多糖顆粒疫苗的製作方法

2023-04-27 19:24:56 2

專利名稱：多糖顆粒疫苗的製作方法
多糖顆粒疫苗
背景技術：
綴合疫苗通常通過將抗原與載體蛋白共價連接來產生。所產生的免疫原然後經常施用於細菌多糖用於預防細菌疾病。使用綴合疫苗的一個缺點是抗原與蛋白化學綴合有困難。因此，不需要蛋白與碳水化合物直接綴合的實質綴合疫苗將是高度合意的，其中抗原和蛋白以與目標細胞緊密締合的方式存在。通過PRINT 技術(Liquidia Technologies, North Carolina)製造的微粒和納米粒提供控制其化學組成、粒徑、顆粒形狀、表面官能度以及其他物理和化學特性的微粒和納米粒。在本發明中使用該技術使得抗原與載體蛋白能夠共包裝以刺激免疫反應。PRINT 顆粒之前已被描述於，例如 US 2009-0028910,WO 2008/11886UW0 2009/111588,US2009-0165320、US 2007-0275193、US 2007-0264481、US 2008-0131692、WO 2008/127455、US 2008-0181958、US 2009-0098380 和 WO 2009/132206 ;每一篇通過引用以其整體結合到本文中。本文進一步描述PRINT 顆粒。 發明概沭
本發明的目的之一在於製備可與多種多糖(PS) —起利用的單顆粒組合物。備選地，如果單顆粒組合物不或不能容納選擇的PS，那麼另一目的是對給定適應證或靶標開發一批可容納目標PS的顆粒組合物。本發明一個方面是一種包含含有實質上均勻組合物的模塑顆粒的免疫原性組合物，其中所述實質上均勻組合物包含免疫原性量的與多糖締合的載體蛋白。本發明一個特定方面是一種包含含有非交聯組合物的模塑顆粒的免疫原性組合物，所述非交聯組合物包含約10-20 丨％的聚合物、約60-70 wt%的蛋白和約10-25 wt%的多糖。本發明另一個方面是一種優化多糖疫苗性能的方法，所述方法是通過使模塑的二維陣列顆粒的免疫原性多糖或免疫原性蛋白組分的類型或化學計量學變化和測試所述顆粒的性能。本發明另一個方面是一種用於製造多糖疫苗的系統，其包括選擇與蛋白和多糖相容的基質組合物和通過在聚合物模具中模塑組合物從所述組合物形成顆粒，其中所述組合物包含約90-99. 9 wt%的蛋白和約10-0. I wt%的多糖。在一個特定實施方案中，多糖是肺炎球菌多糖。在一個特定實施方案中，載體蛋白和/或多糖呈基質的形式。在一個特定實施方案中，顆粒是非交聯的或交聯的。在一個特定實施方案中，免疫原性組合物另外包含選自以下的基質實質上非免疫原性蛋白、糖、聚合物和疏水物。在一個特定實施方案中，免疫原性組合物另外包含聚合物，其中所述聚合物物理上迫使載體蛋白與多糖締合。在一個特定實施方案中，多糖或載體蛋白被吸附在顆粒表面上。在一個特定實施方案中，載體蛋白佔90 wt%-99. 9 wt%,和多糖佔10 wt%_0. Iwt%。在一個特定實施方案中，載體蛋白包含90 wt%-99. 9 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA，和多糖包含10 wt%-0. I wt%的肺炎球菌多糖14。在一個特定實施方案中，聚合物包含約16 wt%的PLGA。在一個特定實施方案中，蛋白包含約66 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA。
在一個特定實施方案中，多糖包含約18 wt%的肺炎球菌多糖14。在一個特定實施方案中，基質組合物包含不降低蛋白或多糖免疫原性的組分和處理。發明詳沭
如本文所述，已製造和/或預期多種顆粒組合物以形成實質綴合PS疫苗顆粒。製造的顆粒通常包含由載體蛋白與目標PS的組合組成的顆粒，其中用交聯劑處理該組合。在一個例示性實施方案中，在自收穫陣列收穫顆粒之前發生交聯劑處理。在另一個例示性實施方案中，在自陣列收穫顆粒之後發生交聯劑處理。在另一個例示性實施方案中，將添加劑加入顆粒基質中，而不是共價交聯顆粒，該添加劑提供足以將載體蛋白與PS的締合保持所需時間的結合力(例如但不限於電荷-電荷相互作用、吸附、疏水相互作用、相分離、聚合物等)。在另一個例示性實施方案中，用包被步驟處理蛋白和PS的顆粒以包裝蛋白和PS。在又一個例示性實施方案中，顆粒由非抗原或免疫原性(本文亦稱為無活性)多糖或蛋白物質(例如聚合物)組成，且表面吸附有蛋白和目標PS。可在必要時任選向顆粒基質中引入添加劑，以維持蛋白、PS或完整蛋白/PS顆粒，添加劑例如但不限於脂質、胺基酸、疏水物、聚合物、小分子、脂肪酸、表面活性劑等。用於本發明的顆粒的其他多糖和/或蛋白混合物技術和複合物可發現於「Formation andcharacterization of amphiphilic conjugates of whey protein isolate (WPI)/xanthan to improve surface activity (形成和表徵乳清蛋白分離物(WPI)/黃原膠的兩親性綴合物以改善表面活性)，」A. Benichou等，Food Hydrocolloids 21 (2007)379 - 391，其通過引用以其整體結合到本文中。顆粒製造 PRINT 顆粒
