膠原蛋白結構體及膠原蛋白結構體的製造方法

2023-04-26 01:30:56 1

膠原蛋白結構體及膠原蛋白結構體的製造方法
【專利摘要】本發明提供一種膠原蛋白結構體，其特徵在於：由平均直徑為1～5μm的膠原纖維構成，含水量為0～15(w/w)％，膠原蛋白密度為50～800mg/cm3。將膠原蛋白酸性溶液調節至中性以生成膠原纖維，之後通過過濾等形成膠原蛋白濃度為12～50(w/v)％的粗膠原纖維。將該粗膠原纖維模製成規定形狀，之後進行乾燥即可製得。由於該膠原蛋白結構體是以膠原蛋白分子締合形成的膠原纖維為材料，所以細胞浸潤性優異，並且膠原蛋白密度與機體內的膠原蛋白組織等價，所以將其填充在機體的缺損部時組織再生力優異，可適用於再生醫療用人工材料等。
【專利說明】膠原蛋白結構體及膠原蛋白結構體的製造方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及包含膠原纖維的膠原蛋白結構體、以及所述膠原蛋白結構體的製造方 法。

【背景技術】
[0002] 膠原蛋白是形成魚或豬、牛等的生皮、肌腱、骨等的主要蛋白質。由於膠原蛋白在 動物間的同源性高，所以其抗原性低，機體親和性或組織適應性優異，作為醫用材料的原材 料具有優異的特性。在機體組織發生任何異常的情況下，作為可以穩定供給移植組織、且可 以避免免疫排斥反應的人工材料等，人們正在開發以膠原蛋白為原料的各種構件。
[0003] 例如，有一種細胞侵入性醫用材料，所述材料是在由合成樹脂等構成的載體上結 合或包覆了螺旋結構含量為〇?80%的變性膠原蛋白（專利文獻1)。雖然膠原蛋白的組 織親和性優異，但在機體內膠原蛋白會被膠原蛋白酶分解。為了避免這種分解，使用進行了 交聯處理、並提高了體內殘留性的膠原蛋白。專利文獻1中記載的細胞侵入性醫用材料在 埋入機體內或覆蓋於創傷面時對機體內的分解酶具有抵抗性，在一定期間可保持必要的機 械強度，並且與細胞、組織的親和性良好，增殖了的細胞容易進入其內部。
[0004] 另外，還有如下技術：在用醋酸調節膠原蛋白稀釋溶液的pH後添加戊二醛，並進 行冷凍乾燥，將所形成的交聯膠原蛋白海綿用作人工皮膚（專利文獻2)。已知若將膠原蛋 白海綿埋植在燒傷等患處，則通過其多孔質的結構提供適合成纖維細胞增殖的無數個孔， 幫助成纖維細胞增殖，由此促進患處的痊癒，但現有的膠原蛋白海綿是使膠原蛋白溶液發 泡來調製的，所以步驟複雜。在上述專利文獻2中，不必將膠原蛋白溶液發泡，即可調製膠 原蛋白海綿。
[0005] 另外，還有由膠原蛋白的微孔性水凝膠構成的膠原蛋白海綿（專利文獻3)。在專 利文獻3中，其特徵在於：將預先調製的膠原蛋白海綿用親水性有機溶劑的水溶液溼潤，之 後進行冷凍乾燥處理以使其乾燥。膠原蛋白海綿可用作人工皮膚或創傷包覆材料等，但現 有的膠原蛋白海綿是在溶液中溼潤來進行保存的，膠原蛋白容易發生變質。另一方面，乾燥 後保存時會發生攣縮。專利文獻3正是鑑於這一點而提出的。在實施例中，將濃度為0.3% 的來自豬的肌腱的缺端膠原在冰冷下攪勻，放入方形模板內冷凍後進行真空冷凍乾燥，再 進行真空熱乾燥以使其交聯，然後浸在戊二醛溶液中使其交聯。將如此調製的膠原蛋白海 綿用親水性有機溶劑的水溶液潤溼，接著在不易發生攣縮的大約_80°C以下的溫度下冷凍 乾燥，則能夠明顯減少乾燥體的裂紋。
[0006] 另外，還有一種邊使膠原蛋白溶液濃縮邊模製成管狀或面狀以製造膠原蛋白結構 體的技術（專利文獻4)。所述技術是使膠原蛋白溶液經由透過性構件與聚乙二醇等濃縮劑 接觸，濃縮至50?100mg/ml的膠原蛋白濃度，再將該濃縮溶液模製成環狀，從而形成環狀 的膠原蛋白結構體。
[0007] 另外，還有一種膠原蛋白凝膠，所述膠原蛋白凝膠是使具有緩衝能力的鹽水溶液 和交聯劑同時與未進行纖維化的膠原蛋白溶液接觸以使膠原纖維之間交聯而形成的（專 利文獻5)。膠原蛋白凝膠作為細胞載體、醫療用材料等有效，但其熱穩定性差，有時凝膠強 度不充分。在使蛋白質交聯劑與膠原蛋白凝膠接觸的現有的交聯方法中，是在膠原纖維表 面進行交聯，交聯劑並沒有滲透到凝膠的中心部，所以凝膠的熱穩定性沒有充分提高。根據 專利文獻5,通過在膠原蛋白的纖維化過程中在纖維間發生交聯反應，可以通過交聯以及纖 維化來提高膠原蛋白凝膠的機械強度和熱穩定性。
[0008] 另外，還有一種膠原蛋白材料，所述材料是由用非纖維化膠原蛋白層夾持膠原蛋 白超微細纖維性無紡布狀多層體而得到的層疊體構成的（專利文獻6)。將膠原蛋白與尼龍 等合成高分子材料組合得到的醫用材料有可能引起來源於合成高分子材料的肉芽形成或 炎症等，在利用戊二醛或環氧化物等進行的膠原蛋白的交聯中，是鑑於交聯劑的毒性問題 等問題而提出的。
[0009] 此外，還有密度為約0. 01?0. 3g/cm3的膠原蛋白移植片（專利文獻7)。所述移植 片是在去端肽膠原的酸性水溶液中添加鹼使膠原蛋白沉澱，將沉澱物溶解形成分散液，在 流延成所期望的厚度後進行瞬時冷凍而形成膠原蛋白基質，再壓縮該基質使厚度為約1? 20_。至少有80 %的孔的直徑為35?282 μ m。
[0010] 而且，還有一種高密度培養組織的製造方法，所述的製造方法是循環培養含有膠 原蛋白和動物細胞的細胞培養液，使膠原蛋白和動物細胞高密度地聚集（專利文獻8、專利 文獻9)。根據專利文獻8、專利文獻9中記載的方法，通過簡單的操作，可以迅速製成膠原 蛋白和動物細胞高密度聚集的人工組織。
[0011] 現有技術文獻
[0012] 專利文獻
[0013] 專利文獻1 :日本特公平06-022579號公報
[0014] 專利文獻2 :日本專利第4681214號公報
[0015] 專利文獻3 :日本特公平07-000100號公報
[0016] 專利文獻4 :日本專利第3221690號公報
[0017] 專利文獻5 :日本專利第4064435號公報
[0018] 專利文獻6 :日本專利第4251665號公報
[0019] 專利文獻7 :日本專利第2820209號公報
[0020] 專利文獻8 :日本專利第4671365號公報
[0021] 專利文獻9 :日本特開2010-172247號公報


【發明內容】

[0022] 發明所要解決的課題
[0023] 機體中的膠原蛋白在細胞外以纖維狀存在，以每單位溼重量計，以如下的高濃度 構成各種組織：皮膚中25%、肌腱中32%、軟骨中16%、骨中23%、象牙質中18%。機體內 的膠原蛋白具有3條多肽鏈進行螺旋纏繞的結構，形成長約300nm、粗達1. 5nm的原膠原， 該原膠原一點一點地錯位締合，形成被稱作膠原蛋白細纖維的更粗更長的纖維。骨基質或 軟骨基質由該膠原蛋白細纖維構成。另外，所述的多個膠原蛋白細纖維進一步締合，形成被 稱作膠原纖維的強大的纖維。其粗度為數μm至數十μ m左右，構成皮膚的真皮或肌腱等。 這樣，通過膠原蛋白分子的締合形成適合於組織的膠原纖維結構，由此發揮著各種功能。
