猴轉化生長因子β1的克隆和表達的製作方法

2023-04-27 07:21:06

專利名稱：猴轉化生長因子β1的克隆和表達的製作方法
1.前言本發明涉及猴轉化生長因子β1(rTGF-β1)的克隆、表達和使用。本發明的產品與成熟人類TGF-β1具有相當的生物活性。
2.發明背景生長調節多肽的轉化生長因子(TGF)族是由TGF-α和TGF-β，兩個功能和結構上均不相同的分子組成的。TGF-α，還原病毒轉化齧齒動物細胞系(De
Larco et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754001-4005;Twardzik et al.，1982，Science 216894-897)和一些人類腫瘤細胞系(Todaro et al.，1980，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 775258-5262)合成及釋放的，與表皮生長因子(EGF)競爭結合在EGF受體上(Todaro et al.，1981，Nature 292259-262)，並且刺激EGF受體的酪氨酸特異性磷酸化作用。成熟的TGF-α是一種間質起源細胞的強的促細胞分裂劑，它由50個胺基酸殘基組成，順序與齧齒動物及人類EGF同源，是從一個159個胺基酸前體上切下來的(Derynck et al.，1984，Cell 38287-297;Lee et al.，1985，Nature 313489-491)。
最近，從牛脫礦質的骨頭分離出的一個蛋白質被證明是與TGF-β有關的(Seyedinetal.，1987，J，Biol.Chem.2621946-1949)。這種蛋白質也可從豬血小板(Cheifetzetal.，1987，Cell48409-415，人類前列腺癌細胞系PC-3(Ikedaetal.，1987，Biochemistry262406-2410)，人類惡性膠質癌細胞系(Wrannetal.，1987，EMBO61633-1636)中分離出來。此蛋白的部分胺基酸順序表明它與TGF-β同源，被命名為TGF-β2。前面所述的人類(Deryncketal.，1985，Nature316701-705)，鼠(Deryncketal.，1986，J.Biol.Chem.2614377-4379)和猴(Sharplesetal.，1987，DNA6239-244)的TGF-β1已經並在以後被稱為TGF-β1。
TGF-β1是個二硫鍵連接的等二聚體(每鏈有9個半胱氨酸殘基)包含兩個相同的亞基(每個亞基有112個胺基酸殘基)，並且利用一個與TGF-α或TGF中不同的受體(Froliketal.，1984，J.Biol.Chem，26010995-11000;Tuckeretal.，1984，Proc.Natl.Acad.SciUSA816757-6761)。這個強的細胞行為調節子是由各種各樣的培養基中的普通細胞及轉化細胞合成的(Robertetal.，1981，Proc，Natl，Acad，Sci.USA785339-5343)並且已純化了不同來源的TGF-β1，這些來源包括胎盤(Frolicketal.，1983，Proc.Natl，Acad.SciUSA803676-3680)，腎(Robertsetal.，1983，Biochemistry225692-5698)，尿(Twardziketal.，1985，J.Cell.Biochem.289-297)和血小板(Childsetal.，1982，Proc.Natl.Acad.SciUSA795312-5316)。TGF-β1需要TGF-α和EGF中的一個來促進正常鼠腎(NRK)成纖維細胞的安抗獨立生長，但是，對促進鼠指示細胞，AKR-2的安抗獨立生長，TGF-α或EGF的需要不那麼嚴格(Tuckeretal.，1983，CancerRes，431581-1586)。從人類血小板中得到的TGF-β1與從非洲綠猴細胞(BSC-1)分離得到的幾乎與TGF-β1具有同樣的生化性質的功能相關肽，對一些培養細胞有抑制生長作用，而不是促進細胞生長。(Tuckeretal.，1984，Science226705-707)。TGF-β1的雙重功能(抑制或促進)和它顯示出極為廣泛的分布提示它在控制哺乳動物細胞的生長和行為方面具關健作用。
從編碼人類(Derhyncketal.，1985，Natare316701-705)和鼠(Deryncketal.1986，J.Biol.Chem.2614377-4379)起源的TGF-β1前體分子的cDNA推測出的胺基酸順序，表明兩者不僅在成熟TGF-β1順序區域而且在前體氨基末端區域有很大程度上的同源性。
雖然人類TGF-β1的基因已被確定並測序，大量活性TGF-β1的克隆和表達目前尚未有報導。可能有一系列因素影響活性TGF-β1的表達，其中之一可能是因為該分子三級結構的複雜性。成熟TGF-β1有許多鏈內和鏈間的二硫鍵，它們是在基因產物的表達中通過適當的加工形成的。此外，TGF-β1的成熟形式是前體大分子糖基化後形成的。成熟形式TGF-β1的正確加工、分泌和酶切可能需要前體分子的正確糖基化。因此，一個具有正確編碼順序的基因在一個不合適的表達載體/宿主細胞系統中的克隆和表達可能產生正確的初級結構(即胺基酸順序)，但是錯誤的二級和三級結構(即摺疊和構象)，從而得到非活性分子。這樣，就阻礙了大量TGF-β1的產生。
3.本發明的概況本發明涉及大量猴TGF-β1的產生，主要是用含猴TGF-β1編碼順序的由表達調節因子控制的重組DNA載體轉染真核細胞而產生的。從非洲綠猴細胞系，BSC-40的cDNA庫中獲得編碼猴TGF-β1前體的cDNA克隆。從成熱猴TGF-β1推測出的胺基酸順序表明它同成為人類TGF-β1具有100%的同源性。人類和猴蛋白質前體區域中的278個胺基酸殘基中只有5個不同，順序具有很強的同源性。猴(和鼠)前體順序編碼的胺基酸比人類少一個。
已構建了含猴TGF-β1整個編碼順序的表達載體，這一順序被置於SV40表達因子的控制下。它們用來轉染中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)。所提到的CHO轉染子產生和分泌與真正TGF-β1具有類似生物活性的成熟rTGF-β1，也產生具生物活性的rTGF-β1前體。
4.


圖1猴TGF-β1cDNA的核苷酸順序和推測的胺基酸順序。1600bP的pTGF-β1-2插入子亞克隆進M13mp18和M13mp19克隆載體(Yanisch-Perronetal.，1985Gene33103-119)，兩鏈均用雙脫氧鏈末端終止法(Sangeretal.，1977Proc.Natl.Acad.SciUSA745463-5467)測序。所推測的猴TGF-β1胺基酸順序直接置於cDNA順序上。人類TGF-β1核苷酸順序排成一行，並且直接置於猴cDNA順序下，點表示順序中的同源核苷酸殘基。人和猴蛋白中胺基酸的差異在最上面一行中表示。成熟TGF-β1順序被用方框劃出，信號肽上面則有劃線。
圖2用猴TGF-β1 cDNA探針對人類(MCF-7)和猴(B SC-40)細胞的RNA作Northern blot分析。從所述的MCF-7和BSC-40(Purchio et al.，1979，J.Virol 29763-769)細胞中分離得多聚腺苷化RNA，在1%瓊脂糖-甲醛凝膠(12)上分級分離，轉移到尼龍膜(Hybond，Amersham)上，與32P標記的pTGF-β1-2探針雜交。第1道，人類MCF-7 RNA(5μg);第2道，猴BSC-40 RNA(5μg)，28S和18S表示28S和18S核糖體RNA的遷移位置。
圖3擴增表達質粒pSV2(TGF-β1-dhfr)的構建。構建的細節在下面第七部分中闡述。最終得到的重組質粒包含前後排列的編碼整個TGF-β1前體分子的TGF-β1cDNA和鼠dhfrcDNA。TGF-β1和dhfrmRNA轉錄的起始是由SV40早期啟動子啟動的。與RNA正確加工有關的多聚腺苷化信號和其它順序由3′SV40順序提供。括號中的限制性位點在構建擴增表達質粒時丟失。
圖4在MTX選擇的不同階段對CHO細胞中的TGF-β1核苷酸順序的檢測。A圖用Northern blot分析檢測TGF-β1 mRNA順序。含Poly(A+)的mRNA(5μg)在1%瓊脂-甲醛膠上分級分離，印跡在Hybond N膜上(Amersham)，用如材料和方法中所述的同位素標記的TGF-β1 DNA作探針檢測。含非轉染CHO mRNA的一列曝光48小時以顯示2.5kb TGF-β1信使RNA的內源性程度。含TGF-β1-3細胞mRNA的一列曝光5分鐘。核糖體標記在右邊。B圖在MTX選擇的不同階段對TGF-β1-3CHO細胞轉染子的基因組DNA的Southern blot分析。來自TGF-β1-3轉染子的高分子量DNA用BamHI或EcoRI酶切，取20μg在1%瓊脂糖凝膠上分級分離。將DNA轉移到Hybond N(Amersham)膜上，用切口轉譯的TGF-β1 DNA作探針檢測。TGF-β1-3-0細胞曝光30小時，TGF-β1-3-200和2000細胞為10小時。DNA大小標記在圖左表示。箭頭表示預計同TGF-β1探針雜交的DNA的大小。
圖5重組或天然β1-TGF對CCL-64水貂肺上皮細胞生長抑制作用測定。A圖使用從牛脾中純化得到的天然TGF-β的生長抑制作用測定。使用8-12微微克的TGF-β1一般可有50%抑制效果。B圖在擴增的不同階段從TGF-β1-3轉染子的融合單層中收集無血清上清液。培養基在0.2M乙酸中充分透析，並如後面7.1.6部分中所述的測定生長抑制效果。所列的結果按1×107細胞/5ml收集液進行標準化。□-□為非擴增TGF-β1-3細胞，●-●在2μM氨甲蝶呤中的TGF-β1-3細胞。○-○在20μM氨甲蝶呤中的TGF-β1-3。
圖6重組TGF-β1的酸激活作用。24小時收集TGF-β1-3/2000細胞無血清上清液。在0.2M乙酸或50m M NH4HCO3(pH7.0)中等量透析。作為對照上清液先在50mM NH4HCO3中透析，然後在0.2M乙酸中透析。圖中顯示了經不同處理後的材料劑量-生物活性曲線。△-△，在NH4HCO3中透析的上清液，●-●，在0.2M乙酸中透析的上清液。○-○，先用NH4HCO3處理後，再在0.2M乙酸中透析的材料。
圖7描述rTGF-β1蛋白質的結構特點及產生位點特異性抗多肽抗血清的多肽區域的線圖。用單字符號表示胺基酸A(丙氨酸)，C(半胱氨酸)，D(天冬氨酸)，E(穀氨酸)，F(苯丙氨酸)，G(甘氨酸)，H(組氨酸)，I(異亮氨酸)，K(賴氨酸)L(亮氨酸)，M(甲硫氨酸)，N(天冬醯胺)，P(脯氨酸)，Q(穀氨醯胺)，R(精氨酸)，S(絲氨酸)，T(蘇氨酸)，V(纈氨酸)，W(色氨酸)，Y(酪氨酸)。TGF-β1的重要的功能性區域已被檢出前導順序，前體順序和成熟TGF-β1。
圖8用免疫印跡法對在條件培養基中的TGF-β-3細胞中重組TGF-β1的測定。從融合培養細胞中收集無血清上清液，在0.2M乙酸中充分透析。冷凍乾燥後，材料溶解於SDS樣品緩衝中，以相當於2×105細胞的量在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離，通過免疫印跡法測定免疫活性TGF-β1蛋白。抗-TGF-β1369-381。
在免疫印跡中應用。在肽阻斷實驗中，在免疫印跡前，先在抗體中加入50μg/ml肽369-381。A圖收集與在0，2，或20μM氨甲蝶呤中的TGF-β1-3上清液中的免疫印跡物質，在還原條件下在SDS聚丙烯醯胺凝膠上分級分離。選擇天然牛脾TGF-β1(100ng)為對照進行比較。B組在非還原條件下上清液分級分離。包括牛脾TGF-β1(250ng)。
圖9由TGF-β1-3細胞產生的經分泌的重組TGF-β1的免疫印跡，TGF-β1由抗-TGF-β181-94和抗TGF-β1225-236探針檢測。收集上清液，如圖8所述處理，在梯度SDS-聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離。(A)在還原SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離的上清液進行免疫印跡。在最後一圖顯示了特異性前體和特異性TGF-β1的抗體混合物的免疫印跡試驗，表示重組材料的三種不同形式。(B)在非還原條件下在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離的上清液做的免疫印跡試驗。在最後一圖顯示特異性前體和TGF-β1特異性的抗體的混合物。
圖10在TGF-β1-3/0和TGF-β1-3/2000細胞總的分泌蛋白中對成熟和前體形式的rTGF-β1的測定，在60mm組織培養皿中融合生長細胞在缺少甲硫氨酸，半胱氨酸和胎牛血清但包含100μCi/ml35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸的3ml DMEM中標記。18小時後，收集及澄清無血清標記上清液，在還原7.5-17.5% SDS-聚丙烯醯膠凝膠上分級分離。電泳後，凝膠用En3Hance處理，放射自顯影。顯示的結果是用3μl標記上清液曝光8小時所得。