在例示性實施方案中，可在PRINT 顆粒中包含合成的生物相容性聚合物。根據這樣的實施方案，一些實例包括但不限於包含一個或多個可交聯的半胱氨酸殘基的合成多肽、包含一個或多個二硫基的合成多肽、直鏈或支鏈聚亞烷基二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯醯胺、聚異丙基丙烯醯胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙交酯/乙交酯、其組合等。根據另外的例示性實施方案，可與本發明的顆粒組合使用的合成聚合物包括但不限於包含半胱氨酸殘基的合成多胺基酸、包含二硫基的合成多胺基酸、修飾以包含游離巰基的聚乙烯醇、修飾以包含游離二硫基的聚乙烯醇、修飾以包含游離巰基的聚甲基丙烯酸羥乙酯、修飾以包含游離二硫基的聚甲基丙烯酸羥乙酯、修飾以包含游離巰基的聚丙烯酸、修飾以包含游離二硫基的聚丙烯酸、修飾以包含游離巰基的聚乙基噁唑啉、修飾以包含游離二硫基的聚乙基噁唑啉、修飾以包含游離巰基的聚丙烯醯胺、修飾以包含游離二硫基的聚丙烯醯胺、修飾以包含游離巰基的聚乙烯吡咯烷酮、修飾以包含游離二硫基的聚乙烯吡咯烷酮、修飾以包含游離巰基的聚亞烷基二醇、修飾以包含游離二硫基的聚亞烷基二醇、其組合等。生物相容性材料/聚合物可為生物可降解的。在一個例示性實施方案中，本發明的免疫細胞靶向的微粒和/或納米粒的預定幾何學包括實質上球形的、實質上非球形的、實質上病毒狀的、實質上細菌狀的、實質上蛋白狀的、實質上細胞狀的、實質上棒狀的、實質上手性狀的、實質上直角三角形、實質上平碟狀的等。在一個例示性實施方案中，顆粒具有小於約100微米的最寬尺寸，例如約I nm-約50微米，例如約50 nm-約10微米、例如約100 nm-約I微米、例如約100 nm-約500 nm。在其他實施方案中，顆粒可具有預定的幾何學特性。根據一些例示性實施方案，幾何學特性包括具有兩個實質上平直和實質上平行的邊的形狀、預定的曲率半徑、兩邊之間的預定角度、具有預定寬度的實質上的平面、兩個實質上的平面、實質上平行的兩個實質上的平面、實質上平行且配置為離開受控間距的兩個實質上的平面、其中兩個實質上的平面以預定角度鄰接的兩個實質上的平面等。在更另外的例示性實施方案中，顆粒被配置為球形、球體樣或球形化的形狀。根據這樣的實施方案，當在模腔中時、從模腔收穫後並在收穫陣列上時、或者從模腔收穫後並在收集或溶液中時，顆粒在給定溫度或之上可自發球形化(包含生物或敏 感組成的組合物的相對低的熔點)。在一些實施方案中，顆粒的形狀沒有控制顆粒化學組成、PS比、載體蛋白比或第三方基質組成比關鍵。PRINT 技術通常使用由材料(例如矽酮、基於全氟聚醚的彈性體(PFPE)或其他基於烴的材料)製備的低表面能模具，以在主模板上複製微米級或納米級結構。PRINT 模具中使用的聚合物在室溫通常為液體，並通常光化學交聯為能夠高分辨複製微米級或納米級結構的彈性體固體。然後當與主模板接觸時，液體聚合物被「固化」，藉此在主模板上形成該結構的複製映像。通過固化(熱或光化學)或通過玻璃化和或結晶冷卻，可發生與主模板接觸的模具的固化。當自主模板移除聚合物模具，聚合物形成包含主模板的微米級或納米級特徵的腔或凹陷複製的有圖案模板，固化液體聚合物中的微米級或納米級腔可用於高分辨微粒或納米粒製造。PRINT 技術能夠製造同時控制結構(例如，形狀、尺寸和組成)和功能(例如，表面結構)的單分散有機和無機納米粒。PRINT 技術是能夠形成以下顆粒的第一種常規獨特方法i)尺寸單分散且形狀均勻；ii)可被模塑為任何形狀；iii)可基本上由任何基質材料組成；iv)可在極其溫和的條件下形成(與易碎載物相容)；v)順應功能化後化學(例如，生物綴合活性物質和/或靶向組分)；和「)其最早在可訪問的2-D陣列中製造顆粒(其開創組合方法，因為顆粒可被「條形碼化」)。在形成順應本文所列的PRINT 方法的預聚物混合物中，當設計PRINT 納米粒載體系統時，待考慮的技術方面包括1)顆粒載物或基質材料與聚合物PRINT 模具材料的相容性，2)載物釋放所需的顆粒降解概況，3)靶向方法，4)顆粒模量和5)第1-4點的組合。可通過經由合理選擇單體來調節預聚物基質的親水性以匹配載物的親水性，解決載物/預聚物基質相容性。本文討論顆粒降解和靶向。可通過改變顆粒內的交聯程度和/或引起其物理纏結的顆粒成分，調節顆粒的模量和穩健性(robustness)。最後,視需要,可通過加入共單體或共溶劑以改變單體溶液的物理性質，優化用於PRINT 製造的顆粒配方。在一個例示性實施方案中，本發明的顆粒包含蛋白基質和PS，其中顆粒可為交聯的。在一些特定實施方案中，當在收猶陣列中時或在顆粒製造後的溶液中收集後，使蛋白和PS顆粒組合物經受交聯。在一個特定實施方案中，蛋白基質是顆粒組合物中的主要組分。在另一個特定實施方案中，PS基質是顆粒組合物中的主要組分。在另一個特定實施方案中，顆粒組合物中包含聚合物以物理保持多糖與蛋白締合。在又一個特定實施方案中，聚合物組分是顆粒的主要組分，且蛋白和多糖被吸附到聚合物顆粒的表面。在另一個特定實施方案中，蛋白組分是顆粒的主要組分，且多糖被吸附到蛋白顆粒的表面。在另一個特定實施方案中，PS組分是顆粒的主要組分，且蛋白被吸附到PS顆粒的表面。在另一個例示性實施方案中，本發明的顆粒包含蛋白、PS和其他第三方基質組分，其中該組分不限於蛋白、非免疫原性蛋白、非抗原、糖、聚合物、疏水分子、小分子、鹽等。在一個特定實施方案中，顆粒是共價交聯的，而在另一個特定實施方案中，顆粒不是共價交聯的。在另一個例示性實施方案中，本發明的顆粒包含核心，核心包括但不限於載體蛋白或者載體蛋白與第三方基質組分的混合物，其中顆粒的表面已被修飾以降低溶解度，並在表面上亦包含一種或多種目標多糖。表面修飾可包括但不限於顆粒製造後用例如PS和疏水分子的混合物包被顆粒表面。
