用於琥珀酸產生的改進微生物的製作方法

2023-04-24 07:08:46 2

諸如具有6個碳或6個以下碳的小的二羧酸的有機化合物是商業上重要的具有許多用途的化學品。例如，小的二酸包括1,4-二酸，如琥珀酸、蘋果酸和酒石酸，及5碳分子衣康酸。其他二酸包括二碳草酸、三碳丙二酸、五碳戊二酸和6碳己二酸，也存在這類二酸的許多衍生物。作為一個組，小的二酸具有一些化學相似性，它們在聚合物生產中的使用可以為樹脂提供特化性質。這種通用性使得它們能夠容易地契合下遊化學基礎市場。例如，1,4-二酸分子滿足大規模化學品馬來酐的許多用途，因為它們轉化為多種工業化學品(四氫呋喃、丁內酯、1,4-丁二醇、2-吡咯烷酮)及琥珀酸衍生物琥珀醯胺、琥珀腈、二氨基丁烷和琥珀酸酯。酒石酸在食品、皮革、金屬和印刷工業中具有許多用途。衣康酸形成用於產生3-甲基吡咯烷酮、甲基-BDO和甲基-THF等的原材料。尤其是，琥珀酸(succinicacid)或琥珀酸(succinate)(這些術語在本文中可互換使用)引起了相當大的興趣，因為它已在食品、化學和藥物工業中用作許多工業上重要的化學品的前體。事實上，來自美國能源部的報告報導，琥珀酸是從生物量製造的前12種化學構件之一。因此，在細菌中產生二酸的能力將具有顯著的商業重要性。WO-A-2009/024294公開了產琥珀酸細菌菌株，該菌株是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)成員，最初分離自瘤胃，能夠利用甘油作為碳源，從其衍生的變體和突變菌株保留該能力，尤其是保藏於DSMZ(德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH),Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,德國)的命名為DD1的細菌菌株，其具有保藏號DSM18541(ID06-614)，且具有產生琥珀酸的能力。如Kuhnert等,2010所分類，DD1菌株屬於物種Basfiasucciniciproducens和巴斯德氏菌科。這些菌株的突變(其中破壞了ldhA基因和/或pflD或pflA基因)公開於WO-A-2010/092155中，這些突變菌株的特徵在於，與WO-A-2009/024294中公開的DD1野生型相比，在厭氧條件下，從諸如甘油或甘油和糖類(如麥芽糖)的碳源產生的琥珀酸顯著增加。但是，在用諸如WO-A-2009/024294或WO-A-2010/092155中公開的那些的細菌菌株來產生諸如琥珀酸的有機化合物時，將碳源轉化為希望得到的有機化合物的選擇性以及希望得到的有機化合物的產率仍可以改進。此外，已觀察到，在用現有技術的細菌菌株來在厭氧條件下產生諸如琥珀酸的有機化合物時，也可以改進微生物的生長速度，以使微生物更適合用於以工業規模產生諸如琥珀酸的有機化合物。因此本發明的目的是克服現有技術的劣勢。具體而言，本發明的目的是提供微生物，該微生物可以用於發酵產生有機化合物(如琥珀酸)，且不僅從可同化的碳源(如甘油、葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、果糖或麥芽糖)大量(優選僅有少量副產物)產生希望得到的有機產物(如琥珀酸)，還表徵為厭氧條件下的快速生長。通過修飾微生物來為達到上述目的提供貢獻，與其野生型相比，該修飾微生物具有降低的pykA基因編碼的酶的活性，其中衍生該修飾微生物的野生型屬於巴斯德氏菌科。尤其通過已在野生型pykA基因中引入突變的修飾微生物來提供促成達到上述目的，其中衍生該修飾微生物的野生型屬於巴斯德氏菌科。令人驚奇地，已發現，優選通過在野生型pykA基因中引入至少一個突變來降低pykA基因編碼的酶(此酶PykA是催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)轉化為丙酮酸的丙酮酸激酶(EC2.7.1.40))的活性產生這樣的重組巴斯德氏菌科菌株，與其中此酶活性未降低的相應微生物相比，該菌株表徵為提高的有機化合物(如琥珀酸)產率，以及厭氧條件下的更快生長。在表述「與其野生型相比具有降低的x基因編碼的酶的活性的修飾微生物」(其中x基因是pykA基因，及可選地，後文所述的ldhA基因、pflA基因和/或pflD基因)的背景中，術語「野生型」指其中x基因編碼的酶的活性未降低的微生物，即指其基因組以引入x基因(尤其是pykA基因，及可選地，ldhA基因、pflA基因和/或pflD基因)的遺傳修飾之前的狀態存在的微生物。優選地，表述「野生型」指其基因組尤其是其x基因以由於進化而天然產生的狀態存在的微生物。該術語可以用於整個微生物和單個基因二者，但優選用於單個基因，如pykA基因、ldhA基因、pflA基因和/或pflD基因。因此術語「修飾微生物」包括這樣的微生物，該微生物已進行遺傳改變、修飾或改造(例如遺傳改造)，使得它與它所衍生自的天然存在的野生型微生物相比顯示改變的、修飾的或不同的基因型和/或表型(例如，在遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時)。根據本發明的修飾微生物的具體的優選實施方案，修飾微生物是重組微生物，其是指用重組DNA獲得的微生物。本文所用的表述「重組DNA」指源自用實驗室方法(分子克隆)使來自多種來源的遺傳物質結合在一起產生否則將不見於生物中的序列的DNA序列。衍生本發明的微生物的野生型屬於巴斯德氏菌科。巴斯德氏菌科包含革蘭氏陰性朊細菌門(Proteobacteria)的大家族，成員從細菌(如流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae))至動物和人類黏膜的共生體。大部分成員作為鳥類和哺乳類黏膜表面(尤其是在上呼吸道中)上的共生體生活。巴斯德氏菌科通常為杆狀，是值得注意的一組兼性厭氧菌。它們可以通過氧化酶的存在而與相關的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)區分開，並通過鞭毛的缺乏而與大多數其他相似的細菌區分開。巴斯德氏菌科中的細菌已根據代謝特性及其16SRNA和23SRNA序列分類為許多屬。巴斯德氏菌科的許多成員包含丙酮酸甲酸裂合酶基因，能夠厭氧發酵碳源為有機酸。根據本發明的修飾微生物的具體的優選實施方案，衍生修飾微生物的野生型屬於Basfia屬，尤其優選衍生修飾微生物的野生型屬於Basfiasucciniciproducens物種。最優選地，衍生本發明的修飾微生物的野生型是在布達佩斯條約下保藏於德國DSMZ(德意志微生物保藏中心)的保藏號DSM18541的Basfiasucciniciproducens菌株DD1。此菌株最初分離自德國來源的牛的瘤胃，巴斯德氏菌屬(Pasteurella)細菌可從動物優選哺乳動物的胃腸道分離。細菌菌株DD1尤其可從牛瘤胃分離，且能夠利用甘油(包括粗甘油)作為碳源。可以用於製備本發明的修飾微生物的其他Basfia屬菌株是以保藏號DSM22022，保藏於DSZM的Basfia屬菌株，或保藏於瑞典哥德堡大學培養物保藏所(CultureCollectionoftheUniversityofCCUG)的具有保藏號CCUG57335、CCUG57762、CCUG57763、CCUG57764、CCUG57765或CCUG57766的Basfia屬菌株。該菌株最初分離自德國或瑞士來源的牛的瘤胃。在此背景中，尤其優選衍生本發明的修飾微生物的野生型具有SEQIDNO:1或與SEQIDNO:1顯示至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列的16SrDNA。還優選衍生本發明的修飾微生物的野生型具有SEQIDNO:2或與SEQIDNO:2顯示至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列的23SrDNA。與待用於本發明的修飾微生物的多種多肽或多核苷酸一併提到的以百分比值表示的同一性優選計算為所比對的序列全長內殘基的同一性，例如，藉助來自生物信息學軟體包EMBOSS(5.0.0版,http://emboss.source-forge.net/what/)的程序，以默認參數計算的同一性(對於非常相似的序列)，該默認參數即為缺口開放(開放一個缺口的罰分)：10.0；缺口延伸(延伸一個缺口的罰分)：0.5；數據文件(包括在軟體包中的評分矩陣文件)：EDNAFUL。應指出，本發明的修飾微生物不僅可以衍生自上述野生型微生物，尤其是衍生自Basfiasucciniciproducens菌株DD1，還可以衍生自這些菌株的變體。在此背景中，表述「菌株的變體」包含具有與野生型菌株相同或基本相同的特徵的每種菌株。在此背景中，尤其優選變體的16SrDNA與衍生變體的野生型具有至少90％、優選至少95％、更優選至少99％、更優選至少99.5％、更優選至少99.6％、更優選至少99.7％、更優選至少99.8％和最優選至少99.9％同一性。還尤其優選變體的23SrDNA與衍生變體的野生型具有至少90％、優選至少95％、更優選至少99％、更優選至少99.5％、更優選至少99.6％、更優選至少99.7％、更優選至少99.8％和最優選至少99.9％同一性。