具有偶氮還原酶活性的微生物的體外檢測的製作方法

2023-05-23 09:24:56 1

具有偶氮還原酶活性的微生物的體外檢測的製作方法
【專利摘要】本發明涉及至少一種偶氮化合物用於檢測樣品中的至少一種微生物的用途。更準確地，本發明涉及用於檢測生物樣品中的具有偶氮還原酶活性的至少一種微生物的方法，包括在於下列中的步驟：將樣品與包含至少一種偶氮化合物的反應培養基相接觸；孵育所述反應培養基；和檢測所述微生物的偶氮化合物還原，其表示所述至少一種微生物的存在。
【專利說明】具有偶氮還原酶活性的微生物的體外檢測
[0001] 本發明涉及微生物領域。更具體地，其涉及檢測樣品中微生物的方法，包括檢測所 述微生物對偶氮化合物的還原的步驟。
[0002] 通常，樣品中微生物的檢測包括將所述樣品與反應培養基相接觸並檢測該反應培 養基中變化（其是微生物存在的標誌）的步驟。因此實施的微生物檢測方法優選地應基本 不依賴於在其中尋找到微生物的樣品的性質，並應有高靈敏度。
[0003] 當反應培養基是固體時，方法包括直接觀察細胞或觀察菌落的形成。
[0004] 當需要將檢測自動化時，複雜程度進一步增加。
[0005] 第一種方法包括通過比濁法或濁度檢測，即通過顯示反應培養基的不透明度來觀 察反應培養基。
[0006] 其他方法，通過自動化或非自動化生物化學途徑，利用比色法或螢光檢測法的檢 測。
[0007] 可以通過pH指示物的方式來檢測樣品與包含碳水化合物，如葡萄糖的試劑之間 的反應。
[0008] 如專利EP 0 424 293 B1所報導，可以檢測樣品與還原或氧化還原的發色或螢光 指示物之間的反應。
[0009] 可以使用發色或突光酶合成底物（綜述見0代叩3 6七31.，2009;上]\1;[(^013；[01· Methods ;79 (2) :139-55)。這樣的底物通常適合於特定的酶活性，並允許在臨床、食品或環 境樣品中的定向微生物檢測。
[0010] 如專利EP 0 790 299 B1所報導，可以，特別是在反應培養基的容器是密封容器 時，顯示pH或C02濃度的變化。
[0011] 根據該現有技術，目前的途徑仍然在於尋找通用底物，和/或允許快速反應的底 物，和/或可以與複雜樣品如食品基質一起使用的底物，和/或允許檢測難以檢測的微生物 的底物。在這方面，本發明涉及用於檢測可存在於樣品中的，具有偶氮還原酶活性的至少一 種微生物的新方法，包括在於下列中的步驟：
[0012] ?將樣品與包含至少一種偶氮化合物的反應培養基相接觸；
[0013] ?孵育所述反應培養基；和
[0014] ?檢測所述至少一種微生物對偶氮化合物的還原，其表示所述微生物的存在。
[0015] 偶氮化合物是含一個或多個Rl-N = N-R2型"偶氮"鍵的分子。其原本已知是用於 紡織、塑料、化妝品和農產品工業中的染料。已經報導了微生物和哺乳動物酶系統降解偶氮 化合物（Xu et al;Anaerobe，16:114-119)。人結腸細菌種類中偶氮還原酶活性的存在甚 至已導致了含有帶偶氮交聯鍵的聚合物的前藥的合成（Chourasia & Kain，2003 ;J. Pharm. Pharmacet. Sci :6(1) :33-66)。
[0016] 含偶氮鍵的化合物也被描述為"淬滅劑"，即如專利申請WO 2005/049 849中，其 改變培養基或螢光基團的螢光性質。其隨後可以與生物分子如脂、核酸、肽、蛋白等結合。在 這方面，偶氮衍生物被用於製備用來序列特定檢測的寡核苷酸：非雜交的寡核苷酸為非熒 光的；當其在其互補靶序列上雜交時，有螢光發射。
