用於輔助診斷和/或監測乳腺癌進展的方法和組合物的製作方法

2023-05-02 04:52:21

專利名稱：用於輔助診斷和/或監測乳腺癌進展的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及基於對給定樣品進行差異性DNA甲基化模式分析而輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌 進展的方法。更具體地，所述方法涉及鑑定使用多種統計學方法產生的一或多種表觀遺傳學標記物(epigenetic markers),以便指出一或多個基因組基因座處的甲基化狀態差異的預後意義，並預測所分析的樣品在治療後具有好的預後還是差的預後。
背景技術：
DNA甲基化見於包括原核生物和真核生物在內的各種生物體的基因組。在原核生物中，DNA甲基化發生於胞嘧啶和腺嘌呤鹼基，並包括一部分宿主限制系統(hostrestriction system)。但在多細胞真核生物中，甲基化似乎限於胞喃唳鹼基,並與抑制型染色質狀態和基因表達抑制相關聯(綜述參見例如Wilson，G.G. and Murray, N. E. (1991)Annu. Rev. Genet. 25,585-627)。在哺乳動物細胞中，DNA甲基化主要出現於CpG 二核苷酸，CpG 二核苷酸在基因組中的分布不均衡且代表性不足。通常非甲基化的CpG簇(也稱為CpG島)見於許多啟動子區域(綜述參見例如Li，E. (2002)Nat. Rev. Genet. 3,662-673)。已經在一些人類癌症例如結直腸癌和前列腺癌中證明有導致異常基因沉默的DNA甲基化的改變(綜述參見例如Robertson, K. D. and ffolffe, A. P. (2000)Nat. Rev. Genet. 1,11-19)。曾證明啟動子的超甲基化是導致腫瘤抑制基因失活的常見機制。另ー方面，啟動子低甲基化通常與DNA斷裂和基因組不穩定有關，且因此與某些癌症的嚴重程度有關(Bird，A. P. (2002) Genes Dev. 16，
6-21)。已有多種方法用於實驗性確定各個基因的差異性甲基化(綜述參見例如Rein，T.et al. (1998)Nucleic Acids Res. 26，2255-2264)。這些技術包括例如亞硫酸氫鹽測序、甲基化特異性PCR(MSP)、Methylight和焦磷酸測序。乳腺癌在全球累及120萬人，是女性中最重要的致死原因之一，在美國和西歐每年有大約400，000個新診斷的病例。因此，乳腺癌診斷劑仍然具有廣闊的市場。已經發現ー些靶基因的差異性甲基化模式與乳腺癌的轉歸相關聯(參見例如Zrihan-Licht, S. et al. (1995)Int. J. Cancer 62,245-251 ；Mancini, D. N. et al. (1998)Oncogene 16,1161-1169)。不過，臨床上存在多種不同類型的乳腺癌，其中ー些在分子水平根本沒有被很好地表徵。此外，已有的用於分析乳腺癌的診斷法也有不足，它們通常都是基於對單一分子標記物的分析，這可能影響檢測的可靠性和/或準確性。此外，単一標記物不能提供有關潛伏分期、腫瘤進展等等的詳細預測。因此，仍然需要鑑定能夠克服上述局限性的用於輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的替代性分子標記物和測定方法。從臨床角度看，最有用的生物學標記物是能夠在診斷確立時預測出對任何治療方案的反應的預測性標記物。能夠鑑定乳腺癌患者在手術後的復發風險的預後標記物也是有用的，如果它們能夠鑑定出哪些患者具有較低的復發風險且因此可免於進行高毒性化療，將更加有用。

發明內容
本發明的目的在於提供基於差異性DNA甲基化模式分析而輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的新方法。更具體地，本發明的目的在於提供使用多種統計學方法產生的表觀遺傳學標記物組，以便指出所分析的一或多個基因組基因座處的甲基化狀態差異的意義，並由此使得能夠預測給定樣品在治療後具有好的預後還是差的預後。
