假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因及其克隆方法
2023-05-01 18:39:41
專利名稱：假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及一種基因克隆，尤其是一種假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶結構基因及其克隆方法。
背景技術：
目前從某種原核生物中克隆一個已知基因的常規做法是通過生物信息查尋，得知其它生物該基因的序列後，再循兩條技術路線進行克隆基因1.合成該基因的寡聚核苷酸DNA探針，以放射性同位素或非放射性化學物質標記該分子探針，將該探針與事先構建的該生物基因組文庫進行Southern雜交，釣出含有目的基因的DNA片段，對該片段測序；構建含該片段的表達重組質粒，轉化受體細胞，檢測該DNA片段轉錄後轉化子獲得的新蛋白及其生物學功能(參見文獻1Sambrook J，Fritsch E F，Maniantis TMolecular CloningA Laboratory Mannual(2nd).Cold Spring HarborLaboratory Press，1989.(金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南(第二版).北京科學出版社，1996))。
2.根據已知基因的兩端序列設計並人工合成3′端和5′端寡聚短核苷酸引物，以該生物的總DNA為模板進行PCR擴增，回收擴增產物並構建重組質粒，測序，轉化受體細胞，檢測該DNA片段轉錄後轉化子獲得的新蛋白及其生物學功能(參見文獻2吳乃虎編著.基因工程原理.北京科學出版社，1998)。
方法1需要事先構建該生物的基因組文庫，然後化學合成放射性或非放射性DNA探針，再進行大量的Southern雜交，費錢、費時，實驗周期又長；方法2雖然比方法1簡單，但由於不同生物的基因序列並不完全相同，因此往往需合成多對的引物，然後在PCR反應中設置多套循環參數，尤其是「退火」的溫度。這樣，方法2一般都要進行多次的反覆摸索才可能克隆出目的基因，甚至可能以實驗失敗而告終。
此外，上述兩種克隆基因的策略都只能克隆已知(即前人已克隆過)的基因，無法克隆序列未知的具有某種功能的基因。
假單胞菌(Pseudomonas sp.cn4902)已被中國典型培養物保藏中心在2004年7月13日收到並檢測存活，登記入冊。包藏編號CCTCC NOM204052
發明內容
本發明的目的在於提供一種假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶結構基因及其一種既快捷又經濟的克隆方法。
本發明所說的假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶結構基因的序列如下1 atgacgaggagcctttcatgtcgcccaatccgcccctgcgcattctcgacggtatccgcc 6061 tggtcgcgttcgacctcgatggcacgctggtggattcggtccccgaccttggccgctgcc 120121 gtcgatgccgccctgcgttcgctgggactcgcgggcgtcgacgaagcgtcggtgcgcgac 180181 tgggtgggcaatgcgtcccgcaagctggtggagcgcgccctggaagcgctcgacgcgcaa 240241 gacacggacccggaggcggctcacgaggcgtttctgcatcattatcgcctggcgccttgt 300301 cgcgcgacgcgcctgtaccccggtgtgcgcgaggcgctcgaagggttgcgcgcacgcggt 360361 ctgacgctggtgctgatcaccaacaagccggcggcgttcatcgccccgatcctcgaaacg 420421 ctgggactgagcgactttttcgacctgacgctgggcggcgattcgctggcggcgaagaag 480481 ccagatccggcgcccttgctgcacgtggcatcccgtttcggggtgacgccgagcgtctgt 540541 ctgatggtgggggactcccggcatgacatcgaggccgggcggggtgccggattccgcacc 600601 ctggcggtgccctacg gctacaatcacggcgatccggtggcggcgagcgcgccggatgc 660661 catggttgaatcgctgggggaactcgtttagtgtttttcgatacttgcgtctataaaacc 720721 aagtttttgat aacgttctgctataacggacagcgttagatgattctgaatgccccctc 780781 gtcgcgtagagccctcgcgttgatgcgtga 810所說的磷酸甘油磷酸酯酶結構基因總長810bp(鹼基對)。根據原核基因特徵判斷，前3個字符「atg」(已用黑體字表示)為該基因的起始符，根據三聯體密碼規則依次計算，最後3個字符「tga」為該基因的終止符，可見這是一個完整的結構基因。
