一種miR1432靶基因串聯模擬物、基因表達盒、表達載體、製備方法及應用的製作方法
2023-07-25 01:44:01 1
一種miR1432靶基因串聯模擬物、基因表達盒、表達載體、製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種miR1432靶基因串聯模擬物、基因表達盒、表達載體、製備方法及應用，屬於植物生物【技術領域】。本發明根據miR1432的核苷酸序列設計併合成靶基因串聯模擬物，構建籽粒特異啟動子質粒表達載體，並轉化農桿菌；利用農桿菌轉化水稻愈傷組織，經過篩選、分化得到轉基因陽性植株；再對轉基因植株籽粒產量相關的表型進行鑑定。通過轉基因植株表型分析表明，轉miR1432靶基因串聯模擬物水稻植株籽粒明顯變大，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】—種miR1432靶基因串聯模擬物、基因表達盒、表達載體、製備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明具體涉及一種miR1432靶基因串聯模擬物，同時還涉及基因表達盒、表達載體、製備方法及應用，屬於植物生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]近年來，通過大規模深度測序發現，在水稻籽粒發育過程中有大量的非編碼小RNA (Micro RNAs, miRNAs)參與杆粒中的基因表達調控(Zhu et al., 2008; Johnson etal., 2009; Xue, et al., 2009; Peng et al.，2011)。非編碼小RNA是真核生物廣泛存在的基因表達調控因子，通常長度在19~24nt之間，可在轉錄或轉錄後水平按照序列互補原則特異地作用於其靶基因，起到轉錄或翻譯抑制的作用，在維持基因組穩定性、生長發育、生物和非生物脅迫響應等過程中起重要調控作用(Ruiz-Ferrer and Voinnet, 2009; Voinnet, 2009;Vazquez et al.，2010)。
[0003]Zhu等對水稻花後兩個時期的籽粒進行miRNAs分析,闡明了 miRNAs在發育著籽粒中的動態變化(Zhu et al.，2008)。Peng等對花後18天水稻強弱勢粒中miRNAs測序分析表明，miRNAs在強弱勢粒中的表達存在差異(Peng et al.，2011)。Lan等研究了水稻籽粒整個發育過程不同時期的miRNAs表達類型，對其靶基因進行預測，結果可能參與碳水化合物代謝、激素信號和與種子成熟相關的途徑中。水稻灌漿結實期是蔗糖、澱粉的代謝過程(Lan et al.，2012)，對水稻庫、源器官中參與澱粉合成的基因進行了表達譜分析，參與蔗糖/澱粉代謝過程中的一些關鍵基因的表達量隨著籽粒發育不同時期存在差異(Ohdanetal.，2005)。而miRNA s是真核細胞中重要的在轉錄水平或轉錄後水平發揮作用的基因調控因子，可能在籽粒發育調控過程中起重要作用。迄今為止，現有技術中對水稻miR1432的功能並未闡明，關於miR1432調控籽粒大小的研究尚未見報導。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種miR1432靶基因串聯模擬物。
[0005]其次，本發明提供一種基於miR1432祀基因串聯I吳擬物的基因表達盒。
[0006]再者，本發明提供一種基於miR1432祀基因串聯I吳擬物的表達載體。
[0007]同時，本發明提供一種基於miR1432祀基因串聯模擬物的表達載體的製備方法。
[0008]最後，本發明提供一種miR1432靶基因串聯模擬物在提高水稻籽粒產量中的應用，以及一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體在提高水稻籽粒產量中的應用。
[0009]為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是:
[0010]一種miR1432靶基因串聯模擬物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的基因表達盒，其含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；還含有Gtl3a啟動子和NOS終止子。