此外，本發明的目的在於提供診斷方法，其使得能夠不依賴於除甲基化狀態以外的其他病理學參數而可靠準確地判斷乳腺癌的預後。隨後的描述將使得這些以及其他的目的變得顯而易見，並且這些以及其他的目的是通過本申請的獨立權利要求的主題實現的。本發明的ー些優選實施方式由從屬權利要求的主題定義。在ー個方面，本發明涉及輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的方法，包括(a)確定待分析的給定樣品中所含DNA的一或多個基因組基因座的甲基化狀態；(b)鑑定DNA甲基化狀態表現出差異的ー或多個基因組基因座；(c)針對步驟(b)獲得的一或多個差異性甲基化的基因組基因座中的每ー個進行統計學存活分析；(d)確定步驟(C)獲得的數據的統計學顯著性；和(e)基於步驟(d)獲得的數據選定DNA甲基化狀態表現出統計學顯著性差異的ー或多個基因組基因座，其中所選定的一或多個基因組基因座對輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展具有預後價值。在所述方法的具體實施方式
中，乳腺癌是雌激素受體陽性乳腺癌。在優選的實施方式中，所述方法用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展，並進ー步包括提供來自待分析的患者的基因組DNA樣品，其中所述方法在體外進行。在另一具體實施方式
中，所述方法進ー步包括在進行步驟(C)之前，依據其甲基化狀態，將所述ー或多個基因組基因座分類為非甲基化、部分甲基化和甲基化。在優選的實施方式中，步驟(C)進行的統計學存活分析包括針對所述ー或多個基因組基因座中的每ー個的相應的甲基化狀態(即，屬於相應的甲基化狀態的樣品)產生卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)存活估計值，並計算針對每一所述基因座產生的卡普蘭-邁耶存活估計值之間的差異。在進ー步優選的實施方式中，確定從存活分析中所獲得的數據的統計學顯著性包括實施時序檢驗(log-rank test)或曼特爾_亨塞爾(Mantel-Haenszel test)檢驗。特別優選地，確定統計學顯著性還包括置換檢驗(permutation testing)方法。在另一具體實施方式
中，所述方法進ー步包括確定所選定的一或多個基因組基因座的預後價值是否依賴於除甲基化狀態以外的其他病理學參數。特別優選地，採用計算裝置進行所述方法。在另一方面，本發明涉及用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的遺傳學標記物組，其中所述組包括表I所列的任何一或多種遺傳學標記物、或優選地表I所列的全部遺傳學標記物。在另一方面，本發明涉及用於在患者中輔助診斷雌激素受體陽性乳腺癌和/或監測雌激素受體陽性乳腺癌進展的遺傳學標記物組，其中所述組包括表2所列的任何一或多種遺傳學標記物、或優選地表2所列的全部遺傳學標記物。優選地，提供本申請所定義的方法確定所述遺傳學標記物組。在另一方面，本發明涉及本申請所定義的所述遺傳學標記物組用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的用途。在優選的實施方式中，監測乳腺癌進展包括將乳腺癌患者歸類為預後良好組或預後不良組。特別優選地，監測乳腺癌進展包括預測診斷後第5年的無復發存活。


圖I示意性顯示了本發明中所使用的進行全基因組差異性甲基化基因座檢測的甲基化寡核苷酸微陣列分析(MOMA)測定法的設計過程。簡言之，以具有富CG識別序列的限制性內切核酸酶(MspI)消化基因組DNA，隨後連接適體，用於下一歩降低基因組的複雜性。將一半的連接有適體的樣品以甲基化特異性內切核酸酶McrBC消化以清除其甲基化序列，對另一半進行假處理。使用仔細平衡的PCR條件以根據大小選擇MspI片段並降低總體的基因組複雜性。比較McrBC處理組的表示與假處理樣品，該假處理樣品用作在具有367K個特徵的寡核苷酸鋪瓦式陣列(tiling array)上進行比較雜交的參照，該陣列覆蓋27，801個已注釋的CpG島中的26，219個。圖2是本發明方法的示意性說明，所述方法用於鑑定給定樣品中代表輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的預後性差異性甲基化基因組基因座。鑑定到一或多個表現出甲基化行為參照差異的基因組基因座(未顯示)之後，採用統計學存活模型評價各基因座的甲基化狀態的變化的顯著性，這涉及分別針對三種甲基化狀態，即非甲基化、部分甲基化和甲基化，產生卡普蘭-邁耶估計量(estimator)。如果針對ー個特定基因座獲得的卡普蘭-邁耶估計量之間的差異具有統計學顯著性，則保留該基因座進行進一歩分析，否則該基因座被廢棄。圖3示意性顯示了本發明的用於分析給定樣品中所鑑定到的預後性基因組基因座的統計學顯著性的一般過程。通過採用時序檢驗或曼特爾-亨塞爾檢驗為每ー比較產生卡方值，由此確定這三種卡普蘭-邁耶估計值的統計學顯著性差異。可通過置換檢驗方法估計這些差異的統計學顯著性，這涉及置換臨床數據並針對所有基因座重新計算卡方指數。這ー步驟重複進行1000次，以獲得卡方值的背景分布。然後將來自原始臨床數據的針對各基因座的卡方值與背景分布相比較，經Benjamini-Hochberg多重檢驗校正之後,任何達到O. 05或更低的統計學顯著性的基因座均可能是用於將患者歸類為預後良好組或預後不良組的良好生物學標記物。