在另一個例示性實施方案中，本發明的顆粒包含核心，核心包括但不限於載體蛋白和PS或者載體蛋白或蛋白、PS與第三方基質組分的混合物，其中顆粒的表面已被修飾以降低溶解度。表面修飾可包括但不限於顆粒製造後包被顆粒表面，並亦可包含設計用以遞送顆粒至特異性B細胞群的組分。在另一個例示性實施方案中，本發明的顆粒包含含有PS和流感血凝素蛋白的顆粒，其溶解度是通過包含具有與血凝素蛋白結合的唾液酸表位的基質組分降低的。作為共價結合的有利備選，PS和載體蛋白與顆粒的非共價締合可用於本發明。例示性實施方案包括但不限於以下情況其中蛋白和PS通過離子相互作用、吸附、疏水相互作用、相分離、物理纏結等與顆粒締合、結合或連接。在一個例示性實施方案中，顆粒包含PS、物質(例如脂質或聚合物)和吸附於顆粒表面的載體蛋白。本文使用的第三方基質指添加劑、修飾劑、乳化劑、粘合劑或配體，其可被摻入顆粒組合物中以給予獨特和/或有利性質，性質例如穩定性(熱/pH)、同質性、均勻包裝密度、多孔性、表面性質和電荷。例示性第三方基質組分包括但不限於PLGA、PLA、聚酐、PLGA-b-PEG、聚己酸內酯、殼聚糖、GRAS材料(例如阿拉伯半乳聚糖)、山嵛酸、胺基酸(例如L-精氨酸或亮氨酸)、非免疫原性蛋白(例如人血清白蛋白或明膠)或聚離子性(生物)聚合物(聚丙烯酸、殼聚糖、肝素、透明質酸(hylaronic acid)),其中PS和載體蛋白與這樣的組分預混合。這樣的組分可促進蛋白-多糖的包封。摻入的低分子量乳化劑(例如在食品中使用的那些)可與聚合物(例如PLGA或PLGA樣聚合物)組合使用。例示性低分子量乳化劑包括但不限於大豆卵磷脂、甘油脂肪酸酯、蔗糖、脂肪酸酯和疏水胺基酸(例如亮氨酸)。在脂肪酸的情況下，脂肪酸(酯化和非酯化)對蛋白(例如卵白蛋白、HSA等)的親和力來源於胺基酸側鏈和脂肪酸羧基碳之間存在的不同離子和/或氫鍵合相互作用。這些相互作用可另外受脂肪酸鏈的大小調節。例如，油酸酯比棕櫚酸酯更緊密地結合人和鼠白蛋白，而對牛白蛋白證明為相反。此外，載體蛋白的三級結構通常通過非局部相互作用來穩定-最常見的是形成疏水核心(除此之外還有例如鹽橋、氫鍵、二硫鍵、和甚至翻譯後修飾)。該三級結構似乎充當蛋白基本功能的基礎。天然疏水的小分子胺基酸能夠適應蛋白支架的內部疏水結合口袋，因此給予結構和化學穩定性和性質。亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸是可在用於吸入的噴霧乾燥粉末中用作「分散性增強劑」的例示性胺基酸，並已知其修飾噴霧乾燥顆粒的霧化特性。此外，配體疏水性與蛋白穩定之間有關聯已知最疏水的配體異亮氨酸引起LIV蛋白的最顯著穩定化。在一個例不性實施方案中，交聯劑和帶電分子亦是第三方基質的一部分。在一個例示性實施方案中，顆粒呈多糖和蛋白的基質的形式，其中多糖蛋白比範圍是約1:99-約99: I。在備選的實施方案中，多糖:蛋白比是約2:98、3:97、4:96、5:95、6:94,7:93,8:92,9:91或10:90。在其他實施方案中，多糖蛋白比範圍是約10:90-約 90:10，分別例如約15:85、例如約20:80、例如約30:70、例如約40:60、例如約50:50、例如約60:40、例如約70:30或例如約80:20。在一個例示性實施方案中，PVP/PEG的高分子量溶液用於收穫和交聯以保持蛋白顆粒對水性加工步驟不溶。在其他例示性實施方案中，溶解抑制技術包括使用交聯劑(例如但不限於戊二醛、穀氨酸、同型雙官能NHS和醯亞胺酯)、疏水分子(例如但不限於亮氨酸、脂質和脂肪酸)、選擇的顆粒包被聚合物(例如但不限於GRAS、PLGA等)、脂質和非共價相互作用(例如但不限於電荷、白蛋白和疏水物)。用於本發明的合適多糖包括細菌多糖以及癌細胞的碳水化合物或者其他非自身或靶細胞碳水化合物。在單獨特定的實施方案中，多糖是肺炎球菌多糖(PnP) 4和14。在多種例示性實施方案中，其他PNP和多糖選自紐莫法raz)、腦膜炎球菌(MeningococcaD、傷寒、細胞表面糖脂、糖蛋白、b型流感嗜血菌{Haemophilusinfluenzae) (HiB)、葡萄球菌屬、衣原體、B型腦膜炎球菌(Mening B)、艱難梭菌{C. Difficile)、假單孢菌屬iPseudomonas)、A和B型鏈球菌、腸產毒性大腸桿菌iBscherichia coli) (ETEC)、結核(TB)、志賀氏菌屬{Shigella、、傷寒沙門氏菌{Salmonella肉毒桿菌、痕疫、伯克氏菌屬(Jkirkholderia)等。例不性多糖包括但不限於肺炎鏈球菌^Streptococcus pneumoniae)的PnP4、PnP6B、PnP9V、PnP 14、PnP 18C、PnP 19F、PnP23F、PnPl、PnP3、PnP5、PnP6A、PnP7F 和 PnP 19A。用於本發明的合適載體蛋白包括但不限於CRM 197、破傷風類毒素、白喉類毒素、血凝素、腦膜炎球菌表面蛋白和莢膜蛋白。