具螢光素酶活性抗輻射菌的製備方法

2023-05-11 00:25:21

專利名稱：具螢光素酶活性抗輻射菌的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種基因載體及其轉化子的製備方法，即一種具螢光素 酶活性的抗輻射菌的製備方法。
技術背景不同的生物對放射線的抵抗性不同，自然界中存在對放射線抵抗性很強的微生物，這類 微生物通常稱為放射線抵抗性細菌，又稱抗輻射菌或抗輻射奇球菌等，本文以下稱抗輻射菌。 代表性的抗輻射菌為"e&ococciAS屬，現在已經鑑定的有7類菌種(".ra力'o^/ra/w; Z .縦輝j') (Ferreira et a丄，Int. J. Syst. BacterioL, 47: 939-947, 1997)。這些細菌 對放射線的抵抗性約為大腸桿菌的100倍，人細胞的1000倍以上。利用基因工程的方法將外 源基因導入該細菌，能夠改變抗輻射菌的性狀，能夠從被放射性物質汙染的廢棄物中除去難 分解的物質和有毒物質，及利用該改造菌進行放射性重金屬的收集等。迄今為止，將外源基因導入抗輻射菌"ei/70coccz^屬，誘導表達異種蛋白質的有1、表 達甲苯雙加氧酶，將難分解的甲苯變成容易分解的物質(Lange eta丄，Nature Biotechnol.， 16:929-933, 1998)， 2、表達2價水銀離子還原酶，將2價水銀離子還原為毒性很低的揮發 性金屬水銀(Brim et al. ， Nature Biotechnol. ， 18: 85-90, 2000)。但到目前為止，將包 含外源基因的質粒載體進行抗輻射菌Zfej'"ococc"s _rac//w/iyra/7s以外的Zfei加cocc"s屬細菌 (如上述的Z .」ra必o/w《/73/w; A ^ra/7力's等)的轉化的研究還沒有。另外，上述重組轉化子的製作存在一些弊端使用了在""/JOCOCC"S屬細菌中不能自我複製的整合質粒，不能控制拷貝數，表達的蛋白質數量少，培養液中需要添加抗生素等。為了克服這些缺點，已有抗 輻射菌Zfei/ ococc"s 7"aoYooi/ra/7^大腸桿菌穿梭載體pRADl (用".Sark株由 來的質粒pUE10的複製子和大腸桿菌載體pMTL23開發而成)(Meima & Lidstrom, Appl. Environ. Microbiol., 66: 3856-3867, 2000 )，但沒有發現用pRADl進行抗輻射菌 "ej'"ococcz^ raWo^ra/w以外的Ztei"ococc^屬細菌的重組轉化的研究報告；同時pRADl 在含有抗生物質氯黴素的選擇性培養基中能穩定複製，在不含氯黴素的非選擇性培養基中不 能穩定存在，這個缺點在將導入外源基因的抗輻射菌釋放到野外開放環境時特別成為問題 在放射性物質汙染的土壤及廢水等環境中保持一定濃度的抗生物質是非常困難的，而且野外 投放抗生物質不但極有可能出現沒有必要的抗生物質的耐性細菌，同時引起環境的二次汙染; 其次，雖然作為野外開放環境的代替，可以用大規模的封閉環境來處理汙染物質，但大量的抗生物質使用不可避免汙染環境。另外，將導入外源基因的抗輻射菌釋放到野外的時候，有 必要隨時監控投放野外以後的生育、分布及對環境的影響等狀況，所以希望開發一種簡便的、 可實時監控重組轉化子的方法。 發明內容本發明的目的是提供有關抗輻射菌itei/70cocc"s ra^'op"^3朋s ATCC19172由來的潛在 性質粒pUE30、在抗輻射菌屬及大腸桿菌細胞內能夠複製的穿梭載體，及將這些穿梭載體導 入到抗輻射菌屬細菌，通過製備螢光素酶活性的轉化子，製備一種具螢光素酶活性抗輻射菌 的製備方法。本發明解決技術問題所採用的技術方案是-以抗輻射菌Zfe^ococc^raA'cp^/ a/w由來的質粒為基礎，與大腸桿菌中能自我複製的 質粒進行重組，製作穿梭載體。其次，將上述穿梭載體與具有北美產螢火蟲(Photinus pyralis)的寄主DNA由來的螢光素酶基因lux領域的DNA片段重組，成功構建具有螢光素酶 基因的質粒。再將該質粒導入抗輻射菌/^//7^0"^屬細菌，得到具有高螢光素酶活性的抗 輻射菌，從而成功構建了本發明。以抗輻射菌Zfe'加coco/sj"aJio/w/卵a/w由來的質粒，包含SEQ ID NO: 1所表示的鹼基序 列或其誘導體為基礎，與大腸桿菌中能自我複製的質粒進行重組而成的穿梭載體，以及穿梭 載體的轉化子。