此定義意義上的菌株的變體可以例如通過用誘變化學劑、X射線或紫外線處理野生型菌株來獲得。本發明的修飾微生物的特徵在於，與其野生型相比，pykA基因編碼的酶的活性降低。酶活性的降低(Δ活性)優選定義如下：其中，在測定Δ活性時，在完全相同的條件下測定野生型中的活性和修飾微生物中的活性。用於檢測和測定pykA基因編碼的酶的活性的方法可見於例如Bergmeyer,H.U.,Gawehn,K.和Grassl,M.(1974):「MethodsofEnzymaticAnalysis」,第2版,I卷,509-511頁,AcademicPress,Inc.,NewYork,NY.中。降低的本文公開的酶的活性，尤其是降低的pykA基因編碼的酶、乳酸脫氫酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶的活性可以是，與野生型微生物中該酶的活性相比，酶活性降低0.1％至99％，或酶活性降低至少15％、或至少25％、或至少35％、或至少45％、或至少55％、或至少65％、或至少75％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％。優選地，pykA基因編碼的酶活性的降低在15％至99％範圍內，更優選在50％至95％範圍內，甚至更優選在15％至99％範圍內。術語「降低的pykA基因編碼的酶的活性」或下文所述的「降低的乳酸脫氫酶活性」或「降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性」也涵蓋沒有可檢測到的這些酶活性的修飾微生物。術語「降低的酶活性」包括，例如，該遺傳修飾(例如遺傳改造)微生物以比該微生物的野生型的表達水平低的水平表達該酶。用於降低酶的表達的遺傳操作可以包括但不限於缺失編碼該酶的基因或其部分、改變或修飾與編碼該酶的基因的表達相關的調節序列或位點(例如通過去除強啟動子或阻抑型啟動子)、修飾涉及編碼該酶的基因的轉錄和/或基因產物的翻譯的蛋白質(例如調節蛋白質、抑制因子、增強子、轉錄激活因子等)、或本領域例行的任何其他降低特定基因表達的常規手段(包括但不限於使用反義核酸分子或其他方法來敲除或阻斷靶蛋白的表達)。此外，可以在mRNA中引入去穩定化元件或引入導致RNA核糖體結合位點(RBS)退化的遺傳修飾。還可能以這樣的方式改變基因的密碼子選擇，使得翻譯效率和速度降低。降低的酶活性也可以通過引入一個或多個導致酶活性降低的基因突變來獲得。此外，酶活性降低還可以包括使激活待降低其活性的酶所必需的激活酶失活(或降低表達)。通過後一種方法，待降低其活性的酶優選保持處於失活狀態。具有降低的pykA基因編碼的酶的活性的微生物可以天然存在，即由於自發突變。可以通過多種技術(如化學處理或輻射)來將微生物修飾為缺乏或具有顯著降低的pykA基因編碼的酶的活性。為此，將通過例如誘變化學劑、X射線或紫外線來處理微生物。在隨後的步驟中，將選擇具有降低的pykA基因編碼的酶的活性的那些微生物。修飾微生物也可通過同源重組技術獲得，該同源重組技術旨在突變、破壞或切除微生物基因組中的pykA基因，或用相應基因取代該基因，該相應基因編碼與野生型基因編碼的酶相比具有降低的活性的酶。根據本發明的修飾微生物的優選實施方案，通過在pykA基因中、優選在野生型pykA基因中引入至少一個突變來降低pykA基因編碼的酶的活性。在此背景中，尤其優選該至少一個突變導致pykA基因的核酸序列的修飾，使得修飾基因編碼的酶的胺基酸序列在至少一個胺基酸上不同於野生型pykA基因編碼的酶的胺基酸序列。可以例如通過定位或隨機誘變來在pykA基因中引入突變，然後通過重組來將修飾基因引入微生物的基因組中。可以通過藉助PCR突變基因序列SEQIDNO:3來產生pykA基因的變體。可以用「Quickchange定位誘變試劑盒」(Stratagene)來進行定位誘變。可以藉助「GeneMorphII隨機誘變試劑盒」(Stratagene)來進行SEQIDNO:3的整個編碼序列或僅其部分的隨機誘變。通過所用模板DNA的量來將誘變率設為希望得到的突變量。通過靶向單突變組合或通過連續進行幾個誘變循環來產生多重突變。在下文中，描述適合用於重組、尤其是用於將修飾的pykA基因引入微生物中的技術。此技術在本位中有時也稱為「Campbell重組」(Leenhouts等,ApplEnvMicrobiol.(1989),55卷,394-400頁)。本文所用的「Campbell入(Campbellin)」指原宿主細胞的轉化體，其中整個環狀雙鏈DNA分子(例如質粒)通過單個同源重組事件(交叉入(crossin)事件)整合入染色體，並有效導致該環狀DNA分子的線性化形式插入與該環狀DNA分子的第一DNA序列同源的染色體的第一DNA序列。「已Campbell入(Campbelledin)」指已整合入「Campbell入」轉化體的染色體中的線性化DNA序列。「Campbell入」包含雙份第一同源DNA序列，其中每個拷貝包含和圍繞同源重組交叉點的拷貝。本文所用的「Campbell出(Campbellout)」指源自「Campbell入」轉化體的細胞，其中在包含在「已Campbell入」DNA的線性化插入DNA上的第二DNA序列和與該線性化插入片段的第二DNA序列同源的染色體來源的第二DNA序列之間發生了第二同源重組事件(交叉出(crossout)事件)，該第二重組事件導致一部分整合DNA序列的缺失(拋棄)，但更重要的是，還導致一部分(這可以少至單個鹼基)整合的已Campbell入DNA保留在染色體中，使得與原宿主細胞相比，「Campbell出」細胞在染色體中包含一個或多個有意改變(例如，單個鹼基取代、多個鹼基取代、插入異源基因或DNA序列、插入同源基因或修飾同源基因的一個或多個額外拷貝、或插入包含一個以上上文所列的這些前述實例的DNA序列)。優選通過針對包含在「已Campbell入」DNA序列的一部分(希望拋棄的部分)中的基因的逆選擇來獲得「Campbell出」細胞，該基因例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)sacB基因，其在約5％至10％蔗糖存在下培養的細胞中表達時致死。在有或無逆選擇的情況下，可以通過用任何可篩選表型篩選希望得到的細胞來獲得或鑑定希望得到的「Campbell出」細胞，該可篩選表型例如但不限於菌落形態、菌落顏色、存在或缺乏抗生素抗性、聚合酶鏈反應確定給定DNA序列的存在或缺乏、存在或缺乏輔源營養、存在或缺乏酶、菌落核酸雜交、抗體篩選等。術語「Campbell入」和「Campbell出」也可以以多種時態用作動詞來指上述方法或過程。應理解，導致「Campbell入」或「Campbell出」的同源重組事件可以在同源DNA序列內的DNA鹼基的一個範圍內發生，由於同源序列將在此範圍的至少一部分內彼此相同，通常不可能確切地指出在什麼地方發生交叉事件。換言之，不可能精確指出那個序列最初來自插入的DNA，哪個序列最初來自染色體DNA。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源的區域分隔開，正是此非同源區域保留在「Campbell出」細胞的染色體中。優選地，第一和第二同源DNA序列長度為至少約200個鹼基對，且長度可以為至多幾千個鹼基對。但是，可使該方法對更短或更長的序列有效。例如，第一和第二同源序列的長度可以在約500個鹼基至2000個鹼基的範圍內，通過安排第一和第二同源序列為大致相同的長度，優選差異小於200個鹼基對，最優選二者中較短的序列是較長的序列的鹼基對長度的至少70％，來便於從「Campbell入」獲得「Campbell出」。其活性在本發明的修飾微生物中降低的pykA基因優選包含選自以下的核酸：a)具有核苷酸序列SEQIDNO:3的核酸；b)編碼胺基酸序列序列SEQIDNO:4的核酸；c)與a)或b)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優選100％同一的核酸，該同一性是a)或b)的核酸全長內的同一性；d)編碼與a)或b)的核酸所編碼的胺基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優選100％同一的胺基酸序列的核酸，該同一性是a)或b)的核酸所編碼的胺基酸序列全長內的同一性；e)能夠在嚴格條件下與a)或b)的任意核酸的互補序列雜交的核酸；和f)編碼與a)或b)的任意核酸相同的蛋白質但由於遺傳密碼的簡併性而不同於以上a)或b)的核酸的核酸。本文所用的術語「雜交」包括「核酸分子的鏈通過鹼基配對與互補鏈結合的任何過程」(J.Coombs(1994)DictionaryofBiotechnology,StocktonPress,紐約)。雜交和雜交的強度(即核酸分子間結合的強度)受諸多因素影響，如核酸分子間的互補程度、所涉及條件的嚴格性、所形成雜合鏈的Tm、核酸分子內的G:C比。本文所用的術語「Tm」用來指「解鏈溫度」。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群體的一半解離為單鏈的溫度。