產生抗寄生化合物的鏈黴菌屬菌株及其製備方法

2023-04-25 11:49:56

專利名稱：產生抗寄生化合物的鏈黴菌屬菌株及其製備方法
阿凡曼菌素類(avermectins)是具有抗寄生作用的有關試劑的一種複合物，已知可通過Streptomyces avermitilis菌株ATCC 31267、31271和31272需氧發酵而製備。如見美國專利US 4，310，519和4，429，042。上述後兩種菌株分別表示將S.avermitilis ATCC NO.31267經紫外線照射而獲得的冷凍小瓶和凍幹試管的培養物。
上述美國專利提到的S.avermitilis菌株可產生一組一般稱為C-076的物質(阿凡曼菌素類，以下稱式I)。該組物質包括8種不同的但十分相關的化合物，稱為阿凡曼菌素A1a、A1b、A2a、A2b、B1b、B2a、B2b。「a」系列化合物指25位取代基為(S)-仲丁基的天然阿凡曼菌素，「b」系列是25位取代基為異丙基的天然阿凡曼菌素。「A」和「B」分別指其中的5位取代基是甲氧基或羥基的阿凡曼菌素。數字「1」指22-23位存在雙鍵的阿凡曼菌素，數字「2」指的是其中在22位是氫而在23位上是羥基的阿凡曼菌素。
因此，阿凡曼菌素是式1的化合物
其中斷線表示單鍵或雙鍵;
R1是H或羥基，而當所述斷線是單鍵時只能存在羥基;
R2是異丙基或仲丁基;
R3是甲氧基或羥基。
已知其它的S.avermitilis菌株可產生一種或多種已知的或「天然的」avermectins，其中的25位取代基或者是異丙基或者是(S)-仲丁基(1-甲丙基)，或「非天然的」avermectins，其中25位取代基不是異丙基或(S)-仲丁基。例如，公開在US 4，378，353中的S.avermitilis ATCC 31780;公開在歐洲專利申請(EP)276131中的ATCC 53567和ATCC 53568;EP 276103中的ATCC 53692;以及EP214731中所述的NCIB 12121。然而，這些S.avermitilis菌株中的每一個均是S.avermitilis ATCC 31267菌株的直接或間接的子代。因此，能產生一種或多種阿凡曼菌素化合物的上述S.avermitilis菌株只包括親株及其子代。
另一種S.avermitilis菌株，ATCC 53814，公開在US 5，015，662中。該菌株可通過它具有生物轉化一系列milbemycin類型化合物的能力，而不能產生大量的阿凡曼菌素來識別。
本發明提供了一種新的產生阿凡曼菌素菌株，S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005。本發明還提供了使用S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005製備阿凡曼菌素的新方法。
本發明涉及微生物S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005的生物純培養物，或其產生阿凡曼菌素的突變體或變異體。
本發明還涉及製備一種或多種阿凡曼菌素的方法，該方法包括在浸沒需氧條件下，在含有碳、氮和無機鹽的可同化源的水液培養基中培育S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005，或其產生阿凡曼菌素的突變體或變異體，直至產生一種或多種阿凡曼菌素並收集。


圖1示出了S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005(A58267.2)和其他S.avermitilis種的樹狀圖。
圖2為從脂肪酸分析得出的表明A58267.2和S.avermitilis種之間相互關係的主要組分區。
本發明的一個方面是關於微生物S.avermitilis亞種黑色NRRL 21005(NRRL 21005菌株)的生物純培養物，或其產生阿凡曼菌素的突變體或變異體。
本發明的產生阿凡曼菌素的新的微生物為了方便也稱作培養物A58267.2。它是培養物A58267.21的改進的菌株，培養物A58267.21是培養物A58267的天然變異體。培養物A58267是從義大利收集的土壤試樣中分離出的。
按照布達佩斯條約，已將培養物A58267.2保藏，並已成為指定保藏號NRRL 21005的the Northern Regional Research Center，Agricultural Research Service，North Central Region，Unit-ed states Department of Agriculture，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604的原種培養物部分。任何這種專利申請授權的整個有效期限內，可保證保藏在Northern Regional Research Center(在Peoria，Illinois)的該培養物的穩定不變，而且公眾易於得到該培養物。在本申請待批期間內，在37℃.F.R§1.14和35 U.S.C.§112條款條件下可以得到該培養物。一旦該專利被批准，對公眾獲得培養物的所有限制則將最後被取消。