發明詳述
本發明基於以下出乎意料的發現，將對樣品的差異性DNA甲基化分析與用於指出甲基化狀態差異的顯著性的多種統計學和機器學習方法相組合，導致鑑定到對輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展具有獨立預後價值的表觀遺傳學標記物組。可以在缺少本文中沒有具體描述的任何一或多個元素、一或多個限定的情況下合適地實施下文中所舉例闡述的本發明。將結合具體的實施方式並參照特定的附圖來描述本發明，但本發明並不限於這些具體的描述，而是由權利要求書限定。所描述的附圖僅是示意性的，且應被理解為是非限制性的。當說明書和權利要求書中使用"包含"ー詞時，其不排除其他元素或步驟。就本
發明而言，術語"由......組成"被認為是術語"包含"的優選實施方式。如果下文中的
一個組被定義為包含至少給定數目的實施方式，這也應理解為公開了ー個組，其優選地由這些實施方式組成。當使用不定冠詞或定冠詞(例如「一」或「ー個」或「所迷」)來描述單數名詞時，其也包括該名詞的複數情況，除非另有具體說明。在本發明中，術語"大約"表示準確性的區間，本領域人員能夠理解該區間仍能保證所提及的特徵的技術效果。該術語通常代表與指定數值具有±10%、且優選地±5%的差異。此外，在說明書和權利要求書中，術語第一、第二、第三、(a)、(b)、(C)等等，是用來區分相似的元素，其不一定是在描述ー種次序或時間順序。應該理解，這些術語在合適的情況中可以互換使用，並且本文中所描述的本發明的實施方式能夠以不同於在此舉例說明的順序的其他順序實施。下文中將結合前後文給出術語進ー步的定義。以下術語或定義僅用於幫助理解本發明。這些定義的範圍不應被理解為小於本領域普通技術人員所理解的範圍。在ー個方面，本發明涉及輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的方法，包括(a)確定待分析的給定樣品中所含DNA的一或多個基因組基因座的甲基化狀態；(b)鑑定DNA甲基化狀態表現出差異的ー或多個基因組基因座；(C)針對步驟(b)獲得的一或多個差異性甲基化的基因組基因座中的每ー個進行統計學存活分析；(d)確定步驟(C)獲得的數據的統計學顯著性；和(e)基於步驟(d)獲得的數據選定DNA甲基化狀態表現出統計學顯著性差異的ー或多個基因組基因座，其中所選定的一或多個基因組基因座對輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展具有預後價值。在本申請中，術語「癌症」通常指任何類型的惡性腫瘤，即與未受累的(健康)野生型對照細胞相比表現出癌症特徵或具有出現癌症特徵的傾向的靶細胞的任何(基於遺傳學重新編程的)形態學和/或生理學改變。此類改變的實例可涉及例如細胞大小和形狀(増大或縮小)、細胞増殖(細胞數量増加)、細胞分化(生理學狀態改變)、凋亡(程序化細胞死亡)或細胞存活。因此，術語"乳腺癌"指的是乳腺組織的癌性生長。在本發明方法的一個實施方式中，乳腺癌是雌激素受體陽性乳腺癌。、
在優選的實施方式中，所述方法用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展，並進ー步包括-提供來自待分析患者的基因組DNA樣品，其中所述方法在體外進行。在本申請中，術語"體外"是指使用來自待分析的患者的分離的DNA樣品來進行所述方法，即ー或多種細胞、細胞提取物、組織活檢物等等。在本申請中，術語"樣品"(或"基因組樣品")是指包含準備對其差異性甲基化狀態進行分析的一或多種基因組DNA分子的任何樣品。樣品中所包含的DNA分子可以是天然存在的或合成的化合物(例如，通過重組DNA技術或通過化學合成產生的)，並可以是單鏈的或雙鏈的。DNA分子可具有任何長度。典型地，其長度在IObp至IOOOOObp之間，優選地在IOObp至IOOOObp之間，特別優選地在500bp至5000bp之間。樣品中所包含的DNA分子可以純化的形式存在(例如，在本領域已知的合適的緩衝液(例如TE或PBS)中提供)或是容納於未純化樣品溶液、部分純化樣品溶液或富集樣品溶液中。此類未純化樣品的實例包括細胞裂解物、體液(例如，血液、血清、唾液和尿液)、溶解的組織等等。