用於計算核酸分子Tm的方程為本領域公知。如標準參考文獻所示，可以通過方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)來計算核酸分子處於1MNaCl水溶液中時的Tm值的簡單估計值(參見例如Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization(1985))。其他參考文獻包括更複雜的計算，其將結構以及序列特徵考慮在Tm的計算中。嚴格條件為本領域技術人員已知，且可見於CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。具體而言，術語「嚴格條件」指這樣的條件，其中作為互補核苷酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)的片段或與互補核苷酸分子同一的100個相鄰核苷酸或更多核苷酸、150個相鄰核苷酸或更多核苷酸、200個相鄰核苷酸或更多核苷酸、或250個相鄰核苷酸或更多核苷酸，在等同於在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交，並在50℃或65℃下、優選65℃下在2×SSC、0.1％SDS中洗滌的條件下，與特定核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)雜交。優選地，該雜交條件等同於在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交，並在50℃或65℃、優選65℃下在1×SSC、0.1％SDS中洗滌，更優選地，該雜交條件等同於在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交，並在50℃或65℃、優選65℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌。優選地，該互補核苷酸與pykA核酸片段或整個pykA核酸雜交。備選地，優選的雜交條件包括在65℃下在1×SSC中或在42℃下在1×SSC和50％甲醯胺中雜交，然後在65℃下在0.3×SSC中洗滌，或在50℃下在4×SSC中或在40℃下在6×SSC和50％甲醯胺中雜交，然後在50℃下在2×SSC中洗滌。其他優選的雜交條件是0.1％SDS、0.1SSD和65℃。通過上述定位誘變和「Campbell重組」的組合在其中引入至少一個突變的pykA基因優選包含上文所定義的核酸。具有核苷酸序列SEQIDNO:3的核酸對應於Basfiasucciniciproducens菌株DD1的pykA基因。根據本發明的修飾微生物的優選實施方案，與其野生型相比，該修飾微生物不具有pcK基因編碼的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(EC4.1.1.49)的提高的活性水平。在此背景中，尤其優選的是，在該修飾微生物中，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶活性水平未由於用改變的提高磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶活性的調節序列取代pck基因的天然調節序列而提高。根據本發明的修飾微生物的另一優選實施方案，與其野生型相比，此微生物不僅表徵為降低的pykA基因編碼的酶的活性，還表徵為：i)降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性；ii)降低的乳酸脫氫酶活性；或iii)降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性和降低的乳酸脫氫酶活性。WO-A-2010/092155、US2010/0159543和WO-A-2005/052135中公開了乳酸脫氫酶缺陷和/或丙酮酸甲酸裂合酶活性缺陷的修飾微生物，其關於降低微生物中、優選巴斯德氏菌屬細菌細胞中、尤其優選Basfiasucciniciproducens菌株DD1中乳酸脫氫酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶活性的不同方法的公開內容，在此引入作為參考。用於測定丙酮酸甲酸裂合酶活性的方法例如由AsanumaN.和HinoT.公開於「EffectsofpHandEnergySupplyonActivityandAmountofPyruvate-Formate-LyaseinStreptococcusbovis」,Appl.Environ.Microbiol.(2000),66卷,3773-3777頁中，用於測定乳酸脫氫酶活性的方法例如由Bergmeyer,H.U.,BergmeyerJ.和Grassl,M.(1983-1986)公開於「MethodsofEnzymaticAnalysis」,第3版,III卷,126-133頁,VerlagChemie,Weinheim中。在此背景中，優選通過失活ldhA基因(其編碼乳酸脫氫酶LdhA；EC1.1.1.27或EC1.1.1.28)來達到降低乳酸脫氫酶活性，通過失活pflA基因(其編丙酮酸甲酸裂合酶激活物PflA；EC1.97.1.4)或pflD基因(其編丙酮酸甲酸裂合酶PflD；EC2.3.1.54)來達到降低丙酮酸甲酸裂合酶活性，其中優選通過缺失這些基因或其部分、通過缺失這些基因的調節元件或至少其部分、或通過在這些基因中引入至少一個突變來達到失活這些基因(即ldhA、pflA和pflD)，其中優選藉助上文所述的「Campbell重組」來進行這些修飾。其活性在本發明的修飾微生物中降低的ldhA基因優選包含選自以下的核酸：α1)具有核苷酸序列SEQIDNO:27的核酸；α2)編碼胺基酸序列序列SEQIDNO:28的核酸；α3)與α1)或α2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優選100％同一的核酸，該同一性是α1)或α2)的核酸全長內的同一性；α4)編碼與α1)或α2)的核酸所編碼的胺基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優選100％同一的胺基酸序列的核酸，該同一性是α1)或α2)的核酸所編碼的胺基酸序列全長內的同一性；α5)能夠在嚴格條件下與α1)或α2)的任意核酸的互補序列雜交的核酸；和α6)編碼與α1)或α2)的任意核酸相同的蛋白質但由於遺傳密碼的簡併性而不同於以上α1)或α2)的核酸的核酸。其活性在本發明的修飾微生物中降低的pflA基因優選包含選自以下的核酸：β1)具有核苷酸序列SEQIDNO:29的核酸；β2)編碼胺基酸序列序列SEQIDNO:30的核酸；β3)與β1)或β2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優選100％同一的核酸，該同一性是β1)或β2)的核酸全長內的同一性；β4)編碼與β1)或β2)的核酸所編碼的胺基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優選100％同一的胺基酸序列的核酸，該同一性是β1)或β2)的核酸所編碼的胺基酸序列全長內的同一性；β5)能夠在嚴格條件下與β1)或β2)的任意核酸的互補序列雜交的核酸；和β6)編碼與β1)或β2)的任意核酸相同的蛋白質但由於遺傳密碼的簡併性而不同於以上β1)或β2)的核酸的核酸。其活性在本發明的修飾微生物中降低的pflD基因優選包含選自以下的核酸：γ1)具有核苷酸序列SEQIDNO:31的核酸；γ2)編碼胺基酸序列序列SEQIDNO:32的核酸；γ3)與γ1)或γ2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優選100％同一的核酸，該同一性是γ1)或γ2)的核酸全長內的同一性；γ4)編碼與γ1)或γ2)的核酸所編碼的胺基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優選100％同一的胺基酸序列的核酸，該同一性是γ1)或γ2)的核酸所編碼的胺基酸序列全長內的同一性；γ5)能夠在嚴格條件下與γ1)或γ2)的任意核酸的互補序列雜交的核酸；和γ6)編碼與γ1)或γ2)的任意核酸相同的蛋白質但由於遺傳密碼的簡併性而不同於以上γ1)或γ2)的核酸的核酸。