肝素雙糖混合物及其製備方法和應用的製作方法

2023-04-27 15:04:56

專利名稱：肝素雙糖混合物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及肝素雙糖混合物，其製備方法，使用該雙糖混合物作為標準物質對肝素或者低分子量肝素進行HPLC分析的方法，以及所述雙糖混合物的應用。
背景技術：
肝素(heparin)是一種糖胺聚糖類天然藥物,於1916年被Mclean發現具有抗凝血功能。1935年開始用作臨床抗凝藥物，成為僅次於胰島素的第2大天然產物藥物。廣泛用於治療血栓塞、暴發性流腦、敗血症、腎炎、急性心肌梗塞、動脈硬化等疾病，還具有澄清血漿脂質，降低膽固醇，抗平滑肌增生、促進纖維蛋白溶解等作用。肝素的化學本質是長短不一的酸性粘多糖長鏈的混合物，由硫酸化或乙醯化不同 的己糖醛酸(UA)和葡萄糖胺(GlcN)雙糖單位交替連接構成，形成分子量4 40kDa的糖鏈混合物。為了從肝素源中產生低分子量肝素，必須將較長的肝素多糖鏈打斷成較短的低分子量鏈。這一過程可以通過化學或酶的解聚作用來進行。將肝素用酶法或β消除法充分分解為雙糖時，主要產生8種雙糖a - AUA-2S-[1 — 4]_GlcNS_6S(I_S)a - AUA-2S-[1 — 4]-GlcNAc_6S(I_A)a - AUA-[1 — 4]_GlcNS_6S(II-S)a - AUA-[1 — 4]-GlcNAc_6S(II-A)a - AUA-2S-[1 — 4]-GlcNS(III-S)a - AUA-2S-[1 — 4]-GlcNAc (III-A)a-AUA-[I — 4]-GlcNS(IV-S)a-AUA-[I — 4]-GlcNAc (IV-A)這8種雙糖在豬腸黏膜或其它來源的肝素和低分子肝素中的含量大致保持恆定，利用這一點，通過分析雙糖組成可以判斷肝素或低分子肝素的來源，也可分析生產中的批次間差異。以SAX-HPLC法測定肝素或低分子肝素中的雙糖種類和含量比例，可作為一種質量是否合格的檢測手段。由於所用SAX-HPLC柱會在使用過程中漸漸因柱效下降而引起雙糖出峰位置漂移，這會對雙糖成分的判斷帶來幹擾，需要在每次使用前先以標準雙糖來標定出峰位置；並且，由於其中I-S含量過高，會掩蓋其他弱勢峰是在HPLC圖譜上如果有某個組分峰極高大時，其他組分峰在圖上就太弱小以至於接近基線而像是噪音峰，不利於對其他雙糖含量進行分析。本申請的發明人經過長期研究發現，通過本發明方法生產的雙糖混合物中不僅含有上述8種標準肝素雙糖，而且這8種雙糖的比例比較溫和，使用本發明雙糖混合物作為HPLC分析中的標準物質時，8個標準物的峰都能比較明顯地辨別出。在每次測定前均先用此混合雙糖做標定，則每次測定目標物的雙糖組分能確定辨別。
並且，本發明中的標準雙糖混合物，不但可以用做HPLC分析時的標準，還可以用來檢測以肝素雙糖為作用底物的酶如肝素雙糖脫硫酸酶、肝素雙糖雙鍵消除酶等的存在。在肝素酶中有時會含有這兩種雜質酶，其存在會導致肝素酶作用的最終產物被繼續作用，從而影響肝素酶降解反應後的色譜分析。所以在使用前對肝素酶中是否含有這二種雜質酶做檢測是很重要的。與現有技術中的相關方法相比，本發明簡單易操作，具有極高的實際使用價值。本發明提出一種標準雙糖混合物的製備方法，通過將肝素先用肝素酶I充分降解為二糖、四糖、六糖混合物，取其中的四糖和六糖，再分別以肝素酶II、III聯合充分降解，分離出產生的雙糖，這樣得到兩種混合雙糖，均含所有8種前述標準肝素雙糖，而且這8種雙糖的比例比較溫和。可以使用這二種混合雙糖之一或其混合物，作為HPLC分析的標準物 質。因此，本發明方法的創新點之一在於先用肝素酶I充分作用肝素，將肝素中含量過高的I-S雙糖除掉大部分，這樣獲得的雙糖混合物色譜圖上不致因I-S峰過於高大而掩蓋其他弱勢雙糖峰；另外將這樣的雙糖混合物用於檢測肝素雙糖脫硫酸酶、肝素雙糖雙鍵消除酶等為本發明首創。

發明內容