[0024] 但是，上述專利文獻1?3以及專利文獻6、專利文獻7中製造的膠原蛋白製品， 都是使用濃度比機體內的膠原蛋白濃度低的膠原蛋白溶液來調製的，製品內的膠原蛋白濃 度低、或者沒有形成粗而長的膠原纖維，無法成為組織等價物。例如，在專利文獻1的實施 例1中，邊攪拌〇. 3w/v%的缺端膠原溶液邊添加0. 3w/v%的變性缺端膠原溶液，並將該溶 液進行急速冷凍和冷凍乾燥。在膠原蛋白溶液中，膠原蛋白分子稀稀拉拉地溶解，所以沒有 形成粗而長的膠原纖維，將其冷凍乾燥而形成的乾燥物並不是由膠原纖維構成的乾燥物。
[0025] 另外，在專利文獻2的實施例3中，向濃度為3mg/ml的膠原蛋白中添加戊二醛，使 最終的戊二醛濃度達到〇. 〇5mM，再使得到的50g含戊二醛的膠原蛋白稀釋溶液流入冷凍幹 燥用的不鏽鋼製模具（llcmXS. 5cm)內，將不鏽鋼製模具冷卻至-40°C以使膠原蛋白發泡 液凍結，在真空減壓下（O.OlmmHg)、於30°C下冷凍乾燥24小時。在膠原蛋白發泡溶液內， 膠原蛋白分子稀稀拉拉地溶解，所以和專利文獻1 一樣，認為沒有形成粗而長的膠原纖維。
[0026] 此外，專利文獻3的實施例1是將濃度為0. 3%、pH3. 0的來自豬的肌腱的缺端膠 原在冰冷下攪勻，將其放入方形模板中冷凍，之後進行真空冷凍乾燥，與專利文獻1 一樣， 沒有形成粗而長的膠原纖維。
[0027] 另外，專利文獻6的實施例1是將1重量％的膠原蛋白溶液注入盤中形成膠原蛋 白溶液層，再將其在_20°C下冷凍24小時，接下來在-80°C下進行24小時的冷凍乾燥和壓 縮加工，形成非纖維化膠原蛋白層。該非纖維化膠原蛋白層也不是由膠原纖維構成的。需 要說明的是，專利文獻7也是為了製造膠原蛋白基質而將膠原蛋白溶液在_20°C下真空吸 引24小時，又在真空中乾燥約8小時以除去殘留的水分。在膠原蛋白溶液中，膠原蛋白分 子稀稀拉拉地溶解，所以沒有形成粗而長的膠原纖維，得到的膠原蛋白基質也不是由膠原 纖維構成的。
[0028] 另一方面，由於膠原蛋白會通過微量的水分而溶脹，所以乾燥體的製造並不容易。 而且，將膠原蛋白溶液通過冷凍乾燥來得到乾燥膠原蛋白時，處理時間長而且乾燥能量很 大，還不易模製成所期望的形狀。因此，希望開發一種膠原蛋白結構體的製造方法，所述膠 原蛋白結構體是膠原蛋白濃度高的人工材料，其還能夠模製成除膜或片以外的厚物，並且 能夠容易地進行製造。
[0029] 另外，上述專利文獻4和專利文獻5中記載的製品均為水合物。維持三重螺旋結構 的未變性的膠原蛋白，其保溼性優異、並且與各種細胞的粘合性優異，但溶解於溶液中的膠 原蛋白的熱變性溫度低，即使在常溫下也會變性，需要冷蔵保存。由於專利文獻4和專利文 獻5的製品均為水合物，所以熱穩定性差，並且有可能通過細菌感染等而發生變性。而且， 由於其含水量為90(w/w) %以上，所以保存時或運輸時的成本也高。因此，希望開發機體親 和性、熱穩定性優異且含水量低的膠原蛋白結構體。
[0030] 將人工組織或人工骨等醫用人工材料用於再生醫療時，在真皮、骨、關節軟骨、肌 腱等的缺損部位使用這些再生醫療材料以保持空間，並向其中導入細胞以促進再生。為了 使這種再生變得圓滑，要求醫療材料的機體親和性優異、能夠防止細胞流出、並且細胞能夠 適度增殖。上述專利文獻1記載的細胞侵入性醫用材料雖然是以聚酯、聚氨酯、氯乙烯這樣 的合成樹脂為載體，但只要其可以僅由機體材料構成，就可以避免由合成樹脂引起的炎症 等的發生。另外，上述專利文獻8或專利文獻9記載的方法在能夠對動物細胞進行三維培 養方面優異，但考慮到保存或運輸的簡便性，希望開發乾燥的膠原蛋白結構體。
[0031] 鑑於上述現狀，本發明的目的在於：提供一種含水量低、且能夠在醫療用途等廣泛 的範圍內使用的膠原蛋白結構體。
[0032] 另外，本發明的目的還在於：提供可以簡便調製的膠原蛋白結構體的製造方法。
[0033] 解決課題的方法
[0034] 本發明人發現：在膠原蛋白酸性溶液中加入中性緩衝液以生成膠原纖維，並溫和 地攪拌時，締合得到促進，析出粗而長的膠原纖維；若過濾該溶液，則可以得到膠原纖維濃 度為12?50 (w/v) %的粗膠原纖維；如果分離收集所述粗膠原纖維，並模製成規定形狀，則 通過冷凍乾燥等可以將其乾燥，此外，若將所述粗膠原纖維分散在親水性有機溶劑中，則可 以有效地將膠原纖維脫水，分離收集膠原纖維後模製成規定的形狀並進行風乾，能夠製造 膠原蛋白結構體，完成了本發明。
[0035] 即，本發明提供膠原蛋白結構體，其特徵在於：由平均直徑為1?5 μ m的膠原纖維 構成，含水量為〇?15(w/w) %，膠原蛋白密度為50?800mg/cm3。
[0036] 此外，本發明還提供所述膠原蛋白結構體，該結構體還包含選白細胞趨化因子、生 長因子、細胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一種以上的因子。
[0037] 另外，本發明還提供所述膠原蛋白結構體，該結構體被用作醫療用人工材料、疾病 治療用構件、化妝用材料或細胞培養材料。
[0038] 此外，本發明還提供膠原蛋白結構體的製造方法，該方法的特徵在於，進行以下步 驟：
[0039] 膠原纖維生成步驟：將膠原蛋白酸性溶液調節至中性，以生成膠原纖維；
[0040] 粗膠原纖維形成步驟：從含有所述膠原纖維的溶液中分離收集所述膠原纖維，以 形成膠原蛋白濃度為12?50 (w/v) %的粗膠原纖維；
[0041] 模製步驟：將所述粗膠原纖維模製成規定形狀；以及
[0042] 乾燥步驟：將所述模製步驟中得到的模製物乾燥。
[0043] 另外，本發明還提供所述膠原蛋白結構體的製造方法，該方法的特徵在於，在所述 粗膠原纖維形成步驟後，接著進行膠原纖維脫水步驟：將所述粗膠原纖維分散在親水性有 機溶劑中，之後從所述親水性有機溶劑中分離收集所述膠原纖維以進行脫水；
[0044] 又接著進行模製步驟：將所述的脫水後的膠原纖維模製。
[0045] 另外，本發明還提供所述膠原蛋白結構體的製造方法，該方法的特徵在於：在所述 膠原纖維脫水步驟後，接著進行處理步驟：對所述脫水後的膠原纖維進行交聯處理和/或 藥物處理；
[0046] 又接著進行乾燥步驟：乾燥所述處理後的膠原纖維。
[0047] 發明效果
[0048] 根據本發明，將膠原蛋白濃度為12?50(w/v) %的粗膠原纖維以規定形狀進行幹 燥、調製，所以其與機體內的膠原蛋白組織等價，又由於以多個膠原蛋白締合形成的膠原纖 維為原料，所以機械強度也優異。