圖11對TGF β3-2000細胞分泌的TGF-β1相關蛋白的測定。A)TGF-β1前體的線圖，參見討論的內容 B)如先前所述(Gentry et al.，1987，Mol.Cell.Biol.73418-3427)在100培養皿中生長融合的TGF β3-2000細胞。收集無血清上清液(5ml)，在0.2M乙酸中透析，冷凍乾燥0.5ml樣品，用一個抗胺基酸殘基369-381和81-94的抗肽抗體庫(anti TGF β369-381和antiTGF β81-94如(Gentry et al.，1987，Mol.Cell.Biol.73418-3427)前所述做免疫印跡第1道，非還原樣品;第2道，還原樣品，在左邊(第1道)和後邊(第2道)的數字是用千道爾頓表示標準分子量的位置。C)在60mm組織培養皿中的TGF-β3-2000細胞生長融合，在缺乏甲硫氨酸和半胱氨酸但包含100-200μCi/ml[35S]半胱氨酸和[35S]-甲硫氨酸的3ml無血清培養基中脈衝標記15分鐘。然後細胞在含甲硫氨酸和半胱氨酸的無血清培養基中追加4小時，在非還原條件下(第1道)如(Laemmli 1970，Nature 227680-685)前所述將10μl樣品在7.5%-15%聚丙烯醯胺-SDS梯度凝膠上分析。第二個皿中的細胞在含200μCi/ml[3H]-氨基葡糖無血清培養基中標記24小時，無細胞上清液在0.2M乙酸中透析48小時。冷凍乾燥200微升此材料，在非還原條件下在7.5%-15%聚丙烯醯胺-SDS梯度凝膠上分析。凝膠經螢光X線照相用Cronx-4 X射線膠片(Dupont)，曝光後放射自顯影。D)基本同C)一樣，只是樣品置於還原環境下。E)TGF β3-2000在無血清和磷酸鹽培養基中用1mCi/ml[32P]-正磷酸鹽標記。無細胞上清液如前所述處理，在還原條件下在15%聚丙烯醯胺-SDS凝膠上分級分離，凝膠放射自顯影。F)通過兩輪聚丙烯醯胺-SDS凝膠電泳及在6M Hcl中95℃水解1小時(Cooper et al.，1983，Meth.Enzymol.99387-402)純化標記前體。在pH1.9和pH3.5電泳分離消化產物，用放射自顯影測定，用茚三酮測定產物內部胺基酸(P-ser，P-tyr，p-tyr)。
圖12用各種糖酵解酶消化來自TGFβ3-2000細胞的無血清上清液。A)TGFβ3-2000細胞生長融合，在無血清培養基中，培養24小時。培養基在0.2M乙酸中透析，冷凍乾燥，樣品用神經氨糖酸苷酶(0.25單位/ml，第3道)，N-多糖酶(20單位/ml，第2道，或糖苷內切酶H(0.2單位/ml，第4道)消化。在還原條件下用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分級分離消化產物，如圖11說明所述作免疫印跡分析。第一道包含未處理樣品。B)如圖11說明所述，用[35S]-甲硫氨酸和[35S]一半胱氨酸標記來自TGF β3-2000細胞的無血清上清液，如上所述用糖苷內切酶H(第2道)，神經氨糖酸苷酶(第3道)和N-多糖酶消化。第1道包含未處理樣品。在還原條件下用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分級分離消化產物，凝膠放射自顯影。N-多糖酶從Genzyme(Boston，Mass)購得，糖苷內切酶H和神經氨糖酸苷酶從Calbiochem(La Jolla，CA)購得，緩衝液條件如生產者所推薦。
圖13TGF-β1特異性轉錄本的無細胞翻譯。A)包含TGF-β1整個編碼區域的1350鹼基對的Pst I-EcoR片段亞克隆進pSR64(pharmacia)，用從Bethesda Research Labs(Baltimore，MD)購得的SP6聚合酶在先前描述過(Pelham and Jackson，1976，Eur.J.Biochem.67247-251)的離子化條件下轉錄5μg線性質粒。反應用DNase酶切，用苯酚∶氯仿∶異戊醇(24∶24∶1)抽提二次，乙醇使之沉澱。RNA溶解於50μl水中，取10μl(第2道)在1%瓊脂糖一脲-凝膠上如(Purchio et al.，1980，J.Virol.35629-639)前所述分級分離。第一道包含網織紅細胞核糖體RNA標記物。凝膠用溴乙錠染色，在UV光照下照像。B)如上述的RNA在22℃10m M甲基汞處理10分鐘，調節到20m M2-巰基乙醇中，取1μg在信使依賴型網織紅細胞無細胞翻譯系統中(Purchio et al.，1983，J.Virol.48320-324)，用[35S]-甲硫氨酸和在前描述(Sharples et al.，1987，DNA6239-244)離子條件下，總量為50μl，進行翻譯。反應物在10%聚丙烯醯胺-SDS凝膠中分級分離(Laemmli，1970，Nature227680-685);凝膠用螢光X線照相，曝光於Cronex-4X射線膠片上。第1道，不加RNA，第2列，1μgTGF-β1RNA。
圖14用硫酸銨沉澱來自TGF-β-3-2000細胞的500ml無血清上清液後，20mg蛋白在Bio-SilTSK-250柱(21.5×600mm)上作凝膠滲透色譜法分析。用包含40%(V/V)乙腈的0.1%TFA水溶液，以2ml/min，在22℃平衡柱，收集4ml分部。所述分部的一部分用來分析測定對水貂肺上皮細胞的生長抑制活性(-O-)實線給出在254nm處蛋白質的吸收峰。以下的蛋白用作標記物α-胰凝乳蛋白酶原(Mr25，700)，牛胰腺核糖酸酶A(Mr13，700)，和胰島素(Mr5，700)。
圖15反相HPLC純化rTGF-β1。從μBondapak C18柱(顆粒10μm，3.9×300mm)上得到來自凝膠滲透色譜法純化的TGF-β1(圖2，B庫)的0.65mg蛋白質的洗脫圖。洗脫是由一個0.05%TFA水溶液到0.045%TFA溶液含30%乙腈的線性10分鐘梯度，和0.045%TFA溶液中含36-60%乙腈的10分鐘梯度完成的。柱流出速度控制在0.2ml/min，在22℃進行。所述分部的一部分用來分析測定對水貂肺上皮細胞的生長抑制活性(-O-)。水平的線表示已收集的rTGF-β1。在214mm連續監測紫外線吸收物質(-);虛線(---)表示乙腈濃度。
圖16純化rTGF-β1蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠分析。在非還原(A)或還原(B)條件下用SDS-PAGE分級分離前體和成熟形式的TGF-β1，用考馬斯藍R-250染色。從牛脾中分離nTGF-β1作為對照。在圖的左和右用千道爾頓標明標記蛋白。
圖17表明此蛋白的考馬斯藍染色圖，此蛋白來自表達TGF-β1的擴增CHO細胞的條件培養基。透析這一條件培養基，在還原條件下在15%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離，用考馬斯藍R-250染色。作為參考，在圖左標明的a，b和c表示rTGF-β1分子。第一道，0.25ml條件培養基，第二道，表示用千道爾頓標明分子量的標記蛋白。
圖18在Bio-SilTSK-250柱上(7.5×600mm)rTGF-β1-前體CNBr肽的凝膠滲透色譜法。用溴化氰裂解rTGF-β1-前體的800pmol洗脫圖。在22℃，以0.25ml/min，用包含40%乙腈的0.1%TFA水溶液平衡柱。在214mm處測定紫外吸收物質。用M標明的峰表示易受埃德曼降解的CNBr肽，數字是指指定的一個片段或一些片段在整個順序中由二硫鍵連結的位置(Sharplesetal.，1987，DNA6239-234)。
圖19純化TGF-β1蛋白對水貂肺指示細胞的生長抑制曲線。生長抑制作用由文中所述評價。通過胺基酸分析確定TGF-β1多肽的濃度。-△-，重組前體蛋白;-●-，從牛脾中得到nTGF-β1;-○-，rTGF-β1。
圖20(A)TGF-β1前體的假設結構，重點表明二硫交叉相連的性質。(B)在轉染CHO細胞中pre-pro-TGF-β1加工的總結。蛋白水解加工的位點已顯著標明。星號表示糖基化位點。塗黑為信號肽;空心為前區域;畫斜線的為成熟TGF-β1。
圖21TGF-β1和TGF-β2對裸鼠中A549人類肺腫瘤生長的作用。雄性裸鼠(Balb/c-nu+/nu+)在12周齡時，在近背部頸區域皮下注入含1.3×106人類肺癌細胞(A549)的0.2ml體積磷酸緩衝液。在大約80%動物中20天內形成可觸摸的腫瘤(10mm-3×3×1mm)。帶腫瘤的動物隨機分入不同的籠中。處理的第一天對應於動物形成可測量的腫瘤後進行處理的第一天動物。每組5個動物如所述在鄰近腫瘤(腫瘤周圍的)皮下注入0.10ml載體。對照組或者注入經高壓液相層析純化的牛血清白蛋白(2μg)，或者注入對應於表皮生長因子環狀區域(殘基11-21)的合成肽(200ng)。先用雙腳規在三維空間中測量腫瘤大小，然後按橫坐標上標明的日子進行注射。每個點的值表示平均腫瘤體積。如先前所述(Massaqueetal.，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.，838206-8210;Spornetal.，1983，Science219;1329)將從牛骨中得到的TGF-β1和TGF-β2純化至均一性，在十倍過量牛血清白蛋白中穩定化。在這個特定實驗過程中，所給的每個成份的總量為每個動物1.4μg。
圖22TGF-β1對裸鼠中A549人類癌腫塊抑制作用與劑量的關係。過程與圖21中所述基本一致，除了在處理的第一天，腫瘤的起始大小要大些(在腫瘤細胞接種後第25天)。對照組動物注入BSA，在15天時間中，處理動物組每隔3天接受注射TGF-β1，在腫瘤周圍，或者是12.5，或者是50，或者是200ng，共5次。所標的值代表15天時每組動物平均腫瘤體積。
圖23未處理過及用TGF-β1處理過的帶A549肺癌裸鼠的照片。照片頂部為第20天的帶，用大的皮下腫瘤的對照動物(由圖21所述的實驗中的鼠真實照片)，照片下部代表TGF-β1處理組的動物(同一個實驗)。插圖(右上角)表示從對照(左邊)和處理(右邊)動物上切下的腫瘤。(照片上動物中及切下腫瘤大小上的差異反映了照相機距離的不同)。
圖24從模擬的和TGF-β1處理動物上切下的腫瘤的組織學觀察。新鮮切下的腫瘤(處理的第20天，圖21)在緩衝福馬林中固定石蠟包埋，切片，用Gamoris's三色染色。從模擬處理動物中來的腫瘤切片，A圖(20X)，C圖(100X)。從TGF-β1處理動物中來的腫瘤切片，B圖(20X)。D圖(100X)。D圖插圖，從TGF-β1處理的動物中來的腫瘤切片的血管壁。
圖25來自模擬處理及TGF-β1處理動物的經固定的人類肺部腫瘤切片的染色圖。從模擬處理動物中來的腫瘤切片用PAS染色(A圖)，100X;用AlcianBlue染色，(C圖)，100X;從TGF-β1處理動物中來的腫瘤切片用PAS染色，(B圖)，100X;用AlcianBlue染色，(D圖)，100X。
圖26從17號克隆的細胞中釋放的TGF-β1前體蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。(A)TGF-β1蛋白線狀圖，
表示磷酸化的糖基化位點;
，表示非磷酸化的糖基化位點。來自17號克隆細胞的無細胞上清液在無血清培養基中用[35S]-甲硫氨酸和[35S]-半胱氨酸(B)，[3H]-氨基葡糖(C)，[3H]-甘露糖(D)和[32P]-磷酸鹽(E)標記，樣品在7.5%-15%梯度SD S-聚丙烯醯胺凝膠(B和C)上，或在15% SD S-聚丙烯醯胺凝膠(D和E)上處理和分析。
圖27由17號克隆細胞產生的TGF-β1前體蛋白的N-多糖酶酶切。(A)[35S]標記無細胞上清液用N-多糖酶加工和處理，在7.5%-15%梯度SD S-聚丙烯醯胺凝膠上分析第1道，無酶;第2道，加N-多糖酶。(B)基本同A，除用[32P]-磷酸鹽標記。
圖28TGF-β1前體糖肽的胺基酸順序。已標明用金黃色葡萄球菌V8蛋白酶(E)和胰蛋白酶酶切獲得的肽。
，表示磷酸化的糖基化位點;
，表示非磷酸化糖基化位點。數字是指TGF-β1前體整個順序中特定糖肽的位置。X，未確定殘基。
圖29[32P]標記TGF-β1前體CNBr肽的凝膠滲透色譜法。色譜法在Bio-Sil TSK-250柱(7.5×600mm)上進行，用CNBr裂解的650pmol S-吡啶乙醇鹽TGF-β1前體和165，000cpm S-吡啶乙醇鹽[32P]-TGF-β1前體的洗脫圖。對標出的部分進行[32P]放射活性測定(-O-)。實線給出在214nm處蛋白吸收值。以下的蛋白用作標記;α-乳球蛋白(Mr18，400)，細胞色素C(Mr12，300)，和胰島素(Mr5，700)。用M表示的峰指CNBr肽，數字指在TGF-β1前體整個順序中這個特定片段的位置(Sharplesetal.，1987，DNA6239-244)。
圖30CNBr肽M(39-113)的金黃色葡萄球菌V8蛋白酶肽的反相高性能液相色譜法。色譜法在RP-300柱(2.1×30mm)上進行。金黃色葡萄球菌V8蛋白酶消化的含12，500cpm[32P]-M(39-113)的370pmol M(39-113)的洗脫圖。在35℃，以100μl/min的流出速率，用2小時在0.1%的三氟乙酸水溶液到含0.08%三氟乙酸的60%乙腈溶液的線性梯度下完成多肽的洗脫。測215mm處紫外吸收物質(-)。用L S6000液相閃爍計數器(Beckman)測定[32P]放射性(-O-)。用E標明的峰值指易受埃德曼降解的V蛋白酶肽。
圖31CNBr肽M(134-253)的金黃色葡萄球菌V8蛋白酶肽和胰蛋白酶肽的反相高性能液相色譜法。色譜法在RP-300柱(2.1×30mm)上進行。(A)經金黃色葡萄球菌V8蛋白酶消化的含44，000cpm[32P]-M(134-253)的400pmol M(134-253)的洗脫圖。(B)來自含3，100cpm[32P]-E(170-194)的庫A(圖31A)的胰蛋白酶肽的洗脫圖。色譜法條件同圖30說明的一致。用E標明的峰表明V8蛋白酶肽，用T標明的峰指易受埃德曼降解的胰蛋白酶肽。
圖32甘露糖-6-磷酸鹽的鑑定。(A)[32P]標記的TGF-β1前體蛋白在酸中水解2小時。水解產物與非放射活性磷酸胺基酸和甘露糖-6-磷酸鹽混合，在pH1.9，垂直方向pH為3.5，進行電泳分離。圖上表示了一個放射自顯影圖。樣品點在右下角(箭頭)。甘露糖-6-磷酸鹽(M6 P)，磷酸絲氨酸(P S)，磷酸蘇氨酸(P T)，磷酸酪氨酸(P Y)和無機磷酸鹽均被指明。經測定，[32P]與甘露糖-6-磷酸鹽共同遷移，並且在磷酸寡糖的位置(小箭頭)。(B)(B)E(76-91)和(C)E(134-139)經1小時水解的產物作類似的分析。(D)[32P]標記TGF-β1前體蛋白水解，在pH8.9用電泳分離，接著作色譜分析。
