由淋巴細胞產生多譜系潛能細胞的方法與流程

2023-04-25 20:51:24

本發明一般地涉及產生表現多譜系潛能(multilineage potential)的細胞的方法以及由此產生的細胞。更特別地，本發明涉及由CD4+單個核細胞、CD8+單個核細胞、CD25+單個核細胞、CD19+單個核細胞或CD20+單個核細胞產生哺乳動物幹細胞的體外方法，以及由此產生的細胞。該發現現在促進了用於可靠和有效地產生用於多種臨床和研究環境的多譜系潛能細胞(例如幹細胞)群的手段(means)的設計。這些用途尤其包括本發明多譜系潛能細胞的體外或體內定向分化以及通過施用本發明的多譜系潛能細胞或者由其得到的更加完全分化的細胞群來治療性或預防性治療一系列病症。還促進了基於體外的篩選系統的設計，所述系統用於測試這些細胞可能暴露的潛在治療或培養方案的治療效果和/或毒性。

背景技術：

在本說明書中由作者引用的出版物的書目細節在說明書結尾處按字母順序收錄。

本說明書中對任何現有出版物(或從其得到的信息)或任何已知事物的引用不是並且不應被視為承認或認可或以任何形式暗示該現有出版物(或從其得到的信息)或已知事物形成了本說明書涉及的領域中的公知常識的一部分。

在鑑定、分離和產生哺乳動物幹細胞和祖細胞方面存在相當大的興趣。提及的「幹細胞」和「祖細胞」通常理解為包括多種細胞類型，包括能夠產生任何細胞類型(包括生殖細胞)的全能細胞(totipotent cell)和能夠產生更有限種類的成熟細胞譜系的多潛能前體細胞(pluripotent precursor cell)。一些前體細胞類型仍然更加分化，並且對應於能夠產生特定細胞譜系細胞的前體。這些能力充當了器官和組織完全發育所必需的所有細胞分化和特化的基礎。

對於體外再現該發育途徑中選定方面，已經非常關注幹細胞的分離和培養。例如，可以通過培養囊胚內細胞團衍生細胞並且頻繁重複分離和傳代培養來建立胚胎幹細胞。在適當的條件下，可以維持體外培養，同時維持幹細胞的正常核型和全能性(totipotency)。在促進幹細胞沿著特定譜系分化方面也取得了顯著進展。雖然已經從人中分離出了ES細胞，但是其在研究和治療中的應用受到倫理考慮的阻礙。

成體組織也含有幹細胞群，其可以自我複製並產生經歷不可逆的終末分化的子細胞(Science，287，1442-1446，2000)。表徵得最好的是造血幹細胞及其後代，但是在大多數組織中鑑定到了幹細胞，包括間充質細胞、神經元和造血細胞(Science，284，143-147，1999；Science，287，1433-1438，2000；J.Hepatol.，29，676-682，1998)。間充質幹細胞被鑑定為骨髓中的粘附成纖維細胞樣細胞，其具有成為間充質組織(包括骨、軟骨、脂肪、肌肉和骨髓基質)的分化潛能(Science，284，143-147，1999)。間充質祖細胞具有與間充質幹細胞相似的形態學和表型特徵和分化潛能，並且已被報導為以極低頻率存在於臍帶血(Br.J.Haematol.，109，235-242，2000)、胎兒(Blood，98，2396-2402，2001)和成人外周血(Arthritis Res.，2，477-488，2000)中。

為此，分化總被認為是採取通過許多基因調節的幹細胞的線性進展形式，以最終獲得終末分化的體細胞的表型，所述體細胞的功能被明確限定並且其壽命受限。這樣的細胞的實例包括紅細胞、破骨細胞、胰島細胞和血小板。認為幹細胞分裂、自我更新並產生子細胞以定型(commitment)為特定的體細胞譜系(不對稱分裂)。還認為在適當的環境條件下，幹細胞可以對稱分裂以產生幹細胞庫的倍增。

然而，事實上，幹細胞的有效和可靠的分離、維持和特別是擴增仍然是難以捉摸的。因此，仍然需要開發有效和可重複地促進幹細胞的分離、維持和分化的新手段。

在本發明之前的工作中，已經確定幹細胞擴增並不必然需要憑藉不對稱幹細胞分裂而發生，來提供幹細胞更新和相關子細胞沿著特定譜系直至終末分化的線性分化。相反，可以通過成熟細胞轉變回具有多譜系潛能的細胞來實現擴增。該發現現已促進了用於可靠和有效地產生表現出多譜系潛能的細胞的手段的開發，從而提供有價值的機制，通過所述機制，可以製備可用於臨床和研究用途的幹細胞群和/或從其分化的體細胞。

技術實現要素：

在本說明書和所附權利要求書中，除非上下文另有要求，否則詞語「包括」及變化形式如「包含」和「含有」將被理解為暗示包括所述整體或步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其他整體或步驟或者整體或步驟的組。

如本文所使用的，術語「衍生自」應當被認為是指特定整體或整體的組來源於指定物種，但不一定直接從指定來源獲得。此外，如本文所使用的，未用數量詞限定的名詞包括複數指示物，除非上下文另外明確指出。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。

本發明的一個方面涉及產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞(mononuclear cell)懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的淋巴細胞懸液，所述淋巴細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單核細胞(monocytes cell)轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的外周血衍生單核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞，所述多譜系潛能細胞表現造血和/或間充質潛能。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-20％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一方面，提供了產生人多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的人外周血單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在本發明的另一方面，提供了促進哺乳動物MLPC衍生細胞的產生的方法，所述方法包括：

(i)建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(a)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(b)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(c)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為MLPC；以及任選地

(ii)使步驟(i)的MLPC與刺激接觸以引導所述MLPC分化為MLPC衍生表型。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一個方面，提供了促進哺乳動物MLPC衍生細胞的產生的方法，所述方法包括：

(i)建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(a)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19和CD20；

(b)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(c)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為MLPC；以及任選地

(ii)使步驟(i)的MLPC與刺激接觸以引導所述MLPC分化為造血或間充質表型。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

本發明的另一個方面涉及治療性和/或預防性治療哺乳動物中的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效數目的已根據本發明的方法產生的MLPC或者部分或完全分化的MLPC衍生細胞。

在另一方面，提供了治療性和/或預防性治療哺乳動物中特徵是造血或間充質功能(functioning)異常的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用：

(i)有效數目的已根據本發明的方法產生的造血幹細胞或者部分或完全分化的造血幹細胞衍生細胞；或

(ii)有效數目的已根據本發明的方法產生的間充質幹細胞或者部分或完全分化的間充質幹細胞衍生細胞。

本發明的另一方面涉及MLPC或MLPC衍生細胞群在製備用於在哺乳動物中治療病症之藥物中的用途，所述細胞已根據本發明的方法產生。

本發明的另一方面涉及MLPC或MLPC衍生細胞以及已根據本發明的方法產生的MLPC或MLPC衍生細胞。

附圖說明

圖1是在培養後第1天(A)和第4天(B)的CD4+PBMC的形態的照片表示。

圖2是在培養後第1天(A)和第4天(B)的CD8+PBMC的形態的照片表示。

圖3是在培養後第1天(A)和第4天(B)的CD19+PBMC的形態的照片表示。

圖4是在培養後第1天(A)和第4天(B)的CD25+PBMC的形態的照片表示。

圖5是在培養後第1天(A)和第4天(B)的CD20+PBMC的形態的照片表示。

圖6是CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+淋巴細胞中(A)巢蛋白、GATA結合因子-4(GATA-4)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(B)窖蛋白的蛋白質表達的照片表示。

圖7是CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+淋巴細胞中(A)肌動蛋白(對照)、突觸泡蛋白(SYP)和神經生成素3(B)β烯醇化酶(ENO-3)、顆粒酶B(GZMB)和神經生長因子(NGF)的蛋白質表達的照片表示。

具體實施方式

本發明部分地基於對以下內容的確定：成體幹細胞的擴增並不必然基於不對稱幹細胞分裂的發生以實現幹細胞更新和沿著特定體細胞譜系的分化兩者。特別地，多能幹細胞可以來源於T淋巴細胞，其被誘導轉變成多譜系潛能狀態，隨後在適當的刺激下進行對稱分裂和分化。這一發現非常重要，因為本領域的一大難題就是還未找到在體外有效誘導幹細胞更新和擴增的方法。因此，本發明提供了用於常規在體外產生哺乳動物幹細胞的手段，其基於誘導成熟哺乳動物細胞去分化為表現出多譜系潛能的幹細胞表型。因此，這些發現的體內和體外應用的潛力極其廣泛，包括但不限於幹細胞群的體外產生、本發明幹細胞的體外或體內定向分化、基於其的治療性或預防性治療方案以及對本發明的細胞可能暴露的潛在治療或培養方案的有效性和/或毒性的體外評估。

因此，本發明的一個方面涉及產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為70％v/v或其功能等同比例。

