細胞計測方法
2023-05-11 09:56:56 2
專利名稱：細胞計測方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞計測方法。
背景技術：
為進行醫藥的開發、檢查技術的開發等，用顯微鏡等對細胞進行觀察，進行各種計測，例如，收集有關醫藥對細胞的影響的信息等的各種信息。在進行這種觀察測定時，為提高效率，用於容納細胞進行觀察等的微小區域即觀察區域(以下簡單地稱作區域)使用多個二維配置的觀察支援設備。
在使用這種的觀察支援設備進行細胞的觀察測定等時，將觀察支援設備載置在顯微鏡的XYZ載物臺上，使載物臺相對於物鏡系統在二維方向(XY)相對移動，使多個區域依次位於顯微鏡的視野內，以一定的時間間隔進行對相同的對象進行攝影的時效的攝影(即時攝影)。因此，在應用了這種顯微鏡的光學測定器中，以使各區域正確地位於顯微鏡的視野內的方式精密地控制載物臺的相對移動。對於這樣的延時觀察，例如，作為非專利文獻，在「Shiro Kanegasaki et al.，A noveloptical assay system for the quantitative measurement ofchemotaxis.Journal of Immunological Methods 282(2003)1 11」中有記載。另外，作為專利文獻，在「日本專利特開2002-277754號公報」中有記載。
但是，在觀察細胞相對於化合物的反應、響應性等時，尋求測定每種細胞的響應性的差異、或測定在改變細胞的條件時的響應性的變異的方法。
這種情況下，通過以適當的濃度進行實驗，可以得到良好的測定結果。例如，在對每種細胞比較細胞相對於某刺激的響應性時，將改變細胞條件時的細胞響應性的變化進行比較時，若設定的濃度過高或過低，則難以了解每種細胞的差異，從而不能得到良好的實驗效果。
因此，在試驗細胞相對於化合物的響應性時，必須設定化合物刺激的適當的濃度。在設定該適當的濃度條件時，設定多個濃度條件，從而必須對各濃度分別進行細胞反應的計測。但是，在現有的技術中，至此還沒有考慮到該問題。
發明內容
本發明的目地在於，提供一種在計測有關細胞的反應時，可以一次性進行寬濃度範圍內的計測技術。
根據本發明第一方面，提供一種細胞計測方法，用攝像裝置對細胞組的圖像進行攝像，將圖像輸入信息處理裝置，在信息處理裝置中基於得到的圖像進行對細胞的計測，其特徵在於，在容納細胞組的細胞容納空間充滿液體，在上述細胞容納空間內配置細胞組，向上述細胞容納空間的液體供給特定的物質，在液體中從該細胞容納空間的一端朝另一端形成特定物質的濃度梯度，將上述細胞容納空間內的細胞組用攝像裝置攝像，輸入信息處理裝置，從得到的圖像生成表示細胞特徵量與特定物質的濃度的對應關係的信息。
根據本發明第二方面，提供一種細胞計測方法，用攝像裝置對細胞組的圖像進行攝像，將圖像輸入信息處理裝置，在信息處理裝置中基於得到的圖像進行對細胞的計測，其特徵在於，在容納細胞組的細胞容納空間充滿液體，在上述細胞容納空間配置細胞組，向上述細胞容納空間的液體供給特定的物質，在液體中從該細胞容納空間的一端朝另一端形成特定物質的濃度梯度，將上述細胞容納空間內的細胞組用攝像裝置攝像，輸入信息處理裝置，在信息處理裝置中，對得到的圖像沿上述濃度梯度區劃出多個區域，從各區域中的圖像提取特徵量，生成表示上述提取的特徵量與濃度梯度的對應關係的信息。