Frederrick P.Mertz(the Lilly Research Laboratories)進行了A52867.2(NRRL 21005)的分類學研究。基於這些研究，該新微生物被分類為該屬的新亞種(菌株)和S.avermitilis種，提議將它們命名為S.avermitilis黑色亞種。這種分類基於公開說明的類似物種的實驗室直接分類法和檢驗法。
使用方法使用由the International Streptomyces Prjeet(ISP)推薦的用於鑑定鏈黴菌屬種的方法來進行分類學研究[Shirling，E.B.and Gottlieb.D.，「鑑定鏈黴菌屬種的方法」，Int.J.Syst。Bacter-ial，16313-340(1966)]以及被推薦用於鑑定諾卡氏菌種的方法[Gordon R.E.，Barnett，D.A.，Handerhan，J.E.，and Pang，C.H.，「Nocardia Coeliaca，Nocardia antotrophica，and the Nocardin Strain」，Int，I.Syst.Bacteriol.，24(1)54-63(1974)]。
使用ISCC-NBS Centroid Color Charts，標準品No.2106(National Bureau of Standards，1958，U.S.Department of Commerce，Washington，D.C.)來命名顏色。
用光學顯微鏡和掃描電鏡(SEM)來進行形態學研究。
用Becker等人[「Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper Chromatography of Whole-Cell Hydroly sates」，Appl.Microbiol，12421-423(1964)]和Lecheraliver等人[A University Laboratory Approach，Dietz and Thayer(eds.)，Society for Industrial Microbiology，Special Publication NO.6，Arlington，Virginia，PP.227-233]的色譜法證實全細胞水解物中的二氨基庚二酸(DAP)和碳水化合物的異構體。
通過將抗生素敏感盤置於接種ISP NO.2瓊脂平板上而測量抗生素抗性。當觀察到不存在抑制作用區時，則抗性記作(+)，當觀察到存在抑制作用區時，則抗性記作(-)。
按照Kroppenstedt，R.M.[「Chemical Methods in Bacterial Systematics」，M.Goodfellow and D.E.Minnikin(eds)，PP.173-196(1985)]和Collins，M.D.[id.PP.267-285]的方法確定甲基萘醌類組合物。
用HP5898A Microbial Identification System(Miller，L.等人，「Bacterial Identification by Gas Chromatography ofWhole-Cell Fatty Acids」，Hewlett Packard Application Note228-41，PP8(1985)]方法進行脂肪酸分析。
脂肪酸甲酯由在相同條件下生長的凍幹的全細胞製得。
通過將NaCl加到ISP NO.2瓊脂中以達到所需濃度來測量NaCl耐性。
圖1中所示的樹狀圖是基於Euclidean距離，並且是由計算機作出的。
圖2所示的主要組分分析是二維的，也是由計算機作出的。
培養物特徵培養物A58267.2在多數培養基上不能很好地生長，並且在複合或限制培養基上不產生氣生菌絲。在Bennetts瓊脂上生長時除了產生特有的黑色色素外，反側的顏色是黃褐色。在ISP培養基2中產生淡亮褐色可溶顏料，在Bennetts瓊脂中產生帶淡紅褐色的可溶色素。表一表示了這些培養物的特徵。
表1 A58267.2[1]的培養物特徵培養基 生長 反側 氣生 氣生 可溶性狀況 顏色 生長 顏色 色素ISP培養基2 好 80.gy.yBr. 無 無 淡褐ISP培養基3 不好 78.d.yBr. 無 無 無ISP培養基4 一般 93.y.Gray 無 無 無ISP培養基5 無 無 無 無 無ATCC培養基172 無 78.d.yBr 無 無 無