在一些實施方式中，本發明的方法還包括對存在於這種未純化樣品中的DNA進行純化。用於純化DNA的方法和相應的裝置(任選地作為自動化系統或工作平臺的ー個集成部分)是本領域已知的，並可從商業途徑獲得。可採用本領域已知的任何檢測方法確定樣品中所含DNA的甲基化狀態，例如，包括亞硫酸氫鹽測序、甲基化敏感性單鏈構象分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)、應用甲基化敏感性微陣列結合亞硫酸氫鹽限制性分析(COBRA)、甲基化敏感性實時PCR，等等。在優選的實施方式中，使用甲基化寡核苷酸微陣列分析(MOMA)測定法(參見圖I)以全基因組形式分析DNA甲基化模式。在本發明中，通過採用期望最大化算法(expectation maximization algorithm)確定每一甲基化譜，將特定樣品中的每一基因座歸類為以下三種不同的甲基化狀態之一——非甲基化、部分甲基化和甲基化。隨後，本發明的方法包括鑑定其DNA甲基化狀態顯示出差異的ー或多個基因組基因座，也就是說，所述基因組基因座例如在非腫瘤樣品中非甲基化的，而在腫瘤進展過程中變為(至少部分)甲基化的，或反過來，在非腫瘤樣品中是(至少部分)甲基化的，而在腫瘤進展過程中變為非甲基化的。在一些實施方式中，將差異性甲基化分析的結果與參考值比較，所述參考值例如是使用來自健康對象的DNA樣品獲得的甲基化模式，或與來自文獻的數據比較，以便鑑定差異性甲基化。在具體的實施方式中，根據其甲基化狀態將ー或多個差異性甲基化的基因組基因座分類為非甲基化、部分甲基化和甲基化，然後進行統計學存活分析。下一歩，對所獲得的甲基化數據進行統計學存活分析，以便鑑定乳腺腫瘤樣品中 的特定基因組基因座的甲基化狀態是否能夠將患者分類為預後良好或預後不良，也就是說，所觀察到的甲基化行為的變化是否有意義。本領域已知多種統計學存活模型。可採用這些模型中的任何一種來實施本發明的方法。
但優選地，本發明方法的步驟(C)中進行的統計學存活分析包括針對每一所述ー或多個基因組基因座的相應的甲基化狀態(即，為屬於相應的甲基化狀態的樣品)產生卡普蘭-邁耶存活估計值，並計算針對每一所述基因座(即，為屬於每一所述基因座的樣品)產生的卡普蘭-邁耶存活估計值之間的差異。存活函數的卡普蘭-邁耶估計量是本領域已知的(Hosmer, D. ff. , et al. (2008)Applied Survival Analysis-Regress ion Modeling of Time-to—Event Data. 2nded. Wiley Series in Probability and Statistics. Hoboken, New Jersey John Wiley &Sons, Inc.)，並利用距離系統性復發的時間為所有入選研究的患者計算出在給定時間點不出現系統性復發的概率。由於通常會有ー些患者在一段時間後會退出研究，卡普蘭-邁耶估計量會考慮因缺乏隨診而造成的不同時間點處的患者丟失。這在存活分析中稱為「刪改問題(censoring problem) 」,並且已經在卡普蘭-邁耶估計量中被考慮進去。在本發明中，計算了在最初診斷後的10年期間的無系統性復發的概率。不過，其他的時間段(例如，1，3，5，15或20年)也是可以的。分別為非甲基化、部分甲基化和甲基化這三種甲基化狀態產生卡普蘭-邁耶估計量。如果針對一特定基因座所獲得的卡普蘭-邁耶估計量之間的差異具有顯著性，則保留該基因座用於進一歩分析，否則就放棄該基因座。圖2中示意性給出了進行統計學存活分析的總體過程。為了選擇那些其差異性甲基化模式對於乳腺癌的診斷具有獨立預後評估價值的基因組基因座，在下一歩中，確定在存活分析中所獲得的數據的統計學顯著性。同樣，有多種已知的統計學手段可用於進行此類檢驗。本領域人員熟知如何選擇合適的方法。在所述方法的優選實施方式中，確定從存活分析中所獲得的數據的統計學顯著性包括實施本領域熟知的時序檢驗或曼特爾-亨塞爾檢驗(Hosmer, D. ff. , et al. (2008),見上)。該檢驗為每ー比較輸出卡方值，其是卡普蘭-邁耶曲線中的差異量的度量。可通過置換檢驗方法進ー步驗證這些差異的統計學顯著性，置換檢驗方法例如涉及置換所分析的樣品的現有臨床數據並為所有基因座重新計算卡方指數。因此，在本發明方法的一個進ー步優選的實施方式中，確定存活分析中所獲得的數據的統計學顯著性進ー步包括置換檢驗方法。將該方法重複進行多次(例如，2、5、10、50、100、200、500、1000、2000次等等)以對於所有基因座獲得卡方值的背景分布。在本發明中，置換檢驗方法優選地重複1000次。