[0049] 由於本發明的膠原蛋白結構體的含水量為0?15(w/w) %，所以熱穩定性優異，並 且可以有效避免由細菌等引起的變質。
[0050] 根據本發明的膠原蛋白結構體的製造方法，通過風乾可以使其乾燥，所以還可以 容易地製造薄片狀物以外的立體物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0051] 圖1是顯示實施例1中製造的薄片狀膠原蛋白結構體的圖。
[0052] 圖2是顯示實施例1中形成的粗膠原纖維的實體顯微鏡圖像的圖。
[0053] 圖3是顯示實施例1中調製的膠原蛋白結構體的表面的掃描型電子顯微鏡圖像 (SEM)的圖。
[0054] 圖4是顯示實施例1中調製的膠原蛋白結構體的截面的掃描型電子顯微鏡圖像 (SEM)的圖。
[0055] 圖5是顯示實施例1中調製的膠原蛋白結構體、以及使用差示掃描量熱計（DSC) 以2°C /分鐘的升溫速度測定製備所述膠原蛋白結構體時使用的膠原蛋白溶液的變性溫度 的結果的圖。
[0056] 圖6是顯示通過DMEM/10%的FBS使實施例1中得到的膠原蛋白結構體溶脹，之後 以1. 0X104細胞/cm2的細胞數接種HFF，20小時後用鈣黃綠素 AM將細胞染色時的螢光顯 微鏡的圖。
[0057] 圖7是顯示實施例2中調製的塊狀膠原蛋白結構體的圖。
[0058] 圖8是顯示比較例1中製造的、由膠原蛋白濃度為0. 2 (w/v) %的膠原蛋白溶液調 制的凝膠狀物乾燥後的乾燥物的掃描型電子顯微鏡（SEM)的圖。
[0059] 圖9是顯示通過DMEM/10%的FBS來馴化比較例1中得到的膠原蛋白凝膠，再以 1. OX 104細胞/cm2的細胞數接種HFF，20小時後用鈣黃綠素 AM將細胞染色時的螢光顯微 鏡的圖。
[0060] 圖10是顯示比較例3中製造的、將1 (w/v) %的膠原蛋白溶液冷凍乾燥而形成的膠 原蛋白海綿的掃描型電子顯微鏡（SEM)的圖。

【具體實施方式】
[0061] 第一本發明為膠原蛋白結構體，其特徵在於：包含平均直徑為1?5μπι的膠原纖 維，含水量為0?15(w/w) %，膠原蛋白密度為50?800mg/cm3。第二本發明為所述膠原 蛋白結構體，該結構體被用作醫療用人工材料、疾病治療用構件、化妝用材料或細胞培養材 料。以下，詳細說明本發明。
[0062] (1)膠原蛋白結構體
[0063] 在本說明書中，"膠原蛋白"是指構成真皮、韌帶、肌腱、骨、軟骨等的一種蛋白。將 膠原蛋白的三條肽鏈螺旋纏繞的產物稱作"膠原蛋白分子"。在本發明中，"膠原纖維"是指 膠原細纖維締合的產物，而所述膠原細纖維是指多個膠原蛋白分子締合的產物。
[0064] 一直以來，已知膠原蛋白有I?XXIX型，但作為本發明中使用的膠原蛋白，可以是 任意一種，還可以是新發現的膠原蛋白。機體內所含的膠原蛋白大部分都不溶於水，在本發 明中，可以廣泛地以能夠形成膠原纖維的膠原蛋白作為對象，例如，可以使用將動物的皮或 骨等的原料中所含的膠原蛋白通過添加蛋白酶等酶進行增溶後"增溶膠原蛋白"。需要說明 的是，在機體內，動物的皮或骨等的原料可以是微溶於中性鹽溶液或酸性溶液的"可溶性膠 原蛋白"。所述"增溶膠原蛋白"或"可溶性膠原蛋白"在進行化學處理時其構成胺基酸可以 被修飾。
[0065] 而且，構成膠原纖維的膠原蛋白分子可以是膠原蛋白衍生物。在本發明中，"膠原 蛋白衍生物"是指使用其他官能團對構成所述膠原蛋白分子的胺基酸進行了修飾的產物。 例如，有醯基化膠原蛋白或酯化膠原蛋白等。作為醯基化膠原蛋白，有琥珀醯化膠原蛋白、 鄰苯二甲醯化膠原蛋白、馬來醯化膠原蛋白等。例如，有將通過酶處理提取的缺端膠原溶液 調節至PH9?12,之後添加琥珀酸、鄰苯二甲酸酐、馬來酸酐等酸酐而形成的琥珀醯化膠原 蛋白、鄰苯二甲醯化膠原蛋白、馬來醯化膠原蛋白等醯基化膠原蛋白等。另外，作為酯化膠 原蛋白，除了將增溶膠原蛋白進行酯化而得到的酯化膠原蛋白外，還有將不溶性膠原蛋白 進行酯化後通過酶反應等進行了增溶的酯化膠原蛋白等。
[0066] 在本發明中，"膠原蛋白結構體"是指具有規定的形狀的固態物。因此，不包括粉 狀物、顆粒狀物等流動體。規定的形狀包括膜狀或片狀、圓柱、圓錐、多稜柱、多角錐、球等的 塊狀等。只要能夠維持規定的形狀即可，可以是不定形。需要說明的是，"膜狀"是指不足 200 μ m的薄膜狀，"片狀"是指200 μ m以上的膜狀。另外，"塊狀"是指平面狀物在高度方 向形成了厚度的塊狀。
[0067] 本發明的膠原蛋白結構體由乾燥狀態下的平均直徑為1?5μπι的膠原纖維構成。 如上所述，在膠原蛋白溶液中具有三重螺旋結構的膠原蛋白分子稀稀拉拉地溶解，通過風 乾等將這種膠原蛋白溶液模製成膜狀時，由膠原蛋白分子或其締合體形成膜。由於膠原蛋 白分子或其締合體細而短，所以膠原蛋白分子間或所述締合體間的間隙窄，細胞無法通過 該間隙。即使在這樣的膜上培養細胞，細胞也是分布在膜表面，而無法浸潤到內部。而且， 由於上述膜由細而短的膠原蛋白分子等構成，所以機械強度低。但在本發明中，由於膠原蛋 白結構體是由具有三重螺旋結構的膠原蛋白分子締合得到的膠原細纖維進一步締合而形 成的平均直徑為1?5μπι的粗膠原纖維構成的，所以膠原纖維間的間隙大，細胞可以自由 通過。由此，若將本發明的膠原蛋白結構體填充到機體中，則細胞浸潤至膠原蛋白結構體的 內部。而且，這種膠原蛋白的纖維結構與機體內的肌腱或韌帶等結締組織中的膠原蛋白的 纖維結構類似。因此，可以高度維持膠原蛋白自身的機械強度。
[0068] 構成本發明的膠原蛋白結構體的膠原纖維在乾燥狀態下的平均直徑為1?5 μ m， 更優選為2?3μπι。在該範圍內，可以得到細胞浸潤性優異的膠原蛋白結構體。需要說明 的是，在將膠原蛋白分子締合而形成的膠原纖維中，當為平均直徑1?5 μ m的膠原纖維時， 若不進行之後的物理切斷等處理，則平均纖維長度一般是1?l〇mm。需要說明的是，在本 發明中，上述的膠原纖維的平均直徑和平均纖維長度是指，對於乾燥狀態、即含水量為〇? 15(w/w) %的膠原蛋白結構體，按照後述的實施例中記載的方法進行測定而得到的值。
[0069] 本發明的膠原蛋白結構體的含水量為0?15 (w/w) %，更優選為0?10 (w/w) %。 由於該結構體是含水量低的乾燥物，所以熱穩定性優異，並且可以避免因細菌感染等引起 的變質。而且，由於其與粉末等不同，是膜狀、片狀、以及塊狀等模製物，所以通過模製成機 體的缺損部的形狀，向機體內的添加或填充也變得容易。需要說明的是，本發明中的含水量 是指，按照後述的實施例中記載的方法測定的值。