圖33A純化的溴化氰肽(134-153)的SDS-聚丙烯醯胺凝膠分析。M(134-253)在(1)非還原或(2)還原條件下在15%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離，用考馬斯亮藍R-250染色，分子量標記以千道爾頓表示。
圖33Bpre-pro-TGF-β1的線性圖。pro TGF-β1，前體的前區域，及成熟TGF-β1，依次用線段a.b.c表示。cys(C)殘基在前區域中已被指明，顯示了包含N連結糖基化的位點(
)和非磷酸化位點(
)的甘露糖-6-磷酸鹽。
圖33CTGF-β1前體類變體。上標表示SER取代胺基酸的位置。粗線表示未配對核苷酸，新的SER密碼子下面劃線。
圖33D，E由轉染CO S細胞分泌的TGF-β1突變體蛋白的免疫印跡。收集無血清上清液，在0.2M乙酸中透析，在7.5-17.5% SD S-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離，在還原(D)或非還原(E)條件下用免疫印跡法分析。印跡用抗前區域(抗TGF-β181-94)和抗成熟(抗TGF-β1369-381)特定抗肽抗體的混合物作探針進行檢測，CO S細胞只用載體(πH3M)(第2道)，或用編碼TGF-β1(第3道)，TGF-β1S33(第4道)，TGF-β1S223(第5道)，TGF-β1S225(第6道)，和TGF-β1S223/225(第7道)的載體進行轉染。第1道含從非轉染CO S細胞得到的上清液。分子量標準用千道爾頓表示。
圖33F，G對TGF-β1突變體前體和成熟蛋白S223/225的鑑定。收集用πH3M(第2道)，pTGF-β1(第3道)，pTGF-β1S33(第4道)，pTGF-β1S223(第5道)，pTGF-β1S225(第6道)或pTGF-β1S223/225(第7道)轉染CHO細胞的上清液，如在圖33D，E中所述的進行處理。用對(F)抗成熟順序(抗TGF-β1369-381)或(G)抗前區域(抗TGF-β181-94)特定的抗體在非還原條件下做免疫印跡。第1道包非轉染CHO細胞上清液。分子量標準用千道爾頓表示。
圖34125I標記的TGF-β1前體與純化甘露糖-6-磷酸鹽受體的結合。純化的人類甘露糖-6-磷酸鹽/IGF-Ⅱ受體(Roth et al.，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun，149600-606)被包被抗此受體的抗體的微滴定板吸收。在已知未標記競爭結合物濃度下，加入125I標記TGF-β1前體(100，000cpm每井)，4℃3小時後，洗滌井，切下並計數。到出的結果為差別少於10%的重複井的平均數，並且是三個試驗的代表。在無競爭物的井中(抑制作用為0)，5.2%標記配體結合上去。TGF，TGF-β1前體;M1 P，甘露糖1-磷酸鹽;M6 P，甘露糖6-磷酸鹽。
圖35胰島素引起IGF-Ⅱ和重組TGF-β1前體與鼠脂肪細胞的結合的增加。同胰島素預處理或沒有處理的鼠脂肪細胞與重組125I-TGF-β1前體(4.9×104cpm)或125I-IGF-Ⅱ(4.2×104cpm)一起孵育。為估計非特異性結合，採用100nMIGF-Ⅱ或3mM man6 P。結果為三次重複測定的平均數。
圖36IGF-Ⅱ和重組TGF-β1前體同CHO細胞結合，及CHO細胞超表達人類IGF-Ⅱ/man6 P受體(CHO-IGF-ⅡR)。細胞與125I-IGF-Ⅱ(8.0×10cpm)或重組125I-TGF-β1前體(1.3×105cpm)一起孵育，如所標明的，加入5mM man6 P或100 nM IGF-Ⅱ來估計非特異性結合。結果為三次重複測定的平均數。
圖37重組TGF-β1前體與CHO細胞超表達人類TGF-Ⅱ/man6 P受體結合的專一性。細胞同重組125I-TGF-β1前體(6.7×104cpm)及指明濃度的競爭性未標記配體一起孵育。結果為三次重複測定的平均值。
圖38重組TGF-β1前體的內在化。超表達TGF-Ⅱ/man 6P受體的CHO細胞在37℃在有或無5mM man6 P存在時與重組125I-TGF-β1前體(5×104cpm)一起孵育。在指定時間，測定全部或與抗酸(即內在化的)細胞有關的數字。結果為三次重複測定的平均值。
圖39血小板TGF-β1前體與分離的IGF-Ⅱ/man6 P受體的結合。純化的IGF-Ⅱ/man6 P受體吸附在微量滴定板中，在指明濃度的從血小板得到的純化潛伏性TGF-β1(□)或者重組TGF-β1(■)存在下與125I標記的重組TGF-β1前體一起孵育。在4℃3小時後，測定受體結合放射活性量。
圖40IGF-Ⅱ/man6P受體與重組TGF-β1前體而不是血小板TGF-β1結合Westernblot分析，重組子(R)(0.5μg)和血小板(P)TGF-β1前體(2.5μg)在還原SDS-聚丙烯醯胺凝膠上電泳，轉移到硝酸纖維素濾紙上，與對前體中一段順序特異的(左)抗肽抗體或與IGF-Ⅱ/man6P受體和受體的抗體(右)反應。用與抗兔Ig結合的鹼性磷酸酶測定結合的兔抗體。用組織化學法染色鹼性磷酸酶。分子量標記物(以千道爾頓為單位)的位置用箭頭表明。重組的未經酶切前體(a)，重組前體殘餘(b)和血小板前體(c)的位置也已標明。
圖41從經衣黴素(TU)處理的CHO細胞和未經處理的CHO細胞中得到的，具免疫活性的TGF-β1的鑑定。細胞在完全培養基中生長融合，用2.5μg/mlTU在0.1%(V/V)二甲亞碸最終濃度中處理4小時。然後加含TU的無血清培養基，在24小時後收集。對照細胞只用0.1%(V/V)二甲亞碸處理。對分泌蛋白，培養基在0.1M乙酸中透析，乾燥，然後免疫印跡法分析。免疫印跡中心標的a，b和c表示TGF-β1的三種形式。這個免疫印跡表示2×105細胞分泌到1ml培養基中的蛋白。對於與細胞有關的TGF-β1形式，收集5×105細胞並作免疫印跡分析。所用的抗體為前體和成熟特異性抗肽抗體的混合物(第7.1.8部分，以下)。
圖42轉染CHO細胞系TGF-β3-2000克隆17分泌TGF-β1的時間。(A)在不同時間從脈衝標記CHO細胞中收集的條件培養基的SDS-PAGE電泳圖。細胞用[35-C]-半胱氨酸和[35-S]-甲硫氨酸脈衝標記0.5小時。在還原條件下，培養基在7.5-20%梯度SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離。標記蛋白(KDal)列在圖右側。(B)在不同追加時間對CHO細胞分泌的TGF-β1的定量。因為在分泌中成熟TGF-β1與TGF-β1前體量的比率是不變的，分泌的重組生長因子的相對水平可通過對可在螢光X線照相中觀察到的12KDalTGF-β1的光密度掃描來測量。每個點代表三次重複實驗的平均數，且包括標準差。在20小時成熟TGF-β1分泌的相對量定為1.0。
圖43糖基化的抑制物對CHO細胞分泌TGF-β1的作用。(A)融合培養細胞在缺乏血清，甲硫氨酸和半胱氨酸的培養基中培養1小時，然後是用[35S]-半胱氨酸和[35S]-甲硫氨酸脈衝標記0.5小時。抑制劑的使用濃度如下;0.23mM SW，0.52mM CA，4m M dN，4mM dMM，和6μM TU。經過6小時追加，條件培養基在SD S-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離及螢光X線照相。標記物與圖41中所述的一致。(B)經抑制劑處理的CHO細胞分泌重組生長因子的定量。生長因子的相對量由螢光X線照相光密度掃描測定。結果得自3個獨立的實驗並表明了標準差。對照CHO細胞中的成熟TGF-β1相對量被定為1.0。
圖44經抑制劑處理的細胞分泌的TGF-β1蛋白用糖基化修飾酶進行消化。轉染CHO細胞用[35-S]-甲硫氨酸和[35-S]-半胱氧酸標記，來自轉染細胞的條件培養基，經6小時追加後被收集，用內切酶H，神經氨糖酸苷酶或N-多糖酶消化。消化產物在還原7.5-20%梯度聚丙烯醯胺凝膠上分級分離，螢光X線照相。在螢光照相左側和右側標明的標記物與圖41中所描述的相同。
圖45來自經糖基化抑制劑處理的CHO細胞的TGF-β1前體的磷酸化作用。用[32-P]-正磷酸標記TGF-β3-2000克隆17CHO細胞的融合培養物，如在12.1部分中所述進行處理收集標記的培養基，用一個SephadexG-25脫鹽柱去除多餘的[32-P]-正磷酸，用還原SDS-PAGE分級分離32-P-標記的蛋白，並進行放射自顯影，標記蛋白(KDal)標在放射自顯影圖的右側，左側的「a」和「b」表達TGF-β1前體多肽。
圖46缺少三個糖基化信號的缺失突變體不能由細胞中分泌。(A)缺少糖基化信號順序的TGF-β1缺失突變體及它插入到瞬時表達質粒CDM8的構建圖。用SacⅡ去除編碼TGF-β1三個糖基化順序的DNA。這個缺少導致框架中160個胺基酸的去除，突變體蛋白在Arg-50和Gly-211間連結，用Sharplesetal.的定位法標數，以後被稱作△51-210TGF-β1。(B)△51-210TGF-β1在COS-1細胞中的瞬時表達。COS-1細胞長成半融合，然後用含有△51-210TGF-β1cDNA插入子的CDM8轉染。轉染條件以下12.1.7中所述。轉染48小時後，細胞在無血清的培養基中培養，48小時後收集。條件培養基在0.1M乙酸中透析，乾燥，用對TGF-β1前體和成熟TGF-β1特異性的抗肽抗體免疫印跡分析。
圖47影響溶酶體內pH的離子載體或弱鹼基，抑制CHO細胞內TGF-β1分子的蛋白水解。(A)在6小時追加後收集的條件培養基，SDS-PAGE分析，細胞在標明的濃度下處理。圖右和左的標記同圖41中的相同。(B)分泌出的TGF-β1分子蛋白水解加工的定量。在實驗中，細胞用200μM氯喹，1μM莫能菌素或10μM氯化銨處理。通過計算分泌的TGF-β1總量及校正重組生長因子水平，通過螢光X線照相的光密度掃描計算出重組生長因子的相對量。在校正後，通過光密度計測定成熟TGF-β1的量，這表明了蛋白水解加工的水平。每一點代表三個獨立的實驗，並已含標準差。對照細胞重組TGF-β1的相對加工水平被定為1.0。
圖48用氯喹，莫能菌素和氯化銨處理CHO細胞，用糖苷酶處理CHO細胞分泌的重組TGF-β1肽。來自TGF-β3-2000克隆17細胞的條件培養基脈衝標記，與10mM氯化銨，200μM氯喹或1μM莫能菌素一起孵育，用糖苷內切酸H，神經氨糖酸苷酶或N-糖苷酶處理。消化產物做SDS-PAGE和螢光X線照相進行分析。標記物如圖41所述。
圖49通過單核細胞的Ln TGF-β17幹擾素誘導激活與劑量有關。單核細胞(2×106細胞/ml)在Costar 96-井微量滴定板上與5μg/ml純化的潛在rTGF-β1(Ln TGF-β1)，在沒有(對照)或有從10-1000U/ml遞增濃度的 rrINF存在下一起培養。培養井中在加入Ln TGF-β1的同時加入細胞素，24小時後收集上清液，用如第7.1.6部分中所述生長抑制試驗測定TGF-β1活性。
圖50γINF介導的單核細胞激活的TGF-β1與來自血小板的TGF-β功能上的一致性。從存在100 U/ml rγTGF的單核細胞培養物中收集無血清的24小時上清液，在所收集的樣品中測定5 μg/ml n TGF-β的活性，所用方法為以後第7.1.6部分中所述的生長抑制測試方法，採用已知的TGF-β血小板標準，通過測定三個重複系列的稀釋液。在30 μg/ml如過去所述抗牛TGF-β1中性單克隆抗體ID 11.16(Dasch et al.，1989 J.I mmunol.1421536-1541)存在或不存在下，用普通鼠腎(NRK)細胞安抗獨立生長測試方法(Twardzik et al.，1982，Science 216894-897測定單核細胞激活的TGF-β稀釋液對數值(1，10，100ng)。在8個隨機低倍鏡視野計數大於20個細胞的菌落。
圖51γTNF誘導的，單核細胞激活的TGF-β1的SD S-PAGE分析。來自親代TGF-β3-2000細胞系的細胞在含3H亮氨酸，45-70Ci/m M，0.5m Ci/ml的無血清DMEM中培養過夜。收集上清液，如以下第13.1.1部分所述純化3H亮氨酸標記的Ln TGF-β1複合物。在100 U/ml rγINF存在或不存在下，單核細胞(1×107細胞/ml)在含有0.5%人體血清的DMEM中和1.6×106cpm3H亮氨酸標記的TGF-β1 P複合物共同孵育12小時，澄清上清液，在非還原條件下用SD S-PAGE(12.5%)進行分析。標記物包含牛血清白蛋白，68kd;卵白蛋白，45kd;碳酸酐酶，30kd;細胞色素C，14kd和TGF-β，24kd，用銀染色法使之顯色(Dasch et al.，1989，J，I mmunol，1421536-1541)。使用帶增感屏的曝光匣在KodakX-omat AR膠片上進行放射自顯影，測試3H亮氨酸標記蛋白。A道，單核細胞加γ(gamma)TGF;B道無r-INF的單核細胞。
5.本發明的說明本發明涉及從猴TGF-β1前體基因編碼順序中產生有生物活性的成熟rTGF-β1以及生產的產物。成熟的具生物活性的TGF-β1可通過在宿主細胞中克隆和表達猴TGF-β1全長核苷酸編碼順序而生產，該宿主細胞能正確加工前體分子，因而可以得到一個成熟的rTGF-β1與真正天然TGF-β1實質上具有相同的生物活性。
本發明還涉及可用猴TGF-β1前體基因生產的具生物活性的rTGF-β1前體蛋白。具生物活性的rTGF-β1前體可通過在一個能夠分泌TGF-β1前體的適當的宿主中克隆和表達猴TGF-β1全長核苷酸編碼順序而得到。
本發明的方法，僅為了便於說明，可分成幾個步驟(a)分離或產生編碼猴TGF-β1前體形式的順序;(b)構建表達載體，它將指導猴TGF-β1編碼順序的表達;(c)轉染可複製和表達基因及加工基因產物合適的宿主細胞，以生產成熟的具生物活性的TGF-β1和/或TGF-β1前體。(d)鑑定和純化TGF-β1前體和成熟的具生物活性的TGF-β1。