提及的「單個核細胞(mononuclear cell)」應理解為是指具有單個核的細胞。在白細胞的情況下，這主要描述單核細胞(monocytes)和淋巴細胞。本發明涉及對於以下內容的確定：當根據本發明的方法培養時，表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20的單個核細胞可以被誘導轉變為多譜系潛能狀態。提及的表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20的細胞應理解為是指表達CD4和CD8抗原之一或兩者或表達CD25或CD19或CD20的單個核細胞。這些細胞表面分子的表達可以是瞬時的(例如在T細胞分化期間胸腺細胞上的CD4和CD8的雙陽性表達)或者是持續的。然而，應當理解，不管CD4/CD8表達是瞬時的還是持續的，本發明的方法涉及使用在初始培養時表達CD4和/或CD8的細胞。相應的含義應當理解為適用於表達CD25或CD19或CD20的細胞。也就是說，提及了在瞬時或持續基礎上表達CD25或CD19或CD20的單個核細胞，只要在初始培養時這些細胞表達這些細胞表面標誌物之一即可。

不將本發明限於任何一種理論或作用模式，CD4是存在於T輔助細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的表面上的糖蛋白。其為免疫球蛋白超家族的成員，並且包含四個免疫球蛋白結構域D1至D4。CD4也被另稱為leu-3和T4。CD8主要在細胞毒T細胞的表面上表達，但也可在自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞、皮質胸腺細胞和樹突狀細胞上發現。CD8採取由一對CD8鏈組成的二聚體形式，最常見的是CD8-α和CD8-β鏈。這兩個鏈也都是免疫球蛋白超家族的成員。儘管CD8最常見表達為異二聚體，但在一些細胞上也表達同二聚體，例如CD8-α同二聚體。CD25是IL-2受體的α鏈。其為存在於活化T細胞、活化B細胞、一些胸腺細胞、骨髓前體和少突細胞上的I型跨膜蛋白，與CD122締合以形成可以作為IL-2的高親和力受體的異二聚體。儘管CD25已經被用作鑑定調節性T細胞的標誌物，但已經發現人中的一部分靜息記憶T細胞組成型地表達CD25。CD19基因編碼與B淋巴細胞的抗原受體組裝的細胞表面分子，以降低抗原受體依賴性刺激的閾值。其在濾泡樹突狀細胞和B細胞上表達。事實上，其存在於從發育期間的最早可識別的B譜系細胞到B細胞母細胞(B-cell blast)的B細胞上。然而，其在熟化為漿細胞時喪失。其主要作為B細胞共受體與CD21和CD81結合。激活後，CD19的胞質尾部變為磷酸化，這導致被Src家族激酶結合併募集PK-3激酶。不將本發明限於任何一種理論或作用模式，CD20是在所有B細胞(起始於前B階段並且濃度逐漸增加直至熟化)的表面上表達的活化糖基化磷蛋白。

因此，在一個實施方案中，所述CD4+和/或CD8+單個核細胞是胸腺細胞、T細胞、自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞。

在另一個實施方案中，所述CD25+細胞是調節性T細胞或記憶T細胞。

在另一個實施方案中，所述CD19+細胞是任何分化階段的B細胞。

為此，提及的「CD4」、「CD8」、「CD25」、「CD19」和「CD20」應理解為是指CD4、CD8、CD25、CD19和CD20的所有形式以及這些分子的功能突變體或多態形式(polymorphic form)，包括可能源自這些分子的mRNA的選擇性剪接的異構形式(isomeric form)。提及的「CD4」、「CD8」、「CD25」、「CD19」和「CD20」也應理解為包括提及這些分子的所有形式，包括可在細胞表面上表達的所有前體、原蛋白或中間體形式。還應當理解為延伸至任何CD4、CD8、CD25、CD19或CD20細胞表面分子，無論是作為二聚體、多聚體還是融合蛋白存在。

如本文所詳述的，CD4、CD8、CD25、CD19和CD20分子主要在淋巴細胞和NK細胞上廣泛表達。提及的「淋巴細胞」應理解為是指任何淋巴細胞或NK細胞，不管其分化的發育階段或相關CD分子的表達水平如何。

不將本發明限於任何一種理論或作用模式，胸腺細胞是存在於胸腺中的造血祖細胞。它們基於細胞表面標誌物的表達被分為多個不同的熟化階段。最早的胸腺細胞階段是「雙陰性」階段(即CD4和CD8兩者均陰性)，其也被描述為譜系陰性並且可以分為四個亞階段。下一個主要階段是「雙陽性」階段(即CD4和CD8兩者均陽性)。熟化的最後階段是單陽性階段(CD8或CD8陽性)。

胸腺細胞來源於骨髓造血祖細胞。在進入胸腺後，祖細胞增殖以產生早期淋巴樣祖細胞群。該步驟之後是產生從皮質-髓質連接處向胸腺囊遷移的CD4-/CD8-胸腺細胞。除增殖以外，CD4-/CD8-胸腺細胞群內還發生分化和T譜系定型。在這個階段還發生可選譜系潛能(例如髓樣、B和NK譜系潛能)的定型或喪失。在T譜系定型之後，胸腺細胞經歷β-選擇。[6]T細胞識別外來抗原的能力由T細胞受體介導，其為能夠識別由MHC呈遞的短蛋白肽的表面蛋白。

與大多數基因(其在表達它們的每個細胞中具有穩定序列)不同，T細胞受體由一系列可選基因片段(alternative gene fragment)構成。為了產生功能性T細胞受體，雙陰性胸腺細胞經歷TCR基因重排。TCR重排發生於兩個步驟中。首先，TCRβ鏈在T細胞發育的CD4-/CD8-階段重排。TCRβ鏈與前Tα配對以產生前TCR。重排過程中的細胞缺點在於許多T細胞受體基因片段的組合是非功能性的。為了消除已經產生非功能性T細胞受體的胸腺細胞，只允許已經成功重排β鏈以產生功能性前TCR的細胞發育超過CD4-/CD8-階段。不能產生功能性前TCR的細胞通過細胞凋亡消除。

在β選擇後，胸腺細胞分化為CD4+CD8+雙陽性細胞，其然後經歷TCRα重排，得到完全組裝的TCR。然而，這些T細胞受體中的許多由於不能結合MHC而仍然是非功能性的。因此，胸腺細胞發育的下一個主要階段是陽性選擇，其中只保留表達能夠結合MHC的T細胞受體的那些胸腺細胞。

然後，陽性選擇的雙陽性胸腺細胞經歷譜系定型，熟化為CD8+T細胞或CD4+T細胞。此後發生陰性選擇以消除自身反應性胸腺細胞。一旦熟化過程完成，T細胞離開胸腺並進入外周血流。

關於調節性T細胞，它們是通過其與胸腺內細胞的相互作用在雙陽性階段而被選擇的，其起始Foxp3的轉錄以成為Treg細胞，但是其可能直到單陽性階段才開始表達Foxp3，那時它們才是功能性Treg。Treg不表現出NKT或γδT細胞的受限TCR表達，而表現出比效應T細胞更大的TCR多樣性，偏向於自身肽。Treg選擇的過程由與自身肽MHC複合物相互作用的親和力決定。成為Treg的選擇作用是「Goldilocks」過程。具體地，接收非常強信號的T細胞將經歷凋亡性死亡，而接收弱信號的細胞將存活並被選擇成為效應細胞。如果T細胞接收中等信號，則其將成為調節性細胞。由於T細胞活化過程的隨機性質，具有給定TCR的所有T細胞群將最終成為Teff和Treg的混合物，相對比例由T細胞對自身肽-MHC的親和力決定。

自然殺傷(NK)細胞是T細胞的異質群，其共有T細胞和自然殺傷(NK)細胞的性質。這些細胞中的許多識別非多態性CD1d分子，其為結合自身和外來脂質和糖脂的抗原呈遞分子。它們只佔全部外周血T細胞的約0.1％。NK細胞共表達αβ T細胞受體(TCR)，但也表達通常與NK細胞締合的多種分子標誌物，如NK1.1。了解得最清楚的NK細胞與常規αβ T細胞的區別在於其TCR的多樣性受限更多(『不變』或『1型』NK)。它們和其他CD1d限制的T細胞(『2型』NK)識別由CD1d分子(抗原呈遞分子CD1家族的成員)呈遞的脂質和糖脂，而不是肽-MHC複合物呈遞的脂質和糖脂。因此，已知NK細胞對於識別來自生物體(例如引起結核病的分枝桿菌)的糖脂很重要。

B細胞發育經歷幾個階段，每個階段代表了抗體基因座中的基因組含量的變化。抗體由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈構成，並且規定它們的基因存在於『V』(可變)區和『C』(恆定)區。重鏈的『V』區有V、D和J三個區段，其在被稱為VDJ重組的過程中隨機重組以在每個單獨B細胞中的免疫球蛋白中產生獨特的可變結構域。輕鏈『V』區發生類似的重排，只是僅涉及兩個區段V和J。下表描述了B細胞發育的不同階段的免疫球蛋白形成過程。