本發明所說的基因和銅綠假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶基因同源性比較(將該序列輸入美國GenBank資料庫進行核苷酸同源性比較)，結果如下Query 1 atga---c-gaggagcctttcatgtcgcccaatccgcccctgcgcattctcgacggtatc 56|||| | | |||||| ||| | ||||| | ||| ||||| || || ||Sbjct 1 atgagcgctgcggagccgttc-t-tcgcc--a--cgcgcctgc-------cg-cg---tc 43 Query 117 tgccgtcga-----tgc-cgccctgcgttcgctgggactc--gcgggcgtcgacgaagcg 168|| ||||| ||| |||| || |||| || | | |||||| |||| |||| |Sbjct 99 cgcggtcgacagcatgctcgcca-gc-ttcgggcggccgccggcgggcatcga-gaag-g 154Query 169 tcggtgcgcgactgggtgggcaatg-cgtcccgcaagctggtggagcgcgccctgg---- 223||||| | ||| | || || | || | ||| |||||| ||||||||||Sbjct 155 tc----cgccagtggatcggtaacggcg-cacgcgtcctggtgcgtcgcgccctggccgg 209
Query 224 aagcgctcga-cgcgcaagaca-cggacccggagg----cg--gctcacga-ggcgtt-- 272|||| |||| | || | | || |||||||||| || | || ||||||Sbjct 210 aagca-tcgagcacg-acggcatcggtga-ggaggaaaccgaagc-cgcgctggcgttgt 265Query 273 tc-tgcatcattatcgcctggc-gccttgtcgcgcgacgcgcctgtaccccggtgtgcg- 329|| || |||| ||| | | | | || ||| | || | | |||||||| || ||Sbjct 266 tcatggaggcctat-gcc-gacagtcatg-cgctcaccgagg-tctaccccggcgt-cgt 320 Query 444 cct-gacgctgggcggcgattcgctggcggcgaagaagccagatccggcgcccttgctgc 502|| || | |||||||| | ||| || | ||||||| || |||||| | |||||Sbjct 435 -ctggatcatcggcggcgacaccctgccgcagcagaagcccgacccggcggcgctgctgt 493Query 503 acgtggcatcccgtttcggggtgacgccgag--cg----tctgtctgatggtgggggact 556|||| || | | || || | |||| ||| || || | || || ||||Sbjct 494 tcgtg--atgaagat---ggctggcatcgagcccgaagatgcgt-tgttcgtcggtgact 547Query 557 cccggcatgacatcgaggccgggcggggtgccggattccgcaccctggcggtgccctacg 516| || | ||| ||||| | |||||| | ||| | |||| || |||| |Sbjct 548 cgcgcaacgacgtgctcgccgccaaagctgccggcgtgcgctgcgcggcgctgacctatg 607Query 617 gctacaatcacggcgatccggtggcggcgag--cgcgccggatgccatggt--t-ga-at 670||||||| |||||| ||| | || |||| ||||| | || |||| | || |Sbjct 608 gctacaaccacggccggccgat--cgccgaggaagcgcc-ca--ccctggtcatcgacaa 662Query 671 cgctgggggaactcgtttagtgtttttcgatacttgcgtctataaaaccaagtttttgat 730| ||| | || || | | | ||||||| | | | || | | |||Sbjct 663 c-ctgcgcgacct-gct--g-------c----cttgcgccgaccaggcc--g-ctgagat 704Query 731 aacgttctgctataacggacagcgttagatgattctgaatgccccct-cgtc--gcgtag 787| || ||| ||||| || ||| |||||| || | ||| ||Sbjct 705 a--gtgttgc-----cggac----------gactc-cctttccccctccgaccagcg-ag 745Query 788 agccctcgcgttgatgcgtgacgtcaagcgttgg-cgatggtgat-gtcgccgtctggtg 845| | | || || ||| | | ||| | ||| || ||| ||||| ||||Sbjct 746 atcaagc-cg-tg--gcg-gtcagcaaactctggatgaaggtcatcaaggcc--ctgg-- 796Query 846 tcgggtcgcggcgatggtttcgcc-ga 871|| || |||| ||| |||| ||Sbjct 797 -cgcgt--tggcgctgg-cgcgcctga 819其中，Query為克隆的假單胞菌基因；Sbjct為銅綠假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶基因。