當一個轉染子被鑑定可表達高水平TGF-β1前體和/或具生物活性的成熟TGF-β1時，本發明實施還包括克隆的擴增和表達基因產物的分離。
本發明方法，通過以下實施例得到證實，其中包括猴TGF-β1前體編碼區cDNA的製備、克隆和測序。編碼區域置於SV40表達控制因子的控制下，用來轉染CHO細胞。CHO轉染子可產生同天然TGF-β1很難區分的具生物活性的成熟TGF-β1，也產生更大的生物活性前體分子。
本發明方法的各方面在以下幾個部分和實施例中更詳盡地描述。
5.1猴TGF-β1編碼順序的分離和生產圖1中描述了猴TGF-β1的核苷酸編碼順序。本發明方法實施中，此核苷酸順序，或其功能上同當物可被用來生產指導TGF-β1產物表達的重組分子。由於核苷酸編碼順序的簡併，其它可編碼與圖1中描述的相同的胺基酸順序的DNA順序，可在本發明實施中用於克隆TGF-β1。圖1中核苷酸順序的這些改動包括缺失、增加或不同核苷酸殘基的置換，結果可得到編碼相同或功能上同當的基因產物的順序。這個基因產物可能包含在順序中有胺基酸殘基的缺失，增加或置換，但無表型變化，因此產生一個生物活性產品。這些胺基酸置換可能是基於殘基極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性分子性質相似而形成的。例如，帶負電荷的胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸;帶正電荷的胺基酸包括賴氨酸和精氨酸;非電荷極性頭部基因或非極性頭部基因胺基酸具相似的親水值，包含有亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸;甘氨酸，丙氨酸;天冬醯胺，穀氨醯胺;絲氨酸，蘇氨酸;苯丙氨酸，酪氨酸。
編碼TGF-β1的核苷酸順序可從產生高的類TGF-β1活性的猴細胞獲得。編碼順序可從克隆從細胞中分離和純化的RNA的cDNA克隆或從基因組克隆得到。cDNA或克隆的基因組庫可以從產生的DNA片段製備，用在本技術領域中已知的技術，包含但不局限於使用限制性酶。編碼TGF-β1的片段可以通過用核苷酸探針篩選識別，這個探針同圖1中描述的順序中任何部分有大量互補。可選擇全長克隆，即包含編碼TGF-β1前體的整個編碼區域的克隆用來表達。
在本發明的另一個實施例中，用本技術領域眾所周知的化學方法，可全部或部分合成圖1的編碼順序。
在以下描述的例子中，可通過TGF-β1前體的cDNA克隆得到猴TGF-β1編碼順序，該前體編碼從非洲綠猴細胞株BSC-40分離的多聚腺苷化RNA，BSC-40能產生高水平生長抑制劑，功能上同TGF-β1有關。對整個編碼區域測序，並且與已公布的人類與鼠TGF-β1順序(見圖1)比較，所推得的成熟猴TGF-β1胺基酸順序證明與成熟人類TGF-β1具100%的同源性。人類與猴的前體順序也證明有強烈的順序同源性，只有5個胺基酸不同。有趣的是，猴(和鼠)前體順序比已報導的人類TGF-β1順序少一個胺基酸殘基(見圖1，胺基酸殘基數目158-159)。
猴、鼠和人類之間TGF-β1順序的高度保守性提示需要強大的進化壓力來保留重要的功能。這不僅應用於成熟形式的TGF-β1，它作為生長調節因子有重要的雙重功能，也應用於成熟TGF-β1順序上遊的前體多肽區域，它可能也顯示同樣的生長調節活性。
在BSC-40細胞中主要的TGF-β1mRNA為2.5kb，與編碼鼠和人類TGF-β1特定區信息的結果一致(圖2)。在4kb和1.45kb處可見的小帶可能代表經異常加工的轉錄本，或者可能是編碼最近由Seyedin描述的類TGF-β1分子(CIF-B)的(1987，J.Biol，Chem.2621946-1949)。這種分子與TGF-β1具強烈的同源性。
推測的猴、人類和鼠克隆的多肽順序克隆包含在8-21位幾乎一致的鄰近伸展的14個疏水殘基，它可能構成氨基端信號肽。另外，一個Arg-Arg二肽緊接在成熟TGF-β1氨基端前面，提示有相似蛋白水解切點。猴TGF-β1前體還包含在成熟分子中沒有的三個潛在的N-糖基化位點。因此，不僅在種中保留了TGF-β1成熟和前體多肽的初級結構，還有獨特的翻譯後修飾位點。
BSC-40合成及釋放高水平的與我們測試的其它細胞系有關的TGF-β1。培養BSC細胞的培養基有一個活性，在毫微克水平的EGF和TGF-α存在下，可刺激NRK細胞的安抗獨立生長，並且顯示與從人類血小板純化而來的TGF-β1一致的生化性質(Froliketal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA803676-3680;Robertsetal.，1983，Biochemistry225692-5698)。另外，從BSC-1細胞分離出與TGF-β1功能上相似的生長抑制劑，此抑制劑與來自血小板的TGF-β1競爭結合TGF-β1膜受體。(Tuckeretal.，1984，Science226705-707)。由來自BSC-1細胞的細胞系，BSC-40細胞合成的大量TGF-β1特異性mRNA表明由Tucker等人在BSC-1條件培養基中鑑定出的雙重功能生長調節因子確實是TGF-β1。這一結論也得到最近數據的支持，這些數據證實Tucker等觀察到的其它來源的TGF-β1也抑制一些培養中的腫瘤細胞的生長(Robertsetal.，1985，Proc.Natl.Acad.SciUSA82119-123)。但是，證明來自BSC-1抑制劑確實是這兒所描述的基因的產物還需要對由培養中的BSC-1細胞釋放的TGF-β1類似活性作順序分析。
5.2含TGF-β1編碼順序的表達載體的構建為了表達有生物活性的成熟形式的TGF-β1，需選擇表達載體/宿主系統，它不僅能提供高水平的轉錄和翻譯，而且能對基因產物進行正確加工。在表達構建物中使用猴TGF-β1前體的整個編碼順序尤其重要，因為成熟形式TGF-β1看來是前體產物經過細胞加工而來。假設的加工方案在圖20中顯示。另外，還要選擇能使產物分泌的表達/宿主細胞系統。
尤其是，看來成熟TGF-β1是由二硫相連接的等二聚體，每個亞基有112個胺基酸，通過細胞加工形成，加工包括在Arg-Arg胺基酸(圖1中殘基位數277和278)處對全長前體進行蛋白水解酶切。另外，在猴TGF-β1前體含有在成熟形中沒有的三個潛在N-糖基化位點，對來自中國倉鼠卵巢細胞系(該細胞系可分泌高水平重組TGF-β1)的[3H]氨基葡糖標記無血清上清液的分析表明，TGF-β1前體，而不是成熟形式，是糖基化的。因此，前體分子的正確糖基化對細胞合成及釋放或分泌成熟分子是重要的。TGF-β1前體(而不是成熟形式)的磷酸化，進一步說明前體的功能重要性。而且，成熟形式TGF-β1是由二硫鍵相連的二聚體組成，每個亞基含有9個半胱氨酸殘基。其中一些在鏈間，其它的是鏈內二硫鍵，影響成熟分子的三級結構和構型，因而影響它的生長活性。因此，在表達系統中所用的宿主細胞能正確表達和加工猴TGF-β1基因產物的能力對生產具生物活性的成熟的TGF-β1是重要的。
在此中描寫的例子中，在中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞系統中用猴病毒40(SV40)表達控制因子成功地生產了成熟的、具生物活性的TGF-β1。但是，各種各樣其它動物宿主/表達載體系統(即含有在一個合適的宿主細胞中，指導複製，轉錄和翻譯TGF-β1編碼順序所必需的一些因子的載體)同樣可在本技術領域應用。這些載體包括，但不局限於，病毒表達載體/哺乳類宿主細胞系統(即細胞巨化病毒，牛痘病毒，腺病毒等等)，昆蟲病毒表達載體/昆蟲細胞系統(即杆狀病毒)，或從哺乳類細胞基因組來的非病毒啟動子表達系統(即鼠金屬硫堇啟動子)。
這些載體的表達因子在強度和特異性上不同。根據所用的宿主/載體系統，可用一系列合適的轉錄和翻譯因子中的任何一個。例如，當在哺乳類細胞系統中克隆時，可用從哺乳類細胞基因組中分離出的啟動子(例如，鼠金屬硫堇啟動子)，或用在這些細胞中生長的病毒中分離出的啟動子(例如，牛痘病毒7.5k啟動子)。通過重組DNA或合成技術生產的啟動子也可用來轉錄插入順序。
插入蛋白編碼順序的充分翻譯也需要特異的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼和鄰近的順序。如果在適當的表達載體中已插入整個TGF-β1基因，包括它自己的起始密碼子和鄰近順序，就不再需要另外的翻譯控制信號。但是，如果僅插入部分編碼順序，則必須提供外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。而且，起始密碼必須與TGF-β1編碼順序的閱讀框架同相，以保證整個插入子的翻譯。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以來自各種來源，天然的和合成的。表達效率可以通過加入轉錄衰減順序，增強子等來得到提高。
過去所述的將DNA片段插入一個載體中的任何方法都可用來構建包含TGF-β1基因和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法可能包括體外重組DNA技術，合成技術和體內重組技術(基因重組)。
如果一個腺病毒被用作表達載體，TGF-β1編碼順序就可與一個腺病毒轉錄/翻譯控制複合物，如晚期啟動子和三重前導順序連結。這個嵌合基因然後可通過體外或體內重組技術插入腺病毒基因組。插入到病毒基因組的非重要區域(例如，E1或E3區)，就可使重組病毒存活並在感染宿主中表達TGF-β1。同樣地，也可使用牛痘7.5k啟動子。
另一個可用來表達TGF-β1的表達系統為昆蟲系統。在一個這樣的系統中，Autographacalifornice核多角體病病毒(AcNPV)被用作表達外源基因的載體。這病毒在Spodopterafrugiperda、(灰翅夜蛾)細胞中生長。TGF-β1編碼順序可以克隆入病毒的非重要區域(例如多面體基因)，並且置於AcNPV啟動子(例如多面體啟動子)的控制下。TGF-β1編碼順序的成功插入將引起多面體基因的失活，並且產生非閉合重組病毒(即缺乏由多面體基因編碼的蛋白質外殼的病毒)。然後用這些重組病毒感染已表達插入基團的Spodoperafrugiperda(灰翅夜蛾)細胞。
另外，可選擇這樣的宿主細胞株，它能調節插入順序的表達，或以所需的特定的方式修飾及加工基因產物。在特定的誘導物存在下，可以提高特定啟動子下表達，(如鋅和鎘離子對金屬硫堇啟動子)。因此，可控制基因工程得的TGF-β1的表達。如果克隆的外源基因蛋白產物對宿主細胞是致命的，則這點很重要。而且，蛋白產物的修飾(如糖基化)和加工(如切割)對蛋白的功能是重要的。不同宿主細胞對翻譯後的蛋白質加工和修飾有特異和特徵性機制。可選擇合適的細胞系或宿主系統以確保外源蛋白表達後的正確修飾和加工。
5.3表達TGF-β1基因產物的轉染子或轉化子的鑑別含有猴TGF-β1編碼順序，並表達有生物活性的成熟產物的宿主細胞可由至少四個普通方法鑑別(a)DNA-DNA雜交;(b)「標記物」基因功能的有在與否;(c)通過測定TGF-β1mRNA轉錄本在宿主細胞中的表達來評估轉錄水平;(d)通過免疫測定及最後通過生物活性測定來檢測成熟基因產物。
在第一個方法中，通過DNA-DNA雜交，用含有與猴TGF-β1編碼順序(如圖1所示)基本同源的核苷酸順序，或部分順序或其衍生物的探針，來檢測插入在表達載體中的猴TGF-β1編碼順序。
在第二個方法中，重組表達載體/宿主系統可依據特定的「標記物」基因功能的存在與否來鑑別和選擇(例如胸苷激酶的活性，對抗生素的抗性，對氨甲蝶呤的抗性，轉化表型，杆狀病毒的閉合體形成等等)。例如，如果TGF-β1編碼順序插入載體的標記物基因區域，就可通過標記物基因功能的缺失來鑑別含有TGF-β1編碼順序的重組子。還可以在控制TGF-β1編碼順序表達的相同或不同啟動子的控制下，將一標記物基因與TGF-β1順序前後排列。對誘導或選擇作出反應的標記物的表達表示TGF-β1編碼順序的表達。
在第三個方法中，可通過雜交測試評估TGF-β1編碼順序的轉錄活性。例如，用一個與TGF-β1編碼順序或其特定部分同源的探針做Nothernblot來分離和分析多腺苷化RNA。還可以提取宿主細胞的整個核苷酸與這些探針雜交而分析。
在第四個方法中，可用免疫學方法評估成熟蛋白產物的表達，例如用Westernblot，免疫測定(如放射免疫沉澱，酶聯免疫測定等等)。然而，表達系統成功性的最終測試包括檢測具生物活性TGF-β1基因產物。在宿主細胞分泌基因產物的地方，收集培養轉染宿主細胞的無細胞培養基，檢測TGF-β1活性。在沒有分泌基因產物的地方，可用細胞溶胞產物測定這一活性。在任何一種情況下，生物學測試例如這兒所述的生長抑制測試，或這兒所述的在靶細胞中安抗獨立生長的激活作用的測試等均可使用。
一旦一個生產高水平的生物活性的成熟的TGF-β1的克隆被鑑別，它可以被擴增，可用本技術領域熟知的技術純化TGF-β1。這些方法包括免疫親和純化，包括高性能液相色譜的色譜方法，等等。
儘管猴TGF-β1前體的胺基酸順序與預計的人類前體的有點兒不同，依照本發明生產的具生物活性的成熟形式猴TGF-β1的胺基酸順序與人類成熟形式的一致。另外，本發明的生產猴TGF-β1具有同天然TGF-β1不能區分的生物活性。這表明本發明的表達/宿主細胞系統能夠加工表達產物，因而能產生具有與真正天然TGF-β1相同生物活性的分子。因此，根據本發明生產的猴TGF-β1可在使用TGF-β1的所在方面應用。
5.4TGF-β1基因產物的最初定性來自人類、鼠和猴的TGF-β1前體區域的氨基部分表現了高程度的同源性(Deryncketal.，1985，Nature316701-705;Deryncketal.，1986，J，Biol.Chem.2614377-4379;Sharplesetal.，1987，DNA6239-244)，表明分子的這部分可能與重要的生物功能有關。在以下第8部分表示的數據，證明TGF-β1前體的這個部分是糖基化和磷酸化的，這些數據支持了這個論點，因為人們可能推測，如果不是因為這特定的功能，細胞不會化代價完成這些二級修飾。這些修飾對前體的二聚化或對指導它在細胞外的運動是重要的也許這個磷酸-糖蛋白可自由地完成其它細胞內或細胞外功能。有證據表明在成熟TGF-β1運輸出細胞時涉及前體的糖基化。