CRM197是來源於白喉毒素(DT)的無毒、突變蛋白的實例，其早就被識別為無毒蛋白並常被用作綴合疫苗的載體。基於其無毒特徵，該蛋白已被用於多種目的，包括作為肝素結合EGF樣生長因子(HB-EGF)的抑制劑和作為疫苗的免疫佐劑。其他合適載體蛋白包括但不限於肺炎球菌=PcsB-(B型鏈球菌的細胞壁分離所需的蛋白)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(StkP) (Intercell);金黃色葡萄球菌{S. Aureus)凝集素樣序列(Als)，包括促進黏附於內皮細胞的Als3 (亦用於念珠菌屬{Candida)的抗原)(Novadigm)、聚集因子A (ClfA) (Wyeth/Pfizer)、聚集因子B (ClfB)、鐵表面決定簇B (IsdB)、Cna-FnBP融合蛋白、聚-N-乙醯葡萄糖胺；腦膜炎B :GNA1870，亦命名為因子H結合蛋白(fHbp)或rLP-2086 (Novartis) ;B型鏈球菌蛋白抗原C、R和X。不同PS之間在化學和/或物理結構中的變化可能需要顆粒製造化學、組成、添加齊U、設計等形式的不同處理，以維持、優化或容納特定PS的官能度、相互作用或呈遞。例如，本文所述的Prevnar 的7個PS中的數個包括反應基(例如羧酸基、胺基)、磷酸酯/磷酸化糖等，其可為交聯或另外反應並改變PS的識別、呈遞、功能等的位點。此外，在備選的實施方案中，本發明提供顆粒組成、尺寸和形狀可調性以容納多糖的備選構象表位，其可在這種表位或多糖的免疫原性和生物反應性中起作用。在一個例示性實施方案中，蛋白和多糖經由技術(例如噴霧乾燥、超濾、乳化等)吸附於「其他」顆粒。本發明中可使用的組合物、組分、物質、技術和化學另外公開於例如US20080009606 ；uTheoretical stability maps for guiding preparation of emulsionsstabilized by protein-poly saccharide interfacial complexes (用於指導製備為蛋白-多糖界面複合物所穩定的乳劑的理論穩定性圖)」，Cho YH等，Lan咖uir, 2009年6月16日；25 (12):6649-57 ；US 7,601, 381 ；US 20090238885 ;「Gel particles from spray-drieddisordered polysaccharide (來自噴霧乾燥的無序多糖的凝膠顆粒)」，Paulomi Burey等，Carbohydrate Polymers,第 76 卷,第 2 期,2009 年 3 月 17 日，第 206-213 頁；每一篇通過引用以其整體結合到本文中。在一個例示性實施方案中，多糖吸附於PRINT 顆粒的表面，例如通過將基質組合 物引入包被/包封顆粒的收穫陣列中或上存在的多糖中。在一個特定實施方案中，待處理的顆粒是PLGA-DC-膽固醇顆粒，其產生多糖包被的PLGA-DC-Chol納米粒/微粒。在另一個實施方案中，多糖可另外與聚合物(例如Pv0H、PvP、Luvitec等)混合。換句話說，可將無活性組合物的顆粒收穫到活性組合物(例如抗原)的或包含其的收穫層上。在這樣的一個實施方案中，顆粒在收穫層中與活性物質吸附、結合、進行電荷相互作用、化學連接、物理連接或另外締合併形成疫苗。在一個例示性實施方案中，從DC-膽固醇/PLGA製造PRINT 顆粒並收穫在多糖薄膜上，有或沒有蛋白或者蛋白的次級吸附。收穫聚合物稀釋劑；存在具有多包被收穫層(例如，在PV0H、透明質酸、葡聚糖、黃原膠的薄膜之上的多糖)的選擇；和基質添加劑篩查。第三方基質代表另一例示性實施方案，其中其他蛋白基質充當吸附於顆粒表面的多糖/蛋白的載體。合適的基質包括但不限於有或沒有糖的MSA/HSA/明膠，其中MSA是小鼠血清白蛋白，HAS是人血清白蛋白。其他載體多糖基質包括，例如透明質酸或任何粘合劑材料例如膠(例如瓜爾膠)天然粘合劑以及衍生物例如海藻酸鹽、殼聚糖、明膠和明膠衍生物。膠和葡聚糖代表亦可使用的特定實施方案。在一個例示性實施方案中，這些材料是除了(多糖和蛋白)共混物外的基質的一部分。在另一個例示性實施方案中，這些材料是收穫層的一部分。在又一個實施方案中，這些材料與PLGA或PLGA樣聚合物(親水-疏水基質)以特定百分比作為共混物聯合使用。可在不涉及共價交聯的顆粒基質組合物中起必要作用的聚合物包括但不限於疏水聚合物(例如PLGA、PLA、PLLA)、聚己酸內酯、明膠、瓊脂糖、瓊脂膠、瓊脂、脂質、可降解的PEG、人工蛋白和聚酐。該看法的原理在於，預混合特定量的PLGA與(蛋白和多糖)共混物可使顆粒保持在一起，而不需要化學交聯主要組分(載體蛋白和多糖)。PEG亦可用作粘合劑和基質形成劑。疏水聚合物例如但不限於聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚維酮通常在形成模塑微粒和納米粒中被用作收穫層。已知合成聚合物(例如Luvitec/聚維酮、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酸衍生物(例如Eudragit、Carbopol))能夠使得顯著的膜形成、起始粘著和粘附於不同材料、複合物形成的能力高、穩定和溶解能力好、對pH變化不敏感、易被輻射誘導的交聯性以及生物相容性好。