上述比較顯示，這兩個基因的核苷酸一致性達61.5％(570/927)，而且兩者之間核苷酸連續相同的片段最長達20bp(以陰影表示)，其方框中所示的核苷酸區段兩者的一致性高達90.5％(38/42)，6個以上核苷酸連續相同的片段有19個。由此可見，ORF3基因應該是假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶結構基因，而且其中的陰影部分和劃方框部分很可能是該基因的高度保守區域。
本基因已經被美國GenBank資料庫收錄，收錄號為AF348165。
根據克隆的假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶結構基因，按照通用的三聯體遺傳密碼推測出它所編碼的酶蛋白序列，再與銅綠假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶的胺基酸序列進行同源性比較，它們完全相同的胺基酸數達45.1％。本發明克隆基因推測的胺基酸序列與銅綠假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶胺基酸序列比較如下 其中，ORF3為克隆的假單胞菌基因推測的胺基酸序列；Sbjct為銅綠假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶；相同的胺基酸用黑色背景表示。
將上述克隆基因與表達載體連接成重組載體，轉化受體細胞(大腸桿菌)，提取轉化子的總蛋白進行電泳，發現該基因表達的磷酸甘油磷酸酯酶蛋白分子量大約為30kD，與理論推測值相符。
磷酸甘油磷酸酯酶的功能在於特異地催化3-磷酸甘油脫去磷酸基團，生成甘油。由於甘油在細胞中的累積，將有助於增加細胞中的水分，使受體生物明顯提高抗逆性(包括耐鹽、耐旱、耐寒等)水平，具有較高的潛在應用價值。
本發明所說的假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶結構基因的克隆方法，其步驟如下1、將假單胞菌在含NaCl 0.1～0.9mol/L的培養基中，溫度為15～33℃，以100～150rpm的速度震蕩培養至指數生長中後期。
2、用常規鹼變性法提取假單胞菌的總DNA，經紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應≥1.8。
3、在無菌條件下用限制性核酸內切酶(E.co RI)或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶對所提取的假單胞菌的總DNA在37℃進行60～100分鐘的不完全酶切，酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量為1～10kb的酶切片段區域，切出含上述該酶切片段的凝膠，回收其中的DNA片段。
4、在無菌條件下以E.co RI在人工構建的表達載體，如pUC18的多克隆位點，將其完全酶切成線性，去磷酸化處理，將回收的DNA片段與線性載體共育；加入T4DNA連接酶在16℃連接10～24h，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(感受態受體菌一般為大腸桿菌)。
5、在無菌條件下，取100μL轉化溶液塗抹在高鹽(例如含NaCl 1.1mol/L)LB瓊脂培養基上，37℃培養48～72h。挑取在培養基表面上長出的單菌落耐鹽轉化子，以劃線的方式接種在含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上，37℃培養48h。在含Amp-Xgal-IPTG(Amp中文名稱為氨苄青黴素，Xgal中文名為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)培養基上出現的白色菌落即可初步判斷為耐鹽轉化子。
6、提取上述至少10個中選耐鹽轉化子中的重組質粒，用E.co RI切出其中的插入片段，測序。
7、將已測知的插入片段序列與生物資料庫(例如美國生物資料庫)中的信息進行基因和蛋白質的同源性比較，初步判斷其中存在磷酸甘油磷酸酯酶基因。
根據該基因兩端的序列設計一對引物(其中包括和下一步驟相同的限制性核酸內切酶識別位點)，以原重組質粒為模板進行PCR擴增。
引物的序列如下5`-AGAATTCATGACCCTTCCATCGATGACGAG-3`(劃橫線處為Eco RI的酶切位點)5`-ATCACCATCG-CCAACGCTTGACGTC-3`PCR反應體系如下
PCR反應程序為95℃ 5min
72℃ 7min4℃ 保存
8、取出上述PCR反應液，經0.6％～1.0％瓊脂糖凝膠電泳後，用鋒利的刀片在紫外燈下切下擴增出的約800bp(鹼基對)的DNA帶，參照華舜公司凝膠回收試劑盒說明書進行DNA回收。
9、將PCR回收產物與pMD18-T載體構建重組表達質粒，其反應體系為
將上述反應體系在16℃反應2～16h，形成重組質粒。全量連接液(10μL)用CaCl2法轉化感受態大腸桿菌JM101(100～150μL)。
10、將上述轉化液塗抹在含有Amp-X-gal-IPTG的LB培養皿上培養24～48h，挑選白色菌落，在含Amp的LB液體培養基中培養過夜，鹼裂解法提取其中重組質粒。
11、為了檢查重組質粒中的插入片段是正插還是反插，用限制性核酸內切酶Sal I在37℃酶切重組質粒1.0～1.5h，65℃ 20～30min結束酶切反應；經1.0％瓊脂糖凝膠電泳，發現只有第3泳道為正插，即產生2867bp和680bp兩條片段；說明磷酸甘油磷酸酯酶基因已經正確插入該重組質粒中。