5.5TGF-β1前體細胞加工，結構性質和可能功能在以下第6部分所述的TGF-β1cDNA克隆，表明分子在分泌出去以前經歷種種翻譯後的加工(Deryncketal.，1985，Nature316701-705，Deryncketal.，1986，J.Biol.Chem.2614377-4379;Sharplesetal.，1987，DNA6239-244)。用蛋白純化和氨基端測序技術對由CHO-TGF-β1-3-2000細胞生產和釋放的重組TGF-β1蛋白作定性分析(以下第8部分)。
以下第8.3和8.4部分描述的對分離的前體及成熟TGF-β1多肽的氨基端順序分析，為蛋白水解加工提供了資料。從還原聚丙烯醯胺凝膠分離的前體多肽產生一個主要蛋白順序，根據對猴cDNA的預測(Sharplesetal.，1987，DNA6239-244)，這一順序在TGF-β1前體的Leu-30處開始。在氨基端順序中沒觀察到不均一性，這表明了蛋白水解加工中的特異性。這一結果表明Gly-29/Leu-30肽鍵為信號肽酶切位點，這一結果與VonHeijne的信號肽預測方法所預測的一致(VonHeijne，1986，NucleicAcid，Res，144683-4690)。除信號肽酶切外，成熟TGF-β1的純化和觀察(以下8.2和8.4部分)顯示rTGF-β1在預測的二元蛋白酶位點經蛋白水解加工(Sharplesetal.，1987，DNA6239-244)，而產生成熟多肽。另外，成熟TGF-β1的CNBr片段的羧基端蛋白順序分析表明這是一個完整分子。因此，CHO細胞擁有正確加工pre-pro-TGF-β1所必需的合適蛋白酶。
由轉染CHO細胞分泌的主要生物活性成份為成熟的兩聚體生長因子。在以下第8.2部分顯示的結果表明CHO條件培養基與成熟TGF-β1一起純化顯示出大於95%活性，而與更大的rTGF-β1前體一起純化活性少於5%。另外，重組TGF-β1與nTGF-β1表現一致，擁有相同的特異性生物活性(以下8.5部分)。rTGF-β1前體，與成熟生長因子相比，其活性低50倍。對水貂肺抑制作用方面的比較顯示一個稍有變化的劑量-反應曲線，提示與成熟TGF-β1相比對前體的受體親和性不同。
雖然在以下第8.5部分出的結果及以上所進行的討論表明rTGF-β1前體是具生物活性的，對其進行深入的結構分析顯示了一些令人感興趣的異常使對其的說明複雜化。蛋白順序分析和SDS-PAGE揭示分離的前體由通過二硫鍵相連的前體pro-TGF-β1，成熟TGF-β1和前體前區域組成。用CNBr化學裂解此由二硫鍵相連混合物並分離CNBr肽，顯示前體的CYS-33與成熟TGF-β1的一個半胱氨酸殘基形成一個二硫鍵(圖20A)。與前體順序相連的TGF-β1單體鏈的存在限制了人們得出關於完整前體生物活性的任何明確結論。在CHO細胞內這個二硫連接的複合物的形成提出一個問題，即在天然分泌TGF-β1的組織和細胞中它起的作用。CHO細胞高水平分泌rTGF-β1多肽可能導致非天然的交叉連接，因為不正確摺疊的rTGF-β1，可引起表達贗品。另一個方面，二硫連接的前體複合物可能在TGF-β1加工中代表一個重要的中間物。但是，研究表明由前體CYS-33形成的二硫連接對表達成熟的具生物活性的TGF-β1不是必需的，提示這些複合物可能不是必需的中間體(以下5.7和10部分)。兩硫相連的前體複合物可在潛伏分離形式的TGF-β1中觀察到(Miyazonoetal.，1988，J.CellBiochem.Suppl.12A200;Wakefieldetal.，1987，J.Biol.Chem，Suppl.11A46)。
根據以下第8.2-8.5部分中所列的結果，提出了在轉染的CHO細胞中pre-pro-TGF-β1的加工(圖20B)。雖然提出的加工方案是不完善的，但它強調了幾個至少已部分確定的步驟。雖然還沒完全確定各種加工步驟的順序，但把它們描繪成依次發生的以使之容易理解。第一步涉及在Gly-29/Leu-30肽鍵處切去信號肽。這一切除很可能在前體傳送通過粗面內質網膜時與翻譯協同發生的(BlobelandDobberstein，1975，J.Cell.Biol.67835-851;Walteretal，1984，Cell385-8)。在信號肽切除後，核心糖基化單體在位於Asn-82，Asn-136和Asn17(8.1和9部分)的每個預測N-糖基化位點處加到pro-TGF-β1上。核心糖基化pro-TGF-β1隨後在傳送通過高爾基體時加工，產生一個磷酸化糖蛋白，含有複合物，唾液酸化的低聚糖。在合成或傳送的某些階段，在二元殘基處出現蛋白水解酶切，並出現二硫異構化，釋放成熟TGF-β1。
在第12部分及以後所述的結果表明合適的糖類處理對從轉染CHO系TGF-β3-2000克隆17分泌TGF-β1多肽是必需的。影響早期糖加工的糖基化抑制劑可強烈地改變分泌過程的效率。對缺失三個糖基化位點的TGF-β1缺失突變體的進一步研究也顯示了分泌中的缺陷，而且極可能在細胞內傳送有缺陷，有可能在內質網上積聚。相反地，通過抑制高爾基體內甘露糖酶的存在而影響後階段加工的抑制劑，可導致TGF-β1分泌的增加。雖然對涉及細胞內傳送的信號通知得還不多，這些結果提示糖加工對TGF-β1適當的分泌通道是必需的，而且加工的早期階段對細胞內傳送是最關鍵的。糖本身在分泌中可能直接起作用，低聚糖側鏈的特異受體可能幫助指導蛋白的分泌。也可能，通過對TGF-β1傳輸的特異的及需要的確定，糖可能起更為間接的作用。
蛋白分泌有兩類的通道，調節的及非調節的(組成型的)。調節通道主要存在於分泌細胞型中，需要外來刺激以釋放分泌囊內的物質。這兒描述的轉染CHO細胞極可能是非調節型。申請人所得到的結果，即在CHO細胞內有低水平蛋白水解加工的TGF-β1，顯示無成熟生長因子的積累，這與釋放的非調節型是一致的。TGF-β1也可由調節通道來分泌和釋放。這個多肽生長因子是血小板的主要組成部分，是通過凝血酶處理從血小板中釋放。
TGF-β1前肽在四個鹼基殘基羧基端酶切，在Ala-279開始的釋放成熟TGF-β1。在第12部分及以後所述的使用影響囊內pH的試劑的研究證實，酶切在酸性囊室內發生，與胰島素和神經肽前體的加工一致。這些加工蛋白酶的性質普通還沒有搞清楚。在酶切位點處的鹼性殘基對的存在，可能是有效蛋白水解所必需的。有趣的是所有最近被鑑定的TGF-β族成員中，成熟TGF-β多肽的氨基端殘基前是幾個鹼性胺基酸殘基。可改變TGF-β1肽三級結構的糖基化加工的抑制劑對蛋白水解加工沒有或只有一點兒作用，表明這個區域在前體中可能是充分暴露的，不管糖加工如何。成熟TGF-β族成員的氨基端基團前的多種鹼基殘基可能是為了加強這個區域的特異蛋白水解。
5.6TGF-β1前體與類胰島素生長因子-Ⅱ/甘露糖6-磷酸鹽受體的相互作用。
在以下第9部分描述的結果，顯示在TGF-β1前體中存在甘露糖-6-磷酸鹽，並且提出了前體擁有獨立功能的可能性。在第11部分及以後的繼續研究證實TGF-β1前體與類胰島素生長因子Ⅱ/甘露糖-6-磷酸鹽細胞表面受體結合。這些研究也提出被結合的TGF-β1前體是內在化的證據。
甘露糖-6-磷酸鹽，磷酸化糖類似物，看來在目標的傳輸及溶酶體酶的細胞內交換中起根本作用(vonFigura，1986，Ann.Rev，Biochem.55167-193)。識別溶酶體酶的甘露糖-6-磷酸鹽殘基的特異性受體已被鑑別，並且是傳輸系統中重要組成部分。在組織培養細胞的條件培養基中已鑑定出包含甘露糖-6-磷酸鹽的被分泌的溶酶體的蛋白(GalandGottesman，1986，J.Biol.Chem2611760-1765;Caponyetal.，1981.J.Cell.Biol104253-262;Baumbachetal.，1984Proc.Natl.AcadSci.USA812985-2989;SahagianandGottesman，1982，J.Biol.Chem25711145-11150)。所有這些蛋白質，顯示酸水解酶活性。TGF-β1前體的甘露糖-6-磷酸鹽殘基可能引導pro-TGF-β1到溶酶體去進行蛋白水解加工以產生成熟TGF-β1。或者是，甘露糖-6-磷酸鹽殘基可能起作用引導已酶切的TGF-β1前體到溶酶體內去降解。
最近有報導陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸鹽受體與類胰島素生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)受體一致(Morganetal.，1987，Nature329301-307;Rothetal.，1987，Biochem，Biophys，Res.Comm.149600-606;MacDonald，1988，Science2391134-1137)。這個受體表現有雙重功能，包含公開的IGF-Ⅱ和甘露糖-6-磷酸鹽的結合位點。雖然與IGF-Ⅱ和包含甘露糖-6-磷酸鹽的蛋白質結合的單個受體的生物學意義還不清楚，這個雙重功能受體可能在信號傳送和/或在對受體結合蛋白作有目標地分類中起重要作用。多育曲菌素，一種與催乳素有關糖蛋白，被認為是自動分泌生長調節子(LeeandNathens，1987，Endocrinology120208-213，顯示包含甘露糖-6-磷酸鹽，及與IGF-Ⅱ甘露糖-6-磷酸鹽受體緊密地結合(LeeandNathens，1988，J.Biol.Chem，2633521-3527)。TGF-β1前體可能與這個雙重功能受體或其它甘露糖-6-磷酸鹽細胞表面受體特異性地作用。
申請人已確定重組TGF-β1前體能與位於細胞質膜上的IGF-Ⅱ/man6P受體結合，這是根據體外實驗的結果得到的，如在第11部分及以後所述。證明(1)胰島素誘導IGF-Ⅱ/man6P受體移位到細胞膜上促進rTGF-β1前體與鼠脂肪細胞的結合。(2)rTGF-β1前體與超表達IGF-Ⅱ/man6P受體的CHO細胞的結合大於與親代CHO細胞的結合;和(3)rTGF-β1前體與鼠脂肪細胞和CHO細胞結合被甘露糖-6-磷酸鹽特異性抑制。
甘露糖-6-磷酸鹽在濃度為10μm時，半完全抑制rTGF-β1與超表達IGFⅡ/man6P受體的CHO細胞結合(轉染的CHO細胞)，這個濃度值接近以前發現的(8μm)半完全抑制與游離受體結合的濃度(第9.2部分，在前)另外，甘露糖-1-磷酸鹽在抑制結合上的效果比man6P差，這結果與已知IGF-Ⅱ/man6P受體對此兩糖的特異性一致(VonFiguroandHasilik，1986，Ann，Rev.Biochem.55167-193)。
申請人根據以下11.2.1.部分中所述結果，相信rTGF-β1前體與轉染CHO細胞上的IGF-Ⅱ/man6P受體結合後迅速內在化。在37℃與轉染CHO細胞上IGF-Ⅱ/man6P受體結合後，對細胞進行酸洗，rTGF-β1前體迅速變得對酸洗無反應。例如，在37℃10分鐘後，大於75%特異性結合放射性配體對酸洗產生抗性，提示在這段時間中大部分結合rTGF-β1前體內在化(Haigler，1980，J.Biol.Chem.2551239-1241)。在37℃孵育更長時間後，觀察到細胞吸收放射性材料進一步增加，因為甘露糖-6-磷酸鹽不阻斷附加吸收，它可能是由於吸收了降解TGF-β1前體的分解產物。
進行了進一步的研究以確定從血小板分離的潛伏TGF-β複合物是否也可與IGF-Ⅱ/man6P受體結合。在以下11.2.2部分給出的這些實驗的結果表明，從血小板來的TGF-β1複合物與rTGF-β1前體強烈競爭結合受體，提示潛伏TGF-β複合物也含有甘露糖-6-磷酸鹽。試圖用電泳及轉移到硝化纖維上測定IGF-Ⅱ/man6P受體與來自血小板的TGF-β1前體殘餘物的結合，但沒有成功，這可能是因為在血小板TGF-β1前體上，man6P殘基數比rTGF-β1前體上的少。這種解釋與觀察到的血小板和重組TGF-β1前體間與rTGF-β1前體競爭結合游離man6P受體的能力上的差異一致在這個方面來自血小板的前體的能力大約為rTGF-β1的三分之一。另一個可能是，在獲取來自血小板的TGF-β1前體的冗長純化步驟中，一些磷酸被磷酸酯酶去除了。
關於血小板TGF-β1前體的最近的研究表明，它的糖結構在保持此複合物在非活性狀態下是重要的(MiyazonoandHeldin，1989，Nature，inpress)，發現用內切糖苷酶或唾液酸酶(sialidase)消化能激活潛在血小板TGF-β1複合物。而且，發現此複合物與man6P和唾液酸，不是其它糖一起孵育能激活潛在的TGF-β1，支持了糖有維持血小板TGF-β1前體在潛伏狀態的作用。在第11.2部分及以後所描述的結果表明，在TGF-β1前體上的man6P通過與ⅠGF-Ⅱ/man6P受體的作用引導這個分子到達細胞。這個相互作用可能通過其內在化和輸送到內吞室，導致TGF-β1前體的激活或降解。
5.7TGF-β1的生物活性本發明的成熟TGF-β1產物在體內和體外是腫瘤細胞生長的有效抑制劑。測量TGF-β1對水貂肺上皮細胞的抗增殖作用的實驗證實，本發明的重組TGF-β1(rTGF-β1)和天然TGF-β1(ηTGF-β1)具相同的特異性活性(以下8.5部分)。另外，nTGF-β1和ηTGF-β1的劑量反應曲線實質上不能區分。
以下第8.6部分中的結果證明，天然TGF-β1及本發明的rTGF-β1都在體內抑制腫瘤生長。用TGF-β處理人類肺腫瘤後觀察到腫瘤停滯，這一現象伴隨一個更加類似分化的表型的誘導。粘液分泌細胞，在模擬處理的分化差的腫瘤中佔少部分，在TGF-β處理腫瘤中佔主導地位。與正常組織中杯狀細胞分泌作用一致(RobbinsandAngell，1971，BasicPathology，W.B.SanderG.，Philidelphia，PA)，這樣，一種更為分化的狀態，就是在用TGF-β處理腫瘤中發現的類似粘蛋白和透明質酸產物的表達增強。無數其它組織學指標也提示TGF-β1介導的分化表型的誘導作用，包括圍繞管壁的柱上皮細胞組織的形成，及細胞外基質即膠原蛋白沉積的增加。
