狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位胺基酸突變株的製作方法

2023-05-02 07:41:31 2

專利名稱：狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位胺基酸突變株的製作方法
技術領域：
本發明屬於重組病毒疫苗領域。本發明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒 疫苗株，其表達的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位胺基酸由精氨酸R突變為谷 氨醯胺Q。更具體地，本發明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位胺基酸突變株 rLEP333Q。本發明還涉及生產所述突變株的方法，以及所述突變株的應用。
背景技術：
狂犬病即瘋狗症，又名恐水症，是由狂犬病病毒引起的、侵害中樞神經系統的急性 病毒性人獸共患性傳染病。幾乎所有的溫血動物都對狂犬病病毒易感。犬類動物在傳播人 狂犬病過程中起主要作用，是本病的主要宿主之一。此外，貓、浣熊、狐狸和蝙蝠等也會患病 並傳播病毒。狂犬病傳播途徑主要是通過動物咬傷後，唾液中的狂犬病病毒經破損皮膚侵 入機體。此外，還可通過消化道、呼吸道以及動物密切接觸等途徑傳播。狂犬病是迄今為止 人類病死率最高的急性傳染病，一旦發病，病死率可高達100%。狂犬病是一種很重要的人 畜共患病，在世界範圍內每年約有60，000餘人死於狂犬病[1]，引起嚴重的公共健康問題， 主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲等發展中國家。中國也是受狂犬病危害最為嚴重的國家 之一。狂犬病的預防主要通過疫苗免疫的方式進行。狂犬病疫苗種類繁多，效果不一。 自從1940年，Koprowski等人從病死女孩腦內分離到狂犬病病毒Flury株，經1日齡雛雞 腦內、雞胚卵黃囊傳代後，再經雞胚傳代178代以上，無論神經內、外接種都對動物喪失致 病力，但對於新生乳鼠和猴在腦內接種時仍具有殘留毒力。在雞胚傳代68代以前的稱為 「LEP」 (雞胚低代株)，高於136代的稱為「HEP」 (雞胚高代株)。Flury-LEP株具有優良的 免疫原性，被廣泛用作人或動物的狂犬病滅活疫苗種毒株，還被包括中國在內的許多國家 用作預防犬狂犬病的弱毒疫苗。科研工作者一直不間斷地對狂犬病疫苗進行改進和創新， 取得了豐碩的成果，但仍然存在很多不足。我國目前生產ERA株和Flury株活疫苗。狂犬 病弱毒疫苗在體內的增殖過程與病原感染機體的過程相似，能誘導產生細胞免疫和體液免 疫，且產生的免疫反應較強，持續時間較長，在我國狂犬病防治工作中曾起到一定的積極作 用。但有的疫苗毒株本身對乳鼠致病，對懷孕動物、免疫機能不全的動物和幼小動物使用不 安全，而且存在毒力回升、返祖的潛在危險。因此，存在獲得更加安全的減毒活病毒疫苗株 的需要。狂犬病病毒屬於彈狀病毒科、狂犬病毒屬，為不分節段單股負鏈RNA病毒，其基因 組長約12kb，共編碼5個結構蛋白核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、囊膜糖蛋白(G) 和RNA聚合酶(L)。囊膜糖蛋白G(簡稱糖蛋白或G蛋白)是狂犬病病毒最主要的致病因 子[2』3]。G蛋白主要功能包括，與細胞表面受體相互作用以介導病毒快速侵入細胞[4』5』6]，與 RNA-NP-M複合物相互作用使病毒出芽[7]。G蛋白的表達水平必須控制在一定的水平以防止 對感染神經細胞的功能性破壞[3]。多項研究表明G蛋白第333位為影響病毒毒力的關鍵位
佔[2,8,9,10] W、O
Flury-LEP雖然已高度致弱，對狗沒有致病性，但是腦內接種小鼠仍致死，且G蛋 白第333位仍是R。本研究採用負鏈RNA病毒反向遺傳(reverse genetics)操作技術，對 Flury-LEP G蛋白第333位R進行人工突變，預期獲得進一步致弱的狂犬病弱毒疫苗株。

發明內容