[0070] 本發明的膠原蛋白結構體，當其含水量為0?15 (w/w) %時，膠原蛋白密度為50? 800mg/cm3,更優選為110?600mg/cm3,特別優選為120?400mg/cm 3。膠原蛋白在機體內以 不溶性膠原蛋白的形式存在，在皮膚組織中以高達25 (w/v) %的濃度形成結締組織，而在肌 腱組織中以高達32 (w/v) %的濃度形成結締組織。為了從動物組織中提取膠原蛋白，需要將 膠原蛋白增溶，該增溶膠原蛋白的粘性高。因此，難以調製高濃度的膠原蛋白溶液，不存在 密度高的膠原蛋白結構體。但是，根據本發明，膠原蛋白密度為50?800mg/cm3,可以提供 與機體內的膠原蛋白密度均等的膠原蛋白結構體。該膠原蛋白結構體可用作組織等價物。 需要說明的是，在本發明中，膠原蛋白密度是指按照後述的實施例所示的方法測定的值。
[0071] 本發明的膠原蛋白結構體的空隙率為20?90%，更優選為30?80%，特別優選 為40?70%。由於其是多孔體，所以浸在溶劑中時在溶劑中迅速溶脹。需要說明的是，在 本發明中，空隙率是指按照後述的實施例所示的方法測定的值。
[0072] 本發明的膠原蛋白結構體是由膠原纖維形成的多孔體，平均孔徑為1?50μπι，更 優選為5?30 μ m。本發明的膠原蛋白結構體是將上述的膠原纖維象無紡布那樣摺疊而構 成的。因此，上述孔成為可與其他孔連通的孔。因此，當細胞侵入孔中時，細胞經由連通孔 可以侵入膠原蛋白結構體內部。在本發明中，"平均孔徑"是指按照後述實施例中記載的方 法測定的值。
[0073] 本發明的膠原蛋白結構體還可以包含選自細胞趨化因子、生長因子、細胞增殖因 子、凝血因子和抗凝血因子的一種以上的因子。通過添加這樣的成分，可以對膠原蛋白結構 體賦予創傷治癒、腫瘤細胞增殖抑制、免疫調節、骨形成、造血的調節、止血、抗凝血等效能。
[0074] 例如，作為趨化因子，有促紅細胞生成素、白介素 l(IL-l)等細胞因子、白介素 8(IL-8)、NAP-2、MIP-2 等趨化因子。
[0075] 作為生長因子，有上皮生長因子（Epidermal growth factor :EGF)、胰島素樣 生長因子（Insulin-like growth factor :IGF)、轉化生長因子（Transforming growth factor :TGF)、神經生長因子（Nerve growth factor :NGF)、來自血小板的生長因子 (Platelet-derived growth factor :PDGF)等。
[0076] 作為增殖因子，有來自腦的神經營養因子（Brain-derived neurotrophic factor :BDNF)、血管內皮細胞增殖因子（Vesicular endothelial growth factor :VEGF)、 粒細胞集落刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor :G_CSF)、粒細胞巨噬 細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor :GM_CSF)、 促紅細胞生成素 （Erythropoietin :EP0)、血小板生成素 （Thrombopoietin :TP0)、鹼性成 纖維細胞增殖因子（basic fibroblast growth factor :bFGF或FGF2)、肝細胞增殖因子 (Hepatocyte growth factor :HGF)等。
[0077] 作為凝血因子，有纖維蛋白原?纖維蛋白（因子I)、凝血酶原·凝血酶（因子II)、 組織因子（因子III、促凝血酶原激酶）等，作為抗凝血因子，有肝素、抗凝血酶III等。
[0078] 這種添加物可以是通過滲入等與膠原蛋白結構體結合的添加物，也可以是通過結 合媒介與膠原蛋白結構體結合的添加物，可以根據用途來適當選擇。例如，使上述成分溶解 液滲入膠原蛋白結構體中，吸附上述成分後進行乾燥而形成的膠原蛋白結構體，若將其填 充在創傷部，則緩慢釋放上述成分，因此可用作藥物傳遞系統等的一個構件。
[0079] 作為結合媒介，可以例示膠原蛋白結合結構域的多肽鏈。例如，可以例示血管性血 友病因子的膠原蛋白結合結構域、或膠原蛋白酶的膠原蛋白結合結構域。若使膠原蛋白結 合結構域的多肽鏈預先與上述成分結合，則上述成分可以經由所述的結合媒介與膠原纖維 穩定結合。
[0080] 本發明的膠原蛋白結構體可以是將膠原纖維內交聯而得到的結構體、或者將膠原 纖維間交聯而形成的結構體。由於膠原蛋白是機體構成物，所以其在機體內會被膠原蛋白 酶等分解。因此，在想要避免生物分解性的部位或用途、例如作為骨材料等使用時，導入交 聯體結構。通過導入交聯結構，可以抑制生物分解性，提高機械強度。可以只向膠原蛋白結 構體表面導入這種交聯結構，也可以將這種交聯結構導入到膠原蛋白結構體內部。
[0081] 本發明的膠原蛋白結構體被模製成膜狀、片狀、塊狀。所述塊狀除了包括柱狀、球 狀、推狀外，還可以模製成任意的形狀。特別是，還可以模製成機體組織的特定形狀。例如， 可以例示構成膝關節的半月體、鼓膜、指、鼻、耳等機體形狀、規定的軟骨形狀等。通過將本 發明的膠原蛋白結構體埋入皮下、或者將其作為人工骨填充在骨折部，使附近的細胞增殖； 或者，通過作為人工皮膚來塗布，可以構成外界與機體的邊界以防止細菌等的侵入，促進再 生功能。需要說明的是，在本發明的膠原蛋白結構體上還可以層疊其他的層。
[0082] 需要說明的是，如果對現有的膠原蛋白海綿進行壓縮加工，則形成膠原蛋白密度 高的片狀物。但是，這種膠原蛋白海綿並不是由膠原纖維構成的，因此，無法確保由膠原纖 維帶來的強度。本發明的膠原蛋白結構體是未經壓縮加工而模製成規定形狀的結構體，其 細胞浸潤性優異，並且即使將其含水使用時，也能確保膠由原纖維產生的強度。
[0083] (2)用途
[0084] 本發明的膠原蛋白結構體可用作醫療用人工材料、疾病治療用構件、化妝用材料、 細胞培養材料等。
[0085] 作為醫療用人工材料，其對真皮、骨、關節軟骨、肌腱、韌帶、血管等的缺損部位適 應，可以促進空間的保持或細胞的導入等。作為這樣的醫療用人工材料，可以以再生醫療作 為對象。另外，滲入了止血劑的膜狀膠原蛋白結構體可以包覆在出血部位，用作止血用構 件。
[0086] 作為疾病治療構件，例如可用於眼睛的創傷、重度燒傷、皮膚移植片的供給部位、 褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、外科手術的切開創傷或瘢痕瘤形成性創傷等。
[0087] 作為化妝材料，可以將膜狀或片狀的膠原蛋白結構體剪成臉的形狀，使化妝水等 滲入其中，從而用作面膜材料。
