一種在穀物培養基中添加中藥組分促進益生菌生長的方法與流程

2023-05-01 15:08:16

本發明涉及微生物發酵領域，具體地說，涉及一種在穀物培養基中添加中藥組分促進益生菌生長的方法。
背景技術：
：益生菌是一類定植於人體腸道、生殖系統內，能產生確切健康功效從而改善宿主微生態平衡，對人體健康有重要作用的活的微生物的總稱，廣泛應用於食品、保健品和藥品生產中。LGG（ATCC53103）是一種專利的鼠李糖乳桿菌，八十年代初由兩位美國教授從健康人體內分離而得，也是目前全球研究最多的益生菌之一。大量的體外實驗、動物實驗、人體實驗和流行病學調查研究充分證明了LGG的安全性。功能性方面，LGG具有顯著的平衡和改善腸道菌群、預防和治療腹瀉、提高機體免疫力、預防過敏、結合併排除毒素、預防齲齒等功能。此外，作為一種益生菌，LGG還具有一些自身的優勢：比如耐胃酸、耐膽汁、可定殖於人體腸道、最終產品（酸奶、牛奶等）保質期內活菌數保持恆定等(王世賓，劉金傑，喬嵐，程琳，益生菌LGG的研究，廣州食品工業科技[J],2003,s1,55-58)。研究發現，益生菌在人體腸道內的數量對益生菌發揮保健和治療功效起到決定性作用。除了益生菌在體內增殖，在加工過程中和貯藏期間保證其存活和保持生物活性等因素外，足量的活菌數是益生菌補充劑產品發揮其有效性的必要前提。植物性穀物原料為培養基，作為發酵底物，穀物不但可以為益生菌的生長提供必要的碳源和氮源、降低發酵成本；經過發酵後的穀物可以明顯提高其營養價值和功能特性，發酵後產生的乳酸、乙酸乙酯、乙醛等芳香成分可改善穀物製品的風味和香氣。趙麗娜以10%的燕麥芽-燕麥粉（燕麥芽粉：燕麥粉=2:1）和1%的脫脂乳粉為培養基，發酵9h可以使植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的活菌數達到8.75LogCFU/mL（趙麗娜，燕麥芽益生菌飲料的研製[D]，西北農林科技大學，2015）。周小莉研究了七株供試乳酸菌在燕麥糊基質中的生長情況，結果表明七株菌均可在燕麥中生長。且當加入麥芽後，瑞士乳桿菌在穀物基質中生長10小時後的活菌數為2.29×108cfu/ml（周小莉，乳酸菌在燕麥基質中生長特性研究[D]，江南大學，2012）。駱超超等將釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌接種到玉米汁中，發現這三株菌可以玉米為發酵底物進行繁殖發酵（駱超超，盧志勇等.幾種益生菌發酵穀物飲料製作工藝研究.東北農業大學學報.2011.42(5):127~129）。有專利文獻報導一種穀物培養基發酵增殖益生菌的方法，是以玉米、燕麥、大豆經酶解等處理後培養兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌，38℃發酵22小時，發酵液pH可下降到4，並可獲得增殖的雙歧桿菌（中國專利申請號：200810015537.X）。有專利文獻報導一種以糯玉米培養基發酵益生菌的方法，將糯玉米去種皮打漿後如發酵罐，按1:1接種乳酸菌種L041和L042高效發酵劑28℃緩速發酵70-80h，發酵終端pH為2.9-3.3（中國專利申請號：200510047702.6）。穀物作為益生菌發酵基質可以為其提供生長必須營養物質，有效增殖益生菌，但這些穀物培養基在進行發酵培養之前均需進行複雜的預處理，包括去種皮、蒸煮、酶解等複雜處理工藝。穀物膨化粉是經高溫、高壓膨化製得，熟化過程中可以最大限度降低營養的損耗。經膨化產生的高溫高壓、高剪切力可以使穀物中的澱粉顆粒膨化並精華，打開澱粉分子連接，增加食糜顆粒的表面積、提高澱粉的消化吸收率；同時膨化使蛋白質肽鏈裂解為肽和胺基酸，大大提高蛋白質的吸收率。使用膨化穀物可以有效簡化發酵工藝、縮短發酵周期，從而降低發酵成本。當前提高益生菌活菌總數的研究方向主要集中在發酵工藝的優化和複合菌高密度發酵。