本發明屬於重組病毒疫苗領域。本發明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒 疫苗株，具體地，所述突變弱毒疫苗株表達的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨 基酸由精氨酸R突變為穀氨醯胺Q。更具體地，本發明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白 (G)第333位胺基酸突變株rLEP333Q，其中所述狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位 胺基酸由精氨酸R突變為穀氨醯胺Q。本發明還涉及生產所述突變株的方法，以及所述突變 株的應用。在第一方面中，本發明構建了 Flury-LEP全長基因組cDNA (SEQ IDN0:1)克隆 pCI-LEP 和 cDNA 片段克隆 pCI_F2，pCI_F3，pCI_F31，pBlue-Fl，pBlue_F2 和 pBlue_F3，以 及轉錄輔助質粒系統pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG_L，所述轉錄輔助質粒分別包括編碼狂犬病 病毒Flury-LEP核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框架(ORF)的 cDNA序列。在第二方面中，本發明利用第一方面構建的Flury-LEP全長基因組cDNA片段克隆 pBlue-F2和pCI-F31，設計帶有糖蛋白(G)第333胺基酸位點突變(R333Q)的PCR引物，成 功構建了 Flury-LEP G333突變全長基因組cDNA重組載體pCI_LEP333Q。在所述重組載體 PCI-LEP333Q中，編碼狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)的核苷酸包含鹼基突變，使得糖蛋白 (G)第333位胺基酸由精氨酸R突變為穀氨醯胺Q。然而，本領域技術人員應該理解，用於構建狂犬病病毒Flury-LEP全長基因組 cDNA重組載體以及構建Flury-LEP G333突變全長基因組cDNA重組載體的質粒包括，但不 限於，PCI，只要攜帶CMV啟動子的質粒都可以用於本發明，例如，pCAGG等。利用攜帶CMV 啟動子的質粒的優點在於，攜帶CMV啟動子的質粒利用細胞內的RNA聚合酶II進行轉錄， 而無需傳統的T7聚合酶系統，因此理論上可以在任何真核細胞系中拯救病毒。另外，本領域技術人員還應該理解，本發明第一方面和第二方面所述的構建狂犬 病病毒Flury-LEP全長基因組cDNA突變重組載體的策略可以適用於構建在Flury-LEP全 長基因組cDNA中引入任何突變的重組載體。在第三方面中，本發明利用構建的Flury-LEP G333突變全長基因組cDNA重組載 體PCI-LEP333Q,和輔助質粒系統pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG_L，在293T細胞中拯救了突變的 重組病毒株rLEP333Q。在第四方面中，本發明鑑定了突變株rLEP333Q的生物學活性。本發明人檢測了野 生株LEP(WtLEP)和突變株rLEP333Q在神經元細胞NA和非神經元細胞BHK-21上的生長動 力學曲線，如圖3所示，rLEP333Q在兩種細胞上的生長性能與wtLEP沒有顯著差異，這表明糖 蛋白(G)第333位的精氨酸R突變為穀氨醯胺Q後並不影響其生長特性。此外，本發明人 還檢測了 wtLEP、突變株rLEP333Q和無毒株HEP的嗜神經指數，結果顯示在表4中，wtLEP的 嗜神經指數為0. 8，而rLEP333Q的嗜神經指數已下降與無毒株Flury-HEP —樣接近於零。最 後，本發明人還檢測了 wtLEP、rLEP333Q以及HEP對小鼠的致病性，測定了 wtLEP和rLEP333Q的LD5tl，分別為8. 8個FFU和80個FFU。結果表明，rLEP333Q突變病毒株腦內接種小鼠感染 仍致死，但與wtLEP相比，喪失了體外嗜神經性，致病性略微下降。這表明本發明的狂犬病 病毒突變株rLEP333Q作為更安全的活毒疫苗應用的潛力。在第五方面中，本發明提供上述生產突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的方 法，所述方法包括(1)構建轉錄質粒，所述轉錄質粒包括在其中引入狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白 (G)第333位胺基酸突變的狂犬病病毒Flury-LEP全長基因組cDNA序列；(2)構建一個或多個轉錄輔助質粒，所述輔助質粒包括編碼狂犬病病毒 Flury-LEP核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框架(ORF)的cDNA 序列；(3)將所述轉錄質粒和轉錄輔助質粒共轉染允許狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗 複製的宿主細胞，培養轉染後的宿主細胞；(4)收穫上清液，鑑定突變病毒株。在一個優選實施方案中，所述轉錄質粒為pCI-LEP333Q，在所述轉錄質粒中，編碼狂 犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)的核苷酸包含鹼基突變，使得糖蛋白(G)第333位胺基酸 由精氨酸R突變為穀氨醯胺Q。