[0088] 作為細胞培養材料，如果將其用作細胞的三維培養基材，則可以對細胞進行繼代 培養。另外，由於其細胞侵入性或定著性優異，所以還可以用作藥物透過性試驗用的基材 等。作為成為對象的細胞，還可用於ES細胞或iPS細胞等細胞。
[0089]另外，作為醫療用人工材料的應用，可用作藥物傳遞系統的載體。使各種成分與膠 原蛋白結構體結合，之後塗布、填充到機體中，則藥物隨時間釋放，起到DDS的作用。
[0090] (3)膠原蛋白結構體的製造方法
[0091] 對上述膠原蛋白結構體的製造方法沒有限定。但可以通過以下步驟來製造：膠原 纖維生成步驟，將膠原蛋白酸性溶液調節至中性，以生成膠原纖維；粗膠原纖維形成步驟， 從含有所述膠原纖維的溶液中分離收集所述膠原纖維，形成膠原蛋白濃度為12?50 (w/ v) %的粗膠原纖維；模製步驟，將所述粗膠原纖維模製成規定形狀；以及乾燥步驟，將所述 模製步驟中得到的模製物乾燥。在所述粗膠原纖維形成步驟後，接著進行膠原纖維脫水步 驟，即，將所述粗膠原纖維分散在親水性有機溶劑中，之後從所述親水性有機溶劑中分離收 集所述膠原纖維進行脫水，之後再進行模製和乾燥，來製造膠原蛋白結構體。另外，在所述 膠原纖維脫水步驟後，接著進行對所述已脫水的膠原纖維進行交聯處理和/或藥物處理的 處理步驟，再接著進行將所述已處理的膠原纖維乾燥的乾燥步驟，從而可以製造交聯膠原 蛋白結構體。
[0092] 本發明中使用的膠原蛋白，可以由牛、豬、鳥、魚等動物的皮膚或其他含有膠原蛋 白的組織獲取。通常，在動物的結締組織中含有大量的膠原蛋白，但若通過熱處理來進行提 取，則膠原蛋白發生熱變性，其所特有的三重螺旋結構被破壞，形成明膠。在本發明中，所以 具有三重螺旋結構的膠原蛋白。作為這種膠原蛋白的提取方法，有以動物的骨、皮等作為 材料，通過酸處理、酶處理進行的增溶法等。作為膠原蛋白的提取原料，優選有牛、豬、雞、 鴕鳥、馬、魚類等的真皮或肌腱。若使用來自胎兒等的年輕動物的組織，則收率提高，因此優 選。
[0093] 另外，作為進行酶處理而形成的膠原蛋白溶液，例如可以使用將牛皮的真皮層細 碎、脫脂而得到的組織。將該組織懸浮於蒸餾水中使膠原蛋白終濃度達到〇. 5?5(w/v) %， 之後加入鹽酸，調節至pH3. 0。加入相對於膠原蛋白重量為百分之一的量的酸性蛋白酶，在 25°C下進行72小時的增溶處理。酶反應停止後，將上述酶增溶膠原蛋白液鹽析，將已回收 的鹽析沉澱分散在蒸餾水中，使膠原蛋白濃度達到1?5(w/v) %，再加入鹽酸進行均勻溶 解，可以形成膠原蛋白溶液。
[0094] 上述的膠原蛋白酸性溶液的pH優選為1. 0?6. 0,更優選為3. 0?4. 0。若pH超 過上述範圍，則膠原蛋白的纖維化有時會變得困難。
[0095] 本發明中，將上述膠原蛋白酸性溶液調節至中性。無論是通過酶處理來調製膠原 蛋白溶液，還是通過酸處理來調製膠原蛋白溶液，由於都是將膠原蛋白分子溶解於溶液中， 所以液性為酸性。在這種膠原蛋白酸性溶液中添加鹼性或中性緩衝液。作為鹼性溶液，可 以使用氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液等。另外，作為中性緩衝液，可以廣泛使用由磷酸和磷 酸鈉構成的ρΗ7· 0?9. 5的磷酸緩衝液、HEPES[2-[4-(2-羥乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸] 緩衝液（PH6. 8-8. 2)、枸櫞酸-磷酸緩衝液（pH2. 6?7. 0)、50mM的Tris緩衝液（pH7. 4)、 50mM的磷酸（pH7. 4)等在pH7. 0附近具有緩衝作用的緩衝液。需要說明的是，中性只要是 ρΗ6· 0?9. 0即可。
[0096] 上述的鹼性溶液或中性緩衝液中，在不改變pH的範圍內可以含有其他的鹽等。作 為這樣的鹽，可以例示氯化鈉、氯化鉀等。通過添加這種鹽，使膠原蛋白溶液達到與人的體 液等滲時，可以形成與機體內的膠原蛋白一樣具有約67nm的錯位的膠原纖維。因此，所添 加的鹽的量優選為中性處理後的膠原蛋白溶液的滲透壓能夠與人的體液等滲的量。
[0097] 在本發明中，中性處理後的膠原蛋白溶液的膠原蛋白濃度為0. 01?5(w/v) %，更 優選0. 1?5(w/v) %，特別優選為0. 3?5(w/v) %。若膠原蛋白濃度低於0. 01 (w/v) %，貝1J 之後的濃縮不易進行。另一方面，由於膠原蛋白的粘性高，所以難以調製濃度高於5(w/v) % 的膠原蛋白溶液。
[0098] 在本發明中，將上述中性處理後的膠原蛋白溶液在溫度4?45°C、更優選30? 37°C的範圍內靜置。在該範圍內，溶解於所述膠原蛋白溶液中的膠原蛋白分子通過上述中 性處理在溶液中締合，形成凝膠狀物。
[0099] 在本發明中，接著緩慢攪拌含有上述的凝膠狀物的溶液。通過緩慢攪拌，促進了構 成凝膠狀物的膠原蛋白分子相互間的締合，在保持膠原纖維結構的同時釋放出纖維間的水 分，粗且纖維長度長的膠原纖維在所述溶液中析出。因此，攪拌的程度只要是能夠促進膠原 蛋白分子的締合的程度即可。若進行激烈的攪拌，則生成的膠原纖維被物理性地截斷，形成 細而短的膠原纖維。通過緩慢攪拌而析出的膠原纖維在溶液中的平均直徑為1?ΙΟΟμ--， 纖維長度為1?l〇mm。需要說明的是，在本發明中，從膠原蛋白溶液中析出的膠原纖維的平 均直徑或平均纖維長度是指，在實體顯微鏡圖像中觀察到的纖維中，隨機選擇的20根纖維 的直徑或長度的平均值。
[0100] 將已析出該膠原纖維的溶液過濾或者離心分離時，可以分離收集所述膠原纖維。 在本發明中，將從膠原蛋白溶液中分離收集的膠原纖維稱作"粗膠原纖維"。因此，粗膠原 纖維以膠原纖維和水分作為主要成分。粗膠原纖維中所含的膠原纖維的濃度不足12(w/ v) %時，再次進行離心分離或過濾等，濃縮至膠原蛋白濃度為12?50(w/v) %、更優選15? 40 (w/v) %、特別優選 18 ?30 (w/v) %。
[0101] 通過過濾來分離收集上述膠原蛋白濃度的粗膠原纖維時，優選使用孔徑大小為 1 μ m?1mm、更優選10 μ m?100 μ m的濾紙。孔徑大小在上述範圍內時，可以有效處理大 量的膠原纖維。
[0102] 另一方面，也可以將所述膠原蛋白溶液離心分離，來分離收集粗膠原纖維。例如， 以10000?20000rpm的轉速離心10分鐘?1小時。需要說明的是，為了調整成上述範圍 的膠原蛋白濃度，可以多次進行離心分離。
[0103] 在本發明中，將分離收集的粗膠原纖維模製成規定形狀。模製後的粗膠原纖維的 形狀除了膜狀、片狀之外，還可以模製成各種立體結構。將膠原蛋白結構體用於組織充填 時，可以模製成能夠與機體內的充填部嵌合的形狀。