rTGF-β1對無胸腺裸鼠中人類肺部腺癌生長和分化的有效抑制作用，提供了進一步的證據，即本發明的rTGF-β1可能用於發展新的，也許細胞毒性小的癌症治療方案。
5.8生產成熟TGF-β1的改進方法。
在本發明的特定實施例中，通過去除圖1中33位的半胱氨酸(CYS-33)，用絲氨酸代換之來修飾TGF-β1前體。修飾是通過在DNA水平上用定點突變完成的。用編碼經修飾前體基因的質粒轉染COS細胞，它最後比表達未修飾前體基因的CHO細胞分泌的成熟TGF-β1多三至五倍。人們認為，這種修飾阻止某些由二硫鍵相連的前體複合物的形成，因此允許分泌更多的成熟TGF-β1。初步分析表明用此方法生產的成熟TGF-β1是經正確加工的，並且在生物學上與天然TGF-β1相同。
在TGF-β1前體另外兩個半胱氨酸(CYS-223和CYS-225)上的修飾，也導致分泌成熟TGF-β1，但不引起更高水平的分泌。在以下的第10部分給出了經修飾的TGF-β1基因的構建和表達細節。
雖然位於TGF-β1前體的前(pro)區域的三個半胱氨酸對生產成熟rTGF-β1不是很重要的，它們的重要性可能在TGF-β1的調節。在這點上，前體的二聚化看來對成熟TGF-β1的蛋白水解酶切是不需要的，但可能在潛伏性形式上需要它。
用編碼pre-pro-TGF-β1S223/225的質粒轉染的細胞釋放活性形式的TGF-β1(以下第10.2.4部分)。最近，潛伏的TGF-β1已從人類血小板中純化出來，為高分子量複合物，其中TGF-β1前體的二聚前(pro)部分同一未知蛋白質以二硫鍵相連，且與成熟TGF-β1非共價相連(Miyazono et al.，1988，J.Biol.Chem.2636407-6415;Wakefield et al.，1988，J.Biol.Chem.2637646-7654)。在CHO細胞表達系統中，無證據表明有其它蛋白質參與和前體和成熟型TGF-β1一起形成複合物。在CO S細胞系統中也是如此，因為由CO S細胞生產的r TGF-β1前體和成熟型用免疫印跡看上去同CHO細胞生產的如果不是一致的話也是相似的。
申請人的實驗結果表明成熟r TGF-β1與前體前(pro)區域非共價結合，若前(pro)區域不能形成二聚體，則沒有潛伏性。雖然這很可能歸因於非共價聯繫的破壞，申請人不能排除此可能性，即成熟TGF-β1非共價與單體的TGF-β1S223/225前(pro)區域結合(形成非潛伏性的複合物，因為其活性所需的成熟順序已充分暴露)。
最近的研究(Migazonoetal.，1988，J.Biol.Chem.2636407-6415)表明在前(pro)區域的糖結構參與與TGF-β1非共價結合以形成潛伏性複合物。也許，前(pro)區域的二聚體化為這種作用提供了合適的框架和穩定性。關於TGF-β1體內調控還知道得很少。因力大多數細胞類型釋放潛伏性TGF-β1(Lawren-ceetal.，1984，J，Cell.Physiol.121184-188;Pitcheretal.，1986，Biochem.Biophys，Res.Commun，13630-37;Wakefieldetal.，1987J.Cell.Biol(105965-975)，潛伏複合物的激活看來是很重要的調控步驟。對於此潛伏性的本質的更清楚了解將有助於確定激活的生理機制。
重組TGF-β1的高水平表達和分泌可能導致非天然交叉連接，使位於成熟多肽上半胱氨酸殘基和Cys-33二硫鍵連接成為表達系統贗品。或者，Cys-33可能通過與其它蛋白質相互作用而起調控作用。從血小板分離出來的二硫鍵連接的複合物，尤有這種可能。
由此，位於前體前(pro)部分的三個半胱氨酸可能以二個方式影響TGF-β1的成熟和激活。CYS-223和CYS-225可能使前體形成二聚體，並隨後以非共價方式與成熟TGF-β1作用形成潛伏性複合物，而CYS-33可能通過與成熟TGF-β1和/或其它蛋白形成二硫鍵而起作用，從而調節TGF-β1的作用。
6.實施例TGF-β1前體的cDNA克隆以下實施例描述從非洲綠猴細胞系(BSC40，BSC-1細胞的一個亞系)來的TGF-β1前體編碼順序的cDNA克隆，它在前面已顯示生產功能上與TGF-β1有關的高水平生長抑制劑。發現猴前體及預測的人類和鼠TGF-β1基因產物間有極強烈的順序同源性。
6.1材料和方法用以下步驟克隆編碼TGF-β1前體的cDNA。
6.1.1.細胞生長和RNA提取BSC-40細胞生長在含10%胎牛血清的Dublbecco′s改良Eagle培養基中。MCF-7細胞生長在含6單位/ml胰島素的同樣培養基中。用如前所描述的寡聚[dT]-纖維素色譜法從細胞中分離多聚腺苷RNA(Purchioetal.，1979，J.Virol.29763-769)。
6.1.2cDNA庫的構建和篩選雙鏈cDNA從所述的B SC-40 poly A RNA中合成(Maniatis et al.，1982，Molecular CloningA Laborat-ory Manual，Cold Sping Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，371-372)，用E co R I甲基化酶處理後，與包含E co R I限制酶識別位點的寡聚核苷酸接頭(EcoRI接頭)連接。c DNA用EcoRI酶切在Sephacryl S-1000用色譜法分級分離。收集大於750鹼基對(bP)的cDNA接入用EcoRI酶切過的λgt10(Davis et al.，1980，A manual for genetic Engineering;Advanced Bacterial Genetics;Cold Spring Har bur Laboratory，Cold Spring Harbour，NY)，包裝並在Ecoli C600rk-mk+hfl上(Grosveld et al.，1981，Gene 13227-237)平板生長。用與成熟TGF-β1分子6-17密碼子互補的[32P]標記寡聚核苷酸探針[5′-CACGCAGCAGTTCTTCTCGTGGAGCTGAAGCAATA-3′]雜交，以空斑雜交(Bentonetetal.，1977，Science196180-182)篩選基因庫(Deryncketal.，1985，Nature316701-705)。在第三次篩選後分離得幾個cDNA克隆，亞克隆進pBR322。一個含1600bp插入子的克隆(pTGF-β1-2)亞克隆進M13mp18和M13mp19克隆載體(Yanisch-Perronetal.，1985，Gene33103-119)，用雙脫氧鏈終止法測雙鏈順序(Sangeretal.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467)。
6.1.3Northernblot分析如前所述從MCF-7細胞和B SC-40細胞中分離PolyA RNA(Purchio et al.，1979，J.Virol.29763-769)，在1%瓊脂糖-甲醛凝膠上分級分離(Lehrach et al.，1977，Biochemistry 164743-4751)，轉移到尼龍膜上(Hybond，Amersham)，與[32P]標記的pTGF-β1-2探針雜交。雜交在42℃，50%甲醯胺溶液中進行，溶液中還有0.9MNa Cl，50m M磷酸鈉，5m M EDTA，0.1% SD S，4XDenharts(Maniatis et al.，1982，Molecular ClningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，371-372)，0.4mg/ml酵母t RNA和0.25mg/ml變性了的小牛胸腺DNA。濾紙於65℃在0.25X S SC(Maniatis et al.，1982)，0.1%SD S中洗滌，乾燥及在帶有增感屏的曝光匣(Dupont)中曝光於Cronex-4 X射線膠上。
6.2結果如上所述，來自BSC-40細胞的polyARNA在λgt10中構建的cDNA庫，用一個與成熟TGF-β1分子6-17密碼子互補的36單體脫氧寡核苷酸篩選(Deryncketal.，1985，Nature316701-705)。由於牛TGF-β1(Robertsetal.，1983，Biochemistry225692-5698)和人類TGF-β1(Deryncketal.，1985，Nature316701-705)之間極為相似，我們選擇來自人類順序的探針篩選猴TGF-β1cDNA克隆。
在三輪空斑純化後，共鑑別出13個陽性克隆。一個1600bp克隆，pTGF-β1-2，經限制性內切酶分析包含整個TGF-β1前體編碼順序，被選擇用來進行測序。DNA順序，與推出的胺基酸順序在圖1中表示。發現一個編碼390胺基酸多肽的單個閱讀框架。成熟TGF-β1多肽由羧基端112殘基組成。這個排列與人類TGF-β1(Deryncketal.，1985，Nature316701-705)和鼠TGF-β1(Deryncketal.，1986，J.Biol.Chem2614377-4379)中所述的一樣。猴cDNA克隆與人類cDNA克隆具98%的同源性，在編碼區域只有27個錯配(圖1)和三個鹼基的一個間隔。
在5′-非編碼區中，人類和和猴TGF-β1DNA順序有91%同源性，有3個間隔，而3′-非編碼區域有94%同源性，沒有間隔。在5′起始密碼子的上遊為一有效的分枝結構，在人類cDNA克隆中存在，而鼠克隆中則沒有。鼠克隆中在這個區域中有明顯的插入會抑制此結構的形成。象人類和鼠克隆一樣，猴cDNA克隆不是全長的，因為未鑑別出3′多聚腺苷化。TGF-β1前體mRNA的3′-末端富含G-C的性質可能會產生防止在這個區域中合成DNA的二級結構。3′非編碼區表現出顯著的重複嘌呤順序，CCCC，接在終止密碼子後。這順序有人類順序中出現9次，並有一個單個鹼基差別的重複。猴和鼠克隆含8個重複，並有二個單個鹼基差別的重複。
用TGF-β1-2探針的Northermblot分析顯示與來自BSC-40細胞和人類乳房癌細胞系MCF-6的主要2.5kb多聚腺苷化RNA種的雜交(圖2)。這與在人類細胞系(Deryncketal.，1985Nature316701-705)和鼠細胞系(Deryncketal.，1986，J.Biol.Chem.2614377-4379)中發現的主要轉錄本大小相同。在4kb和1.45kb處的帶也可在圖2第2道上看見。
圖1中也顯示了人類和猴TGF-β1前體蛋白的胺基酸同源性。只有5個胺基酸出現變化，而且它們都在氨基端前體區猴和人類成熟TGF-β1蛋白在胺基酸水平上有完全的同源性。與之相反，在猴和鼠前體TGF-β1分子之間只存在84%同源性(在胺基酸水平上)。差別包括以下一個胺基酸改變，在成熟TGF-β1編碼區絲氨酸(鼠)變成丙氨酸(猴)。在前體中編碼一額外胺基酸(精氨酸，158位)的密碼子，在猴和鼠克隆中沒有。推測這個變化是因為在人類基因中有一個插入，該基因已被測序(Deryncketal.，1985，Nature316701-705)。猴、鼠和人類TGF-β1前體區之間的極為相似性表明分子的這一部分可能也有重要生物功能。
前體羧基端包含成熟型猴TGF-β112個胺基酸，並通過它與相應人類基因產物的同源性而鑑別。前體的這個富含半胱氨酸(9個殘基)區域代表分泌型的TGF-β1，且不包含任何假定的糖基化位點，而在前體的其它區域也可鑑定三個有效的N-糖基化位點(在82，136和177位的Asn)。已知人類和鼠源的TGF-β1等二聚體，需要完整的二硫鍵以保持活性(Messague.1984J.Biol.Chem.2599756-9761)。通過初級順序分析確立的成熟人類TGF-β1的氨基端(Deryncketal.，1985，Nature316701-705)前面有Arg-Arg兩肽。這個相似的酶切位點也存在於猴同源物的相同位置上。在翻譯過程中或翻譯後酶切，伴隨鏈內或鏈間或兩者二硫鍵的形成，引起具活性的等二聚體的產生(二聚化)。關於這點，TGF-β1前體一個含有14個疏水胺基酸的富含亮氨酸區(8-21位，圖1)，它可能具信號肽功能，而且在分泌/加工中起作用。
7.實施例TGF-β1的表達以下實施例描述了活性TGF-β1在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中的表達，該細胞用含編碼TGF-β1順序的重組質粒轉染，編碼順序在猴病毒40(SV40)表達因子控制下。這兒所述的實驗證明許多CHO轉染子生產和分泌高水平TGF-β1。由轉染細胞釋放的TGF-β1通過用對TGF-β1敏感的靶細胞做生長抑制測定證實同真正天然TGF-β1具類似的生物活性。
7.1材料和方法7.1.1細胞培養二氫葉酸還原酶(dhfr)缺失的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(UrlaubandChasin，1980Proc，NatlAcad.Sci，U.S.A774216)在Ham′sF-12培養基中增殖(GibcoLaboratories，NY)培養基內補充10%胎牛血清(FBS)和150μg/mlL-脯氨酸。分別含100U/ml青黴素和100μg/ml的鏈黴素。CHO轉染子在含上述補充物的Dulbecco′s改良Eagle′s培養基上生長。CHO細胞和它們的衍生物通過胰蛋白酶作用以1∶5分裂速率常規傳代。
製備氨甲蝶呤(Sigma，MO)在水中常規濃度，為10mg/ml。加稀釋NaOH(0.2M)使藥物溶解(最終pH為6)。溶液過濾滅菌並保藏在-20℃。在培養基(100μm)中氨甲蝶呤溶液保存在4℃不超過一個月。