所述轉錄輔助質粒是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。所述 宿主細胞是真核細胞。在第六方面中，本發明提供狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位胺基酸突 變病毒株rLEP333Q的應用，所述突變株rLEP333Q可以用作高安全性的活毒疫苗，其可以單獨 或與其它疫苗一起使用，還可以作為口服疫苗，對野生動物進行投食免疫，也可以在滅活後 進一步用於人免疫，等等。在第七方面中，本發明提供Flury-LEP G333突變全長基因組cDNA重組載體的應 用，其可以作為狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遺傳作業系統進行進一步的應用，例 如，其可以對除G蛋白333位胺基酸以外的Flury-LEP株基因組毒力相關的其它位點進行 定點突變修飾，以研究不同毒力相關位點間的作用，尋找安全性更好的活毒疫苗；還可以在 所述病毒基因組插入導致病毒減毒或增強免疫反應的外源基因，插入額外的G基因以增強 免疫原性，或者從基因組中刪除某個完整的病毒基因，使病毒無法繁殖而失去毒力。因此， 本發明的狂犬病病毒Flury-LEP G333突變全長基因組cDNA重組載體還可以用於構建表達 犬瘟熱等其它重要病原保護性免疫原的重組病毒，研製出可同時預防狂犬病及犬瘟熱等其 它疫病的重組二聯活載體疫苗。


從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特徵和優點將更明顯，其中圖1顯示狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株全長基因組cDNA的重組載體pCI_LEP的 構建示意圖。圖2顯示向編碼LEP G蛋白的基因中引入點突變，構建rLEP333Q。(A)rLEP和 rLEP333Q的基因組圖示；(B)左圖間接免疫螢光檢測拯救病毒rLEP333Q感染BHK-21細胞， 右圖陰性對照，以陰性血清(即，沒有狂犬病病毒抗體的血清)為一抗觀察IFA結果；(C) 重組病毒基因組RNA經RT-PCR擴增，用BECKMAN CEQ 8000自動測序儀進行測序，測序顯示病毒基因組內的鹼基由GG突變為AA，突變部分用邊框表示。圖3顯示野生型LEP (wtLEP)和突變的rLEP333Q在NA細胞(A)和BHK-21細胞⑶ 上的生長動力學曲線。圖4顯示pCI系列質粒(A)、pCAGG質粒(B)和pBluescriptSK+質粒(C)的圖譜。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明 的目的，並不意欲限制本發明的範圍和精神。實施例1狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位胺基酸突變株的構建及其生物學 活性鑑定1 材料1. 1質粒、細胞株和病毒質粒pCAGG、pCI_RBz購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，pBluescriptSK (+) 購自 clonetech。BHK-21 細胞(ATCC CC1-10)，293T 細胞(CRL-11268)購自 ATCC，培養基均 為含10%胎牛血清的DMEM(購自GIBC0)。小鼠腦神經瘤細胞NA細胞來自軍事醫學科學院 軍事獸醫研究所，培養基為含10%胎牛血清的MEM(購自GIBC0)。狂犬病病毒Flury-LEP 和HEP購自中國獸醫藥品監察所中國獸醫微生物菌種保藏管理中心，在BHK-21細胞上擴 增，-70°C凍存備用。1.2主要試劑和儀器T4 DNA連接酶，限制性內切酶Sph I，Mlu I等均購自TaKaRa公司。Phusion 超保真DNA聚合酶。SuperScript III反轉錄試劑盒、無血清培養基Opti-MEM，轉染試劑 Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司。犢牛血清購自Gibco公司。LB培養基成 分均購自OXOID公司。膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)及質粒小量提取試劑盒 (Plasmid Mini Kit)均購自OMEGA公司。質粒中量提取試劑盒QIAfilter Plasmid Midi Kit購自QIAGEN公司。鼠抗狂犬病病毒高免血清由本研究室製備。FITC標記的羊抗鼠螢光 二抗購自Sigma公司。