然後，將從原始臨床數據中獲得的針對各基因座的卡方值與所述背景分布相比較。經多重檢驗校正後(例如經 Benjamini-Hochberg 校正(Benjamini, Y. and Hochberg,Y. (1995) J. Royal Stat. Soc. Series B57，289-300)後)，任何達到 0. 05 或更低的統計學顯著性的基因座均被認為是用於將患者分類為預後良好組和預後不良組的好的生物學標記物。圖3示意性描繪了進行統計學顯著性分析的總體過程。最後,在一些實施方式中，本發明的方法包括確定所選定的一或多個基因組基因座的預後價值是否依賴於除甲基化狀態以外的其他病理學參數，也就是說，針對可能與臨床參數(例如被分析患者的年齡、腫瘤分級、輔助或激素治療等等)有關聯的任何不確定性，對所獲得的結果進行校正。為了估計癌症復發率與給定基因座的甲基化狀態相關聯的程度，可採用已知的Cox回歸分析，但同樣可以採用其他模型。選擇具有統計學顯著性Cox係數的基因座(通過正態近似檢驗(Wald test)確定)用於進一歩分析。可聯合使用顯著性基因座的甲基化狀態與例如年齡(例如 55)、腫瘤分級(I或II級相對於III級)以及諸如p53(陽性相對於陰性)、雌激素受體(ER)(陽性相對於陰性)和ERBB2(陽性相對於陰性)等一些標記物蛋白質的狀態進行多變量Cox回歸分析。在多變量Cox回歸模型中具有統計學顯著性Cox係數的基因座被認為能為輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展提供獨立於其他臨床因素的預後信息。特別優選地，使用計算裝置進行本發明的方法。此類裝置是本領域已知的並可以多種方式設置。例如，這樣的計算裝置可被設計為接收有關給定樣品中所含的DNA的一或多個基因組基因座的DNA甲基化狀態的數據集，處理這一數據集以鑑定其DNA甲基化狀態顯示出差異的ー或多個基因組基因座，採用合適的算法對所鑑定的差異性甲基化的一或多 個基因組基因座進行統計學存活分析，將所獲得的數據集與與所測試樣品有關的其他臨床參數相關聯，並基於所述關聯數據產生顯示出對輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展具有統計學顯著性獨立預後價值的ー或多個基因組基因座的(分級的)列表。在另一方面，本發明涉及用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的遺傳學(更具體地為表觀遺傳學)標記物組，其中所述組包括表I所列的任何一或多個或優選地所有241種遺傳學標記物。所有這些標記物均基於差異性DNA甲基化模式。在另一方面，本發明涉及用於在患者中輔助診斷雌激素受體陽性乳腺癌和/或監測雌激素受體陽性乳腺癌進展的遺傳學(更具體地為表觀遺傳學)標記物組，其中所述組包括表2所列的任何一或多個或優選地所有105種遺傳學標記物。所有這些標記物均基於差異性DNA甲基化模式。優選地，通過本申請所述的方法確定上述遺傳學標記物組。在本申請中，術語「任何一或多個」涉及分別在表I和2中公開的相應的遺傳學標記物基因中的任何ー種、或任何兩種或更多種(即任何兩種、任何三種、任何四種、任何五種、任何六種、任何七種、任何八種、任何九種、任何十種等等)的任何亞組、或全部。優選地，用於輔助診斷乳腺癌的表觀遺傳學標記物組包括表I所列的全部241種標記物，而用於輔助診斷雌激素受體陽性乳腺癌的表觀遺傳學標記物組包括表2所列的全部105種標記物。表I和2所列標記物均通過它們的染色體定位(即人染色體的編號以及相應染色體片段的起點和終點)而清楚地定義。在另一方面，本發明涉及本申請所定義的所述遺傳學標記物組用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的用途。所述遺傳學標記物組可用於根據腫瘤的類型或腫瘤的分級對乳腺癌患者進行分類。在優選的實施方式中，監測乳腺癌進展包括將乳腺癌患者歸類為預後良好組或預後不良組(例如，基幹與本申請所述的統計學多變量模型相關的相應P-值；另參見表I和2)。特別優選地，監測乳腺癌進展包括預測在診斷後第5年(或例如第10年)的無復發存活。通過附圖和以下實施例進ー步描述本發明，這些附圖和實施例僅用於舉例說明本發明的具體實施方式