Bennetts瓊脂 豐富 65.br.Blk 無 無 淡紅-褐蘋果酸鈣 不好 90.gy.Y. 無 無 無棉籽瓊脂 一般 91.d.gy.Y 無 無 無察氏(Czapeks) 無 無 無 無 無培養基葡糖-天冬醯胺 無 無 無 無 無甘油-甘氨酸 無 無 無 無 無腐殖酸瓊脂 無 無 無 無 無NPBM[2]豐富 78.d.yBr 無無 無營養瓊脂 不好 91.d.gy.Y 無 無 無澱粉酪蛋白瓊脂 一般 91.d.gy.Y 無 無 無蕃茄漿燕麥粉 無 無 無 無 無自來水瓊脂 無 無 無 無 無酵母-葡萄糖瓊脂 豐富 90.gy.Y. 無 無 淡紅-褐[1]在30℃培育18天。NPBM＝Nutrisoy粉5gm，花生粉5gm，黑舌葉糖蜜5gm，酒糟5gm，麥片5gm，甘油1gm，馬鈴薯糊精50gm，查貝克氏無機物混合物2ml，去離子水1升。
形態學特徵培養物A58267.2不產生氣生菌絲。因此，不必進行形態學和孢子表面的研究。沒有觀察到孢子囊、遊動細胞或鞏膜。培養物A58267.2在固體或液體培養基上生長期間內不分裂。
生理學特徵培養物A58267.2利用下述的碳水化合物與ISP培養基9一起作為基礎培養基D和L-阿拉伯糖、纖維二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、甘油、糖原、異-肌醇、菊粉、D-麥芽糖、D-甘露醇，D-甘露糖、蜜二糖、D-蜜三糖、L-鼠李糖、D-核糖、海藻糖、木糖醇和D-木糖。培養物A58267.2不能使用下述碳水化合物與ISP培養基9一起作為基礎培養基阿東糖醇、纖維素、糊精、半乳糖醇、乙醇、異-赤蘚糖醇、D-乳糖、松三糖、a-甲基-D-葡萄糖苷、水楊苷、山梨醇、L-山梨糖和蔗糖。
A58267.2分解腺嘌呤、蘋果酸鈣、酪蛋白、澱粉和脲。
A58267.2產生過氧化氫酶、H2S和液化的明膠，並在50℃下能存活8小時。A58267.2對NaCl的耐性高達6%。
A58267.2能水解尿囊素、彈性蛋白、七葉苷、鳥嘌呤、馬尿酸鹽、次黃嘌呤、睪酮、L-酪氨酸、或黃嘌呤。它不產生類黑素色素、還原硝酸鹽、或產生磷酸酶，並且在50mg/ml的濃度時對溶菌酶也不具有抗性。
培養物A58267.2對2μg(微克)林肯黴素、30μg萘啶酮酸、10單位青黴素G、300單位多粘菌素B、和5μg三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。A58267.2對10單位桿菌肽、30μg頭孢金素、30μg氯黴素、15μg紅黴素、10μg慶大黴素、30μg新黴素、30μg新生黴素、15μg夾竹桃黴素、5μg利福平、10μg鏈黴素、30μg四環素、10μg妥布黴素以及30μg萬古黴素敏感。
培養物A58267.2在15-37℃溫度範圍內生長。適宜的生長溫度為約30℃。
細胞壁分析親株A58267.21的細胞壁分析表明水解的全細胞含有LL-二氨基庚二酸(DAP)。存在於全細胞萃取物中的糖是葡萄糖和核糖。脂肪酸類型是2C，而主要的甲基萘醌類是MK-9(H6)。該檢測表明是鏈黴菌屬的典型細胞壁類型，並預期類似於A58267.2菌株。
菌株A58267.2的特性認為培養物A58267.2具有類型I細胞壁，NC型全糖結構，以及主要是MK-9(H6)的甲基萘醌類組成。A58267.2的這些化學分類學特性以及培養和形態學特徵支持了將該分離菌鑑定為鏈黴菌屬的觀點[見Lechevalier等人，「Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes，Int.J.Syst.Bacteriol.，20;435-443(1970)]。
儘管S.avermitilis的11個菌株已公開在ATCC「Catalogue of Bacteria and Bacteriophages」(18 th edition(1992))中，通過該文獻，S.avermitilis ATCC 31267已被鑑定為11個菌株中的10個直接或間接的親株。當ATCC 31267(A54508)不是直接親株時，則為第一代子代，ATCC 31272(A54508.3)，通常是直接親株。文獻中對ATCC 31267或31272的子代的描述說明該子代通常具有親株的特徵，但含有某些次要的區別特徵(見例如在EP 276131中對ATCC 53567和53568的分類學描述)。因此，選擇除一個已知的S.avermitilis菌株、ATCC 31267/A54508，以及一個其首次產生的子代(ATCC 31272/A54508.3)之外的全部的直接或間接親株作為與ATCC21005(A58267.2)菌株相比較的菌株。
在一種高確定性比較中，對A58267.2、A54508和A54508.3進行脂肪酸分析。表2表明了在每種菌株中測得的特性脂肪酸百分數比較結果。