[0104] 例如，將已析出膠原纖維的膠原蛋白溶液過濾來分離收集粗膠原纖維時，例如，如 果在形成於漏鬥中間部的多孔濾紙載置部配設濾紙來過濾膠原蛋白溶液，則在濾紙上可以 將粗膠原纖維堆積成片狀或塊狀。也可以事先將所述濾紙載置部變形成規定形狀作為模型 來使用，在濾紙載置部堆積粗膠原纖維，以形成規定形狀。上述是連續進行粗膠原纖維形成 步驟和模製步驟的方案之一例。另外，也可以將重疊在濾紙上的粗膠原纖維填充在規定形 狀的模型中進行模製。
[0105] 在通過離心分離形成粗膠原纖維的情況下，也同樣可以應用上述的模製方法。例 如，進行離心分離時，使用離心管作為模型，在離心分離的同時可以將粗膠原纖維模製成規 定的形狀。這是連續進行粗膠原纖維形成步驟和模製步驟的方案之一例。需要說明的是， 離心分離後可以將粗膠原纖維填充在規定形狀的模具中進行模製。
[0106] 接著，將已模製的粗膠原纖維乾燥。在本發明的製造方法中，為了模製膠原蛋白濃 度為12?50(w/v) %的粗膠原纖維，可以將已模製的粗膠原纖維通過冷凍乾燥或風乾、溫 熱乾燥、真空吸引等進行脫水和乾燥，來製造膠原蛋白結構體。需要說明的是，預先得到圓 柱或稜柱等形狀的膠原蛋白結構體，通過切削該結構體等方法可以進一步進行造型。乾燥 的程度達到含水量為〇?15(w/w) %。這是由於與膠原蛋白溶液相比，乾燥品的保存穩定性 優異。
[0107] 本發明的膠原蛋白結構體在上述乾燥後，可以將其壓縮模製。構成本發明的膠原 蛋白結構體的膠原纖維的平均直徑為1?5μπι，其長度一般是1?10mm。如此粗且長的膠 原纖維象無紡布那樣堆積，可以確保細胞浸潤性和強度，因此即使進行壓縮模製，也不會降 低細胞浸潤性或強度，可以提高膠原蛋白濃度。這種壓縮模製可以在於燥後進行的以外的 步驟、例如將粗膠原纖維模製成規定形狀時等來進行。
[0108] 本發明中，在分離收集粗膠原纖維之前，可以在粗膠原纖維中添加其3?2000質 量份、優選5?1000質量份、更優選10?100質量份、特別優選10?30質量份的親水性有 機溶劑，調製分散有粗膠原纖維的親水性有機溶劑，接著進行過濾來分離收集粗膠原纖維， 再將粗膠原纖維脫水。本發明中使用的粗膠原纖維的膠原蛋白濃度為12?50(w/v) %，與 現有的股原蛋白溶液相比，其股原蛋白濃度商。因此，例如可以將其分散在100%乙醇等商 濃度的親水性有機溶劑中，由此可以有效地將親水性高的粗膠原纖維脫水。分散有粗膠原 纖維的親水性有機溶劑與膠原蛋白溶液相比流動性高，可以提高溶液的過濾效率和粗膠原 纖維模製後的乾燥效率。由於過濾操作時的堵塞得到抑制，所以可以製造具有厚度的塊狀 膠原蛋白結構體。
[0109] -直以來，已知利用乙醇等進行膠原蛋白的脫水，一般是邊逐漸提高醇濃度邊進 行脫水。但在本發明中，由於粗膠原纖維的膠原蛋白濃度高達12?50(w/v) %，所以即使是 使用乙醇的情況下，也可以使用100%的乙醇。因此，可以利用親水性有機溶劑簡便且有效 地進行脫水。
[0110] 作為分散粗膠原纖維的親水性有機溶劑，只要是能夠與水混和的含碳溶劑即可， 例如可以列舉醇、酮、醚、酯、極性非質子性溶劑等。作為醇，有甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇等 碳原子數為1?6的一元醇或乙二醇、丙二醇等多元醇等。作為酮，有丙酮、丁酮等。作為 醚，有二乙醚、甲基乙基醚、乙二醇單甲醚、二甘醇單丁醚等二醇醚、或四氫呋喃、二惡烷等 環狀醚等。而且，作為酯，有乙酸乙酯、乳酸乙酯等，作為極性非質子性溶劑，有二甲基亞碸 (DMS0)、二甲基甲醯胺（DMF)、吡啶等。其中，優選列舉能夠與水以任意比例混和的有機溶 齊U，例如丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、二甲基亞碸、二甲基甲醯胺等。其中，可 以優選使用乙醇、丙酮、二甲醚或它們的混合溶液。
[0111] 需要說明的是，使用的親水性有機溶劑的溫度優選為15°C以下。這是由於該溫度 不會使膠原纖維變性，並能夠維持膠原蛋白分子的三重螺旋結構。
[0112] 分散有粗膠原纖維的親水性有機溶劑，可以通過過濾等將粗膠原纖維和親水性有 機溶劑分離，其結果，可以將粗膠原纖維脫水。過濾含有粗膠原纖維的親水性有機溶劑時， 在形成於漏鬥中間部的多孔濾紙載置部配設濾紙，過濾分散有所述的粗膠原纖維的親水性 有機溶劑時，粗膠原纖維在濾紙上堆積成片狀。由此，可以連續進行粗膠原纖維的脫水和粗 膠原纖維的模製。還可以增加堆積量以模製成塊狀。需要說明的是，也可以通過規定的模 型來模製脫水後的粗膠原纖維。
[0113] 由於膠原蛋白的親水性高，所以不易進行乾燥，特別是不易進行立體物的乾燥。但 在本發明中，由於是使用上述膠原蛋白濃度的粗膠原纖維，並使用親水性有機溶劑將粗膠 原蛋白纖維脫水，所以能夠製造膠原蛋白密度高且能夠維持立體形狀的膠原蛋白結構體。
[0114] 模製後的粗膠原纖維，雖然還取決於其形狀或大小，但除冷凍乾燥之外，還可以通 過風乾來進行乾燥。通過風乾進行乾燥時廉價，還可以防止膠原纖維的熱變性。
[0115] 本發明的膠原蛋白結構體還可以具有交聯結構。通過導入交聯結構，可以抑制埋 設於機體後的分解。交聯方法可以根據用途適當選擇。例如，可以通過使甲醛或戊二醛等 醛類、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖等與膠原纖維或膠原蛋白結構體接觸來導入交聯結構。 另外，還可以添加碳化二亞胺類、環氧化物類和咪唑類交聯劑來進行交聯。另外，通過照射 紫外線或Y射線、電子射線等也可以進行交聯。需要說明的是，若將膠原蛋白自然乾燥，則 有時可以形成一部分交聯結構。
[0116] 本發明的膠原蛋白結構體，無論是否進行交聯，都可以結合選自細胞趨化因子、生 長因子、細胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一種以上的因子。因子的結合除了化學結 合外，還可以是吸附、擔載等物理結合。
[0117] 結合因子的步驟可以在製造膠原蛋白結構體的任意一個步驟中進行。例如，可以 在粗膠原纖維的乾燥步驟之前的任意一個步驟中，在膠原纖維上結合選自細胞趨化因子、 生長因子、細胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一種以上的因子。在哪個階段結合因 子，這可以根據所添加的成分的化學特性等適當選擇。例如，可以在粗膠原纖維中添加上述 因子並均勻攪拌，進行物理結合，之後將粗膠原纖維模製成規定形狀並進行乾燥，來製造膠 原蛋白結構體。另外，還可以將粗膠原纖維分散在親水性有機溶劑中，過濾該溶劑以進行脫 水，在脫水後的粗膠原纖維中混合上述成分後進行乾燥，製造膠原蛋白結構體。