12、提取外源片段正向插入的重組質粒用Eco RI和Pst I進行雙酶切，以獲取原有的克隆DNA片段，電泳結果顯示酶切後產生兩條帶，分別為2.7kb載體帶和850bp插入帶，後者即為克隆基因。
13、為了確認磷酸甘油磷酸酯酶基因與生物的耐鹽功能密切相關，鹼法提取上述重組質粒及熱啟動高效表達載體pBV220，利用Eco RI和Pst I內切酶分別雙酶切上述兩種質粒；經1.0％瓊脂糖凝膠電泳後分別回收線性pBV220載體和磷酸甘油磷酸酯酶基因，用T4DNA連接酶在16℃連接過夜(12～18h)。連接反應體系如下
14、用上述磷酸甘油磷酸酯酶基因與pBV220連接成的重組載體轉化感受態大腸桿菌ER2566，塗布在含Amp100mg/L的LB瓊脂培養基上；24～32h後隨機挑出若干個菌落進行培養，提取其中的質粒，以Eco RI和Pst I雙酶切或PCR擴增，1.0％瓊脂糖電泳，證明重組質粒中含有磷酸甘油磷酸酯酶基因。
15、將含上述重組質粒的轉化子在LB培養基(含Amp100mg/L)中於37℃培養至指數生長中期(OD600為0.5～0.6)，迅速轉至42℃誘導4～6h，離心收集菌體。提取轉化子的可溶性總蛋白，SDS-PAGE電泳(濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％)，考馬斯亮藍染色，檢測目的基因的蛋白表達產物，發現其分子量約為30kD，與預期相符。
16、配製含NaCl濃度分別為1.0、1.1、1.2、1.3和1.4mol/L的LB固體培養基，分別將轉化子和對照接種在培養基表面，37℃培養48～60h。轉化子可在含NaCl高達1.3mol/L的LB培養基上生長，而對照組最高耐鹽能力不超過NaCl 1.1mol/L。
17、將各轉化子與對照分別接種在含NaCl為1.0mol/L的高鹽液態LB培養基中，在恆溫37℃、100～150rpm的搖床中連續培養。此時對照僅能緩慢進行細胞分裂，而耐鹽轉化子則較快生長。每隔4～8h取樣檢測菌液的OD600值，並換算成含菌數，繪出轉化子與對照的生長曲線，重複二次。結果表明，達到生長平衡期時(36～42h後)，轉化子的OD600值約為對照的3.7倍。可見磷酸甘油磷酸酯酶基因使轉化子具有較好的耐鹽能力。
18、分別取適量轉化子和對照接種於300mL LB培養基(含NaCl 0.9～1.0mol/L，Amp100mg/L)中37℃震蕩培養(100～150rpm)過夜，參照王劍峰等(2001)的方法測定細胞中的甘油含量。實驗得知，轉化子的甘油含量為7.93ng/1.0×106cells，約是對照組的2.9倍。可見，轉化子中的外源磷酸甘油磷酸酯酶基因能促進甘油合成，導致轉化子中的甘油含量顯著升高，耐鹽性大大提高。
在步驟1中，將假單胞菌在含NaCl 0.1～0.9mol/L的培養基中震蕩培養至指數生長中後期所需的時間大約為10～24h。
在步驟2中，用常規鹼變性法提取假單胞菌的總DNA，經紫外光譜檢測純度，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的分子量是否≥21kb。若OD260/OD280比值≥1.8，說明所得DNA較純，可以進入下一步驟；若OD260/OD280比值＜1.8，說明所得DNA純度不夠，應進一步純化，直至OD260/OD280比值≥1.8。
在步驟3中採用凝膠回收試劑盒回收含酶切片段的凝膠中的DNA片段；酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠的含量為1‰。
在步驟4中，將回收的DNA片段與線性載體共育，兩者的分子數比例約為1∶2～10；轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌用大腸桿菌。
在步驟5中，在無菌條件下取100μL轉化溶液用三角形無菌玻棒均勻塗抹在高鹽LB瓊脂培養基上，培養48～72h後，以無菌接種環沾取其中的單菌落按常規劃線法在含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上劃線培養。
在步驟7中，所說的生物資料庫為GenBank或其他資料庫。
在步驟8中，所說的設計一對引物，包括Eco RI的酶切位點，和下一步驟的限制性核酸內切酶識別位點相同。
在步驟12中，所說的線性pBV220載體指的是熱啟動高效表達載體pBV220，經限制性核酸內切酶Eco RI和Pst I雙酶切後從原來的環型轉變成線型質粒。
在步驟13中，所說的挑出在含Amp培養基上長出的轉化子培養，是指將轉化子在37℃培養在含Amp100mg/L的LB液體培養基中，120～150rpm，12～18h後提取轉化子中的重組質粒；PCR擴增的條件與步驟8相同。
在步驟15中，所說的分別將轉化子和對照接種在培養基表面，可以用塗抹法，也可以用點接種法。
在步驟16中，所說的對照為未經遺傳學處理的大腸桿菌。取樣檢測菌液的OD600值，並換算成含菌數，依據的是事先繪成的菌液的OD600值與菌液濃度之間對應關係的標準曲線。
在步驟17中，所說的對照為未經遺傳學處理的大腸桿菌，培養過夜指的是14～20h。
本發明的突出優點在於不必建立基因組文庫或cDNA文庫，即可從耐鹽原核生物的總DNA中直接克隆其耐鹽相關基因，並確認該基因的性質和功能，而且可以是多個性質不同的耐鹽相關基因。
圖1為轉化子E.coli ER2566/pBVORF3總蛋白SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。其中，M蛋白質分子量標誌；1對照E.coli ER2566/pBV220；2轉化子E.coli ER2566/pBVORF3；注箭頭指處為磷酸甘油磷酸酯基因的表達蛋白帶。