當B細胞在熟化過程中的任何步驟中失敗，它將通過克隆缺失死亡。B細胞在骨髓中持續產生。像T細胞一樣，未成熟B細胞在離開骨髓前要通過免疫系統測試自身反應性。在骨髓中產生中樞耐受性。B細胞受體與自身抗原結合太強烈的未成熟B細胞將不被允許熟化。如果發現B細胞對自身具有高反應性，可發生三種機制。

·克隆缺失：通常通過凋亡除去有特定的自身抗原特異性的B細胞。

·受體編輯：給予自身反應性B細胞的受體重排其構象的機會。該過程通過重組活化基因(Recombination activating gene)的持續表達發生。通過RAG的幫助，受體編輯涉及B細胞受體的輕鏈基因重排。如果受體編輯未能產生自體反應較小的受體，將會發生凋亡。

·無變應性(Anergy)：當與小的可溶性的弱交聯自身抗原結合時，B細胞進入永久無響應的狀態。

B細胞類型包括：

·血漿B細胞(也稱為漿細胞(plasma cell或plasmocyte)和效應B細胞)是已經暴露於抗原並且產生和分泌大量抗體的大B細胞。這些細胞是壽命短暫的細胞，當誘導免疫應答的刺激劑消除時，其經歷凋亡。這是由於停止了持續暴露於存活所需的各種集落刺激因子而發生的。

·記憶B細胞由對初次免疫應答期間遇到的抗原具有特異性的活化B細胞形成。這些細胞能夠存活很長時間並且能夠在第二次暴露於相同抗原後快速響應。

·B-1細胞表達比IgG更大量的IgM，並且其受體表現出多特異性，意味著其對許多不同抗原具有低親和力。多特異性免疫球蛋白通常表現出對於其他免疫球蛋白、自身抗原和常見細菌多糖的偏好。

·B2細胞

·邊緣區B細胞

·濾泡B細胞

·調節性B細胞是參與免疫調節的B細胞。Breg的子集存在於B-1和B-2細胞群兩者中。兩個描述得最詳細的表型是人中的B10(CD5+CD1d+)子集和CD24+CD38+子集。

提及的CD4+和/或CD8+或CD25+「淋巴細胞」應理解為是指在發育的任何分化階段的淋巴細胞，包括但不限於，雙陽性和單陽性胸腺細胞和成熟T細胞，包括幼稚記憶和活化T細胞和NK細胞。仍然不以任何方式限制本發明，儘管大部分T細胞將表達αβ T細胞受體，但是已經確定γδ T細胞受體細胞的亞群也表達CD4或CD8。因此，任何淋巴細胞，無論是γδ還是αβ，只要其表達CD4或CD8之一或兩者，就應當理解為落入本發明方法的範圍之內。同樣地，提及的CD19+淋巴細胞應理解為是指任何分化階段的B細胞。

在另一個實施方案中，所述單個核細胞是淋巴細胞。

根據本實施方案，提供了產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的淋巴細胞懸液，所述淋巴細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為70％v/v或其功能等同比例。

在一個實施方案中，所述淋巴細胞是雙陽性的CD4+/CD8+胸腺細胞。

在另一個實施方案中，所述淋巴細胞是單陽性CD4+或CD8+T細胞。

在又一個實施方案中，所述淋巴細胞是CD8+NK細胞。

在又一個實施方案中，所述淋巴細胞是CD25+調節性T細胞。

在又一個實施方案中，所述淋巴細胞是CD19+B細胞。

在又一個實施方案中，所述單個核細胞是CD20+細胞。

應理解的是，本發明的單個核細胞可以來源於任何合適的組織，包括外周血和脾。

在又一個實施方案中，所述單個核細胞來源於外周血。

根據本實施方案，提供了產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的外周血衍生單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為70％v/v或其功能等同比例。

在一個實施方案中，所述單個核細胞是淋巴細胞。

在又一個實施方案中，所述淋巴細胞是單陽性CD4+或CD8+T細胞、CD8+NK細胞、CD25+T細胞、CD19+B細胞或CD20+B細胞。

如前文詳述的，已經確定了成熟體細胞，特別是單個核細胞(如淋巴細胞)，可以被誘導轉變成多譜系分化潛能的狀態。因此，提及表現「多譜系分化潛能」或「多譜系潛能」的細胞應理解為是指表現出沿超過一種體細胞分化途徑發育的潛能的細胞。例如，細胞可能能夠產生一系列體細胞類型，這樣的細胞通常被稱為多能或多潛能。這些細胞表現為定型至比全能細胞受更多限制的譜系範圍，後者是可以在固有可能的任何分化方向(包括全部體細胞譜系和配子)發育的細胞。不將本發明限於任何一種理論或作用模式，在幹細胞來自出生後組織的情況下，其也經常被稱為「成體幹細胞」。那些經典稱為「祖」細胞或「前體」細胞的許多細胞也可落入「多譜系分化潛能」的定義範圍內，這基於在適當的刺激條件下，其可以產生超過一種體細胞譜系的細胞。在通過本發明方法產生的細胞方面提及「幹細胞」的情況下，這應理解為是指表現出本文定義的多譜系分化潛能的細胞。

在本發明的一個實施方案中，已經確定可以誘導CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞轉變為多譜系分化潛能表型，其表現為沿著多種不同譜系(例如造血譜系或間充質譜系)分化的潛能。例如，在適當的刺激下，本發明多潛能細胞可以定向向下分化為造血譜系，包括單核造血細胞(例如淋巴細胞或單核細胞)、多形核造血細胞(例如嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞或嗜酸性粒細胞)、紅細胞或血小板，或沿著間充質譜系分化，如結締組織，如骨、軟骨、平滑肌、肌腱、韌帶、基質(stroma)、骨髓、真皮和脂肪。在適當刺激的存在下，這些細胞也可以被誘導沿其他譜系分化，例如神經元譜系。還應當理解，雖然根據本發明方法產生的所有多譜系潛能細胞可以來源於許多不同的起始群中的一種，但是它們都表現出沿著多個譜系分化的潛力。不將本發明限於任何一種理論或作用模式，由本發明的CD4、CD8、CD25、CD19或CD20起始細胞產生的多譜系細胞表現出獨特的表型譜。雖然所有這些細胞均表現出多能性，但是這些細胞在其傾向方面可能表現出功能差異(如果有的話)，以在不存在特定細胞外刺激的情況下沿著特定譜系分化。然而，在提供特定的刺激時，分化可以定向為沿著任何期望的譜系。

因此，本發明的一個實施方案涉及產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞，所述多譜系潛能細胞表現造血和/或間充質潛能。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為70％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述CD4+衍生多譜系潛能細胞表達CD44+和CD45+。

在又一個實施方案中，所述CD8+衍生多譜系潛能細胞表達CD45+和CD47+。

在又一個實施方案中，所述CD25+衍生多譜系潛能細胞表達CD23+。

在又一個實施方案中，所述CD19+衍生多譜系潛能細胞表達CD44+和CD45+。

更優選地，所述造血潛能是分化成淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞或血小板的潛能，並且所述間充質潛能是分化成骨、軟骨、平滑肌、肌腱、韌帶、基質、骨髓、真皮或脂肪的細胞的潛能。

本文使用的術語「哺乳動物」和「哺乳類」包括人、靈長類、家畜動物(例如馬、牛、羊、豬、驢)、實驗室試驗動物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、伴侶動物(例如狗、貓)和圈養野生動物(例如袋鼠、鹿、狐狸)。優選地，哺乳動物是人或實驗室試驗動物。甚至更優選地，哺乳動物是人。

提及誘導CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞(例如單核細胞)「轉變」成多譜系潛能表型應理解為是指誘導基因、形態和/或功能變化，所述變化是體細胞表型改變為本文所定義類型的多譜系潛能表型所需要的。

在誘導CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞體外去分化為多譜系潛能細胞方面，這可以在小規模的體外組織培養或大規模的生物反應器生產的情況下實現。

如前文詳述的，已經確定了CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞轉變成多譜系潛能細胞可以通過在體外使所述細胞經受獨特的細胞培養方案來實現。具體地，將單個核細胞的起始樣品與白蛋白和細胞培養基以特定比例一起培養。這是本發明方法的一個特別的優點，因為不像大多數細胞培養系統，本發明培養物的建立不是基於培養特定濃度的細胞(這需要確定細胞數目並適當調節細胞濃度)，而是基於圍繞體積比例的培養物而設計，不論該體積內細胞的實際數目如何。這使得本發明方法非常簡單，並且可基於CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞的任何可用或方便操作的起始體積來常規進行。