在此背景中，優選本發明的修飾微生物進一步包含：A)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的調節元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一個突變的引入；B)pflD基因或至少其部分的缺失，pflD基因的調節元件或至少其部分的缺失，或pflD基因中至少一個突變的引入；C)pflA基因或至少其部分的缺失，pflA基因的調節元件或至少其部分的缺失，或pflA基因中至少一個突變的引入；D)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的調節元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一個突變的引入；和pflD基因或至少其部分的缺失，pflD基因的調節元件或至少其部分的缺失，或pflD基因中至少一個突變的引入；或E)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的調節元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一個突變的引入；和pflA基因或至少其部分的缺失，pflA基因的調節元件或至少其部分的缺失，或pflA基因中至少一個突變的引入。本發明的修飾微生物的尤其優選的實施方案是：-Basfia屬且尤其優選Basfiasucciniciproducens物種的修飾細菌細胞，其中在pykA基因中引入了至少一個突變，優選至少一個導致pykA基因所編碼的酶中至少一個胺基酸的取代的突變，最優選至少導致pykA基因所編碼的酶中半胱氨酸取代167位甘氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸、或甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且酪氨酸取代417位半胱氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸、酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸的突變，且其中進一步優選與野生型相比，該修飾細菌細胞不具有提高的pck基因編碼的酶的活性；-Basfia屬且尤其優選Basfiasucciniciproducens物種的修飾細菌細胞，其中在pykA基因中引入了至少一個突變，優選至少一個導致pykA基因所編碼的酶中至少一個胺基酸的取代的突變，最優選至少導致pykA基因所編碼的酶中半胱氨酸取代167位甘氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸、或甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且酪氨酸取代417位半胱氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸、酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸的突變，且其中與野生型相比，優選通過修飾ldhA基因，尤其是通過修飾具有SEQIDNO:27的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:28的胺基酸序列的LdhA的ldhA基因，來降低乳酸脫氫酶的活性，且其中進一步優選與野生型相比，該修飾細菌細胞不具有提高的pck基因編碼的酶的活性；-Basfia屬且尤其優選Basfiasucciniciproducens物種的修飾細菌細胞，其中在pykA基因中引入了至少一個突變，優選至少一個導致pykA基因所編碼的酶中至少一個胺基酸的取代的突變，最優選至少導致pykA基因所編碼的酶中半胱氨酸取代167位甘氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸、或甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且酪氨酸取代417位半胱氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸、酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸的突變，且其中與野生型相比，優選通過修飾pflA基因或pflD基因，尤其是通過修飾具有SEQIDNO:29的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:30的胺基酸序列的PflA的pflA基因，或通過修飾具有SEQIDNO:31的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:32的胺基酸序列的PflD的pflD基因，來降低丙酮酸甲酸裂合酶的活性，且其中進一步優選與野生型相比，該修飾細菌細胞不具有提高的pck基因編碼的酶的活性；或-Basfia屬且尤其優選Basfiasucciniciproducens物種的修飾細菌細胞，其中在pykA基因中引入了至少一個突變，優選至少一個導致pykA基因所編碼的酶中至少一個胺基酸的取代的突變，最優選至少導致pykA基因所編碼的酶中半胱氨酸取代167位甘氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸、或甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且酪氨酸取代417位半胱氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸、酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸的突變，且其中與野生型相比，優選通過修飾ldhA基因和pflA基因，尤其是通過修飾具有SEQIDNO:27的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:28的胺基酸序列的LdhA的ldhA基因，或通過修飾具有SEQIDNO:29的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:30的胺基酸序列的PflA的pflA基因，或通過修飾ldhA基因和pflD基因，尤其是通過修飾具有SEQIDNO:27的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:28的胺基酸序列的LdhA的ldhA基因，或通過修飾具有SEQIDNO:31的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:32的胺基酸序列的PflD的pflD基因，來降低乳酸脫氫酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，且其中進一步優選與野生型相比，該修飾細菌細胞不具有提高的pck基因編碼的酶的活性。此外，通過產生有機化合物的方法來為解決一開始提到的問題提供貢獻，該方法包括：I)在包含至少一種可同化的碳源的培養基中培養本發明的修飾微生物，以允許修飾微生物產生有機化合物，從而獲得包含有機化合物的發酵液；II)從方法步驟I)中獲得的發酵液回收有機化合物。在方法步驟I)中，在包含至少一種可同化的碳源的培養基中培養本發明的修飾微生物，以允許修飾微生物產生有機化合物，從而獲得包含有機化合物的發酵液。可通過本發明的方法產生的優選的有機化合物包括：羧酸，如甲酸、乳酸、丙酸、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、丙烯酸、丙酮酸或這些羧酸的鹽；二羧酸，如丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、戊二酸、衣康酸、己二酸或其鹽；三羧酸，如檸檬酸或其鹽；醇，如甲醇或乙醇；胺基酸，如L-天冬醯胺、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-異亮氨酸、L-甘氨酸、L-穀氨醯胺、L-穀氨酸、L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸等。根據本發明的方法的優選實施方案，該有機化合物是琥珀酸。在本發明背景中使用的術語「琥珀酸」必須以其最廣泛的含義理解，且還涵蓋其鹽(即琥珀酸鹽)，例如，鹼金屬鹽，如Na+和K+鹽，或鹼土金屬鹽，如Mg2+和Ca2+鹽，或銨鹽，或琥珀酸酐。優選在約10℃至60℃或20℃至50℃或30℃至45℃範圍內的溫度下，在5.0至9.0或5.5至8.0或6.0至7.0的pH下，在培養基中培養本發明的修飾微生物。優選地，在厭氧條件下產生有機化合物，尤其是琥珀酸。厭氧條件可以藉助常規技術來建立，例如，通過對反應介質的組分脫氣，並通過按例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入二氧化碳或氮氣或其混合物和可選地引入氫氣來維持厭氧條件。需氧條件可以藉助常規技術來建立，例如，通過按例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入空氣或氧氣。根據需要，可以在方法中應用0.1至1.5bar的輕微超壓。可同化的碳源優選選自蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甘油、其混合物及包含該化合物中的至少一種的組合物，或選自澱粉、纖維素、半纖維素和/或木素纖維素的分解產物。