，而無意於以任何方式限制本發明的範圍。實施例實施例I :設計用於進行差異性甲基化分析的DNA陣列如下設計本發明所使用的用於在全基因組中檢測差異性甲基化基因座的甲基化寡核苷酸微陣列分析(MOMA)陣列。以具有富CG識別序列的限制性內切核酸酶(MspI)消化基因組DNA，隨後連接適體，用於下一歩降低基因組的複雜性。將一半的連接有適體的樣品以甲基化特異性內切核酸酶McrBC消化以清除其甲基化序列，對另一半進行假處理。使用仔細平衡的PCR條件以根據大小選擇MspI片段並降低總體的基因組複雜性。比較McrBC處理組的表示與假處理樣品，該假處理樣品用作在具有367K個特徵的寡核苷酸鋪瓦式陣列(tiling array)上進行比較雜交的參照，該陣列覆蓋27，801個已注釋的CpG島中的26，219個。圖I示意性顯示了該過程。實施例2 :乳腺癌樣品對121份人類乳腺癌腫瘤樣品進行DNA甲基化分析，其中108份具有相關的臨床-病理學注釋，包括長達10年的復發和存活數據。在一個實施方式中，僅分析雌激素受體陽性的腫瘤，共70份腫瘤樣品。採用期望最大化算法確定每一祥品的甲基化譜，將各基因座分為以下三種不同狀態之ー——非甲基化、部分甲基化和甲基化。根據已知的標準方法從腫瘤樣品中分離基因組DNA並確定DNA甲基化模式。實施例3 :統計學存活模型選擇用於評價給定時間量內無系統性復發的概率的統計學模型是存活方程的卡普蘭-邁耶估計量。卡普蘭-邁耶估計量利用距離系統性復發的時間為所有入選研究的患者計算出在給定時間點不出現系統性復發的概率。由於通常會有ー些患者在一段時間後會退出研究，卡普蘭-邁耶估計量會考慮因缺乏隨診而造成的不同時間點處的患者丟失。這在存活分析中稱為「刪改問題」，並且已經在卡普蘭-邁耶估計量中被考慮進去。使用卡普蘭-邁耶估計量分析了在最初診斷後的10年期間的無系統性復發的概率。圖2示意性給出了鑑定在診斷和/或監測乳腺癌方面具有潛在預後價值的基因組基因座的過程。實施例4 :鑑定具有獨立預後價值的基因組基因座採用上述方法捜索了數據集中的159，436個基因組基因座中具有預後能力的基因座。倘若任一基因座有三種可能的甲基化狀態(即非甲基化、部分甲基化和甲基化)，則使用落入該基因座的給定甲基化狀態的所有患者，以卡普蘭-邁耶估計量來估計至少10年無系統性復發的概率。採用時序檢驗或曼特爾-亨塞爾檢驗來評價這三種卡普蘭-邁耶估計值的統計學顯著性差異。該檢驗為每ー比較產生卡方值，其是卡普蘭-邁耶曲線中的差異量的度量。可通過置換檢驗方法評估這些差異的統計學顯著性，置換檢驗方法涉及置換臨床數據並為所有基因座重新計算卡方指數。這ー步驟重複進行1000次，以獲得卡方值的背景分布。然後將來自原始臨床數據的針對各基因座的卡方值與背景分布相比較，經Benjamini-Hochberg多重檢驗校正之後，任何達到O. 05或更低的統計學顯著性的基因座均被認為是用於將患者歸類為預後良好組或預後不良組的合適的生物學標記物。圖3示意性概括了這ー過程。在一個實驗中，將所有121份乳腺腫瘤樣品納入分析。基於前述方法，將潛在的預後性基因組基因座的數量縮小至2，559個。然後確定了這些基因座是否提供獨立於其他臨床變量(例如ER/PR狀態、ERBB2狀態、腫瘤分級以及輔助或激素治療)的預後信息。採用Cox回歸分析估計癌症復發率與給定基因座的甲基化狀態相關聯的程度。選擇具有統計學顯著性Cox係數的基因座(通過正態近似檢驗確定)用於進一歩分析。聯合使用顯著性基因座的甲基化狀態與年齡(く 55相對於> 55)、腫瘤分級(I或II級相對於III級)、P53狀態(陽性相對於陰性)、ER狀態(陽性相對於陰性)和ERBB2狀態(陽性 相對於陰性)進行多變量Cox回歸分析。在多變量Cox回歸模型中具有統計學顯著性Cox係數的基因座被認為能提供獨立於其他臨床因素的預後信息。最後得以鑑定了具有獨立於其他臨床因素的預後價值的總共241個基因座。將這些基因座(均通過它們在染色體上的位置而明確表徵)歸納入表I。在另ー實驗中，僅對70份雌激素受體陽性乳腺癌樣品進行分析。在清除所有不提供獨立於其他臨床因素的預後信息的基因座之後，得以將總共105個基因座鑑定為雌激素受體陽性腫瘤的獨立預後因素。表2列出了這些基因座。可在缺乏任何未在此具體公開的ー或多種元素、一或多種限定的情況下合適地實施在此舉例描述的本發明。因此，諸如「包含」、「包括」、「含有」等術語的含義是開放性的而非限制。此外，本申請所使用的術語和表述是描述性術語而非限制性術語，且此類術語和表述的使用無意於排除所顯示和描述的特徵的任何等價物或其部分，相反，應認識到可以在本發明的範圍內進行各種改動。因此應該理解，儘管已經通過具體實施方式