[0017] 本 申請人:在本文中描述了，在體外診斷方法中，和在微生物控制方法中，例如在農 產品，製藥或化妝品工業或者在環境控制中，實施的偶氮化合物的新用途。
[0018] 為了幫助本發明理解的目的給出下面的定義。
[0019] 術語牛物樣品意為用作分析的小部分或少量的分離的種類(species)。這可以是 得自抽取的生物液體的人或動物臨床樣品，或者得自任何類型食品的食品樣品，藥物或化 妝品產品，或者來自生產或處理食品或藥物或化妝品產品的環境的樣品。因此，這種樣品可 以是液體或固體。以非限制的方式，可涉及全血、血清、血漿、尿或糞便的臨床樣品，收集自 鼻、喉、皮膚、傷口或腦脊液的樣品，食品、水、飲料如奶、果汁、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黃醬、奶 酪、魚等的樣品，得自於期望用於動物的飼料的樣品，特別是如得自動物或植物粉料（meal) 的樣品，或者表面或水控制樣品。在食品來源樣品的情況下，其也指食品基質。
[0020] 該樣品可以以非修飾的形式使用，或者根據本領域技術人員已知的方法，在分析 之前可以經過富集、稀釋、提取、濃縮或純化類型的製備。
[0021] 為了本發明的目的，術語"微生物"函蓋細菌、酵母、黴菌，以及更廣泛的，通常 為單細胞的，肉眼不可見，並可以在實驗室中擴增和操作的生物。可以涉及的革蘭氏 陰性菌包括下列屬的細菌：假單胞菌屬（Pseudomenas)、埃希氏菌屬（Escherichia)、 沙門氏菌屬（Salmonella)、志賀氏菌屬（Shigella)、腸桿菌屬（Enterobacter)、克 雷伯菌屬（Klebsiella)、沙雷氏菌屬（Serratia)、變形桿菌屬（Proteus)、彎曲菌屬 (Campylobacter)、嗜血桿菌屬（Haemophilus)、摩氏菌屬（Morganella)、弧菌屬（Vibrio)、 耶爾森菌屬（Yersinia)、不動桿菌屬（Acinetobacter)、布拉漢氏菌屬（Branhamella)、 奈瑟氏菌屬（Neisseria)、布克氏菌屬（Burkholderia)、朽 1檬酸菌屬（Citrobacter)、哈夫 尼菌屬（Hafnia)、愛德華氏菌屬（Edwardsiella)、氣單胞菌屬（Aeromonas)、莫拉氏菌屬 (Moraxella)、巴斯德氏菌屬（Pasteurella)、普羅威登斯菌屬（Providencia)、放線菌屬 (Actinobacillus)、產喊桿菌屬（Alcaligenes)、博德特氏菌屬（Bordetella)、西地西菌屬 (Cedecea)、歐文氏菌屬（Erwinia)、泛生菌屬（Pantoea)、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia)、寡 養單胞菌屬（Stenotrophomonas)、黃單胞菌屬（Xanthomonas)和軍團菌屬（Legionella)。
[0022] 可以涉及的革蘭氏陽性菌包括下列屬的細菌：氣球菌屬（Aerococcus)、腸球菌屬 (Enterococcus)、鏈球菌屬（Streptococcus)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、芽抱桿菌屬 (Bacillus)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、李斯特菌屬（Listeria)、梭菌屬（Clostridium)、 加德納氏菌屬（Gardneralla)、考克氏菌屬（Kocuria)、乳球菌屬（Lactococcus)、明串珠菌 屬（Leuconostoc)、微球菌屬（Micrococcus)、Falkamia、孿生球菌屬（Gemella)、小球菌屬 (Pediococcus)、分支桿菌屬（Mycobacterium)和棒狀桿菌屬（Corynebacterium)。