在本發明的一方面中，本發明提供了一種標準雙糖混合物，在所述混合物中，含有肝素雙糖 1-8，肝素雙糖 1-8 分別為I-S，I-A, II-S, II-A, III-S, 111-A, IV-S, IV-A00在本發明的另一方面，本發明提供了如上所述的標準雙糖混合物的製備方法，所述方法包括步驟I、肝素樣品用肝素酶I (編號EC 4. 2. 2. 7.)降解；步驟2、對步驟I所得的降解產物中的二、四、六糖進行分離，得到二糖，四糖，六糖；步驟3、步驟2中分離出的四糖、六糖分別用肝素酶II (肝素裂解酶II)、肝素酶III (編號 EC 4.2.2.8.)降解；步驟4、兩種降解物分別用層析柱分離，分別分離出二糖和四糖；步驟5、步驟4得到兩種二糖混合物，即為本發明的第一種雙糖混合物和第二種雙糖混合物。在進一步的實施方案中，所述步驟I的降解作用可以在4°C 35°C下進行，優選在8°C 30°C下進行，更優選在室溫下(25°C )進行。在進一步的實施方案中，所述步驟I的降解作用可以進行2-48小時，更優選2-24小時。在進一步的實施方案中，在步驟2中，利用柱層析方法對步驟I中所得的降解產品進行分離；優選在該方法中使用分子量分離範圍100-10000的凝膠過濾柱，比如聚丙烯醯胺類、葡聚糖凝膠類、瓊脂糖凝膠類，或其他類凝膠過濾柱；優選使用BiO-Gel P6柱(I. 5 X 100cm)。在上述步驟2的洗脫過程中，本領域技術人員可以根據選擇的洗脫柱選擇適當的洗脫液進行洗脫，例如氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫銨。在優選的實施方案中，例如在洗脫柱為Bio-Gel P6柱(I. 5X100cm)的情形中，可以使用O. 1-1. 0M(更優選O. 2M)碳酸氫
銨平衡並洗脫。在洗脫分離過程中，洗脫液的流速可以 由本領域技術人員適當選擇，優選O. 1-5. Oml/min,最優選 O. 1-1. Oml/min。在進一步的實施方案中，所述步驟3的降解作用可以在4°C 35°C下進行，優選在8°C 25 °C下進行，更優選在室溫下進行。在進一步的實施方案中，所述步驟3的降解作用可以進行6-48小時，更優選6_24小時。在進一步的實施方案中，在步驟4中，利用分子量分離範圍100-10000的凝膠過濾柱，比如聚丙烯醯胺類、葡聚糖凝膠類、瓊脂糖凝膠類，或其他類凝膠過濾柱；優選使用Bio-Gel P6 柱(I. 5XIOOcm)。在上述步驟2的洗脫過程中，本領域技術人員可以根據選擇的洗脫柱選擇適當的洗脫液進行洗脫，例如氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫銨等等的水溶液。在優選的實施方案中，例如在洗脫柱為Bio-Gel P6柱(I. 5X100cm)的情形中，可以使用O. 1-1. 0M(更優選O. 2M)碳酸氫銨平衡並洗脫。在洗脫分離過程中，洗脫液的流速可以由本領域技術人員適當選擇，優選O. 1-5. Oml/min,最優選 O. 1-1. Oml/min。在上述實施方案中，所述標準雙糖混合物既可以是上述方法中獲得的雙糖混合物1，也可以是雙糖混合物2，還可以是雙糖混合物I和2的混合物。在進一步優選的實施方案中，最優選步驟I為取肝素樣品，溶於Tris-HCl (50mM，含CaCl2IOmM, pH7. O)緩衝液中，優選肝素與Tris-HCl的質量體積比為200 1-10 (mg ml)，加入肝素酶 I(50mM Tris-HCl 溶液，含 CaCl2IOmM, ρΗ7· O) 2-20IU，在室溫下，酶解2-24小時。在進一步優選的實施方案中，最優選步驟2為取步驟I中獲得的降解產物，上一根Bio-Gel Ρ6柱(I. 5 X IOOcm)，以O. 2Μ碳酸氫銨平衡並洗脫，流速O. 1-1. Oml/min，分部收集，先後得到六糖、四糖、雙糖，將四糖和六糖分別匯合收集，60°C旋轉濃縮。在進一步優選的實施方案中，最優選步驟3為向步驟2獲得的四、六糖組分中，分別加入O. 1-2. OIU肝素酶II和O. 