[0012]具體的，一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的基因表達盒，其核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0013]一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體，其含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0014]具體的，一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體，其含有如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0015]一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體的製備方法，包括以下步驟:
[0016](1)從日本晴基因組0嫩中擴增6七13&啟動子，連接到載體？041^從1301中構建載體pCAMBIA1301-Gtl3a ；
[0017](2)從PCAMBIA1301中擴增NOS終止子，連接到載體pCAMBIA1301_Gtl3a中構建載體pCAMBIA1301-Gtl3a-N0S ；
[0018](3)將SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列連接到載體pCAMBIA1301_Gtl3a_N0S中構建表達載體 pCAMBIA1301-miR1432_STTM。
[0019]所述步驟(1)中擴增Gtl3a啟動子採用的引物序列如下:
[0020]Gtl3a_F:5』 ~CCCAAGCTT(Hindni)C ATGAGTAATG TGTGAGCATT ATGGGA-3』(如 SEQ IDN0.3所示)，
[0021]Gt 13a R: 5? -TTTTGGATCC(BaillHI)GTTGTTGTAG TACTAATGAA CTTGAATGG-3』(如 SEQ IDN0.4所示)；
[0022]擴增反應程序為:9·4度預變性2min，94度變性30s，58度退火30s，72度延伸2min，35個循環，最後72度延伸lOmin。
[0023]所述步驟(2)中擴增NOS終止子採用的引物序列如下:
[0024]N0S_F:5，~AAAAGAGCTC(SacI)AAATCTGCAG CGTTCAAAC-3，(如 SEQ ID N0.5 所示)，
[0025]NOS_R:5，-AAAAGAATTC(EcoRI)CGCGAAGCTT CCCGATCTAG-3，(如 SEQ ID N0.6 所示)；
[0026]擴增反應程序同上。
[0027]一種miR1432靶基因串聯模擬物在提高水稻籽粒產量中的應用。
[0028]一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體在提高水稻籽粒產量中的應用。
[0029]具體的，一種基於miR1432祀基因串聯I旲擬物的表達載體在提聞水稻杆粒廣量中的應用，包括以下步驟:取表達載體pCAMBIA1301-miR1432轉化農桿菌，浸染水稻愈傷組織，經含潮黴素篩選培養基的篩選和分化，得到轉基因陽性植株，PCR鑑定即可。
[0030]所述的鑑定採用的引物序列為:
[0031]Gtl3a_VF:5，-TATCCATCCA CCTTCCGTGT-3，(如 SEQ ID N0.7 所示)，
[0032]Gt13a_VR:5，-GCAACAGGAT TCAATCTTAA-3，(如 SEQ ID N0.8 所示)。
[0033]本發明的有益效果:
[0034]本發明根據miR1432的核苷酸序列設計併合成靶基因串聯模擬物，構建籽粒特異啟動子質粒表達載體，並轉化農桿菌；利用農桿菌轉化水稻愈傷組織，經過篩選、分化得到轉基因陽性植株；再對轉基因植株籽粒產量相關的表型進行鑑定。通過轉基因植株表型分析表明，轉miR1432靶基因串聯模擬物水稻植株籽粒明顯變大、產量增加，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】[0035]圖1為本發明實施例1中miR1432靶基因串聯模擬物的設計圖；
[0036]圖2為實施例4中陽性植株PCR鑑定的凝膠電泳圖；
[0037]圖3為實施例5中轉基因植株miR1432表達量鑑定圖；
[0038]圖4為實施例6中轉基因植株籽粒與野生型及空白載體對照的比較圖。
【具體實施方式】
[0039]下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
[0040]實施例1
[0041]miR1432靶基因串聯模擬物的設計:
[0042]根據miR1432的序列設計一段miR1432靶基因串聯模擬物，其中miR1432序列來自於 miRBase(accession number MIMAT0005966)。miR1432 祀基因模擬物與 miR1432 序列互補，但模擬物在miR1432自5』端第10位鹼基與第11位鹼基之間的位置插入3個鹼基，從而造成miR1432與模擬物匹配時在第10位鹼基與第11位鹼基之間形成一個突起。兩個靶基因模擬物以串聯方式排列，兩者中間加48nt的中間序列，構成miR1432靶基因串聯模擬物(見圖1)。