向發酵培養基中添加有益物質不但能提高益生菌的活菌數，發酵乳還能兼具有益物質的功能。林瑩等將菊粉、大豆低聚糖和低聚果糖等益生素添加到酸奶中進行發酵，結果表明，益生素對雙歧桿菌的增殖有顯著影響，其中又以大豆低聚糖對雙歧桿菌的增殖最有效，活菌數量從0.49×108cfu/ml有效增殖到1.2×108cfu/ml（林瑩，梁世中．益生菌保健酸奶發酵劑配製和益生素對菌體數量影響的研究[J]．廣州食品工業科技，2003:41-43）。有專利文獻報導一種提高益生菌活菌數的方法，是將北蟲草提取物加入到常規的乳酸菌培養基中，能夠使乳酸菌活菌數從1.5×108cfu/ml提高到1.3×109cfu/ml(中國專利申請號：200910038553.5)。劉成國等將益生菌菌種接種到添加有紫薯漿的發酵牛乳基質中進行發酵，能夠顯著提高益生菌發酵乳中益生菌的活菌數，得到的益生菌發酵乳的最大活菌數從109-1010cfu/ml提高到1010-1012cfu/ml。脫脂乳中添加大豆蛋白水解物和酵母膏複合劑對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌生長具有顯著的促進作用，添加增殖複合劑可使乳酸菌數量比脫脂乳培養基提高1-2個數量級。(白鳳翎，曲玲童，張柏林等.大豆蛋白水解物促乳酸菌增殖發酵的研究[J].食品工業科技，2012，33(16):209-212)。李慧靜等研究了添加黃芪之後嗜酸乳桿菌的生長狀況的變化，她們把製備的黃芪提取液添加到改良的MRS培養基中，研究不同濃度黃芪提取液對嗜酸乳桿菌生長的影響，結果表明：當添加黃芪提取液濃度為0.032g/mL時，對嗜酸乳桿菌生長有明顯的促進作用，48hOD從0.6升高到0.8（李慧靜，嗜酸乳桿菌與黃芪相關性研究[D]，安徽工程大學，2013）。趙玉萍等研究不同濃度的甘草多糖和黨參多糖對鼠李糖乳桿菌的影響，發現1.5%(m/v)的黨參多糖對鼠李糖乳桿菌的增殖影響最大，其活菌數最大可達到3.29×109cfu/mL，提高了3倍左右，並且能夠使其提前2～3h達到最大產酸量，縮短發酵時間，較好地提高其耐酸、耐膽鹽及耐高溫的能力(趙玉萍，賈建波，中藥多糖對鼠李糖乳桿菌性質的影響[J]，食品科技，200,8,P13-15)。徐海燕等研究低聚木糖對乳桿菌、雙歧桿菌及腸道菌群生長的影響。結果1%的低聚木糖對植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌和青春雙歧桿菌有明顯的增殖作用。（徐海燕，辛國芹，曹銀生，武香玉，汪孟娟，谷巍，低聚木糖對益生菌及人腸道菌群的影響，藥學研究2013第9期P500-503）當前益生菌增殖技術取得了一定成果，向發酵培養基中添加有益物質是一種高效、簡便的提高益生菌的活菌數的方法。不但能降低發酵生產成本，在某些情況甚至能夠縮短發酵周期。但是更多的具備特殊功能的添加劑的研究還不是很多。許多食物即藥物，它們之間並無絕對的分界線。山藥，性甘平，具有健脾補肺固腎、益氣養陰固精的功效。葛根，性辛甘而涼，既疏散肌腠經絡之邪氣，又鼓舞脾胃清陽之氣上行，而生津止渴、昇陽止瀉。玉竹，甘潤而補、平而少偏，入肺經滋肺陰而能潤肺止咳；入胃經養胃陰而能生津止渴。白芸豆，味甘微溫，既能健脾化溼，又能化溼和中而消暑，還能解酒毒。黃芪，甘溫升補，主以扶正氣，兼能除水邪，既善補中氣、升舉清陽，又善補肺氣、益衛固表。黃芩，苦寒清洩而燥，善清肺與大腸之火，除上中焦溼熱；兼入血分而涼血止血。葡萄籽提取物（GSE），屬多酚類物質，又稱原花青素。20世紀80年代以來，人們對其進行了大量生化、藥理活性等研究。結果表明GSE是清除自由基能力最強的抗氧化劑，是迄今為止所發現的最強的有效氧自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑，能夠防治80多種因自由基引起的疾病，包括心臟病、癌症及關節炎等病症（趙超英,姚小曼.葡萄籽提取物原花青素的營養保健功能(綜述)[J].