和任選的特徵具體公開了本發明，但本領域人員可以對其中具體實施的發明進行改動和變化，而這些改動和變化也落入本發明的範圍。本申請寬泛概括地描述了本發明。落入上位概念中的每一具體概念和下位概念組也構成本發明的一部分。這包括以先決條件或否定限定自上位概念中排除一些主題的上位描述，而無論所去除的內容是否在本申請中具體記載。其他的實施方式落入所附權利要求書。此外，如果本發明的特徵或方面是以馬庫什組的形式描述的，則本領域人員能夠理解本發明也是以所述馬庫什組的任ー單個成員或成員亞組的形式描述的。表I :對輔助診斷和/或監測乳腺癌進展具有預後價值的差異性甲基化的獨立基因組基因座Λ. c ττ.染色體LLJH片段係數 UD存活差異
MSpFragID 編號片段起點、片段終點(Fragcoef)HRP值
MspFragl2449I220928782220928852-1,6150948535,0283648567,28E-07
MspFragl 57734231349554351349554891,5651847274,7835585051,39Ε-06
MspFragl51940224080039040800450-1,6212781285,0595529443,13E-06
MspFragl 059241538550795385509311,490007394,4371283115;40E-06
MspFrag2280222196746012196746531,5173666614,5602008157,63E-06
MspFrag90914122198623021986315-1,4527216024,2747328198,41E-06
MspFragl441322030635304306353741,5661477114,788167217l,01E-05
MspFragl 485892144583759445856931,4960107034,463845896l;05E-05
MspFrag75113101243183012431927-1,4160009814,120609054l,29E-05
MspFrag3646841470402691470403591,4509954424,267360311l,40E-05
MspFragl45054204387458943874738-1,3767940313,962178623l,59E-05
MspFragl554172347274997472766081,3522660333,8661764961.92E-05
MspFrag383065106280410630001,3956355034,0375396252,01E-05
MspFrag8611I113645376113645473-1,3643416163,9131458522,09E-05
MspFragI0298I157045379157045911-1,5278837374,6084138812,36E-05
MspFragl44777203909143339091534-1,339699323,8178953682J3E-05
MspFragl31356197869087877701,4964168044,4656590362J5E-05
MspFrag3468I2185522221855381-1,3803426743,9762639553,46E-05
MspFrag56306772I7I559721718061,3212981643,7482841093,80E-05
MspFragl414481960572535605725831,3582353683,8893240174.49E-05
MspFrag4495251792078591792111651,307770583,6979202974,53E-05
MspFragl097761599147210991474691,4085029294,0898280564,65E-05
MspFrag74I2591375242881375243371,4199243974,1368076744J8E-05
MspFragl715I619360461936592,36375212410,630764665.28E-05
MspFrag2647434846319448463299-1,3636277513,9103533895,83E-05
MspFrag336I106431310644551,335766413,8029094186,04E-05
MspFrag2627I346593412465935301,3993872724,0527159936,38E-05
MspFragl31504199470759471641,3198358023,7428067656.51E-05
MspFrag8995712161002216100741,2934650833,6453962976,69E-05