表2 A58267.2與兩種S.avermitilis菌株的脂肪酸成分脂肪酸 A58267.2 A54508 A54508.314:0異(異豆蔻酸) 3.36 7.95 4.6715:0異 22.30 11.11 11.2415:0反異 19.29 21.41 22.9915:0(十五烷酸) 2.45 2.08 2.1716:1異H 4.23 4.68 1.9616:0異(異十六烷酸) 14.02 19.85 16.4316:1順9(棕櫚油酸) 3.93 3.31 2.8216:0(十六烷酸) 4.53 3.26 5.1417:1異下 7.57 6.07 6.2717:1反異C 3.42 3.56 3.0717:0異(I異十七烷酸) 5.51 5.12 7.8317:0反異 5.88 8.23 11.931.在28℃細胞於TSB(胰骯酶大豆肉湯)中生長4天。
圖1示出了計算機作出的由脂肪酸外形構成的樹狀圖。該樹狀圖表明了A58267.2與其他S.avermitilis菌株之間的相互關係，以Euclidean距離表示。相關度低於10.00的培養物被認為是同類，即同種。A58267.2以相關度高於10.00的水平與S.avermitilis相關。
主要組分的分析是多變量統計的部分，這涉及一系列變量間內在的相互關係。在這種分析中，在原始數據或試驗結果中最大的變量為主要的組分[Alderson，G.「The Application and Relevance of Nonhierarchic Methods in Bacterial Taxonomy」，in Comp-uterassisted Baeterial Systematics，Goodfellow，M.，et al.，(eds)，Academic Press，New York(1985)]。因此，可以繪製表示分布或變化的曲線。然後通過檢驗這些變量即可評價相互關係，這樣，一種微生物種群被鑑定。繪製了基於脂肪酸的兩維的主要組分曲線，它表明了培養物A58267.2及其親株A58267.21與其它S.aver-mitilis種之間的相互關係。這些數據示於圖2中。
在樹狀圖和主要組分曲線兩者中，形成了兩種不同的叢群。A58267.2和A58267.21形成一群，而A54580和A5458.3形成另一群。這兩個群非常類似，足以表明在該兩個群中的菌株是相關的，但也存在明顯的區別，表明無論從群或各個菌株都是不相同的。
A58267.2和A54840.3之間的差別的研究示於表3中。
表3 S.avermitilis菌株A58267.2和A54580.3之間的差別特徵 A58267.2 A54580.3氣生孢子的產物 - -在蘋果酸鈣瓊脂上生長 - +在Bennetts瓊脂上反側 黑色 褐色色素的產生在酵母葡萄糖瓊脂上可溶 + -
性色素的產生抗生素抗性:
林肯黴素 + -多粘菌素B + -在7%NaCl中生長 - +分解:
七葉苷 - +馬尿酸鹽 - +次黃嘌呤 - +黃嘌呤 - +溶菌酶抗性50μg/ml - +類黑素色素產生 - +硝酸鹽還原性 - +蜜三糖產生的酸產物 + -脂肪酸成分%:
15:0異 22.30 11.2415:0反異 19.29 22.9916:1異H 4.23 1.9616:0異 14.02 16.4317:0異 5.51 7.8317:0反異 5.88 11.93如前面所指出的，在S.avermitilis菌株A58267.2和A54508/A54508.3之間沒有足夠差別以將A58267.2確定為一單獨的種。但是，在這些菌株之間存在足夠的差別以將A58267.2確定為一種不同的和獨立的已知的S.avermitilis的亞種(菌株)。因此，將A58267.2確立為S.avermitilis的亞種，並分類為S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005。該亞種名稱「黑色」指在Bennetts瓊脂上所呈現的特殊顏色。
此外，本發明提供了製備一種或多種阿凡曼菌素的方法，該方法包括在浸沒的需氧條件下在含有碳、氨和無機鹽的可同化源的水液培養基中培育S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005，或其可產生阿凡曼菌素的突變體或變異體，直至產生一種或多種阿凡曼菌素，並收集。可使用現有技術中已知的各種分離和純化方法來收集所產生的阿凡曼菌素。