圖2為重組質粒的Sal I酶切分析圖。其中，M分子量標誌物；1～3重組質粒被Sal I酶切，只有第3泳道是所需的重組質粒。
圖3為正向插入的重組質粒雙酶切電泳圖譜。其中，M分子量標誌物；1～3Eco RI+Pst I雙酶切產物。
圖4為重組質粒pBVORF3雙酶切分析圖。其中，M分子量標誌物；1Eco RI+Pst I雙酶切產物。
圖5為轉化子在含NaCl 1.0mol/L的LB培養基中的生長曲線圖。
圖6為轉化子和對照的平均甘油含量圖。
具體實施例方式
以下實施例將對本發明作進一步說明。
實施例1從極端耐鹽的假單胞菌中克隆其耐鹽相關基因，其步驟為1.將假單胞菌接種在含NaCl 0.5mol/L的培養基中，恆溫25℃，以120rpm的速度震蕩培養至指數生長中後期，約為22h；2.常規鹼變性法提取其總DNA。分別檢測總DNA溶液的OD260和OD280值以確認它的純度，兩者的比值為1.88。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的分子量約為21～23kb；3.用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對上述高純度的總DNA在37℃進行80min的不完全酶切。酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量為2kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段；4.以E.co RI在表達載體，如pUC18的多克隆位點將其完全酶切成線性，去磷酸化處理以減少其自身連接的機率。將回收的DNA片段與線性載體共育，加入連接酶在16℃連接20h，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)；5.在無菌條件下，取100μL轉化溶液塗抹在高鹽(含NaCl 1.1mol/L)LB瓊脂培養基上，37℃培養48～72h。挑取在培養基表面上長出的單菌落耐鹽轉化子，以劃線的方式接種在含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上，37℃培養48h。經這樣兩階段篩選，在含Amp-Xgal-IPTG培養基上出現的白色菌落即可初步判斷為耐鹽轉化子；6.在含NaCl 0.5mol/L的LB培養基中，恆溫25℃，以120rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。分別提取10個耐鹽轉化子中的重組質粒，用原內切酶(E.co RI)切出其中的插入片段，測序；7.將已測知的各個插入片段序列與生物資料庫(GenBank或其他資料庫)中的信息進行基因和蛋白質的同源性比較，初步判斷插入基因的性質。
根據上述提示，進一步用SDS-PAGE電泳檢測轉化子中外源基因表達蛋白的分子量是否與所測序列推測的蛋白質的分子量相符。
將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl 0.9mol/L)中，在恆溫37℃、120rpm的搖床中連續培養48h。此時對照僅能緩慢進行細胞分裂，而耐鹽轉化子則較快生長。每隔6h取樣檢測其中的含菌數，分別繪出轉化子與對照的生長曲線，比較兩者生長狀態的差異，藉此再次驗證該基因為耐鹽相關基因。
取上述菌液分別測定細胞中的甘油或耐鹽相關基因表達的其它產物的含量。對照中的含量明顯低於轉化子，從而確證本克隆耐鹽基因的性質。
實施例2與實施例1類似，其區別在於將假單胞菌接種在含NaCl 0.7mol/L的培養基中，恆溫20℃，以150rpm的速度震蕩培養至指數生長中後期，約為20h。用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對從上述菌中提取出的高純度總DNA在37℃進行70min的不完全酶切。酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量約為3kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段。將回收的DNA片段與經相同限制性核酸內切酶酶切的線性載體共育，加入連接酶在16℃連接18h，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)。在含NaCl 0.7mol/L的LB液體培養基中，恆溫20℃，以150rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl 0.95mol/L)中，在恆溫37℃、130rpm的搖床中連續培養48h。
實施例3與實施例1類似，其區別在於將假單胞菌接種在含NaCl 0.3mol/L的培養基中，恆溫28℃，以110rpm的速度震蕩培養至指數生長中後期，約為18h。用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對從上述菌中提取出的高純度的總DNA在37℃進行90min的不完全酶切。酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量約為8kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段。將回收的DNA片段與經相同限制性核酸內切酶酶切的線性載體共育，加入連接酶在16℃連接15h，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)。在含NaCl 0.3mol/L的LB培養基中，恆溫28℃，以110rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl 1.0mol/L)中，在恆溫37℃、110rpm的搖床中連續培養48h。