所述穿梭載體以及穿梭載體的轉化子與具有北美產螢火蟲(Photinus pyralis)的寄主 DNA由來的螢光素酶基因lux領域的DNA片段重組成具有螢光素酶基因的質粒，將該質粒導 入抗輻射菌"^Vwcocc"s屬細菌，獲得的螢光素酶活性抗輻射菌。具體製備方法為以下步驟(1) 質粒的分離精製將抗輻射菌"w'"ococciAS rarf/cp收"朋s ATCC19172用含0. 5 %胰蛋白腖、0.1 %葡萄糖、 0. 3 %酵母提取物的TGY培養基進行培養，離心分離收集菌體，用QIAfilter Plasmid kit提 取質粒成分，瓊脂糖凝膠電泳進行分離精製，將2.45 kb的質粒作為pUE30;(2) 鹼基序列的測定製作pUE30的酶切圖譜，獲取HincII及Aor51HI的酶切位點，用HincII消化pUE30的 2. 5 kb斷片，或用Aor51HI消化2. 5 kb的斷片與大腸桿菌載體質粒pGBM5的多克隆部位連 接製成質粒，然後用Kilo-sequence Deletion kit製作上述質粒的嵌套缺失的克隆，再用這些嵌套缺失的克隆作為模板，用市場上的通用引物，採用螢光標記鏈終止循環測序法測定 p,的DNA序列，電泳反應用DNA Sequencer ABI PRISM 377進行。測定得到如SEQ ID NO: l所示鹼基序列；(3) 穿梭載體的構建以pUE30為模板，SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3所示的鹼基序列(根據上述pUE30的 鹼基序列自行設計)合成的DNA為引物，用AmpliTaq Gold DNA polymerase進行PCR反應， 得到兩端設計有限制性內切酶Sphl部位、包含pUE30的全鹼基序列的PCR產物，用Sphl消 化包含有大腸桿菌載體PUC19複製開始領域、大腸桿菌中有活性的A即抗性基因、抗輻射菌 Z ej'/7ococcz^raWoo^朋s中有活性的氯黴素抗性基因的質粒pKatCAT，再與上述PCR產物的 Sphl消化物混合，用DNA連接酶連接，採用電穿孔法將上述連接物轉化大腸桿菌JM109株， 從抗Amp的轉化株中選擇具有pUE30和沐atCAT連接的質粒的株，獲穿梭載體質粒。(4) 以抗輻射菌Z ei/70cocc〃si-arf/octo"朋sATCC 13939的基因組DNA為模板，SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7所示的鹼基序列合成的DNA為引物，用Pfu Turbo DNA polymerase進行 PCR反應，增幅在抗輻射菌Z w'/ ococc"s ra^'oo^"a;w中具有活性的已知的groEL啟動子領 域，然後用Ncol內切酶消化含有螢光素酶基因的質粒pSP-lux+,用T4 DNA polymerase進 行DNA斷片末端的平滑化，將本步驟所述的PCR反應產物與平滑化的pSP-lux+連接，得到 pGroE-lux+2及pGroE-lux+4兩種質粒；(5) 用HindIII消化上述兩種質粒，進行切斷末端的平滑化處理，再用EcoRV消化，得 到含有groEL啟動子和螢光素酶基因的DNA斷片，將這一 DNA斷片插入步驟3所獲穿梭載體 質粒的EcoRV部位，構建具有螢光素酶基因的質粒，用構建的螢光素酶基因質粒轉化 "wVjococcm《ra"Ws，得到具有螢光素酶基因以及氯黴素抗性的菌株。發明的優點-本發明除能解決前述穿梭載體的各種問題。如己有的穿梭載體pRADl不能在抗輻射菌 Ztei/7ococc"s raWoc/i/rafls以外的Zte// ococci/s屬細菌內重組轉化，而本發明的載體能提供 在抗輻射菌/fe^ococc^屬細菌中進行基因重組操作技術時有用的質粒，在抗輻射菌屬及大 腸桿菌細胞內能自我複製；其次，PRADl在含有抗生物質氯黴素的選擇性培養基中能穩定復 制，在不含氯黴素的非選擇性培養基中不能穩定存在，而本載體在沒有抗生物質的非選擇性培養基條件下，能在抗輻射菌""/7MOCCM屬細菌中穩定存在。同時，本發明的載體中插入有螢光素酶基因lux領域的DNA片段，在抗輻射菌中具有高螢光素酶活性，可實時監控重組 轉化子。發明的應用前景本發明的穿梭載體在抗輻射菌屬細菌及大腸桿菌細胞內能夠自我複製，可利用於載體DNA 的基因重組及將外源基因導入到抗輻射菌屬細菌中。特別在抗輻射菌中進行DNA損傷修復基 因的克隆及表達方面有非常廣泛的應用前景。其次可利用在從包含放射性物質汙染的廢棄物 中除去難分解的物質和有毒物質、及進行放性線重金屬的收集技術上。本發明的穿梭載體因