2-5. OIU肝素酶III (均為50mM Tris-HCl溶液，含CaCl2IOmM, pH7. O)，在室溫下，酶解6-24小時。在進一步優選的實施方案中，最優選步驟4為將步驟3中獲得的兩種降解物分別上一根Bio-Gel P6柱(I. 5 X IOOcm)，以O. 2M碳酸氫銨平衡並洗脫，流速O. 1-1. Oml/min,分部收集，先後得到四糖、雙糖在進一步的實施方案中，本發明提供了如上所述的標準雙糖混合物的製備方法，所述方法包括步驟I、取肝素樣品，溶於Tris-HCl (50mM，含CaCl2IOmM,pH7. O)緩衝液中，優選肝素與Tris-HCl的質量體積比為200 1-10 (mg ml)，加入肝素酶I (50mMTris_HCl溶液，含 CaCl2IOmM, ρΗ7· O) 2-20IU,在室溫下，酶解 2-24 小時；步驟2、取步驟I中獲得的降解產物，上一根Bio-Gel Ρ6柱(I. 5 X IOOcm)，以O. 2Μ碳酸氫銨平衡並洗脫，流速O. 1-1. Oml/min，分部收集，先後得到六糖、四糖、雙糖，將四糖和六糖分別匯合收集，60°C旋轉濃縮；步驟3、向步驟2獲得的四、六糖組分中，分別加入O. 1-2. OIU肝素酶II和
O.2-5. OIU 肝素酶 III (均為 50mM Tris-HCl 溶液，含 CaCl2IOmM, ρΗ7· O)，在室溫下，酶解6-24小時；步驟4、將步驟3中獲得的兩種降解物分別上一根Bio-Gel Ρ6柱(I. 5X 100cm)，以O. 2Μ碳酸氫銨平衡並洗脫，流速O. 1-1. Oml/min，分部收集，先後得到四糖、雙糖；
步驟5、步驟4得到兩種二糖混合物，分別匯合收集，60°C旋轉濃縮至1-lOml，冷凍乾燥，得到本發明的雙糖混合物I和雙糖混合物2。以上步驟中，肝素酶I，肝素酶II、肝素酶III為可商業獲得的酶，來源於IBEX公司或SIGMA公司或其他公司生產的，從天然菌體發酵並分離純化而來的產品，或者經基因工程表達並純化的產品。Bio-Gel P6柱為商業獲得純化填料裝填的柱子，填料來源於BIO-RAD公司生產的層析純化填料產品,柱子為普通玻璃柱。在本發明的另一方面，本發明提供了根據上述方法獲得的雙糖混合物，該雙糖混合物可以為第一種雙糖混合物、第二種雙糖混合物或者二者的混合物。在優選的實施方案中，所述第一種雙糖混合物為雙糖混合物1，其中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S，47% ;I-A，I. 3%；II-S, 18. 9%；II-A, 12. 5%；III-S, 3. 7%；III-A,
3.3% ；IV-S,4. 9% ；IV-A,6. 7%。在優選的實施方案中，所述第二種雙糖混合物為雙糖混合物2，其中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S，40.6% ； I-A, 5. 7% ；II-S,37. 7% ；II-A, I. 2% ；III-S,9. 9% ；III-A,2. 3% ；IV-S, I. 7% ；IV-A,0. 98%。在本發明的另一方面，本發明提供了使用本發明的雙糖混合物檢測肝素雙糖作用酶的存在的方法，所述方法包括I)將本發明的雙糖混合物配成l-10mg/ml溶液；2)向步驟I的溶液中加入可能含有肝素雙糖作用酶的物質，比如肝素雙糖脫硫酸酶、肝素雙糖雙鍵消除酶等，室溫反應6-24小時；3)用SAX-HPLC法(例如，色譜操作條件可以見表I)測定步驟2)反應後的雙糖圖譜，對比步驟I)中使用的雙糖混合物的SAX-HPLC圖譜，觀察各成分的色譜峰面積變化。在步驟I)中，可以使用任何適宜的溶劑，但是優選使用Tris-HCl溶液(50mM，含CaCl2IOmM, pH7. O)作為溶劑。在上述方法中，如果有某種雙糖色譜峰面積減少而另一種雙糖色譜峰面積增多，意味著該酶能催化一種雙糖變成另一種雙糖。如果有某種雙糖色譜峰面積減少而無他種雙糖色譜峰面積增多，則意味著該酶能作用該雙糖引起雙鍵消除。這樣的酶作為雜質存在於肝素酶中，會對酶反應帶來極大的幹擾。事先檢測其存在，可將幹擾提前排除。