中國食品衛生雜誌,2000,12(6):38-41.）。因其資源豐富、療效確切、副作用小等特點，在歐洲、日本備受青睞，近年來又風靡美國。桑葉含有多種活性化學成分，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、抗病毒等功效（歐陽臻,陳鈞.桑葉的化學成分及其藥理作用研究進展[J].江蘇大學學報自然科學版,2003,24(6):39-44.）。冬蟲夏草作為我國傳統的名貴藥材已經有很長的歷史，蟲草多糖作為蟲草的主要活性成分之一，具有多種藥理活性。人工發酵蟲草多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化和提高免疫能力等多種藥理活性。但是經過益生菌發酵的蟲草多糖的研究尚較少見。但是，當前關於中藥組分對益生菌具有增殖作用的研究尚沒有文獻報導，添加中藥組分的微生態製劑也未見報導。技術實現要素：為了解決現有技術存在的問題，本發明的目的是提供一種提高益生菌活菌數的方法。為了實現本發明目的，本發明提供了一種體外培養促進益生菌生長和提高益生菌活菌數的方法，所述方法為：將益生菌菌種接種到添加有中藥組分溶液的培養基中，進行益生菌的增殖發酵。前述方法具體技術方案包括以下步驟：（1）中藥組分溶液的製備：準確稱量各種中藥組分配置成中藥組分的濃溶液，攪拌至溶解，115℃滅菌30min；（2）增菌培養基的配置：將步驟（1）製備得到的中藥組分濃溶液加至滅菌後的改良MRS培養基或穀物培養基中；同時準備一個未添加中藥組分的對照組（3）益生菌種子液的製備：將保存到的益生菌菌株，經復甦、擴大後製成種子液；（4）益生菌的增菌培養：將步驟（3）得到的益生菌種子液，接種到步驟（2）得到的增菌培養基中進行增菌發酵培養。（5）活菌數的測定：對初始發酵培養基澄清無沉澱等渾濁現象的發酵液採用常規OD600光密度計數法。發酵的過程從0h開始，每間隔一段時間測定一次活菌數，最終獲得該益生菌的最大活菌數。同時，使用了流式細胞計數儀，對不能進行光密度檢測的混濁發酵體系進行活菌數檢測。較優地，所述步驟（1）中，黃芩、山藥、葛根、玉竹、白芸豆、葡萄籽、綠茶、黃芪以100mg/mL的濃度配置成中藥組分的DMSO濃溶液。DMSO溶液可以提高中藥組分的溶解性，且按之後的比例加入到增菌培養體系，DMSO並不會抑制益生菌的生長增殖。桑葉提取物、蟲草多糖（50%）以100mg/mL的濃度配置成中藥組分的水濃溶液。較優地，所述步驟（2）中，步驟（1）中所得中藥組分溶液按一定體積加至增菌發酵培養基中，使中藥終濃度為0.1mg/mL至5mg/mL。所述的改良乳酸菌培養基（改良MRS）配置好後於115℃、0.1Mpa下滅菌30min。改良MRS配方如下：成分用量（g）蛋白腖20.0牛肉膏10.0酵母膏5.0檸檬酸氫二銨[（NH4）2HC6H5O7]4.0葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0吐溫-803.0mL乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）5.0磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）2.0硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.25硫酸錳（MnSO4·H2O）0.05瓊脂18.0蒸餾水1000mLpH7.0所述的穀物培養基配方如下：8種80～100目的穀物膨化粉（燕麥、蕎麥、高粱米、粟米、薏米、綠豆、黑豆、黃豆）按照8%的總固含量配置成發酵培養基，培養基中各種穀物組分含量相等。配置好的穀物培養基115℃、0.1Mpa下滅菌25-30min。