普通顯微鏡，購自OLYMPUS公司；螢光顯微鏡，購自ZEISS公司。PCR 儀購自Applied Biosystem公司。核酸測序採用BECKMAN CEQ 8000自動測序儀，所用試劑 為BECKMAN公司產品。P2級生物安全櫃購LABC0NC0自公司。二氧化碳培養箱購自Thermo Electron公司。不同型號離心機均購自BECKMAN公司。-70°C超低溫冰箱購自NBS公司。 普通冰箱冰櫃購自海爾公司。全自動淨水機MILI-Q購自BIOCEL公司。各種規格細胞培養 瓶及細胞培養板均購自CORNING公司。1.3 引物參照Gene Bank中所提供的Flury-HEP株基因組序列(Gene Bank序列號 AB085828)，和 Flury-LEP 基因序列(Gene Bank 序列號 DQ099524，Flury-LEP 全長基因組 cDNA序列見SEQ ID NO 1)，將Flury-LEP基因組分為3段(即，Fl，F2和F3)分別設計PCR 引物。其中，片段Fl為Flury-LEP基因序列的1-4063核苷酸序列(SEQ ID N0:2)，片段F2 為Flury-LEP基因序列的4013-8254核苷酸序列(SEQ ID NO :3)，片段F3為Flury-LEP基 因序列的8187-11925核苷酸序列(SEQ ID NO :4)。構建全長基因組cDNA所用引物(表1) 和構建輔助質粒所用引物(表2)均由上海英俊生物技術有限公司合成。根據Flury-LEP基因組序列，設計將G蛋白第333位精氨酸突變為穀氨醯胺的引物(表3)，突變鹼基用邊框 表示，所述引物也由上海英俊生物技術有限公司合成。表IRT-PCR和全長基因組cDNA構建所用的引物
引物名稱引物序列
GTTAA^PrCTGAfdTG 丁CCdfdACJCMUdmCTAT^UdA/^CKMjiffddJW F1-PF .^G7rACGCTTAACAACAAAACCAAAGAA-3'
Fl-PR 5'- GGCACGCGTACTCCACATAACTTGAGTTTGC -3' F2-PF 5'- AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA -3' F2-PR 5'- ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC -3' F3-PF 5'- TATGCTAGCTCTGGTTAAGCTCCCACGAATC -3'
F3-PR 5'-ATACCC/i CCGCGA GG AGGTGG A GA TGCCA TGCCGA CCCACGCTTAACAAATAAACAATAA AG -3'______注cDNA片斷與圖1相一致。下劃線部分為病毒特異序列，黑體表示酶切位點，錘 頭狀核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)用斜體表示。表2輔助質粒構建所用的引物
引物名稱
L-N- PF L-N - PR L-P 一 PF L-P - PR L-L-PF L-L-PR
引物序列
5'- GGCGAATTCGCC/jCCATGGATGCCGACAAGATTGT -3' 5'- CCGGGTACCTC囚TTATGAGTCACTCGAATACG -3' 5'- GGCGAATTCGCC/^CCATGAGCAAGATCTTTGTTAA -3'
5'- CCGGGTACCTCATTAGCATGATGTGTAGCGATCC -3'
5'- GGCGAATTCGCC/jCCATGCTGGATCCGGGAGAGGTTTA -3' 5'- CCGGGTACC|TTA|TTACAAACAACTC}TAGTCTA -3' 注下劃線部分為病毒特異序列，黑體表示酶切位點，突變鹼基用字符邊框表示， Kozak序列用斜體表示。 表3G333定點突變所用的引物
引物名稱
引物序歹Ij
F2-PF RtoQ-PR
RtoQ-PF F2-PR
5·- AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA -3'(丨司表 1 中F2-PF)
5'-TCAAACACCCTTTTGAGGGGATGATCTCATTCCAGGTfTT|GGACAGACTTG
TAGTGAGCATCAGCCTCCATCAAGGT-3'
5'-GTCTGTCC|A^CCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGA-3' 5'- ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC -3' (iwj表 1 中F2-PR)
注突變鹼基用字符邊框表示。
1. 4構建Flury-LEP基因組全長cDNA克隆和cDNA片段克隆以及輔助質粒系統