7.1.2DNA操作及質粒構建限制性酶，T4連結酶，牛腸磷酸酯酶，DNA多聚酶的Klenow片段及其它DNA製劑從BethesdaResearchLaboratories，MD購得。標準DNA操作如ManiatisT.，etal，1982，MolecularCloningALaboratoryManual.ColdSpringHarbourLaboratory，NewYork中所述。
質粒PSV2(β1-TGF-dhfr)，含前後排列的猴TGF-β1cDNA及鼠dhfr基因，以及插入的SV40順序，如圖3中所述的進行構建。先開始製備pSV2-β1-TGF質粒。含TGF-β1蛋白整個編碼區域的TGF-β1cDNA的1378bpPST-ECORI片段接入pSP65的多聚接頭區，使HindⅢ限制性位點5′置於PSTI識別順序處。得到的質粒用EcoRI酶切，用DNA多聚酶I的Klenow片段修復平頭，然後分離含TGF-β1編碼順序的HindⅢ-EcoRI(平頭)片段。將HindⅢ-EcoRI(平頭)片段加入pSV2-neo的新黴素抗性基因(geo)處，與載體HindⅢ-HpaI段連接，構建質粒pSV2-β1-TGF。
在這點上，構建pSV2-(β1-TGF-dhfr)需兩步。第一步是分離pSV2-β1-TGF的NdeI-EcoRI(平頭)片段。通過用EcoRI酶切pSV2-β1-TGF質粒，用DNA多聚酶的Klenow片段修平末端，用NdeI和PvuI酶切平頭載體，分離2.6kbNdeI-EcoRI平頭片段而完成的。PvuI酶切是必需的，這樣可避免汙染質粒片段在瓊脂糖凝膠電泳上一起純化。構建中最後一步是將含β1-TGFcDNA和SV40順序的NdeI-EcoRI(平頭)片段插入pSV2-dhfr的NdeI-PvuⅡ片段。結果得到的pSV2-(β1-TGF-dhfr)質粒含有單一的NdeI位點，它可使DNA線性化。
7.1.3DNA轉染106缺失dhfr的CHO細胞接種到100mm皿上24小時後，培養物用20ug的NdeI線型pSV2-(β1-TGF-dhfr)質粒以磷酸鈣沉澱法轉染(Wigler，M.，et al.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.761373-1376)。簡要地說，在1ml250mm無菌CaCl2中，加入20ug線型DNA。滴加入1ml 2XHEPES溶液(280mMNa Cl，50mMHEPES，1.5mM磷酸鈉，pH7.1)，混合物置於冰上30分鐘。沉澱物分散滴加到含細胞的10ml F12培養基中。在37℃培養4小時後，更換培養基，換成包含25%甘油的10ml F12培養基，在室溫放90秒，再次用20ml F12培養基衝洗細胞，然後細胞於非選擇性F12培養基(20ml)中另培養48小時。通過用補充了10%透析過的FBS(Gibco，N.Y.)和150ug/ml L-脯氨酸的DMEM置換培養基來選擇表達dhfr的轉染子。在選擇性培養基中細胞培養10-14天，可以觀察到菌落。用巴斯德吸管抽吸十個菌落，然後擴增。
7.1.4.選擇抗氨甲蝶呤細胞擴增二氫葉酸還原酶(dhfr)的細胞主要來自如前所述的初級轉染子(Gasser，C.S.and Schimke，R.T.1986，J，Biol.Chem.2616938-6946)。擴增後，105細胞接種於100mm皿中，與濃度增加的氨甲蝶呤相適應。氨甲蝶呤的起始濃度為50，100，200nM在最高氨甲蝶呤濃度含可見菌落的平板用胰蛋白酶消化，然後在此氨甲蝶呤濃度至少以1∶5細胞再傳二代。然後，細胞(105)接種於2，5和10倍此氨甲蝶呤濃度的100mm培養皿上。含可見菌落的皿再次用胰蛋白酶消化，然後在含氨甲蝶呤的培養基中生長適應。在擴增的各個階段，細胞有含40%FBS，10%二甲亞碸和50%DMEM的培養基中冷凍。在冷凍的培養基中不含氨甲蝶呤。
7.1.5β-TGFmRNA水平的定量用溶液雜交法來估評TGF-β1 m RNA水平(Uhler.M.D.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad Sci，U.S.A，831300-1304).β1-TGF cDNA的600bp Sma I-Sma I片段克隆進pSP65，通過SP 6RNA多聚酶合成[32P]標記的互補RNA，合成細節由產者詳述(PromegaBiotech，MadisonWI)。含整個β1-TGFcDNA的單鍵M13DNA，即和mRNA一樣，用作標準。通過蛋白酶K酶切和苯酚/氯仿抽提，從轉染細胞中分離所有核苷酸(Mcknight，G.S.，etal.，1980，J.Biol.Chem，255144-147)。通過染料結合試驗法測量所有核苷酸樣品中的DNA量(Labarca，C.，andPaigen，K.，1980.Anal.Bio.chem.102334-352)。與M13β1-TGF標準比較，假設每個細胞中有7微微克DNA來估計每個細胞中mRNA分子數。
7.1.6生長抑制試驗水貂肺上皮細胞，Mvl Lu(Accession Number CCL-64，American Type Culture Collection)，對TGF-β1極其敏感，被用來做生長抑制試驗。該試驗是用胸腺嘧啶類似物5′-[125I]-碘代-2′脫氧尿嘧啶(12Idu)來估計DNA的合成。與未處理CCL-64細胞相比，抑制50%125Idu的摻合所需的量被定義為具一個單位的活性，以分離的TGF-β1作標準，一個單位活性一般來說對應於80-100pg/ml TGF-β1。
為了測定轉染細胞對活性TGF-β1的分泌，收集融合培養細胞24小時的無血清上清液，在0.2M乙酸中充分透析。凍幹除去乙酸，樣品重新溶於無菌完全培養基中進行測定。
7.1.7安抗獨立生長的刺激作用測試上清液刺激普通鼠腎纖維細胞(NRK;克隆49)在軟瓊脂上長成菌落的能力。用經酸透析的上清液按所述方法完成軟瓊脂測試(TwardzikandSherwin，1985，J.Cell.Biochem.28289-297;DelarcoandTodaro，1978Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.754001-4005)。
7.1.8肽的合成及抗體產生在Beckman990儀器上用固相技術會成肽，用如前所述的方法從樹脂上切下(Gentry，L.E.，etal.，1983，J.Biol.Chem25811219-11228;Gentry，L.E.andLawton，A.，1986，Virology.152421-431)。用準備好的高性能液相色譜法進行純化。通過胺基酸分析確定肽的組成。
合成的肽通過半胱氨酸殘基與牛γ-球蛋白相連。連接反應基本如前所述(GentryandLawton，1986，Supra)。肽連接的效果為，每個分子的γ-球蛋白的共價連續8到26個分子的肽。
肽連結構(相當於100μg肽)乳化於福氏完全佐劑中，結合皮下和皮內注射，在三到六個位置注入紐西蘭兔子。隔2-3星期給與增強注射。增強注射7-14天後取血。
7.1.9免疫印跡蛋白在7.5%-17.5%梯度SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離，在4℃200mA轉移到未修飾的硝化纖維素上14-18小時(0.45μm;Schilicher和Schuell)、(Burnette，W.N.，1981，Anal.Biochem.112195-203)。硝化纖維素的剩餘結合能力通過與2.5%BLOTTO(Johnson，D.A.，etal.，1984，GeneAnal.Technl3-8)在含0.2%NP-40的磷酸鹽緩衝鹼(PBS)中孵育而阻斷。兔血清抗體在2%BLOTTO中1∶75稀釋，與經阻斷的硝化纖維素紙在室溫孵育2小時。在2.5%BLOTTO中洗滌5分鐘洗去多餘的抗體，硝化纖維素紙與在2.5%BLOTTO中稀釋為1∶500的鹼性磷酸酯酶結合蛋白A一起孵育。孵育一小時後，硝化纖維素紙在含0.2%NP-40的PBS中洗滌5次(洗滌5分鐘)，然後顯影(Learyetal.，1983，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.804045-4049)。
7.1.10NorthernBlot分析如前所述(PwchioandFareed，1979，J.Virol29763)從組織培養細胞中製備細胞質多聚腺苷化RNA，在1%瓊脂糖-甲醛凝膠上分級分離(Lehrachetal.，1977，Biochemistry164743)。此RNA轉移到Hybond尼龍膜(Amersham)上，與放射標記的pTGF-β1-2探針雜交。在0.9MNaCl，50mM磷酸鹽(pH7.0)，5mMEDTA，0.1%SDS，4XDenhardts，0.4mg/ml酵母tRNA，0.25mg/ml小牛胸腺DNA和50%甲醯胺中，在42℃雜交20小時。濾紙在65℃於0.25×SSC中洗四次(30分鐘/洗滌)，乾燥，進行放射自顯影。
7.1.11SouthernBlot分析抽提RNA後得到片狀沉澱核，從核中分離高分子量DNA(PurchioandFareed，下面)，核片狀沉澱物分散於TE緩衝液中，然後置於1%十二基磺酸鈉/10mMTris-HCl，pH7.4/10mMEDTA。加入100ug/ml蛋白酶K，在37℃孵育16-18小時，用酚/氯仿抽提DNA，並用乙醇沉澱，用不含DNAseA的RNAse在TE緩衝液中酶切2小時去除剩餘的RNA，然後在TE中充分透析。
為了作Southern Bolt分析，用適當地限制性內切酶酶切DNA，然後印跡到Hybond尼龍膜上(Southern，E.M.，1975，J.Mol.Biol 98503-517)。Hybond尼龍膜在含有5×166cpm/ml的變性β1-TGF cDNA切口轉譯EcoRI-EcoRI片段的雜交緩衝液中65℃雜交2小時，其中β1-TGF cDNA來自pTGF-β1-2，洗滌的詳細過程在產品中描述。
7.2TGF-β1在CHO細胞中的表達為了表達高水平重組生物活性TGF-β1，我們使用原先描述的pSV2載體(Mulligan，R.C.andBerg，P.，1981.Mol.CellBiol.1449-459;Subramani，S.，etal.，1981，Mol.CellBiol.1854-864)製備一個表達質粒(pSV2-β1-TGF-dhfr)，在同一質粒中，前後排列猴TGF-β1和鼠二氫葉酸還原酶cDNA(圖3)。表達載體帶有很大一部分的TGF-β1cDNA，它編碼整個TGF-β1前體分子。在同一質粒中兩基因的這種連接可以使在擴增dhfr時，能同時擴增TGF-β1。對每個cDNA轉錄起始，終止，多聚腺苷化和剪切所需的信號是一致的，均由猴病毒40(SV40)DNA順序提供。
pSV2-β1-TGF-dhfr按磷酸鈣沉澱法轉染dhfr缺失CHO細胞。表達dhfr表型的十個CHO轉染子通過在選擇性培養基上擴增而分離。所有十個轉染子用雜交溶液控測都顯示含TGF-β1mRNA。為了提高TGF-β1的表達水平，來自10個起始轉染子的細胞在濃度增加的氨甲蝶呤(MTX)中一步步篩選。在擴增的不同階段，用溶液雜交法測試細胞的TGF-β1mRNA水平。10個起始轉染子中的4個表現出TGF-β1mRNA水平提高。這兒，我們描述其中的一個克隆(TGF-β1-3)，它在用MTX的擴增中，表現出很高水平的TGF-β1mRNA。
表1顯示在擴增的不同階段每個TGF-β1-3細胞中TGF-β1mRNA拷貝數。在擴增的不同階段的CHO細胞被稱作TGF-β1-3-0，TGFβ1-3-300，TGFβ1-3-2000，它們依次對應於在0，2μm和20μmMTX中選擇的CHO細胞。
表1在CHO轉染子中TGF-β1mRNA的表達培養細胞每個細胞中TGF-β1mRNA的數目′MTX濃度(μM)(0)(2)(20)
TGF-β1-335034，00076，000CHO＃7700--非轉染CHO201.每個細胞中mRNA的拷貝數用溶液雜交法測定。按一個細胞中DNA含量為7微微克的近似值作計算。
我們用非轉染CHO細胞及起始表現出表達低水平重組TGF-β1的CHO轉染子(CHO＃7)，作為對照，CHO＃7是通過pSV2-β1-TGF(圖3)和pSV2-neo共轉染獲得的，接著在Gentecidin(Gibco，NY)中選擇。起始的TGF-β1-3轉染子顯示與CHO＃7相似的β1-TGFmRNA水平，在非轉染CHO細胞約高20倍。但是，經過MTX選擇，在TGF-β1-3細胞中觀察到的β1-TGFmRNA拷貝數急劇增加，在20μMMTX中，達到每個細胞約有80，000拷貝數。與起始TGF-β1-3轉染子相比，擴增了200倍以上，與非轉染CHO細胞相比，擴增了約4000倍。
圖4A中顯示了從不同壙增階段的TGF-β1-3細胞中來的poly(A)選擇mRNA的northernblot分析。圖中也包括非轉染CHO細胞mRNA，用來顯示這些細胞中低水平的內源性2.5kbTGF-β1mRNA(星號，圖4A)。在幾個其它細胞系中也曾觀察到低水平的TGF-β1mRNA表達TGF-β1-3轉染子顯示大量移至預計2kb大小的可雜交RNA。
在MTX選擇後，TGF-β1-3細胞中TGF-β1 mRNA的急劇增加的最有可能的機制是擴增的結果。為檢查基因擴增，在MTX選擇的不同階段從TGF-β1-3中分離DNA，用限制性酶酶切，轉移到Hybond尼龍膜上，與[32P]標記TGF-β1 DNA雜交。在所述的質粒中，用兩個限制酶EcoRI和BamHI酶切兩次產生缺少側面順序的質粒DNA線性拷貝。因為BamHI位點中有一個位於猴TGF-β1cDNA中，用此酶酶切應產生兩個與切口轉譯探計雜交的片段。
圖4B中顯示了Southernblot的結果。在經MTX選擇的細胞中，可觀察到與TGF-β1探針的強烈雜交。這些片段的大小精確地對應於預測的含pSV2-TGF-β1-dhfr(由EcoRI酶切而來的4.7kb片段和由BamHI酶切而來的4.4和0.51kb)片段的TGF-β1的大小。在起始非選擇轉染子(TGF-β1-3/0)中，可觀察到低水平的相似的酶切產物。光密度計掃描比較不同的TGF-β1-3細胞，揭示在TGF-β1-3/200和TGF-β1-3/2000細胞中分別至少有15和35倍TGF-β1順序的擴增。