MspFrag6966398699306686993159-1,387063774,0030788216J5E-05
MspFragI485202144377738443777871,5348886784,6408088766,93E-05
MspFrag328874668266866828021,2872127853,6226752957.03E-05
MspFrag2626034601223746012342-1,2642090773,5402915317,28E-05 MspFrag201662128359264128359351-1,3057438453,6904331827,28E-05
MspFrag6696881456694751456709771,3100618753,706403047,9 IE-05
MspFragl 170011686300161863003391,812590696,1262982310,00010052

權利要求
1.輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的方法，包括 (a)確定待分析的給定樣品中所含DNA的一或多個基因組基因座的甲基化狀態； (b)鑑定DNA甲基化狀態表現出差異的一或多個基因組基因座； (c)針對步驟(b)獲得的一或多個差異性甲基化的基因組基因座中的每一個進行統計學存活分析； (d)確定步驟(C)獲得的數據的統計學顯著性；和 (e)基於步驟(d)獲得的數據選定DNA甲基化狀態表現出統計學顯著性差異的一或多個基因組基因座，其中所選定的一或多個基因組基因座對輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展具有預後價值。
2.權利要求I的方法，其中所述乳腺癌是雌激素受體陽性乳腺癌。
3.權利要求I或2的方法，用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展，進一步包括 提供來自所述患者的待分析基因組DNA樣品， 其中所述方法在體外進行。
4.權利要求I至3中任一項的方法，進一步包括 在進行步驟(c)之前，依據其甲基化狀態，將所述一或多個基因組基因座分類為非甲基化、部分甲基化和甲基化。
5.權利要求I至4中任一項的方法，其中步驟(c)進行的所述統計學存活分析包括針對所述一或多個基因組基因座中的每一個的相應的甲基化狀態產生卡普蘭-邁耶存活估計值，並計算針對每一所述基因座產生的卡普蘭-邁耶存活估計值之間的差異。
6.權利要求I至5中任一項的方法，其中確定從存活分析中所獲得的數據的統計學顯著性包括實施時序檢驗或曼特爾-亨塞爾檢驗。
7.權利要求6的方法，其中確定統計學顯著性還包括置換檢驗方法。
8.權利要求I至7中任一項的方法，進一步包括 確定所選定的一或多個基因組基因座的預後價值是否依賴於除甲基化狀態以外的其他病理學參數。
9.權利要求I至8中任一項的方法，其中使用計算裝置進行所述方法。
10.用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的遺傳學標記物組，其中所述組包括表I所列的任何一或多種遺傳學標記物、或優選地表I所列的全部遺傳學標記物。
11.用於在患者中輔助診斷雌激素受體陽性乳腺癌和/或監測雌激素受體陽性乳腺癌進展的遺傳學標記物組，其中所述組包括表2所列的任何一或多種遺傳學標記物、或優選地表2所列的全部遺傳學標記物。
12.權利要求10或11的遺傳學標記物組，其中所述組是通過權利要求I至9中任一項的方法確定的。
13.權利要求10至12中任一項的遺傳學標記物組用於在患者中輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的用途。
14.權利要求13的用途，其中監測乳腺癌進展包括將乳腺癌患者歸類為預後良好組或預後不良組。
15.權利要求13或14的用途，其中監測乳腺癌進展包括預測診斷後第5年的無復發存活。
全文摘要
本發明涉及基於對給定樣品進行差異性DNA甲基化模式分析而輔助診斷乳腺癌和/或監測乳腺癌進展的方法。更具體地，所述方法涉及鑑定使用多種統計學方法產生的一或多種表觀遺傳學標記物，以便指出一或多個基因組基因座處的甲基化狀態差異的預後意義，並預測所分析的樣品在治療後具有好的預後還是差的預後。
文檔編號C12Q1/68GK102666876SQ201080042287
公開日2012年9月12日 申請日期2010年9月15日 優先權日2009年9月22日
發明者J·B·希克斯, S·卡瑪拉卡蘭, V·瓦拉達恩 申請人:冷泉港實驗室, 皇家飛利浦電子股份有限公司