7
1.4. 1病毒基因組的提取、反轉錄和PCR取Flury-LEP病毒液250 μ L，加入750 μ L Trizol，經常規方法提取基因組RNA。 提取的RNA用SUperSCriptTMIII反轉錄試劑盒進行反轉錄反應(反轉錄引物見表1)按該 試劑盒說明書進行操作，獲得末端部分重疊的3個病毒cDNA片段Fl、F2和F3片段。1. 4. 2RT-PCR 產物的克隆整個基因組分為末端部分重疊的3個片斷進行RT-PCR擴增，PCR產物經瓊脂 糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒(購自OMEGA公司)回收Fl、F2和F3片段，分別克隆至 pBluscript IIKS (+/-) (Clontech)的EcoR ν位點，轉化感受態細胞DH5 α，選擇並提取陽 性質粒pBlue-Fl，pBlue-F2和pBlue_F3，測序確保克隆的基因組片段與病毒基因組RNA序 列完全一致(具體方法見《分子克隆試驗指南》，J.薩姆布魯克編，2008年第三版，科學出版 社譯)。1. 4. 3Flury-LEP基因組全長cDNA克隆和cDNA片段克隆的構建利用基因組cDNA片段F1、F2和F3相鄰重疊部分存在的限制酶切位點進行連接組 裝(示意圖見圖1)。具體地，首先將F3段cDNA經Nhe I和Rsr II位點克隆進pCI-RBz，所得 質粒命名為PCI-F3，再將Fl段經Nhe I和Mlu I插入到pCI_F3，所得質粒命名為pCI_F31。 最後將F2段經Sph I和Mlu I克隆進pCI-F31，至此Flury-LEP全基因組cDNA組裝完成， 構建成的病毒基因組轉錄質粒命名為pCI-LEP。該克隆在CMV啟動子之下、兩個核酶之間的全長cDNA可以在真核細胞RNA聚合酶 的作用下得到轉錄，並且由於核酶的自身催化功能，可以保證轉錄產物的3'末端與病毒基 因組精確一致。1. 4. 4構建轉錄輔助質粒系統以pCI-LEP為模板，PCR擴增編碼核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因 的開放閱讀框架(ORF) cDNA序列(核苷酸序列分別為SEQ ID NOs :5_7，引物序列見表2)， 分別克隆在PCAGG質粒的多克隆位點(MCS)。在起始密碼子前引入Kozak序列(GCCACC)，以 增強蛋白表達[3』4]；在原有終止密碼子後增加一個終止密碼子，以有效終止輔助質粒mRNA 的轉錄。構建成的輔助質粒分別命名為pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG_L。1. 5 G333突變全長基因組的構建以在1. 4. 2中構建好的pBlue-F2為模板，分別以F2-PF和RtoQ-PR、RtoQ-PF和 F2-ra為引物分別進行PCR擴增，將2個PCR產物回收後，再以2個PCR產物為模板，以F2-PF 和F2+R為引物進行PCR擴增出全長的F2』片段(含有G蛋白333位胺基酸突變，由精氨 酸R突變為穀氨醯胺Q)。將PCR產物克隆至pBluscript IIKS(+/_)的多克隆位點，將陽性 克隆質粒pBlue-F2』 (G333Q)進行測序，確保突變成功以及克隆的基因組片段與病毒基因組 RNA序列完全一致。最後將G333R突變為Q的F2』段經Sph I和Mlu I克隆進在1. 4. 3中已 構建好的PCI-F31，至此Flury-LEP G333突變全基因組cDNA組裝完成，構建成的病毒基因 組轉錄質粒命名為pCI-LEP333Q。本領域技術人員應該理解，本發明上述方面所述的構建狂犬病病毒Flury-LEP全 長cDNA突變重組載體PCI-LEP333Q的策略可以適用於構建在Flury-LEP全長cDNA基因中 引入任何突變的重組載體。1. 6病毒拯救
在轉染前一天，將293T細胞傳到35mm 6孔板上，當細胞密度達到80%以上時即 可進行轉染。將 pCI-LEP333Q、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L 分別以 4 μ g、2 μ g、1 μ g、1 μ g 的 比例加入到250 μ 1無血清培養基OPTI-MEM中，混勻；取15 μ 1 Lipofectamine 2000溶於 250 μ 1 OPTI-MEM中，混勻後在室溫靜置5min ；然後將Lipofectamine 2000與轉染質粒 (即 pCI-LEP333Q、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L 各 4 μ g、2 μ g、1 μ g、1 μ g)混合均勻，室溫孵 育30min。在此期間用OPTI-MEM洗滌293T細胞兩次，然後每孔加入OPTI-MEM 1ml，最後將 Lipofectamine 2000-質粒混合液500 μ 1加入細胞培養孔中，置於37°C CO2培養箱中培 養8h後吸棄轉染液，加入10% DMEM繼續培養。72小時後，仔細吹落培養板上的細胞，將培 養液及細胞混合物全部接種BHK-21細胞。72h後，在BHK-21細胞上用間接免疫螢光(IFA) 檢測病毒滴度，簡言之，即以鼠抗狂犬病病毒高免血清為一抗，相同倍數稀釋的小鼠陰性血 清為對照，螢光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG(Sigma)為二抗，最後用螢光顯微鏡觀察結果。 收穫上清液，獲救突變病毒株，獲救病毒株命名為rLEP333Q株。1.7種毒的製備及滴定將拯救的病毒在BHK-21細胞上進行擴增，10% DMEM 37°C培養3天。在NA細胞或 BHK-21細胞上培養48h後，以IFA(步驟同1. 6)確定病毒滴度。病毒滴度用病灶形成單位 (focus forming unit) FFU 表不。1. 8病毒生長動力學曲線的測定為測定病毒生長動力學曲線，以M.0. I.為0.01分別感染單層NA細胞和BHK-21細 胞。感作Ih後，用無菌PBS洗2次後，分別加含0. 2% FBS的MEM 2ml和2% DMEM 2ml於 37°C培養。分別於接種後24h、72h和120h取細胞培養液上清，在NA細胞和BHK-21細胞上 測定滴度，繪製病毒生長動力學曲線。1. 9小鼠半數致死量(LD5tl)的測定將HEP、wtLEP和rLEP333Q用滅菌的PBS作10倍倍比稀釋至10"，將1(Γ4 10"各 稀釋度分別取30 μ 1腦內接種5隻5 6周齡的Balb/c雌性小鼠。連續觀察21天，記錄每 組小鼠的平均體重變化和死亡情況。利用Reed-Muench法計算小鼠半數致死量(LD5tl)[11]。2.結果2. 1從突變的全長cDNA克隆拯救突變病毒rLEP333Q為了從克隆的cDNA中拯救感染性RV，首先以pCI_LEP333Q及表達RVN、P、L蛋白 的輔助質粒共轉染293T細胞。3天後收穫細胞液，盲傳一代後IFA檢測呈陽性結果(圖 2B)。對拯救病毒進行RT-PCR及基因組序列分析結果顯示，救獲病毒糖蛋白(G)第333位 精氨酸R(CGG)已經突變為穀氨醯胺Q(CAA)，和預期完全相符(圖2C)。結果表明，通過反 向遺傳操作技術，成功拯救出具有感染性的糖蛋白(G)第333位突變為穀氨醯胺的子代病 毒 rLEP333Q。2. 2拯救的Flury-LEP突變株(rLEP333Q)生物學特性的鑑定2. 2.1動力學曲線wtLEP和rLEP333Q在神經元細胞NA和非神經元細胞BHK-21上的生長動力學曲線 如圖所示(圖3)，可見兩種病毒的生長性能並沒有顯著差異，這表明糖蛋白(G)第333位的 精氨酸突變為穀氨醯胺後並不影響其生長特性。2. 2. 2嗜神經指數
狂犬病病毒的體外嗜神經指數是指病毒在NA細胞相對於BHK-21細胞上的感染性 比例[12]，嗜神經指數為1即表示病毒在神經元細胞上感染的能力比在非神經細胞上的高10 倍。致病性毒株與弱毒株相比通常具有較高的嗜神經指數。致病性毒株的嗜神經指數一般 大於1，而弱毒株的嗜神經指數通常接近於0[12』13』14]。WtLEP和rLEP333Q的嗜神經指數分別 為0. 8和0 (表4)。與wtLEP相比，rLEP333Q的嗜神經指數已下降與無毒株Flury-HEP —樣 接近於零。表4wt LEP、rLEP333Q和HEP的體外嗜神經性
滴度(ffU/mla) 體外嗜神經指 _4]母NA細胞_BHK-21 數匕_
wtLEP 3.7X IO85.3 XIO7 0.8
rLEP333Q 3.0X IO73.3 XIO7 0^￡
HEP 5. QX IQ6_5. OXlO6 0_a同一種毒在NA細胞和BHK-21細胞上的滴度b體外嗜神經指數=log (NA上的滴度)-log (BHK-21上的滴度)2. 2. 3對小鼠的致病性為了確定wtLEP、rLEP333Q以及HEP對小鼠的致病性，每隻小鼠腦內接種病毒 105FFU/30y L· HEP感染的小鼠只表現出輕微的症狀如毛微亂、體重略減；而感染wt LEP和 rLEP333Q的小鼠則表現出麻痺、興奮，體重減輕等中樞神經系統疾病的臨床症狀(數據未顯 示)。所有的老鼠在11天內全部死亡。此外，我們測定了 wtLEP和rLEP333Q的LD5tl，分別為 8. 8個FFU和80個FFU。結果表明，rLEP333Q毒株腦內接種小鼠感染仍致死，但與wtLEP相 比，致病性下降。3 討論狂犬病病毒的G蛋白是很重要的致病因子，與細胞粘附、誘導細胞凋亡和免疫 應答等有關。G蛋白的第333位胺基酸位點對小鼠的致病性至關重要。