[0023] 可以涉及的酵母包括下列屬的酵母：假絲酵母屬（Candida)、隱球酵母屬 (Cryptococcus)、酵母屬（Saccharomyces)和毛抱子菌屬（Trichosporon)。
[0024] 可以涉及的黴菌包括下列屬的黴菌：麴黴菌屬（Aspergi 1 lus)、鐮孢黴屬 (Fusarium)、地黴菌屬（Geotrichum)和青黴菌屬（Penicillium)。
[0025] 術語反應培養基意為包含微生物代謝和/或生長表現所需的所有成分的培養基。 反應培養基可以是固體，半固體或液體。術語"固體培養基"意為，例如，膠凝固體。瓊脂是 微生物學中培養微生物用的常規凝膠劑，但也可以使用明膠、瓊脂糖或其他天然或人工凝 膠劑。某些製備品是市售的，例如Columbia瓊脂、胰酶大豆瓊脂、Mac Conkey瓊脂、Mueller Hinton瓊脂，或者，更廣泛地，在Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中描述 的那些。
[0026] 反應培養基可以包括組合的一種或多種成分，如胺基酸、蛋白腖、碳水化合物、核 苷酸、礦物質、維生素等。培養基也可以包含染料。作為指導，可以涉及的染料包括埃文斯 藍、中性紅、羊血、馬血、遮光劑如氧化鈦、硝基苯胺、孔雀石綠、亮綠、一種或多種代謝指示 齊U，一種或多種代謝調節劑等。
[0027] 反應培養基可以是顯示培養基或者培養和顯示培養基。在第一種情況下，微生物 的培養不是必需的或者在接種前進行，而在第二種情況下，檢測和/或表徵培養基也組成 了培養用培養基。
[0028] 反應培養基可以包含一種或多種選擇性試劑。術語"選擇性試劑"意為能夠防止 或減緩非目標微生物的微生物生長的任何化合物。非限制地，〇. 〇lmg/L到5g/L之間的濃度 特別適用於本發明。
[0029] 可以涉及的選擇試劑包括抗生素、抗真菌劑、膽汁鹽、結晶紫、鹼性品紅、亮綠等。 術語"抗生素"意為能夠防止或減緩細菌生長的任何化合物。其主要屬於β丙氨酸、糖肽、 氨基糖苷、多肽、磺醯胺或喹諾酮類。
[0030] 術語"抗真菌劑"意為能夠防止或減緩酵母或黴菌生長的任何化合物。作為指導， 特別可以涉及兩性黴素 Β、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑或放線菌酮。
[0031] 術語"偶氮化合物"意為包含至少一個偶氮基團，即至少一個R「N = N-R2型鍵的 任何分子。
[0032] 術語"偶氮還原酵"意為無論其結構及其分類，能還原偶氮官能的任何酶。
[0033] 術語"還原"意為實際上偶氮雙鍵（-N = N-)的還原。該還原可以是全部的並導致 兩個胺殘基（-NH2)的形成，但其也可以是部分的並導致部分還原鍵的形成，例如-NH-NH-。 [0034] 術語"底物或發色底物"意為能通過可直接或間接檢測信號的方式來檢測酶或代 謝活性的化合物。優選地，所述酶或代謝活性是微生物的酶或代謝活性。術語"發色底物" 意為能夠通過光學信號的變化，如吸收和/或螢光變化的方式來檢測酶或代謝活性的化 合物。對於直接檢測，該底物可以連接到充當突光或有色標記物的部分（Orenga et al.， J. Microbiol. Methods ;79 (2) :139-55)。對於間接檢測，根據本發明的反應培養基可以另 外包含pH指示劑，其對底物消耗引起並顯示目標微生物代謝的pH變化敏感。所述pH指示 劑可以是發色基團或螢光基團。可涉及的發色基團的例子包括溴甲酚紫、溴百裡酚藍、中性 紅、苯胺藍和溴甲酚藍。螢光基團包括，例如，4-甲基傘形酮、羥基香豆素衍生物、螢光素衍 生物或試滷靈衍生物。