圖I步驟2中，二糖、四糖、六糖的A232值對洗脫管數圖譜圖2步驟3中，四糖組分的A232值對洗脫管數圖譜圖3步驟3中，六糖組分的A232值對洗脫管數圖譜
圖4雙糖混合物I的SAX-HPLC圖譜圖5雙糖混合物2的SAX-HPLC圖譜圖6 —種催化I-S雙糖脫去2位硫酸基的酶作用混合雙糖後的SAX-HPLC圖譜圖7 —種能將肝素雙糖中ΛUA雙鍵破壞掉的酶作用混合雙糖後的SAX-HPLC圖譜
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。請對以下實施例中所使用的原料、儀器以及操作方法進行說明
實施例I :標準雙糖混合物的製備步驟I :肝素的酶 I 降解取 200mg 肝素，溶於 2ml Tris-HCl (50mM，含 CaC1210mM，pH7. 0)緩衝液中，加入肝素酶I (50mM Tris-HCl溶液，含CaC1210mM，pH7. O) 12IU，室溫酶解24小時；步驟2 : 二、四糖片段的分離取酶I降解產物，上一根Bio-Gel P6柱(I. 5 X 100cm)，以O. 2M碳酸氫銨平衡並洗脫，流速O. 3ml/min，分部收集，共收集130管，每管I. 5ml，測定A232值(A232指使用Icm光徑比色皿在分光光度計上測得的232nm的吸收值)，以A232值對洗脫管數作圖(以洗脫管數為X軸，以A232為Y軸做圖)，洗脫圖譜上顯示主要的3個峰，見圖1，由後至前分別是二糖、四糖、六糖，將四糖和六糖分別匯合收集，60 °C旋轉濃縮至Iml ；步驟3:四、六糖片段的酶II、III聯合降解向步驟2得到的四、六糖組分，分別加入IIU肝素酶II和2IU肝素酶III (均為50mM Tris-HCl溶液，含CaCl2IOmM, pH7. O)，室溫酶解24小時；步驟4 :聯合酶解物的分離步驟3得到的四、六糖組分再次降解物，分別上一根Bio-Gel P6柱(I. 5X 100cm)，洗脫條件同於步驟2，四、六糖組分再次降解物洗脫圖譜上均顯示主要的2個峰，見圖2、3，由後至前分別是二糖、四糖，將兩者分離出的二糖分別匯合收集，60°C旋轉濃縮至1ml，冷凍乾燥，由此得到雙糖混合物I和雙糖混合物2 ；所述標註雙糖混合物為雙糖混合物I或者雙糖混合物2或者二者的混合物。實施例2 :雙糖混合物組成的鑑定和含量測定採用SAX-HPLC法，色譜條件見表1，洗脫梯度和雙糖出峰時間分別見表2、3，兩種雙糖混合物的SAX-HPLC圖譜見圖4、5，雙糖的摩爾百分含量標示於圖上。由於色譜圖中除8種所述肝素雙糖的吸收峰外，尚含有其它幾個微小的吸收峰，這導致混合物中8種雙糖峰面積積分定量後比例之和小於100%。這幾個微小吸收峰可能是幾種微量的、難以確定化學本質的、非主要肝素雙糖或三糖、四糖，也可能是溶劑峰，暫時不能確定。雙糖混合物I中，8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I_S，47% ；I-A,1.3% ;II_S，18. 9% ；II-A, 12. 5% ；III-S,3. 7% ；III-A,3. 3% ；IV-S,4. 9% ;IV_A，6.7%。雙糖混合物2，中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S，40.6%;I-A，5. 7%;II-S，37. 7% ；II-A, I. 2% ；III-S,9. 9% ；III-A,2. 3% ；IV-S, I. 7% ；IV-A,0. 98%。表I SAX-HPLC法的色譜條件
權利要求
1.雙糖混合物，其特徵在於，在所述混合物中，含有肝素雙糖1-8，肝素雙糖1-8分別為l-s，I-A, II-S, II-A, III-S, 111-A, IV-S, IV-A。