7.3分泌的生物活性重組TGF-β1的檢測為了確定TGF-β1蛋白是在轉染TGF-β1-3細胞中生產和分泌的，從這些細胞中收集條件培養基，並測試其生物活性。根據β1-TGF抑制水貂肺上皮細胞(CCL-64)生長的能力所進行的一種敏感而特異的生物測定是最初的測試。在圖5A中顯示了使用高度純化真正人類TGF-β1的一個典型標準劑量反應曲線。在這個測試中，TGF-β1為8-12微微克(80-120pg/ml)時一般可觀察50%水貂肺細胞生長抑制作用。在擴增的各個階段從TGF-β1-3細胞收集的條件培養基顯示了抑制CCL-64細胞生長的活性。在圖5B中顯示了這些上清液的劑量反應曲線。這些圖與觀察到的真正人類天然β1-TGF的抑制曲線具相似的斜率。
表Ⅱ顯示了在TGF-β1-3細胞培養上清液中存在的生物活性物質水平，是從圖5B曲線計算出來的。
表Ⅱ
從CHO轉染子中收集到的生物活性TGF-β1的濃度根據生物活性的在CHO轉染子的條件培養基中TGF-β1的濃度培養細胞MTX濃度(μM)(0)(2)(20)TGF-β1-3 5.8ng/ml 1000ng/ml 5600ng/ml2CHO＃7--非轉染CHO1ng/ml--1.在無細胞上清液中生物活性物質的濃度用ng/ml表示，是根據圖2B中的數據決定的。計算是根據10微微克天然β-TGF對CCL-64細胞產生50%抑制作用而得出的。
2.由TGF-β1-3/200細胞系生產的TGF-β1絕對量從1.5mg/l到6.5mg/l不等。這可能是由於幾個因素，包括指示細胞(CCL-64)和TGF-β1-3/2000細胞的組織培養條件。
在非擴增TGF-β1-3細胞的上清液中可觀察到低水平分泌的生物活性TGF-β1。這些水平與在CHO＃7轉染子中觀察到的相似。經MTX選擇的TGF-β1-3細胞表達很高水平的重組生物性TGF-β1。在20μmMMTX選擇下，TGF-β1-3細胞(TGF-β1-3/2000)分泌約6μg/ml活性TGF-β1到無血清培養上清液中。
表Ⅲ表示了在MTX選擇的各個階段，分泌在TGF-β1-3轉染子培養上清液中的生物活性物質的水平。用水貂肺細胞抑制測定評估生物活性，得到的值換算為每個細胞每24小時的值。與TGF-β1-3轉染子相反，在非擴增TGF-β1轉染子中觀察到低水平分泌的生物活性TGF-β1。生產重組TGF-β1最高的為TGF-β1-3/2000細胞。由107這種細胞在24小時內分泌到5ml組織培養基中的生物活性重組物質的量接近30μg TGF-β1。在每個轉染子的條件上清液中檢測到的生物活性量與在這些細胞系中觀察到的TGF-β1 mRNA的相對水平相關。
表Ⅲ在MTX選擇的不同階段由CHO轉染子分泌的生物活性TGF-β1的量分泌生物活性TGF-β1的值/細胞/24ha0nm2μm20μm轉染子數目MTXMTXMTXTGF-β1-3 2.9 500 2800ba.由100mm圓形融合組織培養皿中分泌入5ml無血清DMEM中的生物活性TGF-β1量，用如材料和方法中所述的，通過測其對水貂肺細胞的抑制來確定。用血細胞計計數測定細胞數。
b.這些細胞的一個100mm圓形融合組織培養皿(c.a.1×10細胞)在5ml無血清上清液中分泌近30μg生物活性TGF-β1。
還用第二個生物測定來進一步確定分泌重組TGF-β1的特徵。這測定是根據TGF-β1與EFG分子一起，在軟瓊脂中刺激NRK細胞生長的能力來進行的。在表Ⅳ中顯示了生物測定的結果。重組TGF-β1與用作對照的人類天然血小板TGF-β1的活性是不能區分的。
1.普通鼠腎細胞在含1ng/ml上皮生長因子(EGF)的0.3%Difconoble瓊脂平板上生長。每個板上可數到8個低倍鏡視野。當板中無TGF-β1或EGF時，不形成菌落。根據從水貂肺上皮細胞抑制測定而來的值估計加入重組TGF-β1的量。形成菌落的能力用從20μmMTX選擇TGF-β1-3細胞收集的上清液評估。
表Ⅳ比較重組TGF-β1和天然TGF-β1的軟瓊脂菌落測定在軟瓊脂上形成的菌落數TGF-β1從限制性培養基中收集人類血小板(ng/ml)的重組TGF-β1TGF-β110.02602515.02632471.02252110.51931820.150857.4酸激活便篩選的重組體TGF-β1，的生物活性最佳化業已發現，很多類型的細胞能分泌以潛伏形式存在的天然TGF-β1，為了獲得最佳的生物活性，需要將其酸化。在前面的圖和表中所陳述的生物檢定是採用經酸透析的物質來進行的。為了確定轉染CHO細胞是否分泌呈潛伏性的非生物活性形式的TGT-β1，將從TGF-β1-3/2000細胞中收集得到的無血清上清液在0.2M乙酸或50m M NH4HCO3(PH7)中透析，並測定其對水貂肺細胞的抑制活性。結果示於圖6中。經過酸透析的上清液具有有效的抑制CCL-64水貂肺細胞的能力。對比之下，經NH4HCO3透析的樣品的抑制活性的水平低得多(低1%)。而首先在NH4HCO3中透析，然後再通過0.2M乙酸第二次透析處理的上清液則能恢復其抑制活性的能力。這種物質的劑量反應曲線與由僅經過酸透析的樣品所顯示的曲線是重疊的。
7.5在轉染TGF-β1-3CHO細胞培養基中成熟和前體形式的TGF-β1的鑑定抗預計的TGF-β1分子中的肽順序的抗肽抗體是以合成肽作為免疫原在兔子中產生的。所用的肽順序顯示於圖7中，圖7也表明了在TGF-β1前體多肽中它們的相應位置TGF-β181-94，TGF-β1225-236和TGF-β1369-381。其中一種抗體(抗-TGF-β1369-381)抗存在於TGF-β生長因子的成熟形式中的表位。其它兩種抗體(抗-TGF-β181-94和抗-TGF-β1225-236)是前體特異性的，並抗僅存在於TGF-β1的前體分子中的肽順序。
7.5.1.成熟TGF-β1的鑑定收集來自TGF-β-3轉染子的上清液並採用抗-TGF-β1369-381(它能容易地鑑定真實的成熟TGF-β1)進行免疫印跡試驗(圖8)。在免疫印跡前用合成肽免疫原預吸附抗體而證實特異性。
在還原條件下(圖8A)，真正的TGF-β1和大小為12-13kd的多肽一樣遷移。在經MTX選擇的TGF-β1-3細胞的上清液中，與真實TGF-β1共同遷移的蛋白質可容易地被鑑別(圖8A)。採用免疫印跡發現，從非擴增的TGF-β1-3細胞中收集的上清液顯示不能測定重組β1-TGF水平。經20μMMTX選擇的TGF-β1-3細胞顯示出能產生最高水平的成熟TGF-β1，比2μMMTX選擇的細胞產生的水平約高2-4倍。這種提高和mRNA水平(表Ⅰ)以及生物活性(表ⅡA和ⅡB)的表達所得到的結果是一致的。在非還原條件下(圖8B)，重組TGF-β1蛋白質的遷移如真正的TGF-β1，以二聚體形式，其遷移位置在24kd處。
除成熟的TGF-β1外，還觀察到較大形式的免疫反應性物質。在還原凝膠上，這些形式的物質的大小為44kd-56kd(圖8A)。這些免疫反應性物質的主要性質表明了有廣泛的糖基化作用。令人感興趣的是在缺乏還原劑時，這些較大形式也顯示出如大小為95-110kd的二聚體那樣的遷移(圖8B)。對這些較大形式的物質作為前體分子的鑑定是採用如下面的小節中描述的前體特異性抗體來證實的。
7.5.2前體TGF-β1的鑑定收集來自TGF-β1-3轉染子的上清液並採用前體特異性抗體進行免疫印跡試驗(圖9)。還原後，抗前體順序的兩個區的抗體(抗-TGF-β181-94和抗-TGF-β1225-236)可識別44-56kd的較高分子量形式，並且不與存在於上清液中的成熟TGF-β1反應(圖9A)。除了識別較大的44kd-56kd形式外，這些前體特異性抗體也可控測分子量在30-42kd範圍內的前體多肽(圖9A)。這些較小的前體分子不與抗-TGF-β1369-381反應，可能只代表前體順序。因此，在來自MTX選擇的TGF-β1-3細胞的上清液中，除成熟β1-TGF外，還包含較大的前體形式。因為這些前體順序在物種之間極為保守，所以它們可能顯示其它重要的生物特性。為了列舉還原後在轉染子上清液中的全部三種TGF-β1形式，以前體特異性抗體(抗-TGF-β1225-236)和成熟TGF-β1特異性抗體(抗-TGF-β1369-381)的混合物為探針作免疫印跡(圖9A)。
在非還原SD S-聚丙烯醯胺凝膠上，分級分離上清液，並且用前體特異性肽抗體或前體特異性抗體與成熟TGF-β1特異性抗體的混合物為探針檢測上清液，示於圖9B中。大小在95kd到110kd之間的較大分子量形式可容易地被每一種抗體測定。前體特異性抗體(抗TGF-β1225-236)和成熟TGF-β1抗體(抗-TGF-β1369-381)的混合物除可測定95-110kd帶外，還可測定二聚體形式的TGF-β1(24kd)。
7.6重組TGF-β1構成了從TGF-β1-3-2000細胞中分泌的蛋白質的主要部分TGF-β1-3/0和TGF-β1-3/2000細胞生長至融合，在無血清的培養基中用[35S]-半胱氨酸和[35S]-蛋氨酸標記18小時，將經放射標記的分泌蛋白質在SD S-聚丙烯醯胺還原凝膠上分級分離。結果示於圖10中。從經放射標記的TGF-β1-3/0細胞中收集的上清液不顯示可被測定的重組體TGF-β1蛋白質的水平。與之相反，從TGF-β1-3/2000細胞中收集的上清液則顯示出在起始TGF-β1-3/0轉染子中未發現的四種主要的分泌蛋白質。這些蛋白質的三種與通過免疫印跡識別的成熟和前體形式的TGF-β1遷移相同。被[35S]-胺基酸大量標記並由TGF-β1-3/2000細胞釋放的另一種蛋白質遷移的位置在22kd分子量處。該蛋白質的氨基末端順序分析顯示出它與二氫葉酸還原酶是相同的。
8.實例TGF-β1基因產物的特性下面的實例呈現了由CHO-TGF-β-3-2000細胞合成的rTGF-β1產物的純化和許多特性的數據。結果表明rTGF-β1是在CHO細胞中，以pre-pro-TGF-β1形式合成的，後者在羧基末端Gly-29和Arg-278處加工。該rTGF-β1前體被糖基化和磷酸化，但成熟蛋白質未進行糖基化和磷酸化，該rTGF-β1具有與天然TGF-β1相當的特異性活性，並且成熟rTGF-β1在體外和體內是腫瘤細胞生長的潛在抑制因子。
8.1.rTGF-β1前體的糖基化和磷酸化與本章節有關的rTGF-β1前體的結構特徵用線型圖解來列舉，如圖11A所示。從蛋白質的29胺基酸殘基處切下一個疏水頂端，產生了一個361個胺基酸的多肽，在圖11A中被定為『a』。隨後的修飾和裂解產生成熟rTGF-β1單體(在圖11A中以『c』作標記)和一種完全由氨基末端前體殘基構成的249個胺基酸的蛋白質(在圖11A中以『b』示之)。
在該實例中所用的細胞系是TGFβ3-2000和由這些細胞所分泌的與TGF-β1有關的蛋白質，分析是通過免疫印跡進行的，結果列於圖11B中。如前面的第7.5部分中所描述，在非還原條件下，通過SD S-聚丙烯醯胺凝膠分析，發現從TGF-β3-2000細胞中衍生的上清液含有一個95kd-110kd的大的形式的rTGF-β1以及成熟的24kd蛋白質二聚體;而在還原條件下分析時，發現這類上清液含有一個44kd-56kd的帶(圖11B中以｀a′示之，2道)、一個30kd-42kd的帶(圖11B中以｀b′示之，2道)和一個12kd的帶(圖11B中以｀c′示之，2道)的成熟TGF-β1單體。在圖11B中所顯示的a、b和c帶含有圖11中所顯示的rTGF-β1前體區的證據在前面的第7.5部分中已陳述了。通過SD S-聚丙烯醯胺凝膠電泳，再進行螢光X線照相，直接分析來自TGF-β3-2000細胞的[35S]-蛋氨酸和[35S]-半胱氨酸標記的上清液，這些帶就可以容易地辨別(圖11c，1道和圖11D，1道);在來自非轉染CHO細胞的上清液中，未檢測到這些帶。
在圖11中所示的帶｀a′和｀b′的擴散性能表示它們可能被糖基化了。為了研究這種可能性，用[3H]-葡萄糖胺標記TGF-β3-2000細胞，無細胞的上清液首先通過SD S-聚丙烯醯胺凝膠電泳，然後再進行螢光X線照相分析，圖11c(2道)顯示了95-110kd形式已被標記;而在成熟的24kd蛋白質二聚體中未測到標記。當在還原條件下分析時(圖11D，2道)，帶｀a′和｀b′被標記。在帶｀c′中未發現標記。因此，rTGF-β1前體被糖基化了，而成熟的12kd單體沒有。
該糖基化的性能可以通過用多種糖酵解酶處理來自TGFβ3-2000細胞的上清液，然後在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離酶切產物來進行進一步研究。圖12A顯示了這些酶切產物的免疫印跡分析。用唾液酸苷酶處理可引起帶｀a′和｀b′移動較快，但仍有擴散帶(圖12A，3道)，這表明有唾液酸殘基存在。主要裂解高分子甘露糖低聚糖的糖苷酶H無顯著的效果(圖12A，4道)。用可去除N-連接的糖的N-聚糖酶酶切引起帶｀a′和｀b′遷移成兩條細帶，其中最大的遷移帶分子量約為39kd(圖12A，2道)，如所預計的，未觀察到成熟12kd單體的遷移變化。採用來自TGF β3-2000細胞的[35S]-半胱氨酸標記的上清液也得到相同的結果(圖12B)。
為了測定未修飾TGF-β1前體的大小，將含有整個TGF-β1編碼區的1350個鹼基對的PstI-EcoRI片段(Sharples等人，1987，DNA6239-244)亞克隆進pSP64並用SP6聚合酶進行轉錄(Kreig等人，1984，NucleicAcidsRes187057-70)。在瓊脂糖-脲凝膠上分析這些轉錄本，表明產生了一種RNA(圖13A)，它可導致在無信使依賴性網狀細胞的轉譯系統中合成42kd的多肽(圖13B)。該凝膠進行較長時間爆光顯示出有較小的40kd產物存在。無主要細胞的轉化產物的大小(42kd)與所需要的一種390個胺基酸的蛋白質的大小非常一致，並且很可能與未修飾的TGF-β1多肽主鏈相應。在圖12A(2道)和圖12B(4道)中所顯示的39kd帶表示rTGF-β1的除去疏水頂端順序(在圖11A中為｀a′)