較優地，所述步驟（3）中，將益生菌（植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、乾酪乳桿菌、糞腸球菌、唾液乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌）菌種凍存液，分別以1%(v/v)的比例加入到改良MRS培養基中，37℃靜止培養12小時進行菌種的復甦；按10%～20%(v/v)的比例將復甦菌液接種到改良MRS培養基中，37℃靜止培養12小時進行益生菌種子液的製備。較優地，將步驟3)得到的益生菌種子液按照3%(v/v)的比例接種到步驟2)得到的增菌培養基中進行增菌培養。當混菌發酵時，多種菌種子液的總添加量為發酵體系的3%(v/v)。增菌培養溫度為37oC，增菌培養時間為16–24h。本發明以益生菌為發酵菌種，通過在增菌培養基中添加經處理的中藥組分溶液，在適宜溫度下，顯著提高了增菌培養過程中益生菌的生長和活菌數，從而為之後製備益生菌微生態製劑提供大量活益生菌菌體。另外，如在微生態製劑中加入適量的中藥組分，不僅可以促進人體胃腸道內部分益生菌的生長，還可以起到其他保健作用。本發明還綜合利用了低成本的中藥組分資源，並發現了中藥組分在提高益生菌活菌數中的作用，並且對部分種屬的益生菌有明顯的增殖效果。通過添加中藥組分也可以顯著提高穀物發酵體系中的活菌數，同時增加穀物發酵製品的營養組分，增加了對人體健康的多方面調節作用。附圖說明圖1是不同濃度桑葉提取物對鼠李糖乳桿菌體外增殖的的作用。圖2是不同濃度蟲草多糖（50%）對鼠李糖乳桿菌體外增殖的的作用。圖3是流式細胞儀檢測穀物發酵體系中益生菌的活菌及死菌數量。圖4是添加中藥組分對穀物發酵培養基中益生菌的增殖作用。具體實施方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例11)中藥組分溶液的製備：將桑葉提取物或蟲草多糖（50%）分別以100mg/mL的濃度加入蒸餾水中配置成中藥組分的水濃溶液，攪拌至溶解，115℃滅菌30min。2)增菌培養基的配置：將步驟(1)製備得到的中藥組分溶液按一定濃度加至改良MRS培養基中，使中藥組分終濃度為分別為0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL。所述的改良乳酸菌培養基（改良MRS）配置好後於115℃、0.1Mpa下滅菌30min，滅菌後自然冷卻。配方如下：成分用量（g）蛋白腖20.0牛肉膏10.0酵母膏5.0檸檬酸氫二銨[（NH4）2HC6H5O7]4.0葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0吐溫-803.0mL乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）5.0磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）2.0硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.25硫酸錳（MnSO4·H2O）0.05瓊脂18.0蒸餾水1000mLpH7.03)益生菌種子液的製備：將保存的鼠李糖乳桿菌菌株，經復甦擴大後製成種子液。將鼠李糖乳桿菌種以1%(v/v)的比例加入到改良MRS培養基中，37℃靜止培養12小時進行菌種的復甦；按10%(v/v)的比例將復甦菌液接種到改良MRS培養基中，37℃靜止培養12小時進行鼠李糖乳桿菌種子液的製備。4)益生菌的增菌培養：將步驟(3)得到的益生菌種子液接種到步驟(2)得到的增菌培養基中進行增菌。種子液按照3%(v/v)的比例加至增菌培養基。增菌培養溫度為37℃，增菌培養時間為16h。5）活菌數的測定：發酵的過程從0h開始，採用常規10倍稀釋平板厭氧培養計數法每間隔一段時間測定一次活菌數，最終獲得該益生菌的最大活菌數。實施例21)中藥組分溶液的製備：將黃芩、山藥、葛根、玉竹、白芸豆、葡萄籽、綠茶、黃芪加入DMSO中，攪拌至溶解，115℃滅菌30min。