與其它微生物的情況相同，本發明中產生阿凡曼菌素的培養物，S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005的特徵也是易發生變化的。用現有技術中已知的方法可以得到該菌株的突變體，例如用各種物理的和化學的誘變劑如紫外線、X-射線、ㄚ-射線和化學物質如n-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍進行處理。用現有技術中已知的方法也可得到該菌株的天然的變異體，例如，篩選親株的培養物。保持產生阿凡曼菌素特徵的S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005的天然變異體和誘發突變體也是本發明的一部分。
用於生長本發明S.avermitilis培養物的培養基可以是眾多培養基中的任何一種。因此，例如，在大規模發酵中優選的碳水化合物源是葡萄糖、甘露糖以及特別是蕃茄糊精。但是，也可使用其他的碳水化合物，如核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露醇等。
優選的氮源是大豆粉，儘管酶或酸水解的酪蛋白、酵母、肝粉、肉腖、魚粉等也是有用的。
可以摻入培養基中的營養的無機鹽包括能提供鋅離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子、銨離子、鹽酸根離子、碳酸根離子、硫酸根離子、硝酸根離子等離子的常用的可溶性鹽。
在培養基中還應有生物生長和發育所必需的微量元素。這種微量元素通常以混雜物形式存在於培養基的其他組分中，其量足以滿足生物生長所需。如果出現起泡問題，需要時可在大規模發酵培養基中加入少量(如0.2gm/L)泡沫抑制劑，如分子量約2000的聚丙二醇。
培養基組分的優選濃度的例子示於下面的實施例1中。
製備大量的阿凡曼菌素，優選在罐中進行浸沒需氧發酵。少量的A58267.2培養物可通過搖瓶培養得到。因為在阿凡曼菌素製備過程中時間的延遲通常與在大罐中孢子形生物的接種有關，所以應優選地使用營養種菌。通過在少量的培養基上接種孢子形成物或菌絲體的片段可以製得營養種菌，得到新鮮的、有活性的該生長培養物。然後將該營養種菌轉移到較大容器中，開始阿凡曼菌素的製備階段。該營養種菌培養基可以與用於較大量發酵過程的相同，但其他的培養基也是適宜的。
本發明的製備中，由A58267.2生物製備阿凡曼菌素。在約15℃至37℃之間生長。製備阿凡曼菌素最佳的溫度是約29℃至31℃。
如同通常的浸沒需氧培養方法，從容器的底部通入無菌的空氣，而同時該培養基用通用的葉輪攪拌機攪拌。在該條件下發酵過程中最大的氧吸收量至此不會超過約0.16mM/L/分鐘。在一全部擋板的115升發酵罐中含有約107升的液體培養基，通氣速度和攪拌速度在容器內壓為5.0大氣壓下應足以保持溶解的氧至少為45%的空氣飽和度。
在發酵過程中，通過用各種方法(如HPLC)對液體培養基的試樣與已知標準品進行對照來進行阿凡曼菌素的製備。
在浸沒需氧發酵條件下製備之後，用發酵技術中已知的方法從該發酵培養基中收集阿凡曼菌素。通常，在A58267.2培養物或其產生阿凡曼菌素的突變體或異變體的發酵過程中產生的阿凡曼菌素存在於過濾的液體培養基和特別是存在於菌絲體物質中。因此，如果將avermectins直接餵給動物，則可將全部發酵液體培養基幹燥並與餵這種動物的食物摻在一起。
更為優選的是，將avermectins從全部發酵液體培養基中分離出來，分離的avermectin化合物的收集可用溶劑萃取並應用色譜來進行分級分離，這可使用各種色譜技術和溶劑體系。分離和收集阿凡曼菌素的技術在US 4，429，042，以及Miller，T.W.，等人的文章[Antimicrob，Agents Chemother.，15(3)368-371(1979)]中已有描述。優選的用於這種分離和收集的技術在下面實施例中說明。
製得並分離出的阿凡曼菌素特別適用於治療被寄生蟲感染的動物，並且特別適於用作驅腸蟲劑、殺蟲劑和殺蟎劑。這種抗寄生蟲的用途在動物保健領域中是公知的並且有文獻記載(見US 4，429，042和4，310，519)。
另外，ivermectin，一種已知的還原的avermectin Bla和Blb結合體的衍生物，可任選地用Chabula等人在US 4，199，569中所述方法製得，該專利作為參考而引入本文。
為了更完整地說明本發明的操作過程，提供了如下的實施例。但是，這些實施例在任何方面均不試圖並也不應解釋為限制本發明的範圍。
在下面實施例中，在氘化氯仿溶液中，阿凡曼菌素化合物A1a，A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b的13C核磁共振譜數據是由General Electric Model QE 300光譜儀(Fremont，CA)而得到的。每個樣品溶液的體積約為0.7ml。對於每種avermectin化合物相對氘化氯仿的化學位移以ppm給出(77 ppm)。用2ABII-SE分光計(VG Analgtical，Manchester，Engtand)得出FABMS數據。