蛋白變性是水性溶液的溫度和pH的函數。雖然較高的溫度通常可加速綴合反應，但是較高的溫度亦可引起蛋白的熱變性。雖然在PRINT 顆粒製造期間這可能是真的，但是以升高的濃度加入一些上文提及的這些粘合劑或添加劑(例如多糖或PLGA)可保護蛋白免受熱變性。此外，多糖(作為粘合劑)/聚合物(PLGA樣)亦可在防止過多蛋白變性和/或聚集中充當保護試劑。本發明的多種例示性實施方案涉及用戊二醛交聯的顆粒的備選組合物。顆粒用或通過離子相互作用保持在一起。在一個特定實施方案中，顆粒組合物包含下述組分卵白蛋白、多糖、甘油、氨基胍、稀釋劑H20:IPA 7:3。在另一個特定實施方案中，組分具有下述比卵白蛋白(10%)、多糖(2.5%)、甘油(10%)、氨基胍(10%)、稀釋劑H20:IPA 7:3。在一個例示性實施方案中，顆粒通過與顆粒的基質組合的同型雙官能交聯劑保持 在一起。在一個特定實施方案中，顆粒具有下述組成卵白蛋白、多糖、甘油、醯亞胺酯接頭和稀釋劑H20:IPA 7:3。在另一個特定實施方案中，組分具有下述比卵白蛋白(10%)、多糖(2.5%)、甘油(10%)、醯亞胺酯接頭(10%)和稀釋劑H20:IPA 7:3。在本發明的其他特定實施方案中，顆粒具有下述組成與卵白蛋白組合的PLGA-葡聚糖共混物、多糖、甘油和稀釋劑H20:IPA 7:3。在另一個特定實施方案中，顆粒具有呈下述比的下述組成與卵白蛋白(10%)組合的PLGA (1%)-葡聚糖(2. 5%)共混物、多糖(2.5%)、甘油(10%)和稀釋劑H20:IPA 7:3。在本發明的其他特定實施方案中，顆粒具有下述組成與卵白蛋白組合的PLGA-黃原膠共混物、多糖、甘油、稀釋劑H20: IPA 7:3。在另一個特定實施方案中，顆粒具有呈下述比的下述組成與卵白蛋白(10%)組合的PLGA (1%)-黃原膠(0. 625%)共混物、多糖(2.5%)、甘油(10%)、稀釋劑H20:IPA 7:3。本發明的免疫原性組合物可包含其他物質、賦形劑或穩定劑。例如，為了通過增加納米粒的負(電位來增加穩定性或降低非特異性攝取，可加入某些帶負電荷的組分。這種帶負電荷的組分包括但不限於由甘膽酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、牛磺膽酸、鵝脫氧甘膽酸、鵝脫氧牛磺膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、脫氫膽酸等組成的各種膽汁酸的膽汁鹽；包含基於卵磷脂(蛋黃)的磷脂的磷脂，其包括下述磷脂醯膽鹼棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼、棕櫚醯亞油醯磷脂醯膽鹼、硬脂醯亞油醯磷脂醯膽鹼、硬脂醯油醯磷脂醯膽鹼、硬脂醯二十烷醯磷脂醯膽鹼和二棕櫚醯磷脂醯膽鹼。其他磷脂包括L-a-二肉豆蘧醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)和其他相關化合物。帶負電荷的表面活性劑或乳化劑亦適合作為添加劑，例如膽固醇硫酸酯鈉等。類似地，可通過加入帶正電荷的組分來改變納米粒的正(電位。適合口服給藥的製劑的組成可為(a)液體溶液劑，例如在稀釋劑(例如水、鹽水、果汁、橙汁等)中溶解有效量的顆粒，(b)膠囊劑、囊劑或片劑，各包含預定量的顆粒作為固體或顆粒，(C)合適液體中的混懸劑和(d)合適的乳劑。片劑形式可包含乳糖、甘露糖醇、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、微晶纖維、阿拉伯樹膠、明膠、膠體二氧化矽、交聯羧甲基纖維素鈉、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸和其他賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩衝劑、潤溼劑、防腐劑、矯味劑以及藥理學相容的賦形劑中的一種或多種。糖錠劑形式可包含香料(通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或西黃蓍膠)中的顆粒，以及包含活性成分在惰性基質(例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯樹膠)中的錠劑，除了活性成分外還包含這樣的賦形劑的乳劑、凝膠劑等是本領域已知的。合適的藥學載體、賦形劑和稀釋劑的實例包括但不限於乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、西黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯卩比咯烷酮、纖維素、水、鹽水溶液、糖漿、甲基纖維素、甲基羥苯酸酯和丙基羥苯酸酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。製劑可另外包含潤滑劑、潤溼劑、乳化劑和助懸劑、防腐劑、甜味劑或矯味劑。適合胃腸外給藥的免疫原性製劑包括水性和非水性等滲無菌注射溶液(其可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使得製劑與目標受體的血液相容的溶質)和水性和非水性無菌混懸劑(其可包含助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑)。