優選地，可同化的碳源選自D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油及這些化合物中的至少兩種的混合物，其中尤其優選甘油和D-葡萄糖、甘油和蔗糖、甘油和D-木糖、甘油和麥芽糖及D-葡萄糖和果糖的混合物。可同化的碳源的初始濃度優選調節至5至100g/l、優選5至75g/l和更優選5至50g/l範圍內的值，且可以在培養期間維持在該範圍內。反應介質的pH可以通過加入適宜的鹼來控制，例如氣態氨、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物。如果發酵方法過程中形成的有機化合物是羧酸或二羧酸，則尤其需要這些鹼性中和劑。在琥珀酸作為有機化合物的情況下，Mg(OH)2和MgCO3是尤其優選的鹼。本發明的發酵步驟I)可以例如在攪拌式發酵罐、泡罩塔和環式反應器中進行。可能的方法類型(包括攪拌器類型和幾何設計)的綜合概述可見於Chmiel:「Bioprozesstechnik:EinführungindieBioverfahrenstechnik」,1卷中。在本發明的方法中，在本發明的方法中，可用的典型變通形式是本領域技術人員已知或例如Chmiel,HammesandBailey:「BiochemicalEngineering」中解釋的以下變通形式：如批次、補料分批、反覆補料分批或其他具有生物質再循環的連續發酵。取決於生產菌株，可以用空氣、氧氣、二氧化碳、氫氣、氮氣或適當的氣體混合物進行通氣，以達到良好的產率(YP/S)。用於在方法步驟I)中產生有機化合物尤其是琥珀酸的尤其優選的條件是：可同化的碳源：甘油、蔗糖、D-葡萄糖、麥芽糖、甘油+D-葡萄糖、甘油+蔗糖、甘油+麥芽糖、甘油+D-木糖、D-葡萄糖+果糖溫度：30至45℃pH：5.5至7.0所提供的氣體：CO2此外，優選在方法步驟I)中，可同化的碳源轉化為有機化合物(優選琥珀酸)，碳產率YP/S為至少0.5g/g至約1.28g/g，例如，碳產率YP/S為至少0.6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少0.9g/g、至少0.95g/g、至少1.0g/g、至少1.05g/g、至少1.1g/g、至少1.15g/g、至少1.20g/g、至少1.22g/g或至少1.24g/g(有機化合物/碳，優選琥珀酸/碳)。此外，優選在方法步驟I)中，可同化的碳源轉化為有機化合物(優選琥珀酸)，單位生產率(specificproductivityyield)為至少0.6ggDCW-1h-1有機化合物(優選琥珀酸)、或至少0.65ggDCW-1h-1、或至少0.7ggDCW-1h-1、或至少0.75ggDCW-1h-1或至少0.77ggDCW-1h-1有機化合物(優選琥珀酸)。此外，優選在方法步驟I)中，可同化的碳源轉化為有機化合物(優選琥珀酸)，有機化合物(優選琥珀酸)的時空產率為至少2.2g/(L×h)、或至少2.5g/(L×h)、至少2.75g/(L×h)、至少3g/(L×h)、至少3.25g/(L×h)、至少3.5g/(L×h)、至少3.7g/(L×h)、至少4.0g/(L×h)、至少4.5g/(L×h)、或至少5.0g/(L×h)有機化合物(優選琥珀酸)。根據本發明的方法的另一優選實施方案，在方法步驟I)中，修飾微生物將至少20g/l、更優選至少25g/l和甚至更優選至少30g/l的可同化碳源轉化為至少20g/l、更優選至少25g/l和甚至更優選至少30g/l的有機化合物(優選琥珀酸)。本文所述的不同產率參數(「碳產率」或「YP/S」、「單位生產率」或「時空產率(STY)」)為本領域公知，並按例如Song和Lee,2006所述測定。「碳產率」和「YP/S」(各以所產生的有機化合物的質量/所消耗的可同化碳源的質量表示)在本文中作為同義詞使用。單位生產率描述每克幹生物質每小時和每升發酵液產生的產物(如琥珀酸)的量。表示為「DCW」的幹細胞重的量描述生物化學反應中生物活性微生物的量。值作為克產物/克DCW/小時(即ggDCW-1h-1)給出。時空產率(STY)定義為發酵過程中形成的有機化合物的總量與培養物體積的比值，在整個培養時間內考慮。時空產率也稱為「體積生產力(volumetricproductivity)」。在方法步驟II)中，從方法步驟I)中獲得的發酵液回收有機化合物，優選琥珀酸。通常，回收方法包括將重組微生物作為所謂的「生物質」從發酵液分開的步驟。用於去除生物質的方法為本領域技術人員已知，且包括過濾、沉降、漂浮或其組合。因此，可以用例如離心機、分離器、傾析器、濾器或在漂浮設備中去除生物質。為了有價值的產物的最大回收，通常可以例如以滲濾的形式洗滌生物質。方法的選擇取決於發酵液中的生物質含量和生物質的特性，以及生物質與有機化合物(即有價值的產物)的相互作用。在一個實施方案中，可對發酵液進行滅菌或巴氏滅菌。在另一實施方案中，濃縮發酵液。取決於需要，此濃縮可以分批或連續進行。壓力和溫度範圍應這樣選擇，使得首先不發生產物損傷，其次僅有必要最小程度地使用設備和能量。為多級蒸發巧妙地選擇壓力和溫度水平尤其使得能夠節約能量。回收方法可以進一步包括附加的純化步驟，其中進一步純化有機化合物，優選琥珀酸。但是，如果通過下文所述的化學反應將該有機化合物轉化為次級有機產物，則取決於反應類型和反應條件，並非必然需要進一步純化該有機化合物。為了純化方法步驟II)中獲得的有機化合物，優選為了純化琥珀酸，可以使用本領域技術人員已知的方法，例如結晶、過濾、電透析和層析。在琥珀酸作為有機化合物的情況下，例如，可以通過用氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鈣或碳酸氫鈣中和並過濾沉澱，通過將琥珀酸沉澱為琥珀酸鈣產物來分離它。通過用硫酸酸化，然後過濾去除沉澱的硫酸鈣(石膏)來從沉澱的琥珀酸鈣回收琥珀酸。得到的溶液可以藉助離子交換層析來進一步純化，以去除不希望得到的殘留離子。備選地，如果用氫氧化鎂、碳酸鎂或其混合物來中和發酵液，則可以酸化方法步驟I)中獲得的發酵液，以將包含在介質中的琥珀酸鎂轉化為酸形式(即琥珀酸)，隨後可以通過冷卻酸化的介質來結晶。其他適宜的純化方法的實例公開於EP-A-1005562、WO-A-2008/010373、WO-A-2011/082378、WO-A-2011/043443、WO-A-2005/030973、WO-A-2011/123268、WO-A-2011/064151和EP-A-2360137中。根據本發明的方法的優選實施方案，該方法進一步包括方法步驟：III)通過至少一步化學反應，使包含在方法步驟I)中獲得的發酵液中的有機化合物轉化或使方法步驟II)中獲得的回收的有機化合物轉化為不同於該有機化合物次級有機產物。在琥珀酸作為有機化合物的情況下，優選的次級有機產物選自琥珀酸酯及其聚合物、四氫呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁內酯(GBL)和吡咯烷酮。根據用於產生THF、BDO和/或GBL的優選實施方案，此方法包括：b1)直接催化氫化方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸為THF和/或BDO和/或GBL；或b2)化學酯化方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸和/或琥珀酸鹽為其相應的二-低級烷基酯，隨後催化氫化該酯為THF和/或BDO和/或GBL。根據用於產生吡咯烷酮的優選實施方案，此方法包括：b)以本身已知的方式化學轉化方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸銨鹽為吡咯烷酮。對於製備這些化合物的詳情，參考US-A-2010/0159543和WO-A-2010/092155。通過本發明的修飾微生物在發酵產生有機化合物中的用途來為解決一開始提到的問題提供貢獻。優選的有機化合物是已經與本發明的方法一併提到的那些化合物，最優選的有機化合物是琥珀酸。此外，用於發酵產生有機化合物(優選琥珀酸)的優選條件是已經與本發明方法的方法步驟I)一併描述的那些條件。現在藉助附圖和非限制性實施例更詳細地解釋本發明。圖1顯示質粒pSacB(SEQIDNO:5)的示意圖譜。圖2顯示質粒pSacBΔldhA(SEQIDNO:6)的示意圖譜。圖3顯示質粒pSacBΔpflA(SEQIDNO:7)的示意圖譜。圖4顯示質粒pSacBΔpflD(SEQIDNO:8)的示意圖譜。圖5顯示質粒pSacBpykA1(SEQIDNO:9)的示意圖譜。圖6顯示質粒pSacBpykA2(SEQIDNO:10)的示意圖譜。圖7顯示質粒pSacBpykA3(SEQIDNO:11)的示意圖譜。圖8顯示質粒pSacBpykA4(SEQIDNO:12)的示意圖譜。圖9顯示質粒pSacBpykA5(SEQIDNO:13)的示意圖譜。圖10顯示質粒pSacBpykA6(SEQIDNO:14)的示意圖譜。