2.根據權利要求I的雙糖混合物，其特徵在於，所述混合物為混合物1，其中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S,47% ；I-A, I. 3% ；II-S,18. 9% ；II-A, 12. 5% ；III-S,3. 7% ；III-A,3. 3% ；IV-S,4. 9% ;IV_A，6.7%。
3.根據權利要求I的雙糖混合物，其特徵在於，所述混合物為混合物2，其中8種肝素雙糖的摩爾含量分別為I-S，40.6% ；I-A,5. 7% ；II-S,37. 7% ；II-A, I. 2% ；III-S,9. 9% ；III-A,2. 3% ；IV-S, I. 7% ；IV-A,0. 98%。
4.根據權利要求I所述的雙糖混合物的製備方法，包括以下步驟 步驟I、肝素樣品用肝素酶I降解； 步驟2、對步驟I所得的降解產物中的二、四、六糖進行分離，得到二糖，四糖，六糖； 步驟3、步驟2中分離出的四糖和六糖均使用肝素酶II和肝素酶III降解； 步驟4、降解物分別用層析柱分離，分別分離出二糖和四糖； 步驟5、步驟4得到兩種二糖混合物，即第一種混合物和第二種混合物。
5.根據權利要求4的方法，其中所述步驟I的降解作用可以在4°C 35°C下進行。
6.根據權利要求5的方法，其中所述步驟I的降解作用在室溫下進行。
7.根據權利要求6的方法，其中所述步驟I的降解作用在室溫下進行2-24小時。
8.根據權利要求4 7任一項的方法，其中在步驟2中，利用柱層析方法對步驟I中所得的降解產品進行分離。
9.根據權利要求8的方法，其中在步驟2中，使用Bio-GelP6柱(I. 5 X IOOcm)對步驟I中所得的降解產品進行分離。
10.根據權利要求4 9任一項的方法，其中所述步驟3的降解作用可以在4°C 35°C下進行。
11.根據權利要求10的方法，其中所述步驟3的降解作用在室溫下進行。
12.根據權利要求11的方法，其中所述步驟3的降解作用在室溫下進行6-24小時。
13.根據權利要求4 12任一項的方法，其中在步驟4中，使用Bio-GelP6柱(I. 5 X IOOcm)進行分離。
14.根據權利要求4 13任一項的方法，包括以下步驟 步驟I、取肝素樣品，溶於Tris-HCl緩衝液中，加入肝素酶I，在室溫下，酶解2-24小時； 步驟2、取步驟I中獲得的降解產物，上一根Bio-Gel P6柱(I. 5 X IOOcm)，以碳酸氫銨溶液平衡並洗脫，分部收集，先後得到六糖、四糖、雙糖，將四糖和六糖分別匯合收集，濃縮； 步驟3、向步驟2獲得的四糖和六糖組分中，分別加入肝素酶II和肝素酶III，在室溫下，酶解6-24小時； 步驟4、將步驟3中獲得的降解物上Bio-Gel P6柱(I. 5X IOOcm)，以碳酸氫銨溶液平衡並洗脫，分部收集，先後得到四糖和雙糖； 步驟5、步驟4得到二糖混合物，分別匯合收集，旋轉濃縮，冷凍乾燥，得到本發明的第一種雙糖混合物和第二種雙糖混合物。
15.一種檢測肝素雙糖作用酶的存在的方法，所述肝素雙糖作用酶為肝素雙糖脫硫酸酶或肝素雙糖雙鍵消除酶，或其它能以肝素雙糖為作用底物引起可檢測變化的酶，所述方法包括 1)將權利要求I 3任一項的雙糖混合物配成l-10mg/ml溶液； 2)向步驟I的溶液中加入可能含有肝素雙糖作用酶的物質，室溫反應6-24小時； 3)用上述SAX-HPLC法測定步驟2)反應後的雙糖圖譜，對比步驟I)中使用的雙糖混合物的SAX-HPLC圖譜，觀察各成分的色譜峰面積變化，進行判定。
16.根據權利要求4 14任一項的方法獲得的雙糖混合物。
17.根據權利要求16的混合物，其為混合物I、混合物2或者二者的混合物。
全文摘要
本發明涉及肝素雙糖混合物，其製備方法，使用該雙糖混合物作為標準物質對肝素或者低分子量肝素進行HPLC分析的方法，以及所述雙糖混合物的應用。
文檔編號C12P19/12GK102864191SQ20121004675
公開日2013年1月9日 申請日期2012年2月28日 優先權日2011年12月16日
發明者馬小來, 黃洪, 張紫恆, 李鋰 申請人:深圳市海普瑞藥業股份有限公司