根據本發明第三方面，提供一種細胞計測方法，其特徵在於，使用細胞觀察支援裝置和信息處理裝置，其中，細胞觀察支援裝置具有在觀察時容納用於觀察的細胞組的細胞容納區域、和夾著上述細胞容納區域而連通，且在使用時分別裝入液體並用液體將上述細胞容納區域充滿的第一儲液空間及第二儲液空間；信息處理裝置在使用時獲取上述細胞容納區域容納的細胞組的圖像，基於獲取到的圖像收集有關細胞的信息；進行如下處理配置用於上述觀察的細胞組，在向第一儲液空間及第二儲液空間和上述細胞容納區域注滿液體，並且在上述第一儲液空間的液體中添加了刺激上述細胞的細胞刺激物之後，通過上述攝像裝置在不同的定時多次取得細胞組的圖像；對於各次取得的上述圖像，將上述圖像中顯示的細胞容納區域從第一儲液空間側沿第二儲液空間側分為多個區域，將各區域含有的細胞的總個數進行計算，同時識別表示預定的特徵量的特定的細胞，將其個數進行計算；基於上述的個數計算結果，對各區域算出相對於在各區域內計算的總個數的顯示特徵量的特定的細胞個數的比例；生成表示有關顯示上述特徵量的特定的細胞個數的比例的經時變化的信息；根據指令輸出表示上述經時變化的信息。
圖1是表示本發明一實施例的細胞計測系統的原理的說明圖；圖2是表示可以在進行本發明的細胞計測時使用的細胞計測系統的構成之一例框圖；圖3是表示可以用於本發明第一實施例的觀察部件的剖面圖；圖4是表示可以用於本發明第二實施例的觀察部件的剖面圖；圖5是表示可以用於本發明第三實施例的觀察部件的剖面圖；圖6是表示可以用於本發明第四實施例的觀察部件的剖面圖；圖7是表示可以用於本發明第五實施例的觀察部件的剖面圖；圖8是表示通過螢光觀察測定添加後的FITC分子的擴散結果的圖表；圖9是表示捕捉到通過刺激物質將細胞脫顆粒、改變對比度的特徵時的說明圖；圖10是表示對得到的圖像沿濃度梯度將圖像區劃為多區域，提取特徵量的方法的說明圖；圖11是在各地點(區域)計算脫顆粒細胞的比例的圖表；圖12是表示採用細胞運動的濃度梯度方向的速度作為趨化活性強度的指標，將該值在溝道上的各位置計測的結果的圖表；圖13是表示細胞對刺激具有何種的響應性的圖表。
具體實施例方式
下面，參照附圖對實施本發明的最佳方式進行說明。首先，說明本發明的原理，其次，說明具體的應用。
本發明中，細胞在多數存在的平面上再現性好地形成濃度梯度，通過計測在該濃度梯度上的各位置的細胞的反應，可以一次進行在寬濃度範圍內的計測。其結果是，根據本發明，可以減少探測最佳的細胞刺激濃度的所需要的實驗，提高實驗效率。另外，因為刺激細胞的化學物質的濃度可以根據位置連續地設定，故可以得到最佳的濃度的評價。
作為數據的解析方法，可以用如下的考慮方法。即，如後述，將被攝像的畫面劃分長方形的區域，在得到各區域中包含的細胞集團的特徵量後，進行解析。
(a)在最佳的濃度條件下的細胞的藥劑響應性評價方法(最佳條件的選定方法)測定細胞對藥劑的響應性時，對於該細胞及藥劑，必須選定適當的藥劑處理濃度。一直以來，在這種情況下，幾次選擇適當的濃度，獨立地測定在其各濃度的細胞性質，由此選定適當的濃度。這時，為選擇更適當的濃度，必須在多數濃度中重複實驗或比較進行。在本技術中，可以取得藥劑對細胞的處理濃度連續變化時的有關細胞性質變化的連續的數據。
例如，在有兩種以上的細胞組時，探討該各細胞組對藥劑的響應性的差異時，通過應用濃度梯度的本技術，可以對各細胞組一併取得在連續的藥劑濃度的響應性數據。從其一系列的濃度條件中選擇評價各細胞組的性質差異的最適合的濃度，在該濃度中可以進行各細胞組的藥劑響應性的比較。根據該方法，用多種藥劑濃度評價細胞響應性的一系列的檢測實驗不再需要，可以簡便並且確實地取得質量高的數據。
(b)表示細胞的藥劑響應性的特性的函數或值的取得根據本方法，可以連續地評價細胞對藥劑的響應性。以在此取得的「一系列的濃度—響應性關係數據」為基礎，可以取得表示細胞的藥劑響應性的特性的函數或值。例如，在某實驗中，在細胞對藥劑響應性用相對於該藥劑濃度的特定的函數的形式表示時，將用本實驗得到的數據對於其函數適當的調整，由此可以得到近似實驗的細胞組中的藥劑反應濃度依存性的函數。作為這裡所說的特定的函數，可以假設為S函數等，但不限於此。另外，由該函數取得與極大點、極小點、變極點等特徵的點對應的濃度，也可以將該值作為該細胞組對該藥劑的響應性的特徵量使用。