[0118] 還可以在製造含水量為0?15 (w/w) %的膠原蛋白結構體後，使上述因子的水溶 液滲入膠原蛋白結構體中，之後再次進行乾燥，使含水量達到〇?15 (w/w) %。
[0119] 將上述因子與膠原蛋白結構體進行化學結合時，可以使用預先形成了與膠原蛋白 的結合媒介的因子。作為這種結合媒介，有血管性血友病因子的膠原蛋白結合結構域或膠 原蛋白酶的膠原蛋白結合結構域的多肽鏈。例如，先使膠原蛋白結合結構域的多肽鏈與上 述因子結合，再使具有這種結合媒介的因子的溶液滲入膠原蛋白結構體中，則所述因子經 由所述的結合媒介進行結合。膠原蛋白結合結構域的胺基酸序列與以膠原蛋白為底物的膠 原蛋白酶一樣，可以特異性地與膠原蛋白結合。
[0120] 本發明的膠原蛋白結構體的特徵在於：膠原蛋白密度高，並且被模製成所期望的 形狀。作為形狀，除膜狀、片狀外，根據用途還可以選擇塊狀等。以前存在膜狀或片狀等薄 層狀的模製品，還存在膠原蛋白海綿或管狀膠原蛋白結構體，但不存在膠原蛋白濃度高、且 為塊狀物的膠原蛋白結構體。這是由於難以提高幹燥前的膠原蛋白濃度。在本發明中，特 別是通過將粗膠原纖維分散在親水性有機溶劑中以將粗膠原纖維脫水，可以簡便地形成粗 膠原纖維的大的堆積物，並且還可以通過風乾等容易地進行乾燥。需要說明的是，還可以將 大的堆積物填充在規定形狀的模型中模製，來製造複雜形狀的膠原蛋白結構體。
[0121] 實施例
[0122] 接下來，列舉實施例，以具體說明本發明，但這些實施例對本發明沒有任何限制。
[0123] (實施例1)
[0124] (1)膠原蛋白結構體的調製
[0125] 使用絞肉機等將豬皮的真皮層絞碎，脫脂後充分清洗，以所得的組織作為原料。將 所述原料懸浮於混合有終濃度為5mg/ml的胃蛋白酶、50mM的醋酸的增溶水溶液中，使膠原 蛋白終濃度達到4. 5 (w/v) %，在4°C下進行一夜的增溶處理。在如上操作而得到的酶增溶 膠原蛋白液中加入氯化鈉使其終濃度達到5(w/v) %，進行鹽析，通過離心分離回收鹽析物。 回收的鹽析物分散在蒸饋水中使膠原蛋白濃度達到3 (w/v) %，加入鹽酸調節至pH3. 0,均 勻溶解，作為膠原蛋白溶液。
[0126] 向2. 5ml該膠原蛋白溶液（溫度為4°C )中添加47. 5ml溫度為4°C的磷酸緩衝生 理鹽水（PH7. 5)作為中性緩衝液，在溫度37°C下靜置24小時。
[0127] 通過靜置，膠原蛋白分子發生締合，形成凝膠狀物，若將其緩慢攪拌，則促進締合， 形成膠原纖維，將該膠原纖維分散在溶液中。將分散了的纖維注入孔徑為80 μ m的尼龍篩 上進行過濾，在篩上回收粗膠原纖維。該粗膠原纖維的膠原蛋白濃度為20 (w/v) %。
[0128] 接著，將篩上的膠原纖維冷凍乾燥，得到厚度為0. 2mm的片狀膠原蛋白結構體。膠 原蛋白結構體的外觀見圖1。
[0129] (2)含水量
[0130] 利用下述方法測定的上述膠原蛋白結構體的含水量為9. 4 (w/w) %。
[0131] (i)含水量的測定方法
[0132] 測定膠原蛋白結構體的質量（wl)。然後，在120°C下加熱2小時使水分蒸發，之後 測定膠原蛋白結構體的質量（w2)。以加熱前後的質量變化（wl-w2)作為水分量，以所述水 分量相對於膠原蛋白結構體質量（wl)的百分比（％)作為含水量。
[0133] (3)粗膠原纖維的平均直徑和平均纖維長度
[0134] 使用實體顯微鏡觀察尼龍篩上的粗膠原纖維。實體顯微鏡圖像見圖2。通過實體 顯微鏡隨機選出20根粗膠原纖維，測定直徑和纖維長度，算出20根纖維的平均值。平均 直徑為1. 15 μ m，平均纖維長度為4. 09mm。需要說明的是，纖維長度最短是1. 9mm，最長是 8. 75mm〇
[0135] (4)掃描型電子顯微鏡圖像（表面）
[0136] 利用掃描型電子顯微鏡（SEM)觀察所得的膠原蛋白結構體表面的纖維結構。結果 見圖3。
[0137] (5)構成膠原蛋白結構體的膠原纖維的平均直徑、孔徑
[0138] 對於上述膠原蛋白結構體，按照下述方法測定其在乾燥狀態下的纖維的平均直 徑、平均孔徑。結果見表1。膠原蛋白結構體的平均孔徑為18. 47 μ m，具有直徑為5?7 μ m 的足以使細胞浸潤的間隙。
[0139] (i)膠原纖維的平均直徑
[0140] 在掃描型電子顯微鏡（SEM)下觀察到的膠原纖維中，隨機選出20根纖維，測定它 們的直徑。算出20根纖維的直徑的平均值，作為平均直徑。
[0141] (ii)膠原纖維的平均孔徑
[0142] 在掃描型電子顯微鏡圖像（SEM)中觀察到的纖維中，隨機選出20處纖維孔，測定 它們的直徑。算出這20處孔徑的平均值，作為平均孔徑。
[0143] (6)掃描型電子顯微鏡圖像（截面）
[0144] 利用掃描型電子顯微鏡（SEM)觀察膠原蛋白結構體的截面的纖維結構。結果見圖 4。
[0145] (7)變性溫度
[0146] 使用差示掃描量熱計（DSC)，以2°C /分鐘的升溫速度測定所得的膠原蛋白結構 體和作為對照的膠原蛋白溶液的變性溫度。結果見圖5和表2。在膠原蛋白結構體中，在 115. 03°C下觀察到變性溫度的峰，但膠原蛋白溶液的變性溫度是42. 75°C，判明膠原蛋白結 構體的熱穩定性比膠原蛋白溶液的熱穩定性優異。
[0147] (8)膠原蛋白密度和空隙率
[0148] 利用下述方法測定膠原蛋白密度和空隙率時，膠原蛋白密度為200mg/cm3,空隙率 為 40. 9%。
[0149] (i)膠原蛋白密度的測定方法
[0150] 將膠原蛋白結構體準確地裁成邊長為1cm的正方形，製作試驗片。利用厚度計測 定所述試驗片的準確厚度，算出體積。然後，將試驗片溶解於5ml5mM的醋酸溶液中，利用微 量滴定法測定膠原蛋白濃度。由試驗片的體積和膠原蛋白濃度算出每單位體積的膠原蛋白 量，作為膠原蛋白密度。
[0151] (ii)空隙率
[0152] 利用使用了 Pascall40和440 (CARLO ERBA INTRUMENTS公司制）的水銀壓入法進 行測定。
[0153] (8)細胞浸潤性
[0154] 通過DMEM/10%的FBS使所得的膠原蛋白結構體溶脹，以1. OX 104細胞/cm2的細 胞數接種HFF，20小時後用鈣黃綠素 AM將細胞染色，在螢光顯微鏡下觀察。結果見圖6。
[0155] (實施例2)
[0156] (1)膠原蛋白結構體的調製