本研究發現將 Flury-LEP糖蛋白(G)第333位的R突變為Q後，雖然小鼠腦內接種仍能致死，但病毒喪失 了體外嗜神經性，對小鼠的致病性有所下降。目前已報導的狂犬病病毒的細胞受體有菸鹼乙醯膽鹼受體 (nicotinicacetylcholine receptor) [15]> 神經細胞粘附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)[16]和低親和力神經營養因子受體(low-affinity neurotrophinreceptor, p75NTR)[17]。G 蛋白結合 p75NTR 的能力依靠於第 330 位的 lysine 或是333位的R。因此，P75NTR可能與LEP獲得在CNS中傳播和擴增有關係。表4顯示LEP 和LEP333Q體外的嗜神經指數有顯著差異，表明333位上的R改變了病毒結合細胞種屬的特 性。狂犬病病毒在細胞間的傳遞有兩種假設模式一是神經細胞內的病毒直接侵入到 毗鄰的細胞神經細胞，二是自由的病毒粒子侵入到神經細胞內[18]。病毒在神經系統內的傳 播以前者為主，333位的R對細胞間的傳遞極為重要。將LEP333位R突變後，其嗜神經性降 低與無致病性毒株Flury-HEP —致。因此，本發明人認為， 毒神經嗜性的減弱能極大地提高其作為活毒疫苗使用時的安全性。所以，本發明的突變株rLEP333Q可以用作一種更加安 全的疫苗，同時還可以作為口服疫苗，對野生動物進行投食免疫，也可用於人免疫等。實施例2突變重組病毒rLEP333Q對比格犬的免疫試驗為了評價突變重組病毒rLEP333Q對比格犬的免疫效果，將3月齡12隻比格犬隨 機分成兩組，6條後腿肌肉注射IO6FFU的rLEP333Q，6條注射IO6FFU的wtLEP。免疫後3周 採血、分離血清，用於中和抗體滴度檢測。中和試驗血清樣品首先56°C水浴處理30min滅活，隨後連續20倍至1280倍倍比稀釋，同 時設陰性、標準血清對照。攻擊病毒採用標準固定毒CVS株，將稀釋好的血清與含10000個 FFU的病毒等體積混合，37°C孵育lh，然後取100 μ 1加到過夜生長的24孔ΒΗΚ-21細胞上。 每個樣品作3個重複。感染後48h進行IFA檢測。被檢血清的中和抗體滴度為使螢光灶抑 制等於50%的血清最高倍數。標準血清的起始稀釋效價為2IU/ml，待測抗體單位(IU/ml) =待測血清中和滴度/標準血清中和滴度X2。突變重組病毒rLEP333Q對比格犬的免疫保護性根據0. I. E標準測定rLEP333Q和WtLEP誘導比格犬中和抗體水平實驗結果顯 示rLEP333Q免疫比格犬誘導產生的中和抗體達18. 7士6. 5IU/ml，wtLEP免疫比格犬誘 導產生的中和抗體滴度為20士9. 7IU/ml，兩組數據並無顯著性差異。可見，突變重組病毒 rLEP333Q可誘導與wtLEP相當的中和抗體水平，且安全性較wtLEP更好，因此該病毒作為活 疫苗更具有優勢。應該理解，儘管參考其示例性的實施方案，已經對本發明進行具體地顯示和描述， 但是本領域的普通技術人員應該理解，可以在其中進行各種形式和細節的變化，而不背離 由後附的權利要求所定義的本發明的精神和範圍。參考文獻[l]Martinez L. Global infectious disease surveillance. Int J Infect Dis, 2000,4(4) :222-8.[2]Dietzschold B, Wunner WH, Wiktor TJ, et al.Characterization of anantigenie determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity ofrabies virus. Proc Natl Acad Sci USA,1983,80(1) :70-4.[3]Morimoto K, Hooper DC, Spitsin S, et al. Pathogenicity of different rabiesvirus variants inversely correlates with apoptosis and rabies virus glycoproteinexpression in infected primary neuron cultures. J Virol,1999,73(1) 510-8.[4]Dietzschold B, Wiktor TJ, Trojanowski JQ, et al.Differences in cell-to-cellspread of pathogenic and apathogenic rabies virus in vivo and in vitro. J Virol. 1985,56(1) :12-8.[5] Faber M, Pulmanausahakul R, Nagao K, et al. Identification of viralgenomic elements responsible for rabies virus neuroinvasiveness. Proc NatlAcad Sci USA,2004，101(46) :16328_32.[6]Lentz TL, Burrage TG, Smith AL, et al. Is the acetylcholine receptor