下面，就本發明的實施例參照圖1進行說明。如圖1所示，在本實施例中，在配置了多個細胞的空間形成用於觀察細胞的反應的有關特定的物質的濃度梯度。因此，由觀察部件100形成作為容納細胞的細胞容納空間110。圖1所示的細胞容納空間110，為進行原理說明，而模式的表示其結構。具體的結構後述在該細胞容納空間110充滿對細胞無害的液體120，其中，將要觀察的細胞200分散多個(細胞組)配置。在該狀態下，將用於觀察細胞反應的物質(以下稱為刺激物質)130從細胞容納空間110的一側注入，在細胞容納空間110內形成濃度梯度131。在該例中，注入溶解了化合物等的刺激物質130的溶液，在細胞容納空間110內形成特定的刺激物質130的濃度梯度131的狀況下，通過顯微鏡310，用數碼攝像機(例如CCD攝像機)320將各細胞200的狀態進行攝像。另外，在本實施例中，利用光刻技術在矽晶片上形成多個(例如12個)細胞容納空間110。而且，計測在各細胞容納空間110的濃度梯度的各位置的細胞的響應性。通過該方法，可以容易地進行化合物對細胞的作用的比較。
細胞對刺激物質的響應性因濃度而不同。作為細胞表示的響應，例如有遺傳因子的發現、形態變化、生理活性物質的釋放等各種的細胞現象。作為這些響應，細胞有時顯示可從外部觀察的何種特徵量。在本發明中，利用該性質，通過解析細胞組的圖像而提取細胞組顯示的特徵量，從而取得有關刺激物質的有關細胞響應的信息。本發明的情況下，在同樣的畫面內形成濃度梯度。因此，改變濃度，不需要重複實驗這種試行錯誤的費時。用一次的實驗就可以觀察濃度不同產生的響應。
細胞容納空間110具體而言如圖3～圖7所示，通過各種方式的觀察部件100可以實現。該細胞容納空間110是使細胞組在平面上分散配置，從外部通過顯微鏡等可以觀察的空間。因此，其具有扁平的構造。厚度例如為細胞大小的程度。
圖3所示的是，用光刻技術在矽晶片115上形成成為細胞容納空間110的扁平的切口、和成為位於其一端側且向細胞容納空間110流入刺激物質的源區域111及位於細胞容納空間110的另一端側且從細胞容納空間110排出刺激物質的漏空間112切口。矽晶片115載置在玻璃基板117上。由此，被矽晶片115和玻璃基板117夾持的切開的空間構成細胞容納空間110、源區域111及漏區域112。細胞容納空間110以成為細胞不重疊的程度的深度的扁平空間(channel溝道)的方式形成。另外，源區域111及漏區域112說到底只不過是將刺激物質的注入側和排出側為方便而起的名字。在為對稱的觀察部件時，源區域和漏區域無論在哪一側都無妨。
在矽晶片115的上面一側設置構成儲液的儲液構成部件116。儲液構成部件116例如用不鏽鋼等金屬構成。由該儲液構成部件116形成第一儲液空間113a及第三儲液空間113b、第二儲液空間114a及第四儲液空間114b。第一儲液空間113a及第三儲液空間113b與源區域111連通。另一方面，第二儲液空間114a及第四儲液空間114b與漏區域112連通。由於為這樣的構造，從而液體120通過細胞容納空間110，可以在第一儲液空間113a及第三儲液空間113b、第二儲液空間114a及第四儲液空間114b之間來往。但是，在本實施例中，液體本身不流動更適宜觀察，因此，在儲液構成部件116的上方設置了將第一儲液空間113a及第三儲液空間113b、第二儲液空間114a及第四儲液空間114b連通的連通部118。使液體120以到達連通部118的方式流入，由此可以控制因液體120中的壓力差引起的流動。
細胞、刺激物質等用注射器等注入。這時，通過將注射針設定為到達源區域111的狀態，可以可靠地注入細胞容納空間110。
圖4表示與圖3所示的構成具有大致同等構成的觀察部件100。該觀察部件100與在矽晶片115上形成的切口的構造不同，除此之外，與上述圖3所示的具有同樣的構造、同樣的功能。