製劑可存在於單劑量或多劑量密封容器(例如安瓿和小瓶)中，並可在冷凍乾燥(凍幹)條件下儲存，在臨使用前僅需加入無菌液體賦形劑，例如注射用水。可從之前描述種類的無菌散劑、顆粒劑和片劑製備臨時的注射溶液和混懸劑。在一些實施方案中，藥物組合物被配製為具有約4. 5-約9. 0 的pH範圍，包括例如約5. 0-約8. O、約6. 5-約I. 5和約6. 5-約I. 0的任何pH範圍。在一些實施方案中，藥物組合物的PH被配製為不小於約6，包括例如不小於約6. 5、7或約8的任何值。亦可通過加入合適的張度調節劑(例如甘油)將免疫原性組合物製備為與血液等滲。可將本文所述的包含免疫細胞靶向的微粒和/或納米粒的免疫原性組合物經由多種途徑給予受試者(例如人)，途徑例如胃腸外，包括靜脈內、動脈內、腹膜內、鼻內、肺內、口服、吸入、囊內、肌內、氣管內、皮下、眼內、鞘內或經皮。例如，可通過吸入至呼吸道的靶免疫細胞給予納米粒組合物。在一些實施方案中，靜脈內給予納米粒組合物，而在其他實施方案中，口服給予納米粒組合物。本發明免疫原性組合物在給予時提供免疫細胞靶向的微粒和/或納米粒的較好生物分布，並另外使得能夠增加穩定性。以這種方式，在靶位點上遞送了較多的活性物質。數據
已進行了兩個體內研究最初的研究使用(i)作為載體蛋白的OVA (無非內毒素)和PnP4 (備選地PnP14);和(ii)基於吸附的理論與吸附有PnP4 (備選地PnP14)的聚合物顆粒。在隨訪研究中，再次測試OVA (無非內毒素)蛋白載體，並將研究擴大至測試無內毒素OVA以及HSA與PnP4 (備選地PnP 14)的組合。如下文所示，加強免疫前數據與加強免疫後I周和加強免疫後2周一樣顯示顯著的IgG反應。引人關注地，用可溶性對照PnP14在初次免疫注射PRINT 顆粒後的加強免疫在加強免疫後I周和2周顯不IgG反應。與Prevnar (領先的現有技術產品)相反，對於PRINT 顆粒，初次免疫後效價始終顯示IgG反應。在一個顆粒組中，在初次免疫後兩周，PnP14 IgG效價顯示PRINT 顆粒具有是Prevnar 2倍大的IgG反應。作為對照，注射可溶性OVA與可溶性PnP14未產生可觀察的抗體效價。在例示性實施方案中，顆粒組合物可包含與蛋白/多糖組合物混合的聚合物。在特定實施方案中，聚合物包括生物相容性或生物可降解聚合物，並可為O-約5 Wt %、約0. 5-約 5 wt %、約 0. 5-約 4 wt %、約 0. 5-約 3 wt %、約 0. 5-約 2 wt %、約 0. 5-約 I. 5 wt%、約1.5 wt %或約I wt %。在其他特定實施方案中,顆粒組合物中的蛋白與多糖比可為約 99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80或10:90。在一些例示性實施方案中，聚合物給顆粒增加物理穩定性並幫助維持多糖與蛋白的物理締合。在一些實施方案中，將聚合物選擇為生物相容性、生物可降解、受控降解等聚合物。本發明的另外例示性實施方案包括聚合物與蛋白和多糖組合的的顆粒。在一個特定實施方案中，顆粒是非交聯的，並包含16 wt%的聚合物、66 wt%的蛋白和18 wt%的多糖。在這種的具體實施方案中，聚合物包含PLGA。在這種的具體實施方案中，多糖包含肺炎球菌多糖14。在這種的具體實施方案中，蛋白包含卵白蛋白。在一個具體實施方案中，顆粒組合物包含16 wt%的PLGA聚合物、66 wt%的卵白蛋白蛋白和18 wt%的肺炎球菌多糖14。在另一個實施方案中，本發明包括具有蛋白與多糖比為3. 5:1-3. 75:1的多糖疫苗顆粒。本發明的一個特定實施方案包括基於聚合物的多糖疫苗顆粒，其具有的卵白蛋白蛋白與肺炎球菌多糖比為3. 67:1。 在一些例示性實施方案中，顆粒的形狀沒有控制顆粒化學組成、PS比、載體蛋白比或第三方基質組成比關鍵。根據基於聚合物的多糖疫苗顆粒的若干這些實施方案，顆粒可形成為非離散顆粒或者關於三維形狀不具有或不維持嚴格控制，因為例如聚合物是非交聯的、不是重度交聯的或者是熱敏感的或溶劑敏感的等。本發明的另外例示性實施方案包括蛋白與多糖組合的顆粒。根據從蛋白和多糖製造的多糖疫苗顆粒，顆粒在製造期間可為交聯的，或者可在顆粒製造後將交聯劑引入顆粒中以便形成非綴合的多糖疫苗。在這種的一些例示性實施方案中，蛋白包含卵白蛋白、CRM或HSA。在這種的一些例示性實施方案中，蛋白包含卵白蛋白、CRM或HSA，多糖包含肺炎球菌多糖14。在本發明的多糖疫苗顆粒的一個特定實施方案中，蛋白包含範圍為約90-約99.9 wt%的卵白蛋白，多糖範圍是約10-0.01 wt%。在模塑這種顆粒後,顆粒可用交聯劑處理。在本發明的多糖疫苗顆粒的一個特定實施方案中，蛋白包含範圍為約92-約99. 9 wt%的卵白蛋白，多糖範圍是約8-約0.01 wt%。在模塑這種顆粒後，顆粒可用交聯劑處理。在本發明的多糖疫苗顆粒的一個特定實施方案中，蛋白包含範圍為93-99. 9 wt%的卵白蛋白，多糖範圍是7-0. 01 wt%。在模塑這種顆粒後，顆粒可用交聯劑處理。在本發明的多糖疫苗顆粒的一個特定實施方案中，蛋白包含93. 