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12
PatentIn version 3. 1111925DNA狂犬病病毒1acgcttaacaSLCSLSLSLSLCCSLSLagaagaagcagacagcgtcagttgcaaagcaaaaatgtaa60
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13
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一種突變狂犬病病毒Flury LEP弱毒疫苗株，其表達的狂犬病病毒Flury LEP糖蛋白第333位胺基酸由精氨酸R突變為穀氨醯胺Q。
2.生產權利要求1的突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的方法，所述方法包括(1)構建轉錄質粒，所述轉錄質粒包括在其中引入狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333 位胺基酸由精氨酸R突變為穀氨醯胺Q的狂犬病病毒Flury-LEP全長基因組cDNA序列；(2)構建一個或多個轉錄輔助質粒，所述輔助質粒包括編碼狂犬病病毒Flury-LEP核 蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框架的cDNA序列；(3)將所述轉錄質粒和轉錄輔助質粒共轉染允許狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株復 制的宿主細胞，培養轉染後的宿主細胞；(4)收穫上清液，獲救突變病毒株。
3.權利要求2的方法，其中所述轉錄質粒為pCI-LEP333Q。
4.權利要求2的方法，其中所述轉錄輔助質粒是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG_L。
5.權利要求2-4中任一項的方法，其中所述宿主細胞是真核細胞。
6.權利要求1的突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的應用，其用作高安全性的活 毒疫苗，單獨或與其它疫苗一起使用。
7.狂犬病病毒Flury-LEPG333突變全長基因組cDNA重組載體，其表達的狂犬病病毒 Flury-LEP糖蛋白第333位胺基酸由精氨酸R突變為穀氨醯胺Q。
8.權利要求7的狂犬病病毒Flury-LEPG333突變全長基因組cDNA重組載體的應用， 其與分別編碼LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L的轉錄輔助質粒一起用於拯救狂 犬病病毒弱毒疫苗株的一種反向遺傳作業系統。
9.權利要求7的狂犬病病毒Flury-LEPG333突變全長基因組cDNA重組載體的應用， 其用於構建預防狂犬病和其它疫病的重組二聯活載體疫苗。
10.權利要求8或9的應用，其中所述狂犬病病毒Flury-LEPG333突變基因組cDNA重 組載體是 PCI-LEP333Qt全文摘要
本發明屬於重組病毒疫苗領域。本發明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株，其表達的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位胺基酸由精氨酸R突變為穀氨醯胺Q。更具體地，本發明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位胺基酸突變株rLEP333Q。本發明還涉及生產所述突變株的方法，以及所述突變株的應用。
文檔編號C12N15/85GK101942418SQ20091024450
公開日2011年1月12日 申請日期2009年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者步志高, 王喜軍, 葛金英, 陶麗紅 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所