圖5所示的觀察部件是不在上述的圖3及圖4所示的觀察部件上設置的第三儲液空間113b及第四儲液空間114b的構造。即，為具有第一儲液空間113、第二儲液空間114、源區域111、細胞容納空間110、漏區域112的構造。
另外，在圖3及圖4的觀察部件100上設置第三儲液空間113b及第四儲液空間114b的理由是為了吸收注入的液體的搖動。特別是，為了在離開源區域111的位置用注射器等注入刺激物質時，起到使擠出刺激物質時產生的壓力的一部分脫離的作用的效果。
圖6及圖7所示的觀察部件是與上述如圖3～圖5所示的不同的類型的部件。即，圖6所示的觀察部件和圖7所示的觀察部件在儲液空間的構成和細胞容納空間110的構成的方式不同。將第一儲液空間113打開，進行液體的注入、細胞的注入、刺激物質的注入等。另一方面，第二儲液空間114不開放。另外，作為構成細胞容納空間110的部件119，不用矽，而直接使用不鏽鋼。由此，具有使觀察部件的生產簡單化，降低製作成本的效果。
圖6是橫置型的即水平放置型的例子。另一方面，圖7所示的例子是縱置型的。在圖7所示的例子中，在有粘著性的細胞時，其附著在玻璃基板117上，因此，細胞不掉落。
在此，就濃度梯度的形成方法進行說明。
在上述圖5所示的觀察部件的情況下，在由細胞容納空間(溝道)110、由此連通的第一儲液空間113、第二儲液空間114構成的連通管結構的內部充滿適當的液體。另外，在第一儲液空間113及第二儲液空間114的任一個的管中注入含有形成濃度梯度的目標物質的溶液。由此，從源區域111朝漏區域112，物質在溝道110中擴散。另外，由於在上部的連通部118間充滿液體120，從而可以大幅減輕因振動與傾斜等的影響使管110內的液體劇烈移動而造成的濃度梯度的紊亂。由此，可以維持穩定的濃度梯度。
如圖3及圖4所示，也可以應用在第一儲液空間113a設置了作為分支路的第三儲液空間113b，另外在第二儲液空間114a設置了作為分支路的第四儲液空間114b的觀察部件。在這種情況下，分別從第一儲液空間113a或第二儲液空間114a投入含有目標刺激物質130的液體。另外，在從第一儲液空間113a側注入了刺激物質130的液體時，刺激物質從源區域111經過溝道110向漏區域擴散。另一方面，在從第二儲液空間114a側投入了刺激物質的液體時，如圖所示的漏區域112實質上成為源區域，相反側的源區域111實質上成為漏區域。因此，源區域和漏區域是在如圖3、圖4及圖5所示的觀察部件的情況下為了方便而使用的名稱。
另外，也可以用如圖6及圖7所示的觀察部件形成濃度梯度。這時，從開放的第一儲液空間113投入含有目標刺激物質130的液體，從源區域111經由溝道110向漏區域形成刺激物質130的濃度梯度。
就濃度梯度是如何形成，參照圖8進行說明。向圖4所示觀察部件充滿液體，在此，就投入了特定的刺激物質130時的擴散是如何引起的情況示於圖8。在該實驗中，在第一儲液空間113中添加了螢光物質FITC。如圖8所示的是將添加後的FITC分子的擴散通過螢光觀察測定的結果。圖標的橫軸表示溝道上的位置，縱軸表示螢光強度。在此表示FITC分子投入後，1分、3分、6分、9分及15分後的FITC分子的濃度梯度。可知在3分鐘之後，形成並維持大致直線的濃度梯度。
圖2表示本細胞計測裝置的構成之一例。圖2所示的細胞計測系統，具有在細胞容納空間110內容納的用於進行細胞的攝像的攝像裝置、和對攝像後的圖像進行處理並進行用於得到目標信息的信息處理的信息處理裝置。
攝像裝置在本實施例中由顯微鏡310、CCD攝像機320、載物臺316、載物臺驅動裝置315及信息處理裝置350構成。另一方面，信息處理裝置具有輸入裝置330及顯示裝置340、和計算機350。
計算機350具有中央處理器(CPU)351、存儲器352、輔助存儲單元353。在輔助存儲單元353中存儲該CPU351的執行程序360、數據370。
作為程序360，含有未圖示的OS之外的控制細胞計測裝置的計測動作的攝像序列361、控制載物臺的載物臺控制352、控制攝像的攝像控制363、進行得到的圖像數據解析的數據解析364。這些程序，是從網絡等上安裝到輔助存儲單元353中的。作為數據，圖像數據371是典型的數據。
對細胞的攝像，通過上述的觀察部件來準備上述的細胞組，通過計算機350的控制進行測定。測定根據預定的攝像序列進行。即，計算機350通過載物臺控制程序362驅動控制載物臺控制裝置315，將觀察部件的多個部位、例如12個部位用1分鐘一定的定時以攝像的方式進行定位。攝像序列361由XY載物臺316定位，同時由攝像控制程序363在一定的定時，以進行細胞容納空間110的細胞組的攝像的方式對CCD攝像機320發出指令。而且，在預定的定時，將CCD攝像機320拍攝到的圖像輸入存儲器352。
對輸入的圖像數據，通過數據解析程序64進行解析處理。首先，將攝像數據與攝像條件一起存儲於輔助存儲單元353。
之後，對得到的圖像進行指定的處理。要從攝像的圖像提取特徵量，可以有各種的方法。例如，對得到的圖像，沿濃度梯度將畫面區劃出多個區域，在每個區域進行它們中含有的細胞組表示的特徵量的提取。區域例如圖10所示，確定為長方形狀。該區域的大小可以適當設定。例如，在顯示裝置340條顯示的畫面上，用輸入裝置進行框架指定，由此對計算機350識別區域的方法。另外，通過指示區域數，將畫面均等分割為指示的區域數，也可以成為確定區域。無論哪一情況，由於都將計算機350識別的區域顯示給人，故可以將長方形的框架顯示在顯示畫面上。圖10是進行顯示的例子。
另外，在圖10上，為說明的方便，在表示區域的框架的左側付記1至4的數字。在圖10中，將畫面上方作為源側，將下方側作為漏側來表示。因此，如圖10所示的例子的情況中，從上順次下降的數值表示為濃度的濃的順序。
在此，作為細胞組表示的特徵量，例如可以列舉如下。當然也不局限於此。
(a)相對於各區域存在的細胞整體的個數的在該區域具有特定性質的細胞個數的比例
(a1)特定的性質是細胞的脫顆粒的情況(a2)a1中，細胞還是肥大細胞的情況(b)細胞的特徵量的平均值、中央值、分散、標準偏差等(b1)細胞的某特徵量是細胞的運動速度的情況(b2)細胞的某特徵量是細胞的運動方向特異性的情況特徵量的提取如圖10所示，通過用在區域內含有的細胞的圖像的對比度，調查細胞從膨脹到破裂的情況來進行。除此之外，對於大小例如平均直徑、面積等而言，與預定的閾值進行比較，通過調查是否超過閾值，也可以構成判斷。在此，如圖9所示，對捕捉到通過刺激物質將細胞脫顆粒，使對比度變化的特徵的情況進行說明。
首先，進行細胞組的個數的計數。即，分為對比度大的(例如，圖9所示的細胞212)與小的(圖9所示的細胞211)，分別進行識別，將其個數進行計數。識別有各種方法，例如，求輪廓、將封閉形狀的作為一個計數。這時，例如，基於輪廓線與周圍的亮度差，調查對比度。或者，對於圖像而言，使用過濾器分離對比度的大小，對分離出的圖像分別求輪廓，將細胞的個數進行計數。任一種方法都可以計算對比度高的細胞的個數與對比度低的細胞的個數。
另外，作為代替細胞個數的計數，也可以計測細胞區域佔畫面上的面積。例如，在將對比度作為指標識別細胞時，通過對特定的對比度範圍含有的畫面上的區域計數其面積，可以得到與細胞個數的計數同等的效果。例如，評價具有特定的對比度的細胞比例時，持有具有該性質的細胞相對於畫面上佔有的細胞的總面積的的比例，可以作為具有該性質的細胞相對於細胞總數的比例應用。
計算結果是，對各區域而言，通過求低對比度的細胞的個數對於整體細胞個數的比例，例如，可作為相對於刺激物質的脫顆粒率來掌握。再者，在不同的定時進行多次攝像時，在時間的經過的同時，濃度梯度的各濃度中可以生成顯示細胞相對於刺激物質的響應性的信息。圖10是基於這樣生成的信息，將細胞組表示的特徵量(在這裡是脫顆粒的細胞的比例，即刺激物質的活性強度)，對各濃度作為其時間變化顯示的圖。根據圖10表示的信息，可以看到，隨濃度不同活性度不同，及響應性隨時間的經過同時變化。
實施例下面，就實施例進行更具體的說明。
肥大細胞受某化合物的刺激，引起將細胞內現有的顆粒向細胞外釋放的稱為脫顆粒的反應。在脫顆粒時，細胞的形態與對比度變化，因此通過光學裝置可以區分脫顆粒的細胞。在此，在肥大細胞分散的環境中，形成肥大細胞刺激物質的濃度梯度，在各位置計算引起脫顆粒的細胞的比例。
在實驗中使用細胞趨藥性測定用的器具即TAXIScan(KK chamber)(參照Kanegasaki S et al.，(2003)J.Immunol.Methods 282，1-11)。向由矽晶片形成的微型溝道和玻璃基板的間隙(細胞容納空間110)導入由老鼠腹腔採取的肥大細胞，從靠近與微型溝道的一側端連接的源區域111，投入作為刺激物質的肥大細胞刺激劑。這此，作為刺激劑，導入1微升含有100μm的lysoPS與2000，1000，200，80μg/ml的刀豆素A的緩衝液。肥大細胞的脫顆粒是通過顯微鏡直接觀察溝道中的細胞而監視的。肥大細胞的脫顆粒通過以圖9所示的形態的變化與對比度的變化等為指標可以監視。另外，通過以對比度變化等作為指標，也可以用圖像解析進行自動的脫顆粒的檢測。
刺激劑由於通過擴散而形成濃度梯度，因畫面上的位置而使濃度不同。通過在其各地點分別測定脫顆粒活性的強度，來區分各地點的濃度的活性強度(圖10)。圖10右側所示的4幅圖追著時間計測是在照片中的4個區域按脫顆粒的細胞的比例的圖(橫軸是時間(min)、縱軸是比例(％))。濃度梯度通過擴散形成，放置某時間後，脫顆粒細胞的比例穩定。如上所述，在圖10所示的例子中，區域(1)濃度最高，按區域(2)、區域(3)、區域(4)的順序，具有依次降低的濃度梯度。
在圖10中，在細胞容納空間110配置肥大細胞，從畫面上方向導入刺激劑的照片(左刺激前、右刺激後)。畫面上方的細胞脫顆粒，從而使對比度下降，變白的被確認。另外，211表示脫顆粒的細胞，212是未脫顆粒的細胞。
在各地點(區域)計算的脫顆粒細胞的比例圖如圖11所示。縱軸是脫顆粒的細胞的比例(％)，橫軸是刺激劑的濃度(μg/ml)。在橫軸的數字表示形成了濃度梯度的溝道(細胞容納空間)上的區域。1是濃度最高的點，以1至4的順序濃度依次降低的方式形成濃度梯度。在此，1至4的序號與圖10標註的區域的序號(1)至(4)相對應。另外，用於刺激的刀豆素A的濃度為，黑四角2000μg/ml，白四角1000μg/ml，×號200μg/ml，白圓點80μg/ml。根據圖，在地點2和3中，刺激劑的濃度與脫顆粒細胞的比例有差異，並且其值與刺激劑的濃度相關。
在圖11所示的圖表中，在區域(1)及(4)中刺激劑的濃度差幾乎沒有，但是，在區域(2)及(3)中，由濃度引起的反應的差異明了。例如，在研究該細胞的相對於刺激強度的活性偏差，確認試藥給細胞活性的阻害/促進活性的實驗時，通過在區域(2)及(3)的區域採用該刺激物的濃度，可以取得適當的數據。這樣，通過利用濃度梯度，在一次實驗中可以觀察連續變化的濃度中細胞的反應，因此，可以在最適當的條件下進行比較。
下面，對其它的實施例進行說明。在此，敘述細胞的趨藥性的濃度變化。
對細胞的趨藥性的濃度變化而言，通過考慮濃度梯度上的細胞位置也可以檢測。細胞的趨藥性有感應細胞特定的因子的濃度梯度，向濃度濃的方向移動的功能。該趨藥性在特定的濃度活性最大，在高濃度與低濃度中活性減小，公知的是表示鍾型的活性。在現有的方法中，相對於濃度是活性鍾型的情況通過在多種濃度中進行實驗可以確認。若利用在濃度梯度環境中各位置濃度的不同，則可以容易地知道活性的濃度特性。該情況用實驗表示時，使用細胞細胞趨藥性測定用的器具即TAXiscan(KK chamber)(對於方法和材料等Kanegasaki S etal.，(2003)J.Immunol.methods 282，參照1-11)。
在此，將Jurkat細胞導入細胞容納空間110，在那裡測定形成SDF-1a的濃度梯度時的細胞的運動。作成濃度梯度時使用的SDF-1a的濃度用10及1nM的3種，對各區域注入1微升。Jurkat細胞表示在SDF-1a的濃度梯度方向趨藥性，因此，作為趨藥活性強度的指標採用細胞運動的濃度梯度方向的速度，在溝道(細胞容納空間110)上的各位置計測其值。圖12表示其結果。圖表的橫軸是溝道上的位置、縱軸表示趨藥活性(細胞移動速度的濃度梯度方向成分)。濃度梯度靠近圖的右方向形成的，因此越向右濃度越高。縱軸表示細胞運動的濃度梯度方向的速度(μg/sec)。在加上了SDF-1a的濃度為1nM時，如圖12所示，濃度越高趨藥活性越高。觀察10nM時的結果，可知在圖12(a)溝道上的途中地點有活性的峰值，靠近那裡的濃度變濃後趨藥活性減小。由此可知趨藥活性確實是鍾型的。
細胞運動的計測，例如，將圖10所示的畫面區劃成多個網格，在各網格內關注細胞輪廓線的局部，其輪廓線的位置與時間一起對何種的變位進行計測，通過平均這些變位的x成分、y成分，由平均的變位方向和攝像定時可以求出平均速度。
如上所述，在本發明中，給細胞容納空間投入細胞組，同時對細胞組注入刺激物質，形成該刺激物質的濃度梯度，對攝像並得到的圖像沿濃度梯度設置區域，基於圖像處理提取各區域的細胞組顯示的特徵量。至此，每一種濃度、每經過的時間、必須進行多少次的試行的計測，用一次的處理即可進行。
即，在測定因每個細胞的種類引起的響應性的差異、或測定改變細胞的條件時的響應性的變化時，通過適當的濃度進行實驗，可以得到良好的測定結果。例如，在將細胞對於某種刺激的響應性與細胞的每個種類比較、將改變了細胞的條件時的細胞響應性的變化進行比較時，若設定的濃度過高或過低，則不容易發現細胞的種類引起的差異，因此不能得到良好的實驗結果。
在此，細胞對刺激有何種的響應性如圖13(a)所示(橫軸濃度、縱軸活性)。在細胞在適當分散的環境中形成如圖13(b)(橫軸位置、縱軸濃度)所示的濃度梯度時，在濃度梯度中的各位置的細胞響應性如圖13(c)所示(橫軸位置、縱軸活性)。在通常的實驗中，實驗多數的濃度時，將濃度分階段地觀察各濃度的反應，因此實驗的濃度為斷續的。再者，為確認多數的濃度的反應，必須獨立地進行那麼多數量的實驗。若利用濃度梯度，則可以用一次獨立的試驗確認在連續的濃度範圍各濃度的細胞反應。由此，可以減少獨立試驗的個數從而實驗變得簡便。
另外，對於細胞的活性評價而言，以應用了細胞的形態變化與運動性、或螢光探測器等的細胞內分子的局部變化、遺傳因子的發現等在顯微鏡上可以評價的所有的生命現象為對象。
權利要求
1.一種細胞計測方法，用攝像裝置對細胞組的圖像進行攝像，將圖像輸入信息處理裝置，在信息處理裝置中基於得到的圖像進行對細胞的計測，其特徵在於，在容納細胞組的細胞容納空間充滿液體，在上述細胞容納空間內配置細胞組，向上述細胞容納空間的液體供給特定的物質，在液體中從該細胞容納空間的一端朝另一端形成特定物質的濃度梯度，將上述細胞容納空間內的細胞組用攝像裝置攝像，輸入信息處理裝置，從得到的圖像生成表示細胞特徵量與特定物質的濃度的對應關係的信息。
2.如權利要求1所述的細胞計測方法，其特徵在於，濃度梯度是通過螢光觀察將螢光物質形成的濃度梯度進行測定的濃度梯度。
3.如權利要求1或2所述的細胞計測方法，其特徵在於，細胞特徵量是細胞的脫顆粒、運動速度、運動方向特異性、大小、平均直徑、面積、對比度、形態變化、細胞內分子的局部變化、及遺傳因子發現中的任意一種。
4.如權利要求3所述的細胞計測方法，其特徵在於，細胞特徵量是從圖像求取輪廓，將封閉形狀作為一個細胞進行識別，從該識別的細胞得到的特徵量。
5.一種細胞計測方法，用攝像裝置對細胞組的圖像進行攝像，將圖像輸入信息處理裝置，在信息處理裝置中基於得到的圖像進行對細胞的計測，其特徵在於，在容納細胞組的細胞容納空間充滿液體，在上述細胞容納空間配置細胞組，向上述細胞容納空間的液體供給特定的物質，在液體中從該細胞容納空間的一端朝另一端形成特定物質的濃度梯度，將上述細胞容納空間內的細胞組用攝像裝置攝像，輸入信息處理裝置，在信息處理裝置中，對得到的圖像沿上述濃度梯度區劃出多個區域，從各區域中的圖像提取特徵量，生成表示上述提取的特徵量與濃度梯度的對應關係的信息。
6.如權利要求5所述的細胞計測方法，其特徵在於，上述特徵量是通過細胞的圖像表示的對比度的差異而提取的特徵量。
7.如權利要求6所述的細胞計測方法，其特徵在於，將相對於各區域存在的細胞整體的個數的、在該區域具有特定性質的細胞個數的比例作為特徵量從上述各區域的圖像提取。
8.如權利要求7所述的細胞計測方法，其特徵在於，上述特定的性質是細胞的脫顆粒。
9.如權利要求8所述的細胞計測方法，其特徵在於，上述細胞是肥大細胞。
10.如權利要求6所述的細胞計測方法，其特徵在於，將各區域存在的細胞整體的運動的平均值、中央值、分散及標準偏差中任一個指標作為特徵量從上述各區域的圖像提取。
11.如權利要求10所述的細胞計測方法，其特徵在於，作為上述特徵量提取的是有關細胞的運動速度的指標。
12.如權利要求10所述的細胞計測方法，其特徵在於，作為上述特徵量提取的是有關細胞的運動方向特異性的指標。
13.一種細胞計測方法，其特徵在於，使用細胞觀察支援裝置和信息處理裝置，進行下述處理其中，細胞觀察支援裝置具有在觀察時容納用於觀察的細胞組的細胞容納區域、和夾著上述細胞容納區域而連通，且在使用時分別裝入液體並用液體將上述細胞容納區域充滿的第一儲液空間及第二儲液空間；信息處理裝置在使用時獲取上述細胞容納區域容納的細胞組的圖像，基於獲取到的圖像收集有關細胞的信息，進行的處理為配置用於上述觀察的細胞組，在向第一儲液空間及第二儲液空間和上述細胞容納區域注滿液體，並且在上述第一儲液空間的液體中添加了刺激上述細胞的細胞刺激物之後，通過上述攝像裝置在不同的定時多次取得細胞組的圖像；對於各次取得的上述圖像，將上述圖像中顯示的細胞容納區域從第一儲液空間側沿第二儲液空間側分為多個區域，將各區域含有的細胞的總個數進行計算，同時識別表示預定的特徵量的特定的細胞，將其個數進行計算；基於上述的個數計算結果，對各區域算出相對於在各區域內計算的總個數的顯示特徵量的特定的細胞個數的比例；生成表示有關顯示上述特徵量的特定的細胞個數的比例的經時變化的信息；根據指令輸出表示上述經時變化的信息。
全文摘要
本發明提供一種在計測有關細胞的反應時，可以在寬範圍濃度範圍內一次性進行計測的技術。在充滿了液體(120)的細胞容納空間(110)中配置細胞組(200)。向細胞容納空間(110)內的液體供給特定的物質，從該細胞容納空間(110)的一端(111)朝另一端(112)在液體(120)中形成特定物質(130)的濃度梯度(131)。將細胞容納空間(110)內的細胞組用攝像裝置(320)攝像，輸入信息處理裝置，通過信息處理裝置，對得到的圖像沿上述濃度梯度區劃出多個區域，從各區域中的圖像提取特徵量，生成表示提取到的特徵量和濃度梯度的對應關係的信息。
文檔編號C12Q1/02GK101036043SQ200580033510
公開日2007年9月12日 申請日期2005年12月7日 優先權日2004年12月7日
發明者新田尚 申請人:艾菲克特細胞研究所股份有限公司