為在非選擇性培養基條件下能在寄主內穩定保持，所以可以使用在無論是野外開放環境或封 閉環境的上述各種應用領域。另外，本發明的穿梭載體具有螢光素酶基因，在實時監控重組 轉化子的生育、分布及對環境的影響等方面也非常有用。


圖1是本發明的穿梭載體pZT15的限制性內切酶的酶切圖。 圖2是本發明的穿梭載體pZT17的限制性內切酶的酶切圖。圖3是抗輻射菌i)eZ"ocoa^ ra必o/;"g"a7w ATCC43672株中本發明的穿梭載體的穩定性 調查結果。〇為用pZT15進行轉化的轉化株；攀為用pZT17進行轉化的轉化株;A為用pRADl 進行轉化的轉化株。縱坐標表示全細菌中具有氯黴素抗性基因的細菌的比率，橫坐標表示繁 殖世代。圖4是本發明中包含螢光素酶基因的穿梭載體pZTGL2及pZTGL4構建方法的略圖。 圖5是用本發明pZTGL2及pZTGL4轉化到De/"ococc^ ra&o/wg/ta/w ATCC43672株中的螢光素酶活性的測定結果。螢光素酶活性單位用106個菌中1秒的發光量RLU (RelativeLight Unit)表示。
具體實施方式
以下根據實施例詳細介紹本發明，本發明沒有限定這些實施例。實施例h質粒的調製(1) 質粒的分離精製抗輻射菌Zfey"ococciAS ra力'opi/g朋/7s ATCC19172用TGY培養基(含0. 5 %胰蛋白腖、0.1 %葡萄糖、0.3 %酵母提取物)進行培養，離心分離收集菌體。用QIAfilter Plasmid kit (德 國QIAGEN)提取質粒成分，用瓊脂糖凝膠電泳進行分離精製，結果發現了約2.45kb的質粒。 Mackay等(Arch. Microbiol., 141:91-94, 1985)用電子顯微鏡觀察抗輻射菌Zfe '"ococc"s /"a力'o/w卵a/7s，報導了存在大小約2. 5 kb的質粒pUE30。因此，這次分離精製的2. 45 kb的 質粒作為pUE30。(2) 鹼基序列的測定製作上述精製的PUE30的酶切圖譜，發現在pUE30中各存在一個HincII及Aor51HI的酶 切位點。接下去將用HincII (New England Biolabs, Inc.)消化pUE30的2.5 kb的斷片， 或用Aor51HI (Takara Shuzo公司生產)消化的2. 5 kb的斷片與大腸桿菌載體質粒pGBM5的 多克隆部位連接製作質粒，然後用Kilo-sequence Deletion kit (Takara Shuzo公司)製作上述質粒的嵌套缺失的克隆，再用這些嵌套缺失的克隆作為模板，用市場上的通用引物，採 用螢光標記鏈終止循環測序法(BioDye Terminator cycle Sequencing kit, Applied Biosystems公司)測定pUE30的DNA序歹ij，電泳反應用DNA Sequencer ABI PRISM 377(Applied Biosystems公司)進行。測定得到的鹼基序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。 實施例2:穿梭載體pZT15、 pZT17的構建(1) pZT15的構建以pUE30為模板，SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3所示的鹼基序列(根據上述pUE30的 鹼基序列自行設計)合成的DNA為引物，用AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems)進行PCR反應，得到兩端設計有限制性內切酶Sphl部位、包含pUE30的全鹼基 序列的PCR產物。接著，用Sphl消化包含有大腸桿菌載體pUC19複製開始領域、大腸桿菌中 有活性的Amp抗性基因、抗輻射菌Zfe/zjococcz/^raG^^^s/w中有活性的氯黴素抗性基因的 質粒pKatCAT (Funayama等，Mutat. Res. ， 435: 151-161, 1999)，再與上述PCR產物的Sphl 消化物混合，用DNA連接酶連接。採用電穿孔法將上述連接物轉化大腸桿菌JM109株。從抗 Amp的轉化株中選擇具有pUE30和pKatCAT連接的質粒(大小約為6.1 kb)的株，將該質粒 命名為穿梭載體pZT15， pZT15的構造如圖1。(2) pZT17的構建以PUE30為模板，SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5所示的鹼基序列合成的DNA為引物， 用與(i)同樣的方法進行PCR反應，得到包含部分pUE30的鹼基序列(約2.3kb),同時兩 端設計有限制性內切酶Sphl部位的PCR產物。