因此，本發明的體外細胞培養系統圍繞CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞懸液的起始體積來建立。提及的「懸液」應理解為是指非附著細胞的樣品。這些細胞可以被包含在維持細胞存活狀態的任何適當的介質中，如等滲溶液(例如PBS、鹽水、Hank氏平衡鹽溶液或其他平衡鹽溶液變化形式)、細胞培養基、體液(例如血清)等。本發明細胞可以用其他方法(例如正或負磁珠分離)進行富集或處理，根據所使用方法的性質，這將導致CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞的最終懸液被包含在各種不同等滲溶液中的任一種中。不論獲得的細胞的實際濃度如何，任何適當的體積的該懸液可用於建立本發明的培養物。這種體積將基於試圖使用的培養系統的類型來選擇。例如，如果培養在基於燒瓶的系統、基於包的系統或基於滾瓶的系統中，可能的是較小體積(多至約1升)將形成細胞培養物的全部。然而，在生物反應器的情況下，可能考慮顯著更大體積的細胞培養物，因此可以使用較大的起始體積。確定合適的最終細胞培養體積以用於所使用的特定細胞培養系統情況完全在本領域技術人員的技術範圍之內。

在初始建立本發明的細胞培養物方面，將經受培養的細胞培養物的最終體積包含約15％v/v的CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞懸液，連同約15％v/v的5％-85％白蛋白溶液和約70％v/v的細胞培養基。如本文所詳述的，提及的這些百分比數值是近似的，其近似程度為：與這些特定百分比的一些偏差是可接受的，並且提供了功能等同比例。根據示例性培養系統的非常簡單和常規的性質來確定與上述百分比數值的何種偏差程度是可行完全在本領域技術人員的技術範圍之內。例如，預期約20％至40％v/v的單個核細胞懸液和5-40％的5％-85％白蛋白溶液可以是有效的，特別是10％-40％、15％-40％、20％-40％或約15％。對於本發明白蛋白溶液，約4％至90％，或5％-86％，或優選5％-7％的溶液可以是同樣有效的。可以使用30％-60％的細胞培養基，例如30％-40％。

不以任何方式限制本發明，已經確定跨越很寬範圍的白蛋白濃度在本發明的方法中有效。因此，可以使用5％-85％、5％-80％、5％-75％、5％-70％、5％-65％、5％-60％、5％-50％、5％-45％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、5％-20％、5％-15％、5％-10％的濃度範圍。在一個實施方案中，所述濃度為5％-20％。

因此，本發明的一個實施方案涉及產生哺乳動物多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)20-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)20-40％v/v或其功能等同比例的約5％-20％白蛋白溶液；和

(iii)30-50％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述CD4+或CD8+單個核細胞懸液為30％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述CD19+單個核細胞懸液為40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以20％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為40％v/v或其功能等同比例。

在又一個實施方案中，所述CD25+單個核細胞懸液為20％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為40％v/v或其功能等同比例。

在又一個實施方案中，所述CD20+單個核細胞懸液為20％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為40％v/v或其功能等同比例。

在又一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為70％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述白蛋白溶液的濃度為5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

不應將本發明限制於提及嚴格遵守本文所詳述(尤其是與上述實施方案有關)的百分比數值，而是在其範圍內包括保持本發明的功能並且可以由本領域技術人員常規和容易地評估的這些百分比的變化。

如前文詳述的，起始細胞懸液中CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞的濃度可以是任意細胞數目。無論細胞數目是相對低還是相對高，本發明的重要方面在於，起始細胞懸液為起始細胞培養物的總體積的15-40％v/v，而不論該懸液內細胞的濃度如何。然而，在一個優選的實施方案中，儘管起始細胞濃度並不存在下限或上限，但是建議細胞數目不應過高而使得培養期間培養容器中沒有足夠的表面積用於這些單個核細胞附著。雖然在起始細胞濃度過高使得沒有足夠表面積用於這些細胞附著的情況下所述方法也能成功產生表現多譜系分化潛能的細胞，但是可簡單地觀察到不能附著的那些細胞沒有去分化成幹細胞，因此雖然所述方法是有效的，但不是最佳效率的。因此，在這方面，從效率最大化觀點來看，可能希望確保這樣的細胞濃度，其使得起始細胞培養物部分在所有存在的細胞均能夠附著於選擇用於培養的特定組織培養容器的環境下培養。例如，在使用培養袋容器時，不超過106個細胞/ml的細胞濃度是合適的。

在使用白蛋白溶液的方面，6％的白蛋白溶液通常是可商購的，但另外也可以由任何合適的等滲溶液(例如鹽水)構成。應理解的是，提及的「白蛋白」意指在蒸餾水和半飽和硫酸銨溶液中可溶，但是在完全飽和的硫酸銨溶液中不可溶的球狀蛋白的組。例如，血清白蛋白(其為血清的主要蛋白質)可用於本發明方法的上下文。然而，應理解的是，任何白蛋白分子均可以使用，例如乳白蛋白或卵白蛋白。還應理解的是，白蛋白的任何合成重組或衍生物形式也可用在本發明方法中。本領域技術人員將理解，通過例如佔本發明起始培養物體積的15％v/v的比例使用6％白蛋白溶液，實現了0.9％白蛋白的有效濃度。

起始培養體積的其餘部分由細胞培養基構成，其優選地佔起始細胞培養物體積的30-80％。提及的「細胞培養基」應理解為是指被設計來支持哺乳動物細胞生長的液體或凝膠，特別是支持幹細胞培養的培養基。為此目的，可以使用任何合適的細胞培養基，包括基本培養基(其提供用於細胞生長所需的最低營養物)，或富集培養基(其可以包含額外營養物以促進哺乳動物細胞存活和生長的維持)。適合使用的培養基的實例包括DMEM和RPMI。也可以使用補充的基本培養基，其包含額外選擇的試劑，例如胺基酸或糖以促進細胞存活和生長的維持。培養基也可以進一步補充任何其他合適的試劑，例如抗生素。在另一個實例中，細胞培養基補充有胰島素以進一步支持細胞存活和生長。但是應當理解的是，提及的30-80％v/v的細胞培養基是獨立的要求，其不受起始CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞或白蛋白懸浮於其中的溶液的性質影響，無論其是等滲溶液如鹽水還是基本培養基。事實上本發明的一個特別的優點在於，不論在引入到本發明的培養系統中之前單個核細胞初始懸浮於其中或白蛋白溶解於其中的溶液的性質如何，對於作為起始細胞培養群的總體積百分比的30-80％v/v細胞培養基的要求保持不變。

在一個實施方案中，所述細胞培養物還包含10mg/L的胰島素。

如前文詳述的，本發明方法是基於將CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞的群與細胞培養基和5％-85％白蛋白溶液以特定比例一起培養，以誘導單個核細胞去分化為間充質/造血幹細胞表型。將所述CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞在體外培養一定時間，直到實現本發明幹細胞表型。在一個實施方案中，已經確定3-8天，特別是4-7天的培養期適合於產生本發明幹細胞。將理解，對體外培養細胞取樣以確定必要的去分化程度是否發生完全在本領域技術人員的技術範圍之內。確定溫度和CO2百分比兩者方面最合適的條件來培養細胞也完全在本領域技術人員的技術範圍之內。不將本發明限於任何一種理論或作用模式，已經確定在培養人CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞時，4至5天的孵育是特別合適的。培養可以在認為合適的條件下進行，以在數天的培養期中維持良好的細胞存活和生長。為此目的，將理解，建立適當的細胞培養條件對本領域技術人員來說是常規程序。

因此，在一個實施方案中，提供了產生人多譜系潛能細胞的方法，所述方法包括建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(i)10-40％v/v或其功能等同比例的人外周血單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(ii)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(iii)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為表現多譜系分化潛能的細胞。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為70％v/v或其功能等同比例。

在一個實施方案中，所述白蛋白溶液為5％-20％，優選5％-15％。

在一個實施方案中，所述細胞培養物還包含10mg/L的人胰島素或其功能性片段或等同物。

在另一個實施方案中，所述細胞培養4至7天，特別是4至5天或3至6天。

如上文詳述的，本發明是在體外對CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞的分離群進行的。為此，應理解的是，本發明細胞可以是從個體(例如，作為治療對象的個體)新鮮分離的，或者可以來自非新鮮的來源，例如來自細胞的培養物(例如，其中擴增細胞數目和/或培養細胞以使得其可接受分化信號)或細胞的冷凍儲備物(例如，已建立的T細胞系)，其可以是在更早時間點從個體或另一來源分離的。還應理解的是，本發明細胞可以已經經歷一些其他形式的處理或操作，例如但不限於富集或純化、細胞周期狀態的修改或細胞系的形成。因此，本發明細胞可以是原代細胞或次生細胞。原代細胞是從個體中分離的細胞。次生細胞是在其分離後，在實施本發明方法之前，已經經歷了一些形式的體外操作(例如製備細胞系)的細胞。還應理解的是，起始CD4、CD8、CD25、CD19或CD20單個核細胞群可以是相對純的，或者其可以是異質細胞群(例如外周血細胞群)的一部分。這將在下文進一步討論。