[0157] 使用絞肉機等將豬皮的真皮層絞碎，脫脂後充分清洗，以所得的組織作為原料。將 所述原料懸浮於混合有終濃度為5mg/ml的胃蛋白酶、50mM的醋酸的增溶水溶液中，使膠原 蛋白終濃度達到4. 5 (w/v) %，在4°C下進行一夜的增溶處理。在如上操作得到的酶增溶膠 原蛋白液中加入氯化鈉使其終濃度達到5 (w/v) %，進行鹽析，通過離心分離回收鹽析物。回 收的鹽析物分散在蒸餾水中使膠原蛋白濃度達到3 (w/v) %，加入鹽酸，調節至pH3. 0,均勻 溶解，調製膠原蛋白溶液。向5ml該膠原蛋白溶液（溫度為4°C )中添加95ml溫度為4°C 的磷酸緩衝生理鹽水（PH7. 5)作為中性緩衝液，在溫度37°C下靜置24小時。通過靜置，膠 原蛋白分子發生締合，形成了凝膠狀物。
[0158] 若將其溫和地攪拌，則促進締合，形成膠原纖維，將該膠原纖維分散在溶液中使其 沉澱。通過17, 500rpm、20分鐘的離心分離回收沉澱，得到粗膠原纖維。該粗膠原纖維的膠 原蛋白濃度為20 (w/v) %。
[0159] 接著，將得到的0. 75g粗膠原纖維投入到10g溫度為20°C的乙醇中，溫和地攪拌 10分鐘使其分散。過濾所得的分散液，分離收集粗膠原纖維。將分離收集的粗膠原纖維填 充在直徑為1〇_、高為1〇_的柱狀模型中，在室溫下風乾，得到膠原蛋白結構體。該結構體 見圖7。
[0160] (2)含水量、膠原蛋白密度、空隙率、膠原纖維的平均直徑
[0161] 對於得到的膠原蛋白結構體，與實施例1同樣地測定含水量、膠原蛋白密度、空隙 率、膠原纖維的平均直徑時，該膠原蛋白結構體的含水量為6. 7(w/w)%，膠原蛋白密度為 127mg/cm3,空隙率為76. 6%。另外，膠原纖維的平均直徑為1. 59μπι。
[0162] (比較例1)
[0163] (1)凝膠冷凍乾燥物的調製
[0164] 向實施例1中得到的膠原蛋白溶液中添加蒸餾水，稀釋至0. 4(w/v) %的濃度，然 後在4°C的條件下混和等量的兩倍濃縮磷酸緩衝生理鹽水（pH7. 5)，平穩地注入細胞培養 用板中，在溫度37°C下靜置24小時，製作凝膠狀物。
[0165] 不必從上述凝膠狀物中分離膠原纖維，直接將凝膠狀物冷凍乾燥。
[0166] (2)含水量和膠原蛋白密度
[0167] 進行與實施例1相同的操作，測定含水量和膠原蛋白密度時，該冷凍乾燥物的含 水量為10?15(w/w) %，膠原蛋白密度為2. Omg/cm3。
[0168] (3)膠原纖維的平均直徑、孔徑
[0169] 進行與實施例1相同的操作，測定構成冷凍乾燥物的膠原纖維的平均直徑、孔徑。 構成該膜的膠原纖維的平均直徑為〇. 17 μ m。需要說明的是，由於膠原纖維彼此相互接觸， 所以無法測定纖維長度。結果見表1。
[0170] (4)凝膠狀物的掃描型電子顯微鏡
[0171] 利用掃描型電子顯微鏡（SEM)觀察冷凍乾燥前的凝膠狀物。結果見圖8。
[0172] (5)細胞浸潤性
[0173] 通過DMEM/10 %的FBS馴化冷凍乾燥前的凝膠狀物，之後進行與實施例1相同的操 作，以1. OX 104細胞/cm2的細胞數接種HFF，20小時後用鈣黃綠素 AM將細胞染色，在螢光 顯微鏡下觀察。結果見圖9。在實施例1的圖6中，焦點一致的細胞和焦點不一致的細胞同 時存在，觀察到了細胞進行三維配置的狀態，但在圖9中，由於細胞的焦點一致，所以在單 一面上觀察到細胞以平面狀態存在。
[0174] (比較例2)
[0175] 向實施例1中得到的膠原蛋白溶液中加入5倍濃縮磷酸緩衝生理鹽水（pH7. 5) 進行調整，使膠原蛋白濃度達到〇.〇75(?八）％，在371：下強力（600印111)攪拌一夜，同時形 成膠原纖維。使用勻漿器攪拌該含有膠原纖維的溶液，進行物理剪切、或者抑制膠原蛋白 分子的長度方向的連接。該溶液中所含的膠原蛋白締合體的平均直徑為1. 13 μ m，長度為 213 μ m〇
[0176] 接著，通過17, 500rpm、20分鐘的離心分離回收膠原蛋白締合體，反覆進行離心分 離，直至膠原蛋白濃度達到30 (w/v) %。向得到的沉澱物中投入20倍量的乙醇使其分散，之 後注入到孔徑為80μπι的尼龍篩上進行過濾，在篩上回收粗膠原蛋白締合體。得到的沉澱 物沒有形成薄片，而是呈粉末狀。
[0177] (比較例3)
[0178] 向實施例1中得到的膠原蛋白溶液中添加蒸餾水，稀釋至0.8 (w/v) %的濃度，不 必進行中和，而是直接進行冷凍乾燥，製作膠原蛋白海綿。該膠原蛋白海綿是由多孔膜形成 的，並不是由膠原纖維構成的。圖10顯示膠原蛋白海綿的電子顯微鏡圖像。需要說明的是， 膠原蛋白密度為8mg/cm 3。
[0179] [表 1]
[0180]

【權利要求】
1. 一種膠原蛋白結構體，其特徵在於：由平均直徑為1?5μπι的膠原纖維構成，含水 量為0?15(w/w) %，膠原蛋白密度為50?800mg/cm3。
2. 根據權利要求1所述的膠原蛋白結構體，該膠原蛋白結構體還包含選自細胞趨化因 子、生長因子、細胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一種以上的因子。
3. 根據權利要求1或2所述的膠原蛋白結構體，該膠原蛋白結構體被用作醫療用人工 材料、疾病治療用構件、化妝用材料或細胞培養材料。
4. 一種膠原蛋白結構體的製造方法，其特徵在於，進行以下步驟： 膠原纖維生成步驟：將膠原蛋白酸性溶液調節至中性，以生成膠原纖維； 粗膠原纖維形成步驟：從含有所述膠原纖維的溶液中分離收集所述膠原纖維，以形成 膠原蛋白濃度為12?50 (w/v) %的粗膠原纖維； 模製步驟：將所述粗膠原纖維模製成規定形狀；以及 乾燥步驟：將所述模製步驟中得到的模製物乾燥。
5. 根據權利要求4所述的膠原蛋白結構體的製造方法，其特徵在於： 在所述粗膠原纖維形成步驟後，接著進行膠原纖維脫水步驟：將所述粗膠原纖維分散 在親水性有機溶劑中，之後從所述親水性有機溶劑中分離收集所述膠原纖維以進行脫水； 又接著進行模製步驟：將所述的脫水後的膠原纖維模製。
6. 根據權利要求5所述的膠原蛋白結構體的製造方法，其特徵在於： 在所述膠原纖維脫水步驟後，接著進行處理步驟：對所述已脫水的膠原纖維進行交聯 處理和/或藥物處理； 又接著進行乾燥步驟：乾燥所述已處理的膠原纖維。
【文檔編號】A61P19/02GK104144715SQ201380005501
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年1月11日 優先權日:2012年1月12日
【發明者】小倉孝之, 田中啟友, 大場康弘, 服部俊治 申請人:株式會社日皮