實施例1A58267.2的發酵A、搖瓶使用保存在液氮中的培養物S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005接種於(0.5ml)具有下列成分的第一階段營養培養基營養培養基成分 含量(g/l)胰酶鮮酪蛋白大豆液體培養基 30.0酵母萃取物 3.0MgSO4.7H2O 2.0葡萄糖 5.0麥芽糖 4.0去離子水加至到50ml未調節的pH＝7.0;在滅菌處理後不調節pH;
滅菌處理後的pH＝6.9。
該接種的營養培養基在250ml廣口錐形瓶中於30℃培育約46小時，以250 rpm以2英寸(5.08cm)的圓周軌跡搖動。該瓶用兩張生物保護濾紙防護，該振蕩器的置放板(board)角度為0°。
B、A58267.2的罐發酵為了提供更大體積的種菌，將上面A節中所製得的10ml已接種的第一階段培養基用於接種與第一階段培養基具有相同組成的400ml第二階段營養培養基。該第二階段培養基在2L廣口錐形瓶中於30℃培育約48小時，以250 rpm以2英寸(約5.08cm)的圓周軌跡搖動。該瓶也用兩張生物保護濾紙防護，該振蕩器的置放極角度為0°。
將該第二階段營養培養基(400ml)用於接種具有下面組成的107L無菌製備培養基製備培養基成分 含量(/L)大豆粉 5.0g蕃茄糊精 80.0g嫩燕麥粉 5.0g廢糖蜜 5.0gCaCO32.0g甘油 1.0mlCzapek′s Mineral Stock 2.0ml去離子水加到107L。
未調節的pH＝6.5，約用30 ml 5N NaOH將pH調到7.3，滅菌後PH＝7.0。
加入抑泡劑SAG 471，濃度為0.2mg/l(Union Carbide Sistersville，West Virginia)。
在30℃溫度下將制種的製備培養基在115L無菌發酵罐中發酵10天和11天之間。保持溶解的氧量為約45%空氣飽和度，在攪拌的容器中攪拌速度是低的(約137～約255rpm)。
實施例2阿凡曼菌素的一般分離用5N HCl將115L按類似實施例1所述方法製得的全部發酵液體培養基調至pH6.5。將等體積的甲醇加到該溶液中，並經過Membr-alox陶瓷過濾器(U.S.Filter/SCT，Bazet，France)過濾該溶液。然後將濾液經過含10 L HP-20SS(Diaion)的柱(Mitsubishi Chemical Industries Ltd，Tokyo，Japan)。接著用線性梯度的50～100%甲醇水溶液洗脫該柱。用含Dynamax C18的4.6mm(直徑)×30cm的柱子(Rainin Company，Woburn，MA)通過HPLC來分析搜集的洗脫液。用常液梯度的MeOH∶CH3CN∶(0.2% HOAC，用NaOH調至pH 5.0)(44∶44∶12)洗脫該柱，流速為1.5ml/分鐘。基於該HPLC分析將洗液合成兩份。在減壓下將每份濃縮至約500ml。用CHCl3將每份萃取，將萃取物蒸發，產出18.25g的油(份A)和6.48g的油(份B)。
實施例3份A的處理將由實施例2得到的份A(18.25g)溶於45ml甲醇中，並在5cm(直徑)×1.1m的含Sephadex LH-20的柱上(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)色譜分離。用甲醇洗脫該柱並用HPLC分析洗脫液。將含有阿凡曼菌素的那些洗脫液合併成兩份並蒸發則產出份C(10.96g)和份D(1.45g)。
實施例4份C的處理將份C(由實施例3得出，2g)物質溶於4.5ml甲醇中並用41.4mm(直徑)×25cm的含有Dynamax-60AC18的柱(Rainin，Woburn，Massachusetts)作色譜分離。在100分鐘內，用線性梯度的CH3CN∶MeOH∶H2O(40∶40∶20至46∶46∶8)洗脫該柱，流速為15ml/分。基於HPLC製得4份份E(489 mg)，份F(624 mg)，份G(656 mg)，以及份H(177 mg)。
實施例5阿凡曼菌素Ala的分離將由實施例2得到的份B溶於30ml甲醇中並如實施例3中所述進行色譜分離。用甲醇洗脫該柱並用HPLC分析該洗脫液。將含有阿凡曼菌素的那些洗脫液合併，蒸發得殘餘物(658 mg)。將殘餘物的一部分(200 mg)作色譜分析，用2.5cm(直徑)×30cm的含Chromegabond MC18的柱(ES Industries，Berlin，New Jersey)，使用梯度的CH3CN∶MeOH∶H2O(40∶40∶20～42∶40∶16)以5ml/分流速洗脫90分鐘以上。該方法得出63mg的阿凡曼菌素Ala。MS∶FAB m/z＝909[AverAla+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ11.96，12.88，15.03，16.30，17.62，18.32，19.82，20.18，27.44，30.50，34.18，34.43，35.13，36.52，39.66，40.41，45.61，56.32，56.41，57.69，67.18，68.07，68.15，68.32，74.83，76.01，76.89，77.41，78.15，80.43，80.50，81.92，118.25，118.31，119.58，124.79，135.10，135.98，136.08，137.58，139.85，173.81，94.88，98.44，68.33，127.74.