[0035] 作為指導，發色底物靶向的酶活性可以屬於水解酶類，優選地糖苷酶（osidase)、 酯酶、或肽酶類。優選地，發色底物靶向的酶活性選自：葡糖醛酸苷糖酶、葡萄糖苷酶、半乳 糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶和脫氨酶。不必說，根據本發明的方法中使用的偶氮化合物相應為 檢測偶氮還原酶活性的底物。
[0036] 術語"孵育"意為達到或保持在適合的溫度，通常在20到50°C之間並優選在30到 40°C之間，5分鐘到48小時之間，優選地4到24小時之間並更優選地16至24小時之間。
[0037] 術語"檢測"意為以肉眼或使用光學儀器辨識目標細菌生長和/或活性的存在。有 利地，當使用的培養基包括發色底物時，檢測也可以允許表徵目標微生物。
[0038] 術語"淬滅劑"意為降低指定物質螢光強度的成分。淬滅劑可以被定義為通過吸 收激發或發射的能量的滅絕物（extincteur)。淬滅可隨之被定義為激發或發射波長的滅 絕或抑制，或者是通過分子上基團的替換，所述替換誘導電子激發能力的改變。術語"基團" 意為含氣的、輕基、疏基、基於碳的，甲基、丙基、丁基、苯基等基團或殘基。
[0039] 本發明涉及檢測生物樣品中至少一種具有偶氮還原酶活性的微生物的方法，包括 在於下列中的步驟：
[0040] a)將樣品與包含至少一種偶氮化合物的反應培養基相接觸；
[0041] b)孵育所述反應培養基；和
[0042] c)檢測所述微生物的偶氮化合物還原，其表示所述至少一種微生物的存在。
[0043] 有利地，步驟c)也允許微生物計數。
[0044] 有利地，根據本發明的方法允許表徵（或鑑定）至少一類微生物。也就是說，其使 得可以檢測並確定哪類微生物被檢測到。
[0045] 大多數偶氮化合物在氧化條件下顯色而在還原條件下無色。偶氮化合物的還原可 以導致螢光化合物的形成。因此，優選地，通過測量吸收或螢光的變化來檢測偶氮化合物的 還原。優選地，通過著色的消失和/或螢光的出現來檢測偶氮化合物的還原。
[0046] 根據本發明，孵育步驟可以有氧或無氧地，也就是說在存在或不存氧氣的情況下 進行。具體地，根據本發明檢測到的微生物活性與微生物的有氧和/或無氧呼吸代謝關聯。 因此大多數微生物具有此類活性。
[0047] 根據特定的實施方式，根據本發明的方法中使用的偶氮化合物可以與螢光基團偶 聯，螢光基團的發射波長或激發波長被偶氮化合物的著色所淬滅。
[0048] 根據本發明另一特定實施方式，根據本發明的方法中使用的偶氮化合物可以淬滅 另一種分子的螢光。
[0049] 總結起來，可以：
[0050] ?檢測偶氮化合物著色的消失；
[0051] ?檢測還原產物的自然螢光；或者
[0052] ?檢測與偶氮化合物相偶聯的螢光基團或者對應於不同分子的螢光基團，淬滅現 象的消失導致的螢光出現。
[0053] 在優選的螢光基團中，以非限制的方式，可以涉及香豆素，其中有AMC(7_氨 基-4-甲基香豆素）、4-MU(4-甲基-傘形酮）、螢光素衍生物等。
[0054] 螢光基團和偶氮化合物之間的偶聯可以是分子內偶聯或分子間偶聯。術語"分子 內偶聯"意為螢光基團共價連接到偶氮化合物。例如，偶氮化合物可以與螢光基團偶聯，所 述螢光基團能夠在氧化的偶氮化合物的吸收波長下被激發或者發射。顯色的氧化偶氮化合 物隨後掩蓋了螢光。還原之後，化合物脫色並由分子內淬滅現象消失而顯示螢光。