7 wt%的卵白蛋白，多糖包含約6. 3 wt%的肺炎球菌多糖。在模塑這種顆粒後，顆粒可用交聯劑處理。在本發明的多糖疫苗顆粒的一個特定實施方案中，蛋白包含約96. 4 wt%的卵白蛋白，多糖包含約3. 6 七％的肺炎球菌多糖。在模塑這種顆粒後，顆粒可用交聯劑處理。在多糖疫苗顆粒的一個特定實施方案中，蛋白包含約99 wt%的卵白蛋白，肺炎球菌多糖約I wt%。在模塑這種顆粒後,顆粒可用交聯劑處理。在本發明的多糖疫苗顆粒的一個特定實施方案中，蛋白包含約99. 7 wt%的卵白蛋白，多糖包含約0. 3 wt%的肺炎球菌多糖。在模塑這種顆粒後,顆粒可用交聯劑處理。在多糖疫苗顆粒的一個特定實施方案中，蛋白包含約99. 97 wt%的卵白蛋白，多糖包含約0.03被％的肺炎球菌多糖。在模塑這種顆粒後，顆粒可用交聯劑處理。在一個備選的特定實施方案中，本發明的蛋白組分包含約96. 4%的HSA蛋白，多糖組分包含3. 6 wt%。在另一個特定實施方案中，多糖疫苗顆粒的蛋白組分包含約45 wt%的CRM蛋白，多糖組分包含約55 wt%的肺炎球菌多糖14。在一些實施方案中，顆粒的形狀沒有控制顆粒化學組成、PS比、載體蛋白比或第三方基質組成比關鍵。根據基於蛋白的多糖疫苗顆粒的一些實施方案，因為例如用某溶劑配製的顆粒在移除該溶劑後剩下多孔或柔軟顆粒等，顆粒可形成為非離散顆粒或者關於三維形狀不具有或不維持嚴格控制。
實施例實施例I :小鼠研究I，交聯的蛋白/多糖顆粒
通過將各組分以下述濃度溶解在水中來製備各顆粒組分的溶液2mg/mL多糖、IOmg/mLCRM197、55mg/mL甘油和55mg/mL卵白蛋白。通過混合下表中給出的每體積的單獨組分溶液 來製備用於製備顆粒的溶液。這些終溶液包含3被％總固體。在所有鑄膜液中，甘油為0.9wt%，卵白蛋白名義上為2 wt%和多糖(PnP4或PnP14)為0. 075 wt%。包含CRM197的溶液為
0.075 wt%的類毒素。
I ieitiSE I^IiLPS^pL TRM1^ I pL 計油! |iL OVA j pL 水^總體 fc I II <2nig/niL| (IfiiififmLl | (55ms/mL)丨(55n jjtel4 |fpL) |
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ICRMl4J I112,5 HS I4'IJ II4 j9S jJl |
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ICRMl1J IMJ IiJ II8 ,6j13 j25 |使用#3 Mayer杆，在5mil生PET上包被鑄膜液，並立刻用冷空氣吹以蒸發水並形成蛋白、多糖和甘油的薄膜。薄膜目視表現為透明和均勻。通過用薄膜層壓模具然後通過加熱夾[溫度205° F、壓力60psi、速度2fpm]，填充具有200nm X 200nm圓筒形腔的Fluorocur模具。在通過加熱夾後將PET與模具分離，留下填充有薄膜組合物的模腔。然後通過再次通過加熱夾[溫度205° F、壓力60psi、速度2fpm]，將填充的模具層壓為Luvitec包被的PET收穫層。冷卻後，將模具從收穫層剝離，結果是200nm X 200nm顆粒自模腔轉移至收穫層。將顆粒在收穫薄板上4°C保存。戊二醛被用作模塑多糖/蛋白顆粒的交聯劑。將戊二醛(70%，在水中)應用於顆粒陣列。將PET薄板放置在收穫薄板之上，橡膠滾筒用於將戊二醛鋪展到整個陣列(陣列交聯)。10分鐘後，移除PET薄板。使用聚乙烯葉片細胞刮棒將顆粒收集到70mM CNBH3Na(aq)中。通過離心3次沉澱顆粒(30分鐘，11500 X g，4°C )，每次移除上清液並將顆粒重懸到ImL WFI中。注射之前將顆粒進一步稀釋到無菌(0. 22Mm過濾)0. 1% PVOH 100k/5%甘露糖醇溶媒中。亦測試吸附顆粒，其中多糖單獨或者CRM197與多糖兩者吸附到80nm X 320nm陽離子性95% PLGA/5% pDMAEMA基礎顆粒的表面。通過將PLGA/pDMAEMA組合物引入Fluorocur模具腔中、收集並在0. 1% PVOH 100K中純化來製備基礎顆粒。基礎顆粒形成如下的6個不同組的吸附顆粒I.對於一組,將水中的18. 2 PnP4加入混懸液中的728吒基礎顆粒中。將混合物渦旋10秒，然後在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動物遞送80呢顆粒和2 I^g PnP4。2.對於一組，將水中的18. 2吒PnP4加入混懸液中的1092吒基礎顆粒中。將混合物渦旋10秒，然後在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動物遞送120呢顆粒和2 I^g PnP4。3.對於一組，將水中的18. 2吒CRM197加入混懸液中的728吒基礎顆粒中。然後將水中的18. 2 PnP4加入該混合物中。將混合物渦旋10秒，然後在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動物遞送80吒顆粒、2吒PnP4和2吒CRM197。4.對於一組，將水中的18. 2吒CRM197加入混懸液中的1092吒基礎顆粒中。然後將水中的18. 2 PnP4加入該混合物中。