實施例6阿凡曼菌素A2a和B1b的分離將由實施例4得到的份F物質溶於2.5ml甲醇中並用實施例4中所述的柱色譜分離。使用MeOH∶H2O(85∶15)常液以15ml/分流速洗脫該柱，得出純的阿凡曼菌素A2a。
MSFAB m/z＝927[AverA2a+Na]+;13CNMR(75 MHz，CDCl3)δ173.4，139.83，137.48，135.79，135.60，124.80，119.65，118.43，117.47，99.56，98.41，94.78，81.67，80.50，80.36，79.24，78.15，77.50，76.80，75.90，70.67，69.79，68.25，68.12，68.06，67.55，67.18，57.60，56.38，45.54，41.06，40.70，39.62，36.27，35.61，35.04，34.41，34.26，34.07，27.18，20.20，19.86，18.31，17.65，15.06，13.72，12.37，11.75;and avermectin Blb(79mg)MSFAB m/z＝881［AverBlb+Na]；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ173.56，139.54，137.95，137.80，135.97，135.07，127.72，124.70，120.31，118.28，118.00，98.43，95.63，94.88，81.83，80.38，80.32，79.32，79.22，78.22，77.26，75.96，68.32，68.28，68.24，68.10，67.67，67.21，56.46，56.36，45.66，40.45，39.72，36.63，34.52，34.22，30.88，28.31，21.03，20.18，19.88，18.37，17.68，16.51，15.08，14.86.
實施例7阿凡曼菌素A1b和B1a的分離將由實施例4中得到的份G物質溶於3ml CH3CN中並用含Chromegabond C18的2.5cm(直徑)×30cm的柱(ES Industries，Berlin，New Jersey)作色譜分離，以5ml/分鐘流速在三個分離的中用線性梯度的CH3CN∶H2O(73∶27至80∶20)洗脫100分鐘以上，則得出純的阿凡曼菌素。
MSFAB m/z＝895［AverA1b+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.39，139.61，137.35，135.60，134.87，127.58，119.45，118.29，118.07，98.22，94.41，94.69，81.68，80.29，80.22，79.10，77.99，77.28，77.00，76.65，75.73，68.08，68.05，67.91，66.98，57.43，56.21，56.18，45.39，40.24，39.45，36.36，34.30，34.05，30.65，28.09，20.82，20.03，19.66，18.15，17.48，16.31，14.87，14.64，124.63;and avermectin Bla(245mg)MSFAB m/z＝895[AverBla+Na]；13c NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.40，139.53，137.84，137.70，136.08，135.08，127.74，124.69，120.23，118.23，117.94，98.42，95.69，94.87，81.69，80.23，80.15，79.13，78.05，75.69，74.61，68.12，68.03，67.93，67.46，67.01，56.26，56.17，45.43，40.28，39.51，36.33，34.93，34.23，34.05，30.32，27.25，19.99，19.66，18.14，17.50，16.15，14.85，12.74，11.81.