實施例4與實施例1類似，其區別在於將假單胞菌接種在含NaCl 0.1mol/L的培養基中，恆溫32℃，以100rpm的速度震蕩培養至指數生長中後期，約為16h。對從上述菌中提取出的高純度總DNA用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)37℃進行60min的不完全酶切。酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量約為5kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段。將回收的DNA片段與經相同限制性核酸內切酶酶切的線性載體共育，加入連接酶在16℃連接10h，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)。在含NaCl 0.1mol/L的LB培養基中，恆溫32℃，以100rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl 0.95mol/L)中，在恆溫37℃、100rpm的搖床中連續培養48h。
實施例5與實施例1類似，其區別在於將假單胞菌接種在含NaCl 0.9mol/L的培養基中，恆溫30℃，以150rpm的速度震蕩培養至指數生長中後期，約為24h。用限制性核酸內切酶E.coRI(或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶)對從上述菌中提取出的高純度總DNA在37℃進行100min的不完全酶切。酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量約為6kb的酶切片段區域，用鋒利的刀片切出含上述片段的凝膠，用凝膠回收試劑盒回收其中的DNA片段。將回收的DNA片段與經相同限制性核酸內切酶酶切的線性載體共育，加入連接酶在16℃連接24h，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌(大腸桿菌)。在含NaCl 0.9mol/L的LB培養基中，恆溫15℃，以150rpm的速度震蕩培養各個耐鹽轉化子。將各轉化子與對照(未經遺傳學處理的大腸桿菌)分別接種在高鹽液態LB培養基(含NaCl 0.9mol/L)中，在恆溫37℃、150rpm的搖床中連續培養48h。
實施例6將含上述重組質粒的轉化子在LB培養基(含Amp100mg/L)中於37℃培養至指數生長中期(OD600為0.5～0.6)，迅速轉至42℃誘導4～6h，離心收集菌體。提取轉化子的可溶性總蛋白，SDS-PAGE電泳(濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％)，考馬斯亮藍染色，檢測目的基因的蛋白表達產物，發現其分子量約為30kD，與預期相符(參見圖4)。
實施例7為了檢查重組質粒中的插入片段是正插還是反插，用限制性核酸內切酶SalI在37℃酶切重組質粒1.3h，65℃，25min結束酶切反應；經1.0％瓊脂糖凝膠電泳，發現只有第3泳道為正插，即產生2867bp和680bp兩條片段(參見圖5)；說明磷酸甘油磷酸酯酶基因已經正確插入該重組質粒中。
實施例8在提取外源片段正向插入的重組質粒用Eco RI和Pst I進行雙酶切，以獲取原有的克隆DNA片段。電泳結果顯示酶切後產生兩條帶(參見圖6)，分別為2.7kb載體帶和850bp插入帶，後者即為克隆基因。
實施例9用上述磷酸甘油磷酸酯酶基因與pBV220連接成的重組載體轉化感受態大腸桿菌ER2566，塗布在含Amp100mg/L的LB瓊脂培養基上；24～32h後隨機挑出若干個菌落進行培養，提取其中的質粒，以Eco RI和Pst I雙酶切或PCR擴增，1.0％瓊脂糖電泳，證明重組質粒中含有磷酸甘油磷酸酯酶基因(參見圖7)；實施例10將各轉化子與對照分別接種在含NaCl為1.0mol/L的高鹽液態LB培養基中，在恆溫37℃、100～150rpm的搖床中連續培養。此時對照僅能緩慢進行細胞分裂，而耐鹽轉化子則較快生長。每隔4～8h取樣檢測菌液的OD600值，並換算成含菌數，繪出轉化子與對照的生長曲線(參見圖8)，重複二次。結果表明，達到生長平衡期時(36～42h後)，轉化子的OD600值約為對照的3.7倍。可見磷酸甘油磷酸酯酶基因使轉化子具有較好的耐鹽能力。
實施例11分別取適量轉化子和對照接種於300mL LB培養基(含NaCl0.9～1.0mol/L，Amp 100mg/L)中37℃震蕩培養(100～150rpm)過夜，參照王劍峰等(2001)的方法測定細胞中的甘油含量(參見圖9)。實驗得知，轉化子的甘油含量為7.93ng/1.0×106cells，約是對照組的2.9倍。可見，轉化子中的外源磷酸甘油磷酸酯酶基因能促進甘油合成，導致轉化子中的甘油含量顯著升高，耐鹽性大大提高。
權利要求