接著，與(1)同樣，和質粒pKatCAT連接， 再轉化大腸桿菌JM109株。從抗Amp的轉化株中選擇具有pUE30的一部分和pKatCAT連接的 質粒(大小約為5.8 kb)的株，將該質粒命名為穿梭載體pZT17， pZT17的構造如圖2。 實施例3:本發明穿梭載體pZT15及pZT17性質驗證(1) 用穿梭載體進行抗輻射菌/teJ'加coccus 5ra/7c//s ATCC43672株的重組轉化 用上述穿梭載體pZT15或pZT17重組轉化抗輻射菌Z ej'/70cocc^《ray^/s ATCC43672株，重組轉化參考Kitayama等的方法(J. BacterioL, 155: 1200-1207， 1983),採用CaCV法。 無論用pZT15還是pZT17穿梭載體，都能得到含有氯黴素抗性基因的菌株。用QIApr印 Minipr印Plasmid kit (Qiagen)從這些株中提取質粒成分，用瓊脂糖凝膠電泳進行分析， 確認在重組轉化株中保持有導入的質粒。(2) 穿梭載體在抗輻射菌Zfe^ococciAs gr朋必s的穩定性驗證將包含穿梭載體PZT15或pZT17的抗輻射菌/^'"ococc"s gra/^j's在含有氯黴素的TGY 培養基中培養24 Hr，將上述培養液稀釋256倍後在沒有含有氯黴素的TGY培養基中接種， 30'C培養。經過8世代分裂後的培養液再稀釋256倍，然而再在沒有含有氯黴素的TGY培養
基中接種，30'C培養。重複上述操作直到在非選擇培養基中分裂40代為止。每分裂8世代後 提取一部分培養液，分別在沒有含有氯黴素的TGY平板培養基及含有氯黴素的TGY平板培養 基上塗抹接種，測定培養液中氯黴素抗性細菌佔全細菌數的比率；作為對照，用Meima & Lidstrom(AppL Environ. Microbiol., 66: 3856-3867， 2000)記載的抗輻射菌Zfei"ococc〃5^ 大腸桿菌穿梭載體pRADl導入抗輻射菌Z e&oc0cci/s gra/^is後得到的重組轉化株中pRADl 的穩定性。其結果，pRADl在非選擇培養基中不能穩定存在，而pZT15及pZT17在非選擇培 養基條件下能夠在"ej'/ ococcivs《ra/ &'s中穩定存在(圖3)。 實施例4:具有螢光素酶基因的穿梭載體的構建及性質測定(1) pZTGL2及pZTGL4的構建以抗輻射菌""/70cocciAS j"aW0(A/ray7s ATCC13939的基因組DNA為模板，SEQ ID N0: 6 及SEQ ID NO: 7所示的鹼基序列(根據Meima等的論文自行設計，J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001)合成的DNA為引物，用Pfu Turbo DNA polymerase (Stratagene)進行 PCR反應，增幅Meima等(J. Bacteriol. 183: 3169-3175， 2001 )記載的在抗輻射菌 Z w'加cocc"5Lra力'o^/ra/w中具有活性的已知的groEL啟動子領域(131 bp)。然而用Ncol 內切酶消化含有螢光素酶基因的質粒。5 -11^+ (Promega)，用T4 DNA polymerase (Takara) 進行DNA斷片末端的平滑化。最後，將上述的PCR產物與平滑化的pSP-lux+連接，得到 pGroE-lux+2及pGroE-lux+4 (4235 bp)。用HindIII消化這些質粒，進行切斷末端的平滑化處理後，再用EcoRV進行消化，得到 含有groEL啟動子和螢光素酶基因的DNA斷片。接著將這個DNA斷片插入穿梭載體pZT17的 EcoRV部位，構建pZTGL2及pZTGL4 (7618 bp) 。 pZTGL2及pZTGL4的構建略圖如圖4。用構 建的質粒轉化"e^ococcu5 ^^/7^'s，得到氯黴素抗性的菌株。(2) 螢光素酶活性的測定將上述得到的重組轉化子在TGY培養基中3(TC培養，24 Hr後將培養液10 TL與等量的 Bright-Glo Uiciferase Assay Solution (Promega)混合，1分鐘後用Uimi Imager Fl (Roche Molecular Biochemicals)測定1分鐘間的化學發光活性。測定結果如圖5。由測定得知，含 有groEL啟動子和螢光素酶基因順向連接的pZTGL2的重組轉化子發現螢光素酶活性，而在含 有groEL啟動子和螢光素酶基因逆連接的pZTGL4的重組轉化子中沒有發現螢光素酶活性。 