[0043]miR1432靶基因模擬物的核苷酸序列如下:
[0044]5，-TGTCGGTGTC ATTCACTCTC CTGAT-3，(見 SEQ ID N0.9)。
[0045]miR1432的核苷酸序列如下:
[0046]3』 -ACAGCCACAG UAGAGAGGAC UA-5』(見 SEQ ID N0.10)。
[0047]設計得到的miR1432靶基因串聯模擬物的核苷酸序列如下:
[0048]5』 -GGTACC(KpnI)TGTC GGTGTCATTC A(insertion)CTCTCCTGA TGTTGTTGTTGTTATGGTCT AATTTAAATATGGTCTAAAG AAGAAGAAT(spacer) T GTCGGTGTCA TTCA(insertion)CTCTCCTGATACTAGT(SpeI)-3』 (見 SEQ ID N0.1)。
[0049]實施例2
[0050]表達載體pCAMBIA1301-miR1432_STTM 的構建:
[0051]1、從日本晴基因組DNA (DNA提取方法同常規植物基因組DNA提取方法)中擴增出Gtl3a啟動子，擴增採用的引物序列為:
[0052]Gtl3a_F:5，-CCCAAGCTTC ATGAGTAATG TGTGAGCATT ATGGGA-3，(見 SEQ ID N0.3),
[0053]Gtl3a_R:5』 -TTTTGGATCC GTTGTTGTAG TACTAATGAA CTTGAATGG-3』(見 SEQ IDN0.4)。
[0054]PCR擴增體系如下表1所示，PCR反應程序為:94度預變性2min，94度變性30s，58度退火30s，72度延伸2min，35個循環，最後72度延伸lOmin。
[0055]表lGtl3a啟動子PCR擴增體系
【權利要求】
1.一種miR1432靶基因串聯模擬物，其特徵在於:其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的基因表達盒，其特徵在於:其含有如SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列；還含有Gtl3a啟動子和NOS終止子。
3.根據權利要求2所述的基於miR1432靶基因串聯模擬物的基因表達盒，其特徵在於:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體，其特徵在於:其含有如SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列。
5.一種基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體，其特徵在於:其含有如SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列。
6.—種如權利要求5所述的基於miR1432祀基因串聯模擬物的表達載體的製備方法，其特徵在於:包括以下步驟: Cl)從日本晴基因組DNA中擴增Gtl3a啟動子，連接到載體pCAMBIA1301中構建載體pCAMBIA1301-Gtl3a ； (2)從pCAMBIA1301中擴增NOS終止子，連接到載體pCAMBIA1301_Gtl3a中構建載體pCAMBIA1301-Gtl3a-N0S ； (3)將SEQID N0.1所示的核苷酸序列連接到載體pCAMBIA1301-Gtl3a_N0S中構建表達載體 pCAMBIA1301-miR1432_STTM。
7.一種如權利要求1所述的miR1432靶基因串聯模擬物在提高水稻籽粒產量中的應·用。
8.一種如權利要求4或5所述的基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體在提高水稻籽粒產量中的應用。
9.根據權利要求8所述的基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體在提高水稻籽粒產量中的應用，其特徵在於:包括以下步驟:取表達載體pCAMBIA1301-miR1432_STTM轉化農桿菌，浸染水稻愈傷組織，經含潮黴素篩選培養基的篩選和分化，得到轉基因陽性植株，PCR鑑定即可。
10.根據權利要求9所述的基於miR1432靶基因串聯模擬物的表達載體在提高水稻籽粒產量中的應用，其特徵在於:所述的鑑定採用的引物序列為:
Gtl3a_VF:5』 -TATCCATCCA CCTTCCGTGT-3』，
Gtl3a_VR:5』 -GCAACAGGAT TCAATCTTAA-3』。
【文檔編號】A01H5/10GK103710341SQ201310695733
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】孫紅正, 趙亞帆, 彭廷, 杜彥修, 王豐青, 趙全志, 李俊周, 張靜 申請人:河南農業大學