在一個相關方面，應理解的是，本發明的方法也可適於誘導通過本發明方法產生的多譜系潛能細胞(MLPC)分化成更成熟的表型。例如，在本發明的一個實施方案的情況下，造血幹細胞產生所有血細胞(例如，紅細胞、血小板、淋巴細胞、單核細胞和粒細胞)，而間充質幹細胞產生各種各樣的結締組織，包括骨、軟骨、平滑肌、肌腱、韌帶、基質、骨髓、真皮和脂肪。在本發明方法產生具有造血和間充質潛能兩者的情況下，本發明方法可適於在體外或在體內包括進一步的步驟，其將本發明MLPC群引入到實現沿目的譜系部分或完全分化所需的特定刺激。

還應當理解，雖然該另外的定向分化事件可便於在體外進行，但是其也可以在體內實現。這將在下文中更詳細地討論。然而，特定的原位環境也可方便地提供引導MLPC沿著特定譜系分化所需的信號範圍。

因此，提及的「MLPC衍生細胞」應理解為是指比MLPC更加分化並且可以由所述MLPC產生的細胞類型。這些細胞將對應於已知的MLPC所產生譜系的細胞，例如，在造血幹細胞情況下的血細胞和在間充質幹細胞情況下的結締組織。應理解的是，本發明MLPC衍生細胞可以是更加分化的祖細胞，其不可逆地定型為沿著細胞譜系的特定亞組分化，例如造血幹細胞或間充質幹細胞，或者其可對應於特定細胞譜系的部分或最終分化形式，例如紅細胞、淋巴細胞等。因此，應理解的是，落入本發明這個方面的範圍之內的細胞可以處於發育的MLPC之後的任何分化階段。如前面詳述的，這種進一步的分化可以組成性地(constitutively)發生或者可能需要一種或更多種另外的信號。這些信號可以在體外提供，例如在小規模體外組織培養或大規模生物反應器生產的情況下，或者在體內微環境中，例如如果將前體細胞移植到合適的組織微環境中以使其進一步分化。

因此，在本發明的一個相關方面中，提供了促進哺乳動物MLPC衍生細胞的產生的方法，所述方法包括：

(i)建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(a)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(b)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(c)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為MLPC；以及任選地

(ii)使步驟(i)的MLPC與刺激接觸以引導所述MLPC分化為MLPC衍生表型。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為70％v/v或其功能等同比例。

在一個實施方案中，所述CD4+和/或CD8+單個核細胞是淋巴細胞，更優選外周血衍生CD4或CD8單陽性T細胞。

在又一個實施方案中，所述淋巴細胞是CD8+NK細胞。

在又一個實施方案中，所述淋巴細胞是CD25+調節性T細胞。

在又一個實施方案中，所述淋巴細胞是CD19+B細胞。

在又一個實施方案中，所述淋巴細胞是CD20+B細胞。

在另一個實施方案中，所述白蛋白為5％-20％。

在又一個實施方案中，所述MLPC表現出造血潛能和間充質潛能兩者。

根據該實施方案，因此優選地提供了促進哺乳動物MLPC衍生細胞的產生的方法，所述方法包括：

(i)建立體外細胞培養物，其按比例包含：

(a)10-40％v/v或其功能等同比例的單個核細胞懸液，所述單個核細胞表達CD4、CD8、CD25、CD19或CD20；

(b)5-40％v/v或其功能等同比例的約5％-85％白蛋白溶液；和

(c)30-80％v/v或其功能等同比例的細胞培養基，

其中所述細胞培養物在一定條件下保持一定時間，所述保持足以誘導所述單個核細胞轉變為MLPC；以及任選地

(ii)使步驟(i)的MLPC與刺激接觸以引導所述MLPC分化為造血或間充質表型。

在一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為20-40％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15-40％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為30-80％v/v或其功能等同比例。

在另一個實施方案中，所述單個核細胞懸液為15％v/v或其功能等同比例，所述5-85％白蛋白溶液以15％v/v或其功能等同比例使用，並且所述培養基為70％v/v或其功能等同比例。

還更優選的是所述造血幹細胞衍生細胞是紅細胞、血小板、淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞或嗜酸性粒細胞。

在另一個優選的實施方案中，所述間充質幹細胞衍生細胞是結締組織細胞，例如骨、軟骨、平滑肌、肌腱、韌帶、基質、骨髓、真皮或脂肪的細胞。

在本發明的這一方面的情況下，應理解的是，可產生細胞聚集物如組織(例如，肌肉或皮組織)或細胞懸液(例如，造血細胞懸液)兩者。

如上文詳述的，本發明是基於以下的確定：可以從CD4、CD18、CD25、CD19或CD20單個核細胞產生幹細胞。為此目的，應理解，這可以在引導起始群的所有CD4、CD8、CD25、CD19和CD20細胞轉變的情況下或者在引導這些體細胞起始群的亞群轉變的情況下實現。這可能取決於例如起始細胞群的純度和/或異質性。另外，本發明的培養系統可以導致產生異質細胞群。例如，如果並非起始群的所有細胞都轉變成MLPC表型或者如果並非所有MLPC細胞隨後都被誘導分化成更成熟和同質的表型，這就可能發生。情況是，由於並非起始群的所有細胞可必然地分化成MLPC表型或MLPC衍生表型，並且獲得的MLPC衍生細胞輸出本身可以是異質的，所以本發明方法可能需要使用篩選和選擇步驟來鑑定和分離表現出期望表型的細胞。鑑定方法是本領域技術人員公知的，包括但不限於：

(i)細胞譜系特異性結構的檢測。

根據待鑑定的結構類型，可以例如通過光學顯微術、螢光親和標記、螢光顯微術或電子顯微術來進行細胞譜系特異性結構的檢測。光學顯微術可用於檢測形態特徵，例如淋巴細胞vs多形核細胞vs紅細胞核特徵或多核骨骼肌細胞。在另一個實例中，可以鑑定直徑為約10-30μm，具有未成熟心肌細胞的圓形或棒狀形態特徵的單個核細胞。電子顯微術可用於檢測的結構如肌節、X-帶、Z-體、閏盤、間隙連接或橋粒。螢光親和標記和螢光顯微術可用於通過與所討論的結構特異性結合併且直接或間接地與螢光團綴合的螢光標記的分子(通常是抗體)來檢測細胞譜系特異性結構。可以用適當的檢測和計算系統中來執行這樣的結構的自動化定量。

(ii)細胞譜系特異性蛋白質的檢測。

細胞譜系特異性蛋白質(例如細胞表面蛋白質或細胞內蛋白質)的檢測可例如通過螢光親和標記和螢光顯微術方便地實現。特異性蛋白質可以在全細胞和組織中檢測。簡單地說，將螢光標記的抗體在固定細胞上孵育，以檢測特異性心臟標誌物。或者，可以使用諸如Western免疫印跡或雜交微陣列(「蛋白質晶片」)技術。可以通過這種方法檢測的蛋白質可以是特定細胞群中任何特徵性的蛋白質。例如，可以通過一種或更多種細胞表面分子表達的存在或不存在來區分前體/祖細胞類型的類別。在這方面，這種方法可用於基於任何一種或更多種分子的表達通過陽性或陰性選擇步驟來鑑定細胞類型。更成熟細胞通常可以憑藉其在文獻中良好確定的一系列特異性細胞表面或細胞內蛋白質的表達來表徵。例如，所有造血細胞類型的分化階段在細胞表面分子的表達模式方面已經被充分確定。同樣地，肌肉細胞和其他間充質衍生細胞類型在發育的各個分化階段的蛋白質表達譜方面也已經進行了良好記錄。為此，本發明的MLPC通常表達一系列本文示例的細胞表面標誌物，這些表面標誌物是一般單個核細胞幹細胞，間充質幹細胞、造血幹細胞、多譜系潛能細胞和神經元幹細胞特徵性的細胞表面標誌物。

(iii)細胞譜系特異性RNA或DNA的檢測。

這種方法優選使用RT-PCR或實時(qRT-PCR)實現。或者，其他可以使用的方法包括雜交微陣列(「RNA晶片」)或Northern印跡或Southern印跡。RT-PCR可以用來檢測基本上編碼任何蛋白質的特定RNA，如在上文第(ii)點中詳述的蛋白質，或者被分泌或另外不方便通過第(ii)點中詳述的方法檢測的蛋白質。例如，在早期B細胞分化的情況下，在重排免疫球蛋白分子的細胞表面表達之前，可以在DNA水平檢測到免疫球蛋白基因重排。

(iv)細胞譜系特異性功能活性的檢測。

雖然一般認為在其功能方面分析細胞群不是如第(i)至(iii)點那樣方便的篩選方法，但是在一些情況下可能並非如此。例如，在試圖產生心肌細胞的情況下，可以在光學顯微鏡下簡單地篩選心臟特異性的機械收縮。