圖11顯示丙酮酸激酶的胺基酸序列比對(pykA野生型：來自野生型菌株BasfiasucciniciproducensDD1的丙酮酸激酶的胺基酸序列；pykA2：來自DD1ΔldhAΔpflApykA2菌株的丙酮酸激酶PykA2的胺基酸序列；pykA4：來自DD1ΔldhAΔpflDpykA4菌株的丙酮酸激酶PykA4的胺基酸序列；pykA5：來自DD1ΔldhAΔpflDpykA5菌株的丙酮酸激酶PykA5的胺基酸序列；pykA6：來自ΔldhAΔpflDpykA6菌株的丙酮酸激酶PykA6的胺基酸序列)。實施例實施例1：用於轉化Basfiasucciniciproducens的一般方法菌株野生型DD1(保藏號DSM18541)DD1ΔldhADD1ΔldhAΔpflADD1ΔldhAΔpflApykA2DD1ΔldhAΔpflDDD1ΔldhAΔpflDpykA4DD1ΔldhAΔpflDpykA5DD1ΔldhAΔpflDpykA5表1：實施例中提到的DD1野生型和突變體的命名。通過使用以下流程的電穿孔來用DNA轉化BasfiasucciniciproducensDD1(野生型)：為了製備預培養物，從凍存物將DD1接種入100ml搖瓶中的40mlBHI(腦心浸液；Becton,DickinsonandCompany)。37℃、200轉/分鐘過夜進行孵育。為了製備主培養物，在250ml搖瓶中放入100mlBHI，用預培養物接種至最終OD(600nm為0.2。37℃、200轉/分鐘過夜進行孵育。在OD約為0.5、0.6和0.7時收集細胞，用4℃的10％冷甘油洗滌沉澱一次，重懸在2ml10％甘油(4℃)中。在寬度為0.2cm的電穿孔杯中將100μl感受態細胞與2-8μg質粒DNA混合，並在冰上放置2分鐘。在以下條件下電穿孔：400Ω、25μF、2.5kV(GenePulser,Bio-Rad)。電穿孔後立即加入1ml冷BHI，並在37℃進行約2小時孵育。將細胞接種在含5mg/L氯黴素的BHI上，並在37℃孵育2-5天，直至轉化體的菌落可見。分離克隆，並重新劃線接種在含5mg/L氯黴素的BHI上，直至獲得純的克隆。實施例2：缺失/突變構建體的產生1.缺失構建體的產生缺失質粒基於載體pSacB(SEQIDNO:5)構建。圖1顯示質粒pSacB的示意圖譜。通過PCR從Basfiasucciniciproducens的染色體DNA擴增應缺失的染色體片段5』-和3』-側翼區(各約1500bp)，並用標準技術引入該載體。通常，靶向至少80％的OFR進行缺失。以這種方式，構建了用於乳酸脫氫酶ldhA(pSacB_delta_ldhA(SEQIDNO:6))、丙酮酸甲酸裂合酶激活酶pflA(pSacB_delta_pflA(SEQIDNO:7))和丙酮酸甲酸裂合酶pflD(pSacB_delta_pflD(SEQIDNO:8))的缺失質粒。圖2、3和4分別顯示質粒pSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflA和pSacB_delta_pflD的示意圖譜。在pSacB的質粒序列(SEQIDNO:5)中，從鹼基2380至3801包含sacB基因。從鹼基3802至4264包含sacB啟動子。從鹼基526至984包含氯黴素基因。從鹼基1477至2337包含用於大腸桿菌(E.coli)的複製起點(oriEC)(參見圖1)。在pSacB_delta_ldhA的質粒序列(SEQIDNO:6)中，從鹼基1519至2850包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的ldhA基因5』側翼區，而從鹼基62至1518包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的ldhA基因3』側翼區。從鹼基5169至6590包含sacB基因。從鹼基6591至7053包含sacB啟動子。從鹼基3315至3773包含氯黴素基因。從鹼基4266至5126包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)(參見圖2)。在pSacB_delta_pflA的質粒序列(SEQIDNO:7)中，從鹼基1506至3005包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pflA基因5』側翼區，而從鹼基6至1505包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pflA基因3』側翼區。從鹼基5278至6699包含sacB基因。從鹼基6700至7162包含sacB啟動子。從鹼基3424至3882包含氯黴素基因。從鹼基4375至5235包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)(參見圖3)。在pSacB_delta_pflD的質粒序列(SEQIDNO:8)中，從鹼基1533至2955包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pflD基因5』側翼區，而從鹼基62至1532包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pflD基因3』側翼區。從鹼基5256至6677包含sacB基因。從鹼基6678至7140包含sacB啟動子。從鹼基3402至3860包含氯黴素基因。從鹼基4353至5213包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)(參見圖4)。2.用於在pykA基因中引入點突變的構建體的產生在pSacB_pykA1的質粒序列(SEQIDNO:9)中，從鹼基6至1185包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pykA基因部分。從鹼基3458至4879包含sacB基因。從鹼基4880至5342包含sacB啟動子。從鹼基1604至2062包含氯黴素基因。從鹼基2555至3415包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)(參見圖5)。通過定位誘變從pSac_pykA1質粒產生質粒pSacB_pykA2。在pykA基因中引入的G至T突變最終將導致PykA蛋白質中167位的G(甘氨酸)至C(半胱氨酸)交換(參見圖6)。SEQIDNO:15中顯示pSacB_pykA2中的pykA基因的核苷酸序列，SEQIDNO:16中顯示此基因編碼的酶的胺基酸序列。在pSacB_delta_pykA2的質粒序列(SEQIDNO:10)中，從鹼基6至1185包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pykA基因部分。從鹼基3458至4879包含sacB基因。從鹼基4880至5342包含sacB啟動子。從鹼基1604至2062包含氯黴素基因。從鹼基2555至3415包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)(參見圖7)。在pSacB_pykA3的質粒序列(SEQIDNO:11)中，從鹼基6至909包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pykA基因部分。從鹼基3729至5150包含sacB基因。從鹼基5151至5613包含sacB啟動子。從鹼基1875至2333包含氯黴素基因。從鹼基2826至3686包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)(參見圖8)。通過定位誘變從pSac_pykA3質粒產生質粒pSacB_pykA4。在pykA基因中引入的G至A突變最終將導致PykA蛋白質中417位的C(半胱氨酸)至Y(酪氨酸)交換(參見圖8)。SEQIDNO:17中顯示pSacB_pykA4中的pykA基因的核苷酸序列，SEQIDNO:18中顯示此基因編碼的酶的胺基酸序列。此外，通過沉默突變產生DraI限制位點。此限制位點將幫助鑑定正確的轉化體。在pSacB_delta_pykA4的質粒序列(SEQIDNO:19)中，從鹼基6至909包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pykA基因部分。從鹼基3729至5150包含sacB基因。從鹼基5151至5613包含sacB啟動子。從鹼基1875至2333包含氯黴素基因。從鹼基2826至3686包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)(參見圖9)。通過定位誘變從pSac_pykA1質粒產生質粒pSacB_pykA5。在pykA基因中引入的C至G突變最終將導致PykA蛋白質中171位的A(丙氨酸)至G(甘氨酸)交換(參見圖9)。SEQIDNO:19中顯示pSacB_pykA5中的pykA基因的核苷酸序列，SEQIDNO:20中顯示此基因編碼的酶的胺基酸序列。