1.假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因，其特徵在於其序列為1 atgacgaggagcctttcatgtcgcccaatccgcccctgcgcattctcgacggtatccgcc 6061 tggtcgcgttcgacctcgatggcacgctggtggattcggtccccgaccttggccgctgcc 120121 gtcgatgccgccctgcgttcgctgggactcgcgggcgtcgacgaagcgtcggtgcgcgac 180181 tgggtgggcaatgcgtcccgcaagctggtggagcgcgccctggaagcgctcgacgcgcaa 240241 gacacggacccggaggcggctcacgaggcgtttctgcatcattatcgcctggcgccttgt 300301 cgcgcgacgcgcctgtaccccggtgtgcgcgaggcgctcgaagggttgcgcgcacgcggt 360361 ctgacgctggtgctgatcaccaacaagccggcggcgttcatcgccccgatcctcgaaacg 420421 ctgggactgagcgactttttcgacctgacgctgggcggcgattcgctggcggcgaagaag 480481 ccagatccggcgcccttgctgcacgtggcatcccgtttcggggtgacgccgagcgtctgt 540541 ctgatggtgggggactcccggcatgacatcgaggccgggcggggtgccggattccgcacc 600601 ctggcggtgccctacg gctacaatcacggcgatccggtggcggcgagcgcgccggatgc 660661 catggttgaatcgctgggggaactcgtttagtgtttttcgatacttgcgtctataaaacc 720721 aagtttttgat aacgttctgctataacggacagcgttagatgattctgaatgccccctc 780781 gtcgcgtagagccctcgcgttgatgcgtga 810假單胞菌「磷酸甘油磷酸酯酶結構基因」總長810bp(鹼基對)，根據原核基因特徵判斷，前3個字符「atg」為該基因的起始符，根據三聯體密碼規則依次計算，最後3個字符「tga」為該基因的終止符。
2.假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因的克隆方法，其特徵在於其步驟如下1)、將假單胞菌在含NaCl 0.1～0.9mol/L的培養基中，溫度為15～33℃，以100～150rpm的速度震蕩培養至指數生長中後期；2)、用常規鹼變性法提取假單胞菌的總DNA，經紫外光譜檢測純度，其OD260/OD280比值應≥1.8；3)、在無菌條件下用限制性核酸內切酶或其它產生粘性末端的限制性核酸內切酶對所提取的假單胞菌的總DNA在37℃進行60～100分鐘的不完全酶切，酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下找到分子量為1～10kb的酶切片段區域，切出含上述該酶切片段的凝膠，回收其中的DNA片段；4)、在無菌條件下以E.co RI在人工構建的表達載體，如pUC18的多克隆位點，將其完全酶切成線性，去磷酸化處理，將回收的DNA片段與線性載體共育；加入T4DNA連接酶在16℃連接10～24h，形成重組質粒，轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌，所說的感受態受體菌優選大腸桿菌；5)、在無菌條件下，取100μL轉化溶液塗抹在高鹽LB瓊脂培養基上，37℃培養48～72h，挑取在培養基表面上長出的單菌落耐鹽轉化子，以劃線的方式接種在含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上，37℃培養48h，在含Amp-Xgal-IPTG培養基上出現的白色菌落即可初步判斷為耐鹽轉化子，所說的高鹽優選含NaCl 1.1mol/L的鹽；6)、提取至少10個中選耐鹽轉化子中的重組質粒，用E.coRI切出其中的插入片段，測序；7)、將已測知的插入片段序列與生物資料庫中的信息進行基因和蛋白質的同源性比較，初步判斷其中存在磷酸甘油磷酸酯酶基因，所說的生物資料庫優選美國生物資料庫。
3.如權利要求2所述的假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因的克隆方法，其特徵在於在步驟7)中所說的初步判斷其中存在磷酸甘油磷酸酯酶基因後，再進行以下步驟1)根據該基因兩端的序列設計一對引物，其中包括和下一步驟相同的限制性核酸內切酶識別位點，以原重組質粒為模板進行PCR擴增，引物的序列如下5`-AGAATTCATGACCCTTCCATCGATGACGAG-3`(劃橫線處為Eco RI的酶切位點)5`-ATCACCATCGCCAACGCTTGACGTC-3`PCR反應體系如下
PCR反應程序為95℃ 5min
72℃ 7min4℃ 保存2)、取出PCR反應液，經0.6％～1.0％瓊脂糖凝膠電泳後，用鋒利的刀片在紫外燈下切下擴增出的約800bp(鹼基對)的DNA帶，進行DNA回收；3)、將PCR回收產物與pMD18-T載體構建重組表達質粒，其反應體系為
將反應體系在16℃反應2～16h，形成重組質粒，全量連接液用CaCl2法轉化感受態大腸桿菌JM101，所說的全量連接液選用10μL，所說的感受態大腸桿菌JM101選用100～150μL；4)、將轉化液塗抹在含有Amp-X-gal-IPTG的LB培養皿上培養24～48h，挑選白色菌落，在含Amp的LB液體培養基中培養過夜，鹼裂解法提取其中重組質粒；5)、為了檢查重組質粒中的插入片段是正插還是反插，用限制性核酸內切酶Sal I在37℃酶切重組質粒1.0～1.5h，65℃，20～30min結束酶切反應；經1.0％瓊脂糖凝膠電泳，發現只有第3泳道為正插，即產生2867bp和680bp兩條片段；說明磷酸甘油磷酸酯酶基因已經正確插入該重組質粒中；6)、提取外源片段正向插入的重組質粒用Eco RI和Pst I進行雙酶切，以獲取原有的克隆DNA片段，電泳結果顯示酶切後產生兩條帶，分別為2.7kb載體帶和850bp插入帶，後者即為克隆基因；7)、為了確認磷酸甘油磷酸酯酶基因與生物的耐鹽功能密切相關，鹼法提取上述重組質粒及熱啟動高效表達載體pBV220，利用Eco RI和Pst I內切酶分別雙酶切上述兩種質粒；經1.0％瓊脂糖凝膠電泳後分別回收線性pBV220載體和磷酸甘油磷酸酯酶基因，用T4DNA連接酶在16℃連接，連接反應體系如下