本發明所涉及的序列表 SEQ ID NO: 1tagggcagag aaactataga aaacttattc ggtttttctt gcagaagags ttagaactag 120 tccgccgccc actatscats acagagctas ggcgtttatt agaaagttgg gggacagaat 180 ttcgtaattg 3aacttattt tactagtsat cagttctatt tttttattaa acagatttat 240 tctctcaact attataattc ctataccgaa gagtacgaag atggatgcca agagcatagt 300 cattactccc ttttgcattg tcgctccttt casatcgtat gatacagtgt tctgacgcggcaatatg333 gggsgtgscg tgctgctgtg cctgtcgctt gagg33c3gc agcaggatgs aatccatgat cggctgaccs g己cgcggaca cctgtcggac tcgtcgtctt tgcgtaaggc360 420 480 540 600 660 720 780 84Q 900 960ggctgaggcg gagcgaaacc gggctaggta ggccaaatcc tgaccgtgcc aaagccccagctaaagtgca tcttgcctct gaaactgcgt tccagagggg aaaaaaccag ggtgctgtta attttaatta ctggtcaact tttgggccgt ttttcgaggg gtcaatgcgc gagaaatggc ccaaaaaatc agcagggsgg gaggtgctgg scctgccgtt csccccsact ggcsscsccc cgctgggagg cggggtgcta aggtaattct cgaagccagt caaaagtgtc tccaaacacc 1020 gttgattgag ccatcccact ccgaaggacc acttccgatg aacastcaaa agcaggacag 1080 ctataccgat agggtacggc aaatcgcccc cgtagttcca ctcctggacc tcattgttaa 1140 gcccctcatc cctgaacgag cagcccctaa tccctatctg gagatgggcc tagccgccct 1200 gcgtggcgag ccggtggaca cccgccgcgc ccaggtgcsg cccagcaagc agttccagaa 1260 ggccsgccgc ccagccccag ccgccccccc ccttgtgctg acctcagacc 3gggcg3gg3 1320 ccaggaggcc gccatgctgc tgcccgagat cgtcgaagag acgcgccgcc gcctggagaa 1380 gcaggcccgc gagaaccgcg agacgcgccg cgccgaacag cgcgcccgct ttcaccagct 1440aggccgcgcc ggacttcgtg ccgcctgtga gccttcagga 1500 gcagtgtgcg cgtcaccttg ccccgccctg aagtccctgg 1560 gcgccgacgc ggtgcttgat tcggtgccgt ggctgagcaa 1620:cc，actg 1680actcggcggc cttccscacg ccccasctgt tgctggcctt 1740 ggcacttccg gcgactgacc aatgagctgg agcacgctgg 1800 acgccgcgaa ggtcaagscc ggcatcggca ccacccggca 1860 gggcggtcaa gctscggccc agcacctgtg acgcctacct 1920sgtcgggcsg 1980cctatctaaa cacctgtgag ggtttagcca ggcaggagca 2040 ttaatcccaa tgcgaaaatg acttcgttgt gtttsgagcg 2100 aaatgaccct ccaggacacg gtttatgccc tgccgctgat 2160 agcaggccgg agccatcgga aacgcggcgt cgatcatctc 2220 