此外，通過沉默突變產生HpaI限制位點。此限制位點將幫助鑑定正確的轉化體。在pSacB_pykA5的質粒序列(SEQIDNO:13)中，從鹼基6至1185包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pykA基因部分。從鹼基3458至4879包含sacB基因。從鹼基4880至5342包含sacB啟動子。從鹼基1604至2062包含氯黴素基因。從鹼基2555至3415包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)。通過定位誘變從pSac_pykA1質粒產生質粒pSacB_pykA6。在pykA基因中引入的G至T突變最終將導致PykA蛋白質中167位的G(甘氨酸)至C(半胱氨酸)交換(參見圖10)。SEQIDNO:21中顯示pSacB_pykA6中的pykA基因的核苷酸序列，SEQIDNO:22中顯示此基因編碼的酶的胺基酸序列。此外，通過沉默突變產生HpaI限制位點。此限制位點將幫助鑑定正確的轉化體。在pSacB_pykA6的質粒序列(SEQIDNO:14)中，從鹼基6至1185包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pykA基因部分。從鹼基3458至4879包含sacB基因。從鹼基4880至5342包含sacB啟動子。從鹼基1604至2062包含氯黴素基因。從鹼基2555至3415包含用於大腸桿菌的複製起點(oriEC)。實施例3：改進的產琥珀酸菌株的產生1.缺失突變體的產生a)用pSacB_delta_ldhA按上文所述轉化BasfiasucciniciproducensDD1，並「Campbelled入」，以產生「Campbell入」菌株。通過PCR來確認轉化和整合入Basfiasucciniciproducens基因組，該PCR產生質粒整合入Basfiasucciniciproducens基因組的事件的條帶。然後用含有蔗糖的瓊脂平板作為針對sacB基因(的功能)的喪失進行選擇的反選擇培養基「Campbelled出」「Campbell入」菌株。因此，在25-35ml非選擇培養基(不含抗生素的BHI)中37℃、200轉/分鐘過夜孵育「Campbell入」菌株。然後將過夜培養物劃線培養在現配製的含蔗糖的BHI平板(10％，不含抗生素)上，並在37℃過夜孵育(「第一次蔗糖轉移」)。從第一轉移獲得的單菌落再次劃線培養在現配製的含蔗糖的BHI平板(10％)上，並在37℃過夜孵育(「第二次蔗糖轉移」)。重複此流程，直至在蔗糖中完成最少五次轉移(「第三、第四、第五次轉移」)。術語「第一至第五次蔗糖轉移」指為了選擇sacB基因和周圍質粒序列丟失的菌株的目的而將染色體整合了含有sacB果聚糖蔗糖酶基因的菌株轉移至含有蔗糖和生長培養基的瓊脂平板上。將從第五塊轉移平板獲得的單菌落接種在25-35ml非選擇培養基(不含抗生素的BHI)上，並在37℃、220轉/分鐘過夜孵育。將過夜培養物系列稀釋，並接種在BHI平板上，以獲得分離的單菌落。通過氯黴素敏感性來確認含有ldhA基因座的野生型環境或ldhA基因的突變/缺失的「Campbelled出」菌株。通過PCR分析來鑑定和確認這些菌株中的突變/缺失突變體。這產生了ldhA缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhA。b)按上文所述用pSacB_delta_pflA轉化BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhA，並「Campbelled入」，以產生「Campbell入」菌株。通過PCR來確認轉化和整合。然後按之前所述「Campbelled出」「Campbell入」菌株。通過PCR分析來鑑定和確認這些菌株中的缺失突變體。這產生了ldhApflD雙缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflA。c)按上文所述用pSacB_delta_pflD轉化BasfiasucciniciproducensΔldhA，並「Campbelled入」，以產生「Campbell入」菌株。通過PCR來確認轉化和整合。然後按之前所述「Campbelled出」「Campbell入」菌株。通過PCR分析來鑑定和確認這些菌株中的缺失突變體。這產生了ldhApflD雙缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflD。2.pykA基因中攜帶點突變的突變體的產生a)按上文所述用pSacB_pykA2轉化BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflA，並「Campbelled入」，以產生「Campbell入」菌株。然後按之前所述「Campbelled出」「Campbell入」菌株。藉助PCR擴增pykA編碼區並測序，以鑑定在pykA基因內攜帶突變的「Campbell出」克隆。這產生了突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflApykA2。b)按上文所述用pSacB_pykA4轉化BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflD，並「Campbelled入」，以產生「Campbell入」菌株。然後按之前所述「Campbelled出」「Campbell入」菌株。為了鑑定在pykA基因內攜帶突變的「Campbell出」克隆，用引物pykA4_fw(SEQIDNO:23)和pykA4_rv(SEQIDNO:24)藉助PCR擴增部分pykA基因座。在預篩選中，用DraI限制酶消化所得到的DNA片段。對顯示附加的DraI限制位點的片段進行測序，以確認預期的靠近pykA基因內引入的DraI限制位點的點突變。這產生了突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflDpykA4。c)按上文所述用pSacB_pykA5轉化BasfiasucciniciproducensΔldhAΔpflD，並「Campbelled入」，以產生「Campbell入」菌株。然後按之前所述「Campbelled出」「Campbell入」菌株。為了鑑定在pykA基因內攜帶突變的「Campbell出」克隆，用引物pykA5/6_fw(SEQIDNO:25)和pykA5/6_rv(SEQIDNO:26)藉助PCR擴增部分pykA基因座。在預篩選中，用HpaI限制酶消化所得到的DNA片段。對顯示附加的HpaI限制位點的片段進行測序，以確認預期的靠近pykA基因內引入的HpaI限制位點的點突變。這產生了突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflDpykA5。d)按上文所述用pSacB_pykA6轉化BasfiasucciniciproducensΔldhAΔpflD，並「Campbelled入」，以產生「Campbell入」菌株。然後按之前所述「Campbelled出」「Campbell入」菌株。為了鑑定在pykA基因內攜帶突變的「Campbell出」克隆，用引物pykA5/6_fw(SEQIDNO:25)和pykA5/6_rv(SEQIDNO:26)藉助PCR擴增部分pykA基因座。在預篩選中，用HpaI限制酶消化所得到的DNA片段。對顯示附加的HpaI限制位點的片段進行測序，以確認預期的靠近pykA基因內引入的HpaI限制位點的點突變。這產生了突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflDpykA6。實施例4：丙酮酸激酶活性在血清瓶中在如下培養基(BHI培養基(BectonDickinsion，含有以下添加：MOPS9.4g/l、Mg(OH)20.625g/l、BIS-TRIS5.8g/l、NaHCO31,8g/l)中37℃厭氧培養Basfia菌株18小時。通過離心收集細胞並冷凍。將細胞沉澱重懸在60mMHEPES-Na、60mMKCl、8.5mMMgCl2pH7.5中。用Ribolyser(ThermoHybaid)機器和藍色基質管裂解細胞。提取物在eppedorf離心機中4℃、14000轉/分鐘離心10分鐘，並保持在冰上，直至進行測定。上清用於用以下測定法測定丙酮酸激酶活性：按照MethodsofEnzymaticAnalysis,第2英文版,1卷,Bergmeyer,H.U.編輯,AcademicPress(NewYork,NY:1974),509-511頁測定的PykA酶活性。用IgG作為蛋白質校正標準品，通過Bioradproteinblueassay來測定細胞提取物中的蛋白質濃度。酶活性表示為比活(U/mg蛋白質和分鐘)，並相對地表示為攜帶未突變的pykA等位基因的菌株DD1ΔldhAΔpflD的活性的百分比。結果顯示在表2中。