應當理解的是，在表徵通過使用本發明方法獲得的細胞群的情況下，可以使用任何一種或更多種上文詳述的技術。

在根據本發明方法培養之前針對CD4、CD8、CD25、CD19或CD20淋巴細胞富集成熟體細胞群或者在分離或富集由其得到的MLPC細胞群方面，可以再次使用各種公知的技術。如上文詳述的，抗體和其他細胞表面結合分子(例如凝集素)對於鑑定與特定細胞譜系和/或分化階段相關的標誌物特別有用。所述抗體可以附著到固體支持物以允許進行分離。然而，其他細胞分離技術包括基於物理特性的差異(密度梯度離心和逆流離心淘析)和活體染色性質的差異(線粒體結合染料若丹明123和DNA結合染料Hoechst 33342)的那些。

分離方法可包括使用抗體或凝集素包被的磁珠的磁分離、親和色譜、利用附著於固體基質的抗體的「淘選」或任何其他方便的技術。提供特別精確分離的其他技術包括螢光激活細胞分選術，這種技術也適於基於形態特徵的細胞分離，所述形態特徵可通過前向vs側向光散射辨別。鑑於這些技術可適於陽性選擇或陰性選擇的情況，另外的陰性選擇技術包括但不限於定點施用溶細胞劑、凋亡劑或其他毒劑。這可以最方便地通過將這樣的試劑偶聯至單克隆抗體以促進其定向遞送來實現。在另一個實例中，用抗體調理然後施用補體可實現相同結果。

這些技術可以作為單步驟或多步驟方案進行，以實現期望水平的純化或富集。

由於本發明的細胞和組織的增殖能力對於給定用途如修復受損組織或測試治療性治療方案的效果是必不可少的，所以可能期望篩選表現出充足水平的增殖能力的細胞。可以通過多種標準技術進行細胞增殖能力的確定。優選地，通過3[H]-胸苷或125I-碘代脫氧尿苷攝取測定實現增殖的確定。或者，使用代謝染料如XTT的比色測定或直接細胞計數可用於確定增殖能力。也可通過細胞周期標誌物如Ki-67的表達評估增殖能力。

如上文詳述的，本發明的方法在體外進行。在體外技術方面，現因此提供了常規和可靠地小規模或大規模生產MLPC或MLPC衍生細胞的手段。在小規模生產方面，其可以在例如組織培養瓶或袋中實現，這可特別適於針對給定個體並在特定條件情況下生產細胞群。在大規模生產方面，本發明方法提供了滿足大規模需求的可行手段。根據本發明方法實現大規模生產的一種手段是通過使用生物反應器。

生物反應器被設計為提供模擬體內營養物濃度和速率以受控的濃度和速率遞送培養基和氧的培養過程。生物反應器已經市售了許多年，並且採用了多種類型的培養技術。在用於哺乳動物細胞培養的不同生物反應器中，大部分已被設計為允許用於生產單一細胞類型的高密度培養物，因此可用於本發明。這些高密度系統的典型應用是產生作為終產物的由細胞產生的條件培養基。對於例如單克隆抗體的雜交瘤生產和包裝細胞系用於病毒載體生產正是如此。然而，這些應用不同於其中治療性終產物是所收穫的細胞本身的應用，如在本發明中那樣。

一旦運行，生物反應器提供自動調節的培養基流動、氧氣遞送以及溫度和pH的控制，並且其通常允許生產大量的細胞。因此，生物反應器節省勞動並使過程中汙染的可能性最小化，並且最精密的生物反應器允許涉及最少的人工勞動需求和開放處理步驟的建立、生長、選擇和收穫過程。這樣的生物反應器最佳地設計成用於均質細胞混合物或聚集的細胞群，如本發明所構思的。用於本發明的合適的生物反應器包括但不限於在以下中描述的那些：美國專利No.5,763,194、美國專利No.5,985,653和6,238,908、美國專利No.5,512,480、美國專利No.5,459,069、5,763,266、5,888,807和5,688,687。

對於任何大體積、長期的細胞培養(例如其中期望MLPC體外定向分化的)，需要控制幾個基本的參數。培養物必須提供有允許細胞生存力維持、增殖和分化(假設在幾個獨立的分化培養物和條件的情況下)以及最終細胞培養物保存的培養基。通常，通過生物反應器中的泵浦機構向細胞遞送各種培養基，定期進料和更換培養基。更換過程允許從培養物除去副產物。生長的細胞或組織也需要氧源。不同的細胞類型可具有不同的氧需求。因此，用於給細胞供氧的柔性且可調節的裝置是期望的部件。

根據具體的培養，培養室中細胞群的均勻分布和培養基的供應可以為重要的過程控制。這種控制通常通過使用懸浮培養設計來實現，在細胞-細胞相互作用不重要的情況下，其可能有效。懸浮培養系統的實例包括各種罐式反應器設計和可透氣塑膠袋。對於不要求組裝成三維結構或需要接近基質或飼養層的細胞(例如大多數血細胞前體或成熟血細胞)，可以使用這樣的懸浮設計。

在培養過程結束時有效收集細胞是有效細胞培養系統的重要特徵。生產細胞作為產物的一種方法是在限定空間中培養細胞，不用物理屏障來回收，使得細胞產物通過簡單洗脫就產生易控制的、體積濃縮的細胞，其適於在設計用於所述目的的商業、封閉系統細胞洗滌器中進行最終洗滌。最佳地，系統允許加入具有或沒有防腐劑的可藥用載體或細胞儲存化合物，以及提供到合適的無菌包裝中的有效收穫。最佳地，可完成收穫和包裝過程而不破壞培養室的流體路徑的無菌屏障。

對於任何細胞培養過程，一個主要的擔心是無菌性。當產品細胞要向患者移植時(通常在患者患病或免疫功能低下之時)，必須不存在微生物。

本發明的開發現已促進了用於治療或預防性治療對象的手段的開發。特別是，在本發明的優選實施方案的情況下，基於向這些對象施用通常已根據本發明方法產生的MLPC或者部分或完全分化的MLPC衍生細胞(例如，造血或間充質衍生細胞)，提供了治療表現出不足、不充分或異常造血或間充質細胞功能的患者的手段。

所述方法可應用於廣泛範圍的病症，包括但不限於造血疾病、循環疾病、中風、心肌梗塞、高血壓骨疾病、II型糖尿病、不育、損壞或形態異常的軟骨或其他組織、疝修復、利用支持網和生物支架的盆底脫垂手術、用於其他肌肉骨骼疾病的細胞療法，以及在衰老、手術或創傷的情況下替換有缺陷的支持組織。

提及特徵為「造血或間充質細胞功能異常，，的病症應理解為是指至少部分地由於造血或間充質譜系細胞的功能或發育方面的缺陷的或不需的或不期望的結果造成的任何病症。這可對應於均質或異質細胞群。提及「造血幹細胞」、「造血幹細胞衍生細胞」、「間充質幹細胞」或「間充質幹細胞衍生細胞」應理解為具有上文所定義的相同含義。本發明缺陷應理解為是指細胞的不正常的或其他方面不期望的任何結構或功能特徵，包括這些細胞的產生數目不足。

因此，本發明的另一個方面涉及治療性和/或預防性治療哺乳動物的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效數目的已根據本發明的方法產生的MLPC或者部分或完全分化的MLPC衍生細胞。

更特別地，提供了治療性和/或預防性治療哺乳動物中特徵為造血或間充質功能異常的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用：

(i)有效數目的已根據本發明方法產生的造血幹細胞或者部分或完全分化的造血幹細胞衍生細胞；或

(ii)有效數目的已根據本發明方法產生的間充質幹細胞或者部分或完全分化的間充質幹細胞衍生細胞。

提及向個體「施用」有效數目的本發明細胞應理解為是指向哺乳動物引入根據本發明方法產生的離體細胞群。提及「施用」，「試劑」應理解為向哺乳動物中引入有效量的一種或更多種刺激，所述刺激作用於引入體內的MLPC以產生MLPC衍生細胞。

根據本發明，本發明MLPC或MLPC衍生細胞優選為自體細胞，所述自體細胞被鑑定、分離和/或離體分化成所需的表型，並且移植回最初獲得它們的個體。然而，應理解的是，本發明仍然延伸到使用從任何其他合適來源得到的細胞，其中所述細胞與治療對象個體呈現相同的主要組織相容性譜。因此，這樣的細胞有效地為自體的，因為它們不會導致通常與移植呈現外來MHC譜的細胞相關聯的組織相容性問題。這樣的細胞應理解為落入「自體」的定義內。例如，在某些情況下，本發明細胞分離自遺傳學上的同卵雙生體(identical twin)可能是合乎期望的、必要的或具有實際意義的。所述細胞也可以已被工程化以表現出期望的主要組織相容性譜。使用這樣的細胞克服了在組織和器官移植物的情況下固有遇到的困難。但是，在分離或產生自體細胞不可能或不可行的情況下，可能有必要使用同種異體(allogeneic)幹細胞。「同種異體」細胞是分離自與被治療對象相同的物種但是表現出不同MHC譜的那些。雖然在治療劑的情況下使用這樣的細胞可能必須使用免疫抑制處理，但是通過使用與被治療對象呈現出類似MHC譜的細胞(例如由親戚如兄弟姐妹、父母或子女分離/產生的細胞群)，該問題可被最小化。本發明還應理解為延伸到異種移植。即，根據本發明方法產生並且引入到患者中的細胞分離自被治療對象以外物種的哺乳動物物種。