實施例8阿凡曼菌素A2b、B2a和B2B的分離將由實施例4得到的份E物質溶1.9ml CH3CN中並在實施例7中所述的柱上進行色譜分離。在100分鐘內以5ml/分的流速用線性梯度的CH3CN∶H2O(65∶35至75∶25)洗脫該柱兩次，則得出純阿凡曼菌素MSFAB m/z＝913[AverA2b+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.60，139.83，137.47，135.92，135.54，124.75，119.52，118.21，117.44，99.53，98.37，94.69，81.53，80.43，80.30，79.21，78.10，77.34，76.81，75.92，72.24，69.75，68.24，68.10，68.05，67.45，67.14，57.65，56.38，56.31，45.52，40.99，40.63，39.60，36.37，35.95，34.47，34.14，27.86，20.68，20.16，19.80，18.29，17.59，15.05，13.85，13.55;avermectic B2a(125mg);MSFAB m/z＝913[AverB2a+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.63，139.68，138.01，135.62，～135，124.72，120.34，117.92，117.54，99.63，98.47，94.77，81.55，80.35，79.31，79.08，78.17，76.07，72.35，69.86，68.43，68.32，68.10，67.68，67.51，67.25，～56.3，～56.3，45.67，41.11，40.72，39.75，36.55，36.07，34.57，34.24，34.17，34.17，27.96，20.80，20.21，19.97，18.41，17.68，15.17，13.95，13.67;and avermectin B2b(145mg);MSFAB M/Z＝899[AverB2b+Na]+;13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ173.09，139.44，137.65，137.57，135.44，124.50，120.90，117.76，117.34，99.41，98.26，94.63，81.47，80.19，79.20，79.10，78.04，75.72，70.57，69.66，68.10，68.03，67.97，67.45，67.36，67.05，56.28，56.24，45.45，40.57，39.52，36.17，35.46，34.90，34.26, 34.09，33.91，27.04，20.00，19.69，18.16，17.51，14.91，13.56，12.33，11.59.
權利要求
1.一種生物純的微生物Streptomyces avermitilis黑色亞種NRRL 21005培養物，或者其產生阿凡曼菌素的突變體或變異體。
2.權利要求1的培養物是Streptomyces avermitilis黑色亞種NRRL 21005。
3.一種製備至少一種阿凡曼菌素化合物的方法，該方法包括在浸沒需氧條件下，在含有碳、氮和無機鹽的可同化源的水液培養基中培育S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005，或其產生阿凡曼菌素的突變體或變異體，直至產生至少一種阿凡曼菌素化合物。
4.權利要求3的方法，其中所述的阿凡曼菌素化合物選自A1a、A1b、A2a、A2b、B1b、B2a和B2b。
5.權利要求3的方法，其中使用S.avermitilis黑色亞種NRRL 21005。
6.權利要求3的方法，它還包括另一個從所述培養基中收集所述的一種或多種阿凡曼菌素的步驟。
7.一種製備ivermectin的方法，該方法包括在浸沒需氧條件下，在含有碳、氮和無機鹽的可同化源的水液培養基中培育S.avermit-ilis黑色亞種NRRL 21005，或其產生阿凡曼菌素的突變體或變異體，直至阿凡曼菌素化合物B1a和B1b產生，並還原所述的B1a和B1b化合物。
全文摘要
提供了一種新的微生物，Streptomycesavermitilis黑色亞種NRRL 21005，以及使用該微生物製備已知的阿凡曼菌素和ivermectin的方法。
文檔編號A61K31/7048GK1088983SQ9311529
公開日1994年7月6日 申請日期1993年11月26日 優先權日1992年11月30日
發明者羅塞尼·邦茹克廉, 小奧迪斯·韋伯斯特·戈福雷, 蒂姆·阿蘭·斯密卡, 雷蒙德·姚 申請人:伊萊利利公司