[0055] 術語"分子間偶聯"意為螢光基團和偶氮化合物為兩個不同的化學分子。偶氮化 合物的還原引起了由分子間淬滅現象消失而導致的可能螢光出現。
[0056] 有利地，根據本發明的方法中使用的反應培養基也包含能檢測酶活性的至少第二 底物。優選地，所述底物是發色底物，即所述底物的代謝產生著色或螢光。優選地，所述酶 活性不同於偶氮還原酶活性。
[0057] 根據本發明的方法特別適用於食品類型的樣品。目前，通過市售試劑盒的方式檢 測總菌群使用三種螢光底物並允許在48小時內讀取結果。缺點在於某些食品基質與該試 劑盒有交叉反應。也就是說，與食品自身相關的非特異酶反應導致假陽性結果。以偶氮化 合物進行的測試顯示，在檢測總菌群的該測試中有最大量假陽性結果的食品基質，在使用 偶氮化合物時沒有任何背景噪聲。
[0058] 因此，有利地，根據本發明的方法可以在固體容器，如微孔板、微量管、微坩堝、毛 細管、或多孔卡如Vitek?卡或Tempo?卡中進行。優選地，反應卡是\Trtek?卡或 TemP〇? 卡。
[0059] 最後，本發明也涉及至少一種偶氮化合物用於檢測包含在樣品中的至少一種微生 物的用途。
[0060] 下面展開的實施例是為了幫助理解本發明。其是為了說明的目的給出，而不應限 制本發明的範圍。
[0061] 實施例1
[0062] 代表10種微生物的10個菌株對具有"偶氮"官能的化合物在35°C 24小時間的還 原測試。
[0063] 在微量滴定板中測試表II所列物種，每個物種由一個菌株代表，對表I中所列底 物的"偶氮"官能的還原。
[0064] 表 I
[0065]
【權利要求】
1. 檢測生物樣品中至少一種具有偶氮還原酶活性的微生物的方法，包括下列中的步 驟： a) 將所述樣品與包含至少一種偶氮化合物的反應培養基相接觸； b) 孵育所述反應培養基；和 c) 檢測所述微生物對偶氮化合物的還原，其表示所述至少一種微生物的存在。
2. 根據權利要求1的方法，其中步驟c)也能夠計數。
3. 根據權利要求1或2的方法，其中步驟c)能夠表徵至少一類微生物。
4. 根據權利要求1到3之一的方法，其中通過測量吸光度或螢光的變化來檢測所述偶 氮化合物的還原。
5. 根據權利要求4的方法，其中步驟c)對應於檢測著色的消失。
6. 根據權利要求4的方法，其中步驟c)對應於檢測螢光的出現。
7. 根據權利要求6的方法，其中所述偶氮化合物的還原導致分子內淬滅的抑制。
8. 根據權利要求6的方法，其中所述偶氮化合物的還原導致分子間淬滅的抑制。
9. 根據權利要求1到8之一的方法，其中所述培養基包含能檢測酶反應的至少第二底 物。
10. 根據權利要求9的方法，其中所述第二底物為發色底物，其代謝產生著色或螢光。
11. 根據權利要求1到10之一的方法，其中所述反應培養基是固體或液體培養基。
12. 根據權利要求1到11之一的方法，特徵在於其在卡式容器中進行。
13. 根據權利要求12的方法，其中所述反應卡是Vitek?或Tempo?卡。
14. 根據權利要求1到13之一的方法，其中所述樣品是食品基質。
15. 至少一種偶氮化合物用於檢測樣品中的至少一種微生物的用途。
【文檔編號】C12Q1/04GK104114712SQ201380006119
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年1月18日 優先權日:2012年1月19日
【發明者】A·詹姆斯, C·羅歇-達伯特, C·梅西耶, S·奧倫加 申請人:生物梅裡埃公司