不將本發明限於任何一種理論或作用模式，甚至僅部分恢復異常細胞群所不提供的功能將改善許多病症的症狀。因此，提及「有效數目」意指對於以下所需的細胞數目：至少部分地獲得期望效果，或者延遲被治療的特定病症的發作、抑制被治療的特定病症的進展，或者完全停止被治療的特定病症的發作或進展。這樣的量當然將取決於被治療的特定病症，病症的嚴重程度和個體患者參數，包括年齡、身體狀況、尺寸、重量、生理狀況，同時進行的治療，醫療史和與所討論病症有關的參數。本領域技術人員將能夠確定構成有效劑量的本發明細胞和組織的數目及其最佳施用方式，而不需要過度實驗，後一話題將在下文中進一步討論。這些因素是本領域普通技術人員公知的，並且可以用不超過常規實驗來解決。通常優選的是使用最大細胞數目，即，根據合理的醫學判斷的最高安全數目。但是，本領域普通技術人員將理解，由於醫學原因、心理原因或任何其他原因，也可施用較低的細胞數目。

如前文所討論的，還應理解，雖然本發明的方法在其範圍內包括向患有如本文所定義的病症的個體引入轉變的或者完全或部分分化的細胞，但並不需要向個體引入的群的每一細胞均已獲得目標MLPC或MLPC衍生表型。例如，當CD4、CD8、CD25、CD19或CD20淋巴細胞群已轉變成MLPC並且一起施用時，可能存在尚未轉變成表現所需表型的細胞的細胞群。在施用MLPC衍生細胞群，例如特定造血或間充質群的情況下，可出現相同的問題。因此，只要如此引入的細胞的相關部分構成如上定義的「有效數目」，就實現了本發明。然而，在一個特別優選的實施方案中，已經經歷分化的細胞群將進行成功分化細胞的鑑定、其分離以及引入到對象個體。這提供了選擇異質MLPC衍生細胞群的手段(例如在以下情況下可能發生，誘導間充質衍生結締組織發育)或挑選出用於施用的特定細胞亞群(例如紅細胞)。選擇來應用的方法類型將取決於被治療病症的性質。但是，預期通常期望施用純細胞群，以避免潛在副作用，例如畸胎瘤形成。或者，在一些情況下，可能可行的是使MLPC群分化，並且只要該群作為整體顯示為表現必要的功能活性，該群作為整體就可以引入到對象個體中，而不需要預先移除不相干細胞類型。因此，在這種情況下，提及「有效數目」應理解為是指使得分化細胞的數目足以產生實現治療對象病症的本發明的目的的活性水平所需的待引入細胞的總數目。

如上文詳述的，在體外進行MLPC轉變。在這種情況下，則需要將本發明細胞引入到個體中。例如，可以通過直接注射來引入細胞懸液，或者在血塊內引入細胞懸液，其中細胞被固定在血塊中從而有利於移植。細胞也可以在移植之前封裝。封裝是這樣的技術，其可用於防止可能的繼續增殖(即，表現出永生的特徵)的細胞的傳播，或者使組織不相容的排斥問題最小化。但是，封裝的有用性將取決於移植細胞所需要提供的功能。例如，如果主要需要移植細胞分泌可溶性因子，封裝的細胞群將可能實現該目的。但是，例如如果需要移植細胞的收縮特性，將可能需要細胞與肌肉的現有組織支架整合。封裝細胞將無法有效做到這一點。

向患者施用的細胞可以通過任何合適的途徑以單劑量或多劑量施用。優選地，並且在可能的情況中，使用單次施用。根據所需修復的類型，通過注射的施用可以針對組織或器官的不同區域。

將理解，根據本發明的這些方面，向患者施用的細胞可以採取任何合適的形式，例如作為細胞懸液(例如，血細胞)或採取組織移植物的形式(例如結締組織)。在產生單細胞懸液的情況下，也可以設計分化方案使得其有利於維持細胞懸液。或者，如果細胞聚集或組織形成，這些將分散到細胞懸液中。在使用細胞懸液方面，也可能期望選出特定細胞亞群來向患者施用，例如特定的單核造血細胞。在期望將組織移植到患者中的情況下，這通常需要手術植入(與通過針或導管的施用相反)。或者，可移植這種組織的僅一部分。在另一個實例中，可通過標準組織工程技術來產生工程化組織，例如通過用本發明的細胞和組織接種具有設計形式的組織工程化支架，在接種細胞或組織能夠在支架中定殖從而能夠產生所形成組織的條件下培養接種的支架。然後向接受者施用形成的組織，例如使用標準手術植入技術。可以例如使用包含細胞外基質組分(例如層粘連蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白等)的生物相容性、可生物降解的聚合物纖維或泡沫產生合適的支架。用於產生或獲得合適的支架、培養這種支架和治療性植入這種支架的詳細的指導方針可在文獻中獲得(例如，參考Kim S.S.和Vacanti J.P.，1999.Semin Pediatr Surg.8：119，Osiris，Therapeutics，Inc.的美國專利No.6,387,369；Bell E.的美國專利申請No.US20020094573A1)。

根據本發明的方法，其他蛋白質或非蛋白質分子可以與本發明細胞的引入一起或者在其之前或之後共施用。「共施用」意指在同一製劑中或者在不同製劑中通過相同或不同途徑同時施用，或者通過相同或不同途徑按順序施用。「順序」施用是指在引入這些細胞和施用蛋白質或非蛋白質分子之間，或者在開始這些細胞的功能活性和施用蛋白質或非蛋白質分子之間的秒、分鐘、小時或天的時間差。其中可能需要這種共施用的情況的實例包括但不限於：

(i)當向對象施用非同基因(non-syngeneic)細胞或組織時，經常出現對象對這些細胞或組織的免疫排斥。在這種情況下，有必要也用免疫抑制方案治療患者，優選在所述施用之前開始，以使得這樣的排斥最小化。用於例如通過施用環孢菌素A、免疫抑制抗體等來抑制同種異體移植排斥的免疫抑制方案是普遍和標準的做法。

(ii)根據被治療病症的性質，可能有必要維持患者的藥物的療程，以減輕病症的症狀，直到移植細胞被整合併且完全發揮作用時。或者，在治療病症時，可能有必要開始長期使用藥物，以防止損傷的再次發生。例如，當對象損傷是由自身免疫病症造成(例如，在類風溼性關節炎的情況下發生的)時，可能需要不間斷地使用免疫抑制藥物，即使當同基因幹細胞用於替換或修復軟骨時也是如此。

還應當理解的是，本發明方法可以獨立進行以治療所討論病症，或者與被設計來促進或增強本發明治療的一種或更多種另外的技術一起進行。這些另外的技術可以採用共施用其他蛋白質或非蛋白質分子的形式，如前文所述。

本發明的另一個方面涉及MLPC或MLPC衍生細胞的群在製備用於治療哺乳動物中的病症的藥物中的用途，所述細胞已根據本發明的方法產生。

本發明的另一個方面涉及已根據本發明方法產生的MLPC或MLPC衍生細胞。

優選地，所述MLPC是造血或間充質幹細胞。

在本發明的一個相關方面中，進行治療或預防的對象可以是需要治療性或預防性治療的任何人或動物。在這一點上，本文提及的「治療」和「預防」應在其最廣泛的範圍內考慮。術語「治療」並不一定意味著治療哺乳動物直到完全恢復。同樣地，「預防」不一定意味著對象最終不感染疾病病症。因此，治療和預防包括改善特定病症的症狀或者防止或以其他方式降低出現特定病症的風險。術語「預防」可以認為是降低特定病症發作的嚴重程度。「治療」也可以降低現有病症的嚴重程度。

用於體外產生MLPC和MLPC衍生細胞的方法的開發現在已經促進了用於測試現有或潛在的治療或培養方案的有效性和毒性的基於體外的篩選系統的開發。

因此，根據本發明的另一個方面，提供了評估治療或培養方案對於MLPC或MLPC衍生細胞的表型或功能狀態的影響的方法，所述方法包括使所述MLPC或MLPC衍生細胞經受所述治療方案並且篩選改變的功能或表型狀態，所述細胞由根據前文定義的方法產生。

優選地，所述MLPC是造血或間充質幹細胞。

通過「改變」意指分析本發明的一種或更多種功能或表型參數相對於未治療細胞的變化。當所討論治療方案被設計來改善細胞功能時，這可能是理想的結果。然而，在治療方案與不利的結果有關時，這可指示毒性，因此使用治療方案是不適合的。現在已經公知的是，在個體對於特定藥物的響應性方面觀察到的差異通常與所述個體的獨特遺傳組成有關。因此，本發明方法提供了在使用來源於所討論個體的核材料產生的細胞上測試現有的或新的治療方案的有價值的手段。這提供用於在體內施用藥物之前評估藥物對個體細胞系統的可能有效性的獨特手段。在患者非常不舒服的情況下，可以避免或至少最小化可能由治療方案造成的導致不期望結果的生理應激。

因此，本發明的這一方面提供了優化被設計來使細胞功能正常化的治療的手段。但是，所述方法也可用於評估治療的毒性，特別是利用化合物的治療。因此，響應於利用化合物的治療，例如在本發明的細胞和組織中，不能產生與造血或間充質表型有關的特徵可用於評估該化合物的毒性。

因此，本發明的方法可用於篩選和/或測試藥物、其他治療方案或培養條件。在評估表型的改變的情況下，本發明的這個方面可以用來監測本發明細胞和組織的基因表達譜的變化。因此，根據本發明這個方面的方法可用於確定例如響應於治療的基因表達模式的變化。

優選地，本發明細胞或組織所經受的治療是暴露於化合物。優選地，化合物是藥物或生理離子。或者，化合物可以是生長因子或分化因子。為此目的，非常希望具有能夠在施用藥物之前預測對於細胞群的這種副作用的可用方法。

通過參照以下非限制性實施例進一步描述了本發明。

實施例1.

CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+PBMC細胞培養物中的CD標誌物和蛋白質表達

從20-40歲的健康志願者收集外周血單個核細胞(PBMC)並且通過GE Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Instructions 71-7167-00 AG)根據產品說明書分級。

使用所選附著方法由PBMC產生CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+白細胞。簡要地說，通過微珠(MACS)獨立地從PBMC純化這五個淋巴細胞群，純度通常＞90％，通過流式細胞術驗證。

將這些淋巴細胞的每個群單獨培養在無菌的FEP培養袋中。這些最終培養基是重構的30％CD4+和CD8+PBMC、40％的6％人白蛋白(CSL Behring)溶液和30％細胞培養基，以及2％胰島素(Invitrogen，USA)。40％CD19+PBMC細胞是重構的20％的6％人白蛋白(CSL Behring)溶液和40％細胞培養基。20％的CD20+和CD25+細胞是重構的40％的6％人白蛋白(CSL Behring)溶液和40％細胞培養基，以及2％胰島素(Invitrogen，USA)。細胞在這些混合物中在5％CO2的加溼孵育器中於37℃生長3-6天。

在這段孵育期中，通過流式細胞術檢查五個淋巴細胞群(CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+)的CD標誌物和表面蛋白質表達。此外，在CD4+群中，通過Western印跡檢查總細胞蛋白質的表達。

PBMC的形態觀察

利用來自在37℃的CO2孵育器中孵育1天和4天後的細胞培養物樣品製備切片。為了研究PBMC的生物學特徵，在細胞培養期間通過倒置顯微鏡分析附著細胞表型(圖1至5)。

通過流式細胞術分析的CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+的CD標誌物表達

分別從FEP培養袋中收穫CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+PBMC並且用PBS(含有2％胎牛血清；FBS)洗滌，在4℃下於640×g下離心5分鐘，保留細胞沉澱。將細胞密度調整到每管3×105個細胞用於流式細胞術測定。用螢光標記的抗體標記這5個白細胞群。最後，向每個管中加入100微升固定緩衝液(BD)，然後在4℃孵育20分鐘，最後在4℃下在黑暗中儲存直至流式細胞術分析(Bacton Dickinson)。使用CellQuest軟體鑑定活細胞，所得數據在表1-10中示出。

通過western印跡分析的CD4+、CD8+、CD19+、CD20+和CD25+淋巴細胞的蛋白質表達

細胞提取物的製備

在培養3-6天後，從來自40位健康志願者的CD4+PBMC細胞中獨立地提取細胞蛋白質。簡要地說，通過RIPA裂解緩衝液(Millipore，Temecula.CA 92590)獲得細胞蛋白質提取物。將提取的懸液在冰上孵育20分鐘，然後在13000×g離心5分鐘。收集上清液(可溶級分)用於蛋白質表達。

Western印跡分析

針對多種蛋白質的抗體購自市售品。這些包括膠原I型、HLA 1類、TAZ、胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)、鹼性磷酸酶、神經生長因子(NGF)、腫瘤壞死因子配體超家族成員18(TNFSF18)、幹細胞抗原-1(Sca-1)、窖蛋白-2和穿孔素(Abcam Inc.)；CDX2、纖連蛋白、巨噬細胞-1抗原(MAC-1)、M鈣粘蛋白、MyoD(MYOD1)、核轉錄因子Y亞基α(NF-YA)、Notch 1、配對盒-5(PAX-5)、P-糖蛋白、Wiskott-Aldrich症候群蛋白(WASP)(Epitomic Inc)；α-輔肌動蛋白、Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CaM激酶IV)、細胞視黃酸結合蛋白(CRABP II)、GATA結合因子-4(GATA4)、缺氧誘導因子-1a(HIF-1a)、肌細胞生成素、Achaete-scute同源物1(ASCL1)、突觸泡蛋白(SYP)、巢蛋白和Runt相關轉錄因子3(Runx3)(Merck Millipore Headquarters.)、膜聯蛋白VI(G-10)、神經生成素3(E-8)、顆粒酶B、穀氨酸脫羧酶(GAD2，D5G2)、神經纖毛蛋白-2、β烯醇化酶(ENO-3)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和粒溶蛋白(F-9)(Santa Cruz Biotechnology.)、Fms相關酪氨酸激酶1(FLT-1)和多藥耐藥相關蛋白1(MRP1)(CHEMICON international，SerlogicalR公司的一個部門)和PU.1(Cell Signaling Technology，Inc.)。

將這些細胞裂解物的上清液用於十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。將100微克每種細胞裂解物樣品上樣到Pierce 4-20％Tris-甘氨酸凝膠(Thermo SCIENTIFIC，Rockford USA)。電泳後，將凝膠印跡到PVDF膜(Millpore，Temecula.CA 92590)上。將PVDF膜在Tris緩衝鹽水Tween-20緩衝液(10mMTris，pH 8.0，150mM NaCl)中用5％脫脂牛奶封閉，然後將膜在新鮮5％脫脂牛奶Tris緩衝鹽水Tween-20緩衝液中用多種一抗在2-5℃下孵育18-20小時。將膜洗滌，然後用辣根過氧化物酶綴合的二抗孵育。用Amersham增強型化學發光系統進行帶的可視化。用CCD相機記錄響應條帶並且用Multi Gauge軟體進行分析。使用β-肌動蛋白標準化的內部對照確定半定量分析的表達百分比增加。結果在本文中示出在圖6-7和表11中。

表1衍生自根據本發明方法培養的CD4+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表2衍生自根據本發明方法培養的CD4+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表3.衍生自根據本發明方法培養的CD8+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表4衍生自根據本發明方法培養的CD8+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表5.衍生自根據本發明方法培養的CD19+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表6.衍生自根據本發明方法培養的CD19+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表7.衍生自根據本發明方法培養的CD20+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表8衍生自根據本發明方法培養的CD20+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表9.衍生自根據本發明方法培養的CD25+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表10.衍生自根據本發明方法培養的CD25+PBMC的多譜系祖細胞的流式細胞術分析

表11.通過western印跡分析，CD4+ PBMC示出多種蛋白質表達。A-F示出通過半定量分析的CD4+PBMC的蛋白質表達，通過內部對照β-肌動蛋白歸一化確定表達的百分比提高。將0-20％、21-40％、41-60％、61-80％和81-100％的5個水平分別表示為「+」、「++」、「+++」、「++++」和「+++++」。

A.CD4+PBMC蛋白質表達的肌動蛋白、穿孔素、HLA I類ABC、TAZ、膠原蛋白I、ALP和IGFBP3

B.CD4+PBMC蛋白質表達的肌動蛋白、PAX5、纖連蛋白、TNFSF18、FLT-1、HIF-1α和WASP

C.CD4+PBMC蛋白質表達的肌動蛋白、CDX2、膜聯蛋白VI、GAD2、CAMK4、α-輔肌動蛋白和神經纖毛蛋白-2

D.CD4+PBMC蛋白質表達的肌動蛋白、M-鈣粘蛋白、Sca-1、Notch1、P-gp、NFYA和MyoD1

E.CD4+PBMC蛋白質表達的肌動蛋白、MAC-1、PU.1、粒溶蛋白、Runx3、ASCL1和肌細胞生成素

F.CD4+PBMC蛋白質表達的肌動蛋白、CRABP2、MRP1、巢蛋白、GATA4、G-CSF和窖蛋白-2

G.CD4+PBMC蛋白質表達的肌動蛋白、突觸泡蛋白、神經生成素3、β烯醇化酶、顆粒酶B和NGF

本領域技術人員將理解，除了具體描述的那些以外，本文描述的發明易於進行變化和修改。應理解本發明包括所有這些變化和修改。本發明還包括在本說明書中單獨或共同提及或指出的所有步驟、特徵、組合物和化合物，以及任意兩種或更多種所述步驟或特徵的全部組合。

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