菌株比活[mU/mg蛋白質]Δ活性[％]DD1ΔldhAΔpflD32.40DD1ΔldhAΔpflApykA22.2593.1DD1ΔldhAΔpflDpykA42.4092.7DD1ΔldhAΔpflDpykA59.7090.3表2：PykA酶活性測試結果實施例5：在葡萄糖、蔗糖和麥芽糖/甘油上培養多種DD1菌株在存在葡萄糖、或蔗糖、或麥芽糖和甘油作為碳源的情況下，將DD1ΔldhAΔpflA菌株的生產力與DD1ΔldhAΔpflApykA2菌株的生產力相比較(表6、7和8)。利用下文所述的培養基和孵育條件分析生產力。1.培養基配製培養基的組成和配製如以下表3、4和5中所述。化合物濃度[g/L]酵母提取物(BioSpringer)10.0CaCl2×2H2O0.2MgCl2×6H2O0.2(NH4)2SO42.0NaCl1.0K2HPO43.0MgCO350.0NaHCO38.4葡萄糖52.0表3：用於葡萄糖上培養的培養基組成(培養基P)化合物濃度[g/L]酵母提取物(BioSpringer)10.0CaCl2×2H2O0.2MgCl2×6H2O0.2(NH4)2SO42.0NaCl1.0K2HPO43.0MgCO350.0NaHCO38.4蔗糖50.0表4：用於蔗糖上培養的培養基組成(培養基P)化合物濃度[g/L]酵母提取物(BioSpringer)10.0CaCl2×2H2O0.2MgCl2×6H2O0.2(NH4)2SO42.0NaCl1.0K2HPO43.0MgCO370.0NaHCO38.4麥芽糖22.5甘油50.0表5：用於麥芽糖/蔗糖上培養的培養基組成(培養基P)2.培養和分析為了培養主培養物，用來自新鮮培養的BHI瓊脂平板(厭氧條件下37℃過夜孵育)的細菌接種具有氣密丁基橡膠塞的100ml血清瓶至OD600＝0.75，該血清瓶包含50ml表3、4和5中所述液體培養基，具有CO2氣體，具有0.8bar超壓。37℃和160轉/分鐘(搖動直徑：2.5cm)孵育血清瓶。24小時後通過HPLC(HPLC方法在表9和10中描述)定量碳源的消耗和羧酸的產生。通過用分光光度計(Ultrospec3000,AmershamBiosciences,UppsalaSweden)測量600nm吸光度(OD600)來測量細胞生長。3.結果表6至8中顯示不同DD1菌株的培養實驗的結果。表6：葡萄糖上的DD1ΔldhAΔpflA菌株和DD1ΔldhAΔpflAΔpykA2菌株培養a培養時間b底物(葡萄糖)的消耗c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸和乙醇的形成gSA產率(每份所消耗的底物的SA定量)h發現乙酸、乳酸、蘋果酸和甲酸的檢測限在給定HPLC方法中低於0.01g/l表7：蔗糖上的DD1ΔldhAΔpflA菌株和DD1ΔldhAΔpflAΔpykA2菌株培養a培養時間b底物(蔗糖)的消耗c琥珀酸的形成pykA基因編碼的酶的活性的降低導致細胞在蔗糖上的更快生長。這在比較表7中的蔗糖消耗值時得到證明：在16小時內，DD1ΔldhAΔpflA菌株消耗18.55g/L的蔗糖；在相同時間(也是16小時)內，DD1ΔldhAΔpflAΔpykA2菌株已消耗50.90g/L的蔗糖。表8：麥芽糖/甘油上的DD1ΔldhAΔpflA菌株和DD1ΔldhAΔpflAΔpykA2菌株培養a培養時間b底物(麥芽糖和甘油)的消耗c琥珀酸的形成表9：用於分析葡萄糖、麥芽糖、甘油、琥珀酸、甲酸、乳酸、乙酸、丙酮酸和乙醇的HPLC方法(ZX-THF50)表10：用於分析葡萄糖和蔗糖的HPLC(Fast-CH)方法實施例6：葡萄糖、或蔗糖、或甘油和葡萄糖存在下的DD1ΔldhAΔpflDpykA4培養在存在葡萄糖、或蔗糖、或葡萄糖和甘油作為碳源的情況下，將DD1ΔldhAΔpflD菌株的生產力與突變體菌株DD1ΔldhAΔpflDpykA4的生產力相比較。利用下文所述的培養基和孵育條件分析生產力。1.培養基配製培養基CGM的組成和配製如以下表11中所述。表11：培養基CGM的組成。培養基LSM_3_葡萄糖、培養基LSM_3_蔗糖和培養基LSM_3_甘油_葡萄糖的組成如以下表14、15和16中所描述。表12：痕量元素溶液5的組成表13：維生素溶液9的組成表14：LSM_3_培養基的組成表15：SM_3_蔗糖培養基的組成表16：LSM_3_甘油_葡萄糖培養基的組成2.培養和分析為了培養預培養物，用來自新鮮培養的BHI瓊脂平板(厭氧條件下37℃過夜孵育)的細菌接種具有氣密丁基橡膠塞的100ml血清瓶，該血清瓶包含50ml表11中所述CGM液體培養基，具有CO2氣體。37℃和170轉/分鐘(搖動直徑：2.5cm)孵育血清瓶。為了培養主培養物，用CGM培養基中的2.5ml細菌培養物(孵育10小時後)接種具有氣密丁基橡膠塞的100ml血清瓶至，該血清瓶包含50ml表14中所述LSM_葡萄糖液體培養基(或LSM_3_蔗糖培養基，或LSM_3_甘油_葡萄糖培養基)(LSM_3_蔗糖培養基：表15；LSM_3_甘油_葡萄糖培養基：表16)，具有CO2氣體。6小時和30小時後通過HPLC(HPLC方法在表9和10中描述)定量碳源的消耗和羧酸的產生。通過用分光光度計(Ultrospec3000,AmershamBiosciences,Uppsala瑞典)測量600nm吸光度(OD600)來測量細胞生長。3.結果表17、18和19中顯示葡萄糖、蔗糖和麥芽糖/甘油上的DD1ΔldhAΔpflDpykA4菌株培養實驗的結果。表17：葡萄糖上的DD1ΔldhAΔpflD菌株和DD1ΔldhAΔpflDpykA4菌株培養a培養時間b底物(葡萄糖)的消耗c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸的形成表18：蔗糖上的DD1ΔldhAΔpflD菌株和DD1ΔldhAΔpflDpykA4菌株培養a培養時間b底物(蔗糖)的消耗c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸的形成表19：甘油和葡萄糖上的DD1ΔldhAΔpflD菌株和DD1ΔldhAΔpflDpykA4菌株培養a培養時間b底物(甘油、葡萄糖)的消耗c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸的形成pykA基因編碼的酶的活性的降低導致細胞在葡萄糖、蔗糖以及甘油/葡萄糖混合物上的更快生長。這在比較葡萄糖上(表17)、蔗糖上(表18)和甘油/葡萄糖上(表19)生長的DD1ΔldhAΔpflD菌株和DD1ΔldhAΔpflDpykA4菌株時得到證明。序列SEQIDNO：1(菌株DD1的16SrDNA的核苷酸序列)tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggaggaaagcttgctttctttgccgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatatcttcggattaaagggtgggactttcgggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtgacgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcagactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgggaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggSEQIDNO：2(菌株DD1的23SrDNA的核苷酸序列)agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgactaagcgtacaaggtggatgccttggcaatcagaggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggtgagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaacccagtagatgaagaatctactatcaataaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaatcaaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagaggaatcggctgggaagccgggcggcacagggtgatagccccgtacttgaaaatcattgtgtggtactgagcttgcgagaagtagggcgggacacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactcctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaaggaaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaat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