所述中藥組分以100mg/mL的濃度配置成中藥組分的DMSO濃溶液。2)增菌培養基的配置：將步驟(1)製備得到的中藥組分溶液按一定濃度加至穀物培養基中，使中藥組分終濃度為0.1mg/mL。所述的穀物培養基配置方法為：將8種80～100目的穀物膨化粉（燕麥、蕎麥、高粱米、粟米、薏米、綠豆、黑豆、黃豆）按照8%的總固含量配置成發酵培養基，其中穀物培養基中各種穀物組分含量相等。配置好的穀物培養基115℃、0.1Mpa下滅菌25-30min。3)益生菌種子液的製備：將保存的益生菌菌株（植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、乾酪乳桿菌、糞腸球菌、唾液乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、發酵乳桿菌），經復甦擴大後製成種子液。將鼠李糖乳桿菌種以1%(v/v)的比例加入到改良MRS培養基中，37℃靜止培養12小時進行菌種的復甦；按10%(v/v)的比例將復甦菌液接種到改良MRS培養基中，37℃靜止培養12小時進行益生菌菌種子液的製備。所述的改良乳酸菌培養基（改良MRS）配置好後於115℃、0.1Mpa下滅菌30min，滅菌後自然冷卻。配方如下：成分用量（g）蛋白腖20.0牛肉膏10.0酵母膏5.0檸檬酸氫二銨[（NH4）2HC6H5O7]4.0葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0吐溫-803.0mL乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）5.0磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）2.0硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.25硫酸錳（MnSO4·H2O）0.05瓊脂18.0蒸餾水1000mLpH7.04)益生菌的增菌培養：將步驟(3)得到的益生菌種子液接種到步驟(2)得到的增菌培養基中進行增菌。種子液按照3%(v/v)的比例加至增菌培養基。增菌培養溫度為37℃，增菌培養時間為20h。5）活菌數的測定：採用流式細胞儀計數法測定發酵液中益生菌菌數，獲得穀物發酵液中益生菌的活菌數與死菌數。流式細胞儀計數法的具體操作如下所述：a.樣品準備，將取出的發酵液進行適當的稀釋，使待檢測菌液樣品中活菌數的數量範圍在5.5×105～6.5×105CFU/mL。稀釋後的發酵液樣品經300目紗網過濾，取稀釋後的待檢樣品200μL加入到1.5mL的EP管中，於37℃恆溫培養箱溫浴3分鐘。b.樣品染色，待檢樣品200μL中加入2μL100×SybrGreenI和2μL100×PI，37℃避光染色10分鐘。SybrGreenI和PI(PropidiumIodide)是兩種常見的DNA螢光染料。SybrGreenI能穿透活細胞和死細胞的細胞膜，而PI不能很好地穿透活細胞的細胞膜。利用SybrGreenI和PI染色細菌，可將細菌分為三群：SybrGreenI(+)PI(-)的活細菌，SybrGreenI(+)PI(+)的死細菌，以及處於兩群之間的損傷細菌。c.C6Accuri絕對計數，C6Accuri流式細胞儀分析樣品，閾值設為FSC-H大於10000，流速選擇慢速，採樣量設置為60μL，進行絕對計數檢測。d.以FL1-H為橫坐標，FL2-A為縱坐標，畫細胞密度圖。通過分析水樣密度圖、菌液以及加熱後的菌液，根據這些樣品的細胞分群，圈設門計數。根據本發明得到的益生菌穀物發酵液的最大活菌數可達到4.1×108CFU/mL，與未添加中藥組分成分的發酵液獲得的最大活菌數1.4×108CFU/mL相比，有顯著的提高。雖然，上文中己經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp