一種高產紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其應用的製作方法

2023-05-10 16:54:01 2

一種高產紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高產紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其應用。該蘭黑紫色桿菌被命名為ZSJ，已於2014年7月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.9465，經發酵培養即可產生紫色桿菌素。發酵培養基的溶質及濃度為：蛋白腖8.0～12.0g/L、牛肉粉2.0～4.0g/L、氯化鈉4.0～6.0g/L、葡萄糖為0.5～1.5g/L；發酵培養基的PH為4～8；發酵培養的溫度是7℃～30℃、時間為48h～240h。該菌株分泌生產的紫色桿菌素屬純天然色素，沒有人工色素潛在的危害，有很好的廣譜抗菌性、抗病毒性、抗腫瘤等生物活性，可廣泛應用於醫學、工業等各領域中。
CGMCC No.9465
2014.07.16
【專利說明】一種高產紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種高產紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌及其 應用。

【背景技術】
[0002] 色素一般分為人工合成色素和天然色素。人工合成色素是指用化學合成方法所制 得的有機色素，主要是從煤焦油中提取或以苯、甲苯、萘、苯胺等芳烴類化合物為原料合成。 因性能優異、價格低廉、使用方便而佔據色素市場的絕對優勢。但由於其存在安全性問題， 各國使用合成色素的產品品種在逐漸減少。
[0003] 天然色素是利用自然界存在的物質或培養方法生產得到的次生代謝物質進行一 定加工而製成，具有無毒副作用、安全可靠、色調自然和大多具備一定的營養價值等優點， 其開發利用越來越受到各領域人們的廣泛認可。目前天然色素主要以紅、黃色調為主，蘭紫 色素非常稀少，因此加快對蘭紫色素的開發研究具有重要意義。天然色素的主要來源為：植 物、動物、微生物。利用微生物資源生產天然色素，克服以動植物為原料生產天然色素受季 節、氣候、產地等諸多因素限制的缺點，並且易於工業化。因此採用微生物生產天然色素將 逐漸成為天然色素來源的主流。
[0004] 紫色桿菌素（Violacein，略寫為Vio)是細菌合成的一種次級代謝產物，由兩個色 氨酸分子氧化縮合而成，屬於吲哚衍生物。自19世紀首次從紫色色桿菌中發現這一色素以 來，又有不同的產紫色桿菌素的微生物陸續被發現。人們對紫色桿菌素的生物活性進行了 大量的探索，目前很多實驗已證明紫色桿菌素具有很強的生物活性：（1)抗原生動物活性； (2)光譜抗菌性；(3)抗病毒性；(4)抗腫瘤細胞；（5)其他功能，如能抗可見光輻射。另外 還可代替合成色素作染料，對天然原料和合成原料具有很好的著色效果。


【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供一種高產紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌 (Janthinobacterium Iividum)〇
[0006] 上述所述的蘭黑紫色桿菌被命名為ZSJ，已於2014年7月16日保藏於中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 9465。
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種蘭黑紫色桿菌在製備紫色桿菌素中的應用。
[0008] 本發明還有一個目的是提供一種生產紫色桿菌素的方法。
[0009] 上述所述的方法，包括如下步驟：首先將蘭黑紫色桿菌進行發酵培養；再用有機 溶劑提取紫色桿菌素。
[0010] 上述方法中，所述的發酵培養基的溶質及其濃度為：蛋白腖8. 0?12. Og/L、牛肉 粉2. 0?4. Og/L、氯化鈉4. 0?6. Og/L、葡萄糖為0? 5?I. 5g/L，溶劑為水。
[0011] 上述方法中，所述的發酵培養基具體為蛋白腖10. 〇g、牛肉粉3. 0g、氯化鈉5. 0g、 葡萄糖I. 0g，使用蒸饋水定容至lOOOmL。
[0012] 上述方法中，所述發酵培養基的PH為4?8 ;具體為7。
[0013] 上述方法中，所述發酵培養時間為48h?240h ;具體為168h。
[0014] 上述方法中，所述發酵培養溫度為7°C?30°C ;具體為21°C。
[0015] 上述方法中，所述提取紫色桿菌素的有機溶劑為無水甲醇或無水乙醇或無水異丙 醇或無水四氫呋喃；具體為無水甲醇。
[0016] 本發明最後一個目的是提供上述任一所述的方法在生產紫色桿菌素中的應用。
[0017] 本發明的蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum),保藏編號為CGMCC No. 9465。該蘭黑紫色桿菌經發酵培養即可產生紫色桿菌素。該菌株分泌的紫色桿菌素屬純 天然色素，沒有人工色素潛在的危害，有很好的廣譜抗菌性、抗病毒性、抗腫瘤等生物活性， 可廣泛應用於醫學、工業等各領域中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465的分離培養基 上菌落圖。
[0019] 圖2為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465的液體培養基 靜置培養圖。
[0020] 圖3為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465的液體培養基 搖床培養圖。
[0021] 圖4為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465在光學顯微鏡 下照片。
[0022] 圖5為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465產生的色素酸 鹼穩定性結果。圖5A為紫色桿菌素在不同PH的甲醇溶液中的顏色變化；圖5B為紫色桿菌 素在不同PH的甲醇溶液中置於自然光下照射36h後的顏色變化。
[0023] 圖6為紫色桿菌素在不同溶劑中的溶解程度及顏色。
[0024] 圖7為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465產生的色素的 主要成分HPLC分離圖譜。I為紫色桿菌素；II為脫氧紫色桿菌素。
[0025] 圖8為蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium Iividum)保藏號9465色素主要成分 (I )的核磁氫譜譜圖。
[0026] 圖9為紫色桿菌素粗產品圖。
[0027] 圖10為紫色桿菌素的分子結構圖。

【具體實施方式】
[0028] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0029] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0030] 實施例1、菌株的分離與鑑定
[0031] 一、分離
[0032] 1、樣品採集
[0033] 從北京市昌平區小湯山火雞老店採集關中羊奶，迅速冷藏，送回實驗室進行實驗。
[0034] 2、菌株的分離和篩選
[0035] 配製分離培養基：胰蛋白腖5. 0g、酵母浸膏2. 5g、葡萄糖I. 0g、脫脂奶粉I. 0g，使 用蒸餾水定容至1000ml，加入18. Og瓊脂，80°C水浴溶解。準備乾淨平皿若干，用廢舊報紙 包好。將培養基及平皿121°C滅菌15min。滅菌後，將培養基及平皿保溫至50?60°C。
[0036] 將樣品用生理鹽水進行10倍梯度的稀釋，取10-2、10-3、10-4梯度的樣品液I. Oml 分別加入滅菌後的平皿中，再倒入20?25ml保溫著的培養基，混勻、待凝。倒置平板於TC 培養箱，培養10天。
[0037] 培養後觀察發現有蘭紫色單菌落，挑取該菌落，進行劃線分離。重複劃線分離，直 至為單一純菌株（如圖1所示）。將上述獲得的菌株命名為ZSJ。
[0038] 二、鑑定
[0039] 1、形態鑑定
[0040] 液體培養基：胰蛋白腖5. 0g、酵母浸膏2. 5g、葡萄糖I. 0g、脫脂奶粉I. 0g，使用蒸 饋水定容至1000ml，121°C滅菌15min。
[0041] 將菌株ZSJ接種於液體培養基，菌株於液體培養基靜置培養（圖2)，搖床培養如圖 3所示。培養48h後，挑取單菌落，做革蘭氏染色實驗，在光學顯微鏡下觀察見圖4。
[0042] 結果表明：在分離培養基的平皿上，菌落呈深藍紫色，圓形，表面光滑，邊緣整齊； 顯微鏡觀察該菌株呈短杆狀，無芽孢、莢膜，無鞭毛，不運動，無孢子，革蘭氏陽性。
[0043] 2、分子鑑定
[0044] 採用北京天根生化科技有限公司的TIANnamp Bacteria細菌基因組DNA提 取試劑盒提取本發明篩選的ZSJ菌株的基因組DNA。以獲得的ZSJ菌株基因組DNA 為模板，採用下述引物PCR擴增菌株ZSJ的16s rDNA序列。引物序列如下：27f: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ;1492r :5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。
[0045] PCR反應條件：

【權利要求】
1. 一種高產紫色桿菌素的蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium lividum)，該菌株被命 名為ZSJ，已於2014年7月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為 CGMCC No. 9465。
2. 權利要求1所述蘭黑紫色桿菌（Janthinobacterium lividum)在製備紫色桿菌素中 的應用。
3. -種生產紫色桿菌素的方法，包括如下步驟：首先對權利要求1中所述蘭黑紫色杆 菌進行發酵培養；再用有機溶劑提取紫色桿菌素。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於：所述發酵培養基中溶質及其濃度為：蛋白 腖8. 0?12. Og/L、牛肉粉2. 0?4. Og/L、氯化鈉4. 0?6. Og/L、葡萄糖為0. 5?1. 5g/L， 溶劑為水；具體為蛋白腖10. 〇g、牛肉粉3. 0g、氯化鈉5. 0g、葡萄糖1. 0g，使用蒸饋水定容至 lOOOmL。
5. 根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於：所述發酵培養基的PH為4?8 ;具體 為7。
6. 根據權利要求3-5任一所述的方法，其特徵在於：所述發酵培養時間為48h?240h ; 具體為168h。
7. 根據權利要求3-6任一所述的方法，其特徵在於：所述發酵培養溫度為7°C?30°C ; 具體為21°C。
8. 根據權利要求3-7任一所述的方法，其特徵在於：所述提取紫色桿菌素的有機溶劑 為無水甲醇或無水乙醇或無水異丙醇或無水四氫呋喃；具體為無水甲醇。
9. 權利要求3-8任一所述的方法在生產紫色桿菌素中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK104293703SQ201410487660
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月22日 優先權日:2014年9月22日
【發明者】呂加平, 張書文, 劉鷺, 薛海曉, 逄曉陽, 蘆晶 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所