將混合物渦旋10秒，然後在冰上孵育30分 鍾。注射之前將顆粒在無菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動物遞送120吒顆粒、2吒PnP4和2吒CRM197。5.對於一組，將水中的18. 2吒PnP14加入混懸液中的1092吒基礎顆粒中。將混合物渦旋10秒，然後在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動物遞送120呢顆粒和2 I^g PnPH06.對於一組，將水中的18. 2吒CRM197加入混懸液中的1092吒基礎顆粒中。然後將水中的18. 2 PnP14加入該混合物中。將混合物渦旋10秒，然後在冰上孵育30分鐘。注射之前將顆粒在無菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀釋。給予顆粒以向各動物遞送120吒顆粒、2吒PnP14和2吒CRM197。與顆粒結合的CRM197由Bradford來測試。所有組被測定為具有超過84%的與基礎顆粒結合的CRM197。與基礎顆粒結合的多糖由HPLC來測試。所有PnP4組被測定為具有100%的多糖結合。PnP14組被測定為具有超過42%的多糖結合。來自上文顆粒的免疫原件總結:
可溶性多糖(參見結果)和無抗原吸附的裸PLGA/pDMAEMA顆粒不產生可檢測的IgG反應，表明未實現T細胞依賴的抗多糖抗體反應和相關的記憶反應。卵白蛋白+ PnP14顆粒產生了可檢測的IgG反應，表明誘導了 T細胞依賴的抗多糖抗體反應，引起抗體同種型轉換和記憶反應的發生。卵白蛋白+ PnP14 + CRM197顆粒產生了可檢測的IgG反應，表明誘導了 T細胞依賴的抗多糖抗體反應，引起抗體同種型轉換和記憶反應的發生。Prevnar 產生了可檢測的IgG反應,表明誘導了 T細胞依賴的抗多糖抗體反應,弓I起抗體同種型轉換和記憶反應的發生。此外，單次注射後，卵白蛋白/多糖顆粒始終能夠誘導產生可測量的抗多糖IgG效價(初次免疫後4周測量)。該行為未在用Prevnar (Pfizer Inc.)注射的動物中觀察到，如圖I所示。圖I
權利要求
1.一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含 含有實質上均勻組合物的模塑顆粒， 其中所述實質上均勻組合物包含免疫原性量的與多糖締合的載體蛋白。
2.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述多糖是肺炎球菌多糖。
3.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述載體蛋白呈基質的形式。
4.權利要求I的免疫原性組合物,其中所述多糖呈基質的形式。
5.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述顆粒是非交聯的或交聯的。
6.權利要求I的免疫原性組合物，其另外包含選自以下的基質實質上非免疫原性蛋白、糖、聚合物和疏水物。
7.權利要求I的免疫原性組合物,其另外包含聚合物,其中所述聚合物物理上迫使所述載體蛋白與所述多糖締合。
8.權利要求I的免疫原性組合物，其另外包含聚合物，其中所述多糖或載體蛋白被吸附在顆粒的表面。
9.權利要求I的免疫原性組合物,其中所述蛋白佔90wt%-99. 9 wt%，和所述多糖佔10 wt%-0. I wt%0
10.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述蛋白包含90wt%-99. 9 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA，和所述多糖包含10 wt%-0. I wt%的肺炎球菌多糖14。
11.一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含 含有非交聯組合物的模塑顆粒，所述非交聯組合物包含約10-20 wt%的聚合物、約60-70 wt%的蛋白和約10-25胃七％的多糖。
12.權利要求11的免疫原性組合物,其中所述聚合物包含約16wt%的PLGA。
13.權利要求11的免疫原性組合物,其中所述蛋白包含約66wt%的卵白蛋白、CRM或HSA。
14.權利要求11的免疫原性組合物，其中所述多糖包含約18 1%的肺炎球菌多糖14。
15.一種優化多糖疫苗性能的方法，所述方法是通過使模塑的二維陣列顆粒的免疫原性多糖或免疫原性蛋白組分的類型或化學計量學變化和測試所述顆粒的性能。
16.一種用於製造多糖疫苗的系統，其包括選擇與蛋白和多糖相容的基質組合物和通過在聚合物模具中模塑組合物從所述組合物形成顆粒，其中所述組合物包含約90-99. 9wt%的蛋白和約10-0. I wt%的多糖。
17.權利要求16的系統，其中基質組合物的相容性包含不降低所述蛋白或多糖免疫原性的組分和處理。
全文摘要
製備顆粒組合物用作多糖顆粒疫苗。
文檔編號A61K39/00GK102834112SQ201180020342
公開日2012年12月19日 申請日期2011年2月22日 優先權日2010年2月22日
發明者S.M.雷勒, A.墨菲, B.胡拜 申請人:流體科技公司