5，5，20，50 μ g/mL)洛克沙胂標準溶液響應值，得到的色譜峰積分得面積K，根據得到的峰面積和濃度Cs，做出標準曲線如附圖6所示，再分別測定樣品峰面積Ai,帶入標準曲線算出，回收率R(^1)=IOOXCiZCstj實施例8將實施例1製備的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物(粒度為54 75 μ m)裝填於ImL固相萃取空小柱(50mg/柱)中，依次用2mL甲醇、2mL水平衡活化。分別取0.5、5、20及50 μ g/mL系列濃度的洛克沙胂自來水溶液ImL過柱，依次用2mL水、2mL甲醇洗漆,壓幹,再用5%氨水和甲醇混合液(氨水與甲醇的體積比為5:95) 2mL洗脫。氮氣吹乾洗脫液，用50mm·oL/L的磷酸二氫鉀溶液溶解，離心，用高效液相色譜紫外檢測。洛克沙胂自來水溶液過NIPl固相萃取柱的操作步驟同上。地下水和地表水實施方案除將洛克沙胂自來水溶液換成地表水和地下水外,其餘步驟完全相同。圖3為洛克沙胂自來水溶液過MIPl和NIPl固相萃取柱的色譜圖(5 μ g/mL);圖4為洛克沙胂地表水溶液過MIP2和NIP2固相萃取柱的色譜圖；圖5為洛克沙胂地下水溶液過MIP2和NIP2固相萃取柱的色譜圖。表I為MIP、NIP對三種水基質中不同濃度洛克沙胂的回收率。回收率的測定方法，同實施例7。表I三種水基質中不同濃度洛克沙胂回收率(n=3)
權利要求
1.一種用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物的製備方法，其特徵在於:包括以下步驟:將模板、致孔劑、功能單體、交聯劑和引發劑在50 80°C聚合8 48h，除去模板後，即得用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物；所述的模板為阿散酸或對羥基苯甲酸乙酯。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於:所述的模板、功能單體、交聯劑、致孔劑和引發劑的比例為1:2 16:10 40: I 200:10 60，所述的比例為mmol:mmol:mmol:mL:mg。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於:所述的功能單體為2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸、丙烯酸、4-乙烯基吡啶、對乙烯苯甲酸或丙烯醯胺。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於:所述的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或二乙烯苯。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於:所述的致孔劑為甲醇、乙腈、氯仿、丙酮中的一種以上；所述的引發劑為水溶性引發劑或油溶性引發劑。
6.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於:所述的致孔劑為乙腈；所述的油溶性引發劑為偶氮二異丁腈；所述的水溶性引發劑為過硫酸銨。
7.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於:所述的致孔劑為體積比為1:1的甲醇與乙腈的混合液。
8.根據權利要求1所述的製備，其特徵在於:包括以下步驟: (1)預聚物的製備:向模板中加入致孔劑，渦旋至模板溶解，加入功能單體，超聲，靜置，得到預聚物； (2)聚合固化:向預聚物中加入交聯劑和引發劑，超聲，冰浴下通氮氣，密封，真空乾燥箱中聚合，得到塊狀聚合物； (3)用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物的製備:將塊狀聚合物處理為細小顆粒，溶劑A洗滌去模板，溶劑B洗滌後，真空乾燥，即得用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物。
9.根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中所述的超聲時間為5min；靜置時間為Ih ； 步驟(2)中所述的超聲時間為5min ;所述的冰浴通氮氣時間為5min ;所述的真空乾燥箱中聚合的溫度為50 80°C，時間為8 48h ; 步驟(3)中所述的溶劑A為乙酸與甲醇的混合溶液，混合溶液中乙酸與甲醇的體積比為1:9 ;所述的溶劑A洗滌的流速為lmL/min以下；所述的溶劑B為甲醇，體積為40mL ;所述的真空乾燥的溫度為60°C，時間為12h。
10.根據權利要求1 9任一項所述的製備方法製備得到的用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物，其特徵在於:該分子印跡聚合物對洛克沙胂的回收率為90%以上。
全文摘要
本發明屬於材料化學技術領域，公開了一種用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物及其製備方法。該分子印跡聚合物的製備方法，包括以下步驟將模板、致孔劑、功能單體、交聯劑和引發劑在50～80℃聚合8～48h，除去模板後，即得用於檢測洛克沙胂的分子印跡聚合物。製備的分子印跡聚合物對洛克沙胂回收率為90%以上，對洛克沙胂顯示高的交叉反應，具有高的選擇性和特異性，作為分析飼料、動物組織及環境水等基質中洛克沙胂的樣品淨化前處理材料有著廣泛的應用前景。
文檔編號C08F212/14GK103232572SQ20131013008
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月15日 優先權日2013年4月15日
發明者賀利民, 張高奎, 劉雅紅, 方炳虎, 楊建文, 王宗楠, 楊海翠 申請人:華南農業大學