8)、用上述磷酸甘油磷酸酯酶基因與pBV220連接成的重組載體轉化感受態大腸桿菌ER2566，塗布在含Amp100mg/L的LB瓊脂培養基上；24～32h後隨機挑出若干個菌落進行培養，提取其中的質粒，以Eco RI和Pst I雙酶切或PCR擴增，1.0％瓊脂糖電泳，證明重組質粒中含有磷酸甘油磷酸酯酶基因；9)、將含重組質粒的轉化子在LB培養基中於37℃培養至指數生長中期，迅速轉至42℃誘導4～6h，離心收集菌體，提取轉化子的可溶性總蛋白，SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，檢測目的基因的蛋白表達產物，發現其分子量約為30kD，與預期相符；10)、配製含NaCl濃度分別為1.0、1.1、1.2、1.3和1.4mol/L的LB固體培養基，分別將轉化子和對照接種在培養基表面，37℃培養48～60h，轉化子可在含NaCl高達1.3mol/L的LB培養基上生長，而對照組最高耐鹽能力不超過NaCl 1.1mol/L；11)、將各轉化子與對照分別接種在含NaCl為1.0mol/L的高鹽液態LB培養基中，在恆溫37℃、100～150rpm的搖床中連續培養。此時對照僅能緩慢進行細胞分裂，而耐鹽轉化子則較快生長，每隔4～8h取樣檢測菌液的OD600值，並換算成含菌數，繪出轉化子與對照的生長曲線，重複二次，結果表明，達到生長平衡期時，轉化子的OD600值約為對照的3.7倍。
4.如權利要求2所述的假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆方法，其特徵在於在步驟2)中，用常規鹼變性法提取假單胞菌的總DNA，經紫外光譜檢測純度，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的分子量是否≥21kb。若OD260/OD280比值≥1.8，說明所得DNA較純，進入下一步驟；若OD260/OD280比值＜1.8，說明所得DNA純度不夠，應進一步純化，直至OD260/OD280比值≥1.8。
5.如權利要求2所述的假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆方法，其特徵在於在步驟3)中採用凝膠回收試劑盒回收含酶切片段的凝膠中的DNA片段；酶切後的總DNA經含溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠的含量為1‰。
6.如權利要求2所述的假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆方法，其特徵在於在步驟4)中，將回收的DNA片段與線性載體共育，載體的量至少1倍於DNA片段；轉化用CaCl2處理獲得的感受態受體菌用大腸桿菌。
7.如權利要求2所述的假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆方法，其特徵在於在步驟5)中，在無菌條件下取100μL轉化子溶液用三角形無菌玻棒均勻塗抹在高鹽LB瓊脂培養基上，培養48～72h後，以無菌接種環沾取其中的單菌落按常規劃線法在含Amp-Xgal-IPTG的LB瓊脂培養基上劃線，37℃培養48h，經兩階段篩選，在含Amp-Xgal-IPTG培養基上出現的白色菌落即可初步判斷為耐鹽轉化子。
8.如權利要求2所述的假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆方法，其特徵在於在步驟7)中，所說的生物資料庫為GenBank。
9.如權利要求3所述的假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆方法，其特徵在於所說的對照為未經遺傳學處理的大腸桿菌，分別接種在含NaCl為0.9～1.0mol/L的高鹽液態LB培養基中，在恆溫37℃、100～150rpm的搖床中連續培養48～72h，每隔4～8h取樣檢測其中的含菌數。
全文摘要
假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因及其克隆方法，涉及一種基因克隆，提供一種假單胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶結構基因及其一種既快捷又經濟的克隆方法。基因總長810bp，前3個字符「atg」為起始符，最後3個字符「tga」為終止符。提取假單胞菌總DNA，用限制性核酸內切酶對總DNA不完全酶切，經電泳，找酶切片段區域，切出凝膠，回收DNA片段；以E.coRI在人工構建的表達載體，將回收的DNA片段與線性載體共育，形成重組質粒，取轉化溶液塗抹在高鹽LB瓊脂培養基上，挑取長出的單菌落耐鹽轉化子，接種在培養基上。出現的白色菌落即可初步判斷為耐鹽轉化子；重組質粒，用E.coRI切出其中的插入片段，測序；進行基因和蛋白質的同源性比較。
文檔編號C12N15/63GK1670209SQ200410091990
公開日2005年9月21日 申請日期2004年12月29日 優先權日2004年12月29日
發明者劉廣發, 張會永, 謝金鎮 申請人:廈門大學