gcacgccctg ggcgacagcc acagccgaag attctggtgt gggttgctgt gggcagccsc 2280 ccggaacggc tctttagagg cgttctcggc ccagttgctg cggttgctgg cggatgtgca 2340 ggagtccagc gagctgagaa accccggcgc gctgttcgcg gcccgccttc gcagcgcctg 2400 accttcgggg accgcgcccg aagaccaggc gctgctcagt tgggcttgag ggtgattacg 24 60 ttctgsg 2467cgtg3ccgcc cccaccgaicg aggccgtcag ccccccagcg gcctgcctgg ggcg3gctg3 gggcgcgcgg ccggtstccg gtg3tcccc3 cgtggcgcgg tacaccaccc ggtgattgsc ggcggcgcgc cctgtgggac ggctcgstctcgtcctgaaa acctgggccg gac3tttc3g gccgagcaga cggggsactg agcgaactcaSEQ ID NO: 2cgcggtacca tcttgcctct gaaactgcgt31SEQ ID NO: 3gcgggtsccg cactttagtg ctaiaitcttgc g31SEQ ID NO: 4gaaaccgggc taggtacccc aaatcctgac30 SEQ ID NO: 5Ggtggtaccc tcagacatga tcgggcctc SEQ ID NO: 6ttgtcagctt cggtcagttg acatSEQ ID NO: 7tggggtcctc ctgtgagtga
權利要求
1.具螢光素酶活性抗輻射菌的製備方法，其特徵在於以下步驟(1)以SEQ ID NO1所表示的鹼基序列或其誘導體為基礎，與大腸桿菌中能自我複製的質粒進行重組成穿梭載體，以及穿梭載體的轉化子；(2)所述穿梭載體以及穿梭載體的轉化子與具有北美產螢火蟲(Photinus pyralis)的寄主DNA由來的螢光素酶基因lux領域的DNA片段重組成具有螢光素酶基因的質粒pSP-lux+，將該質粒pSP-lux+導入抗輻射菌Deinococcus屬細菌，獲得具螢光素酶活性的抗輻射菌。
2. 按權利要求1所述具螢光素酶活性抗輻射菌的製備方法，其特徵在於所述步驟(2) 的具體操作為(1) 以抗輻射菌Z e^ococciAsra力'oo^r朋sATCC13939的基因組DNA為模板，SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7所示的鹼基序列合成的DNA為引物，用Pfu Turbo ■ polymerase進行 PCR反應，增幅在抗輻射菌Ztei/70cocc"s rafl^o^a/ s中具有活性的已知的groEL啟動子領 域，然後用Ncol內切酶消化含有螢光素酶基因的質粒pSP-lux+，用T4 DNA polymerase進 行DNA斷片末端的平滑化，將PCR反應產物與平滑化的pSP-lux+連接，得到pGroE-lux+2及 pGroE-lux+4兩種質粒；(2) 用HindIII消化上述兩種質粒，進行切斷末端的平滑化處理，再用EcoRV消化，得 到含有groEL啟動子和螢光素酶基因的DNA斷片，將這一 DNA斷片插入步驟1所獲穿梭載體 質粒的EcoRV部位，構建具有螢光素酶基因的質粒，用構建的螢光素酶基因質粒轉化 Ztej'/ ococci/s ^ra/7￡/i&得到具有螢光素酶基因的菌株。
全文摘要
具螢光素酶活性抗輻射菌的製備方法。以抗輻射菌Deinococcus radiopugnans由來的質粒為基礎，與大腸桿菌中能自我複製的質粒進行重組而成穿梭載體。載體與具有北美產螢火蟲(Photinus pyralis)的寄主DNA由來的螢光素酶基因lux領域的DNA片段重組成具有螢光素酶基因的質粒，將該質粒導入抗輻射菌屬細菌，用構建的質粒轉化Deinococcus grandis，得到氯黴素抗性的菌株。使用本發明製備的抗輻射菌可使用在野外開放封閉環境的各種領域，載體具有螢光素酶基因，在實時監控重組轉化子的生育、分布及對環境的影響等方面有較好的使用價值。
文檔編號C12N15/53GK101113426SQ20061015466
公開日2008年1月30日 申請日期2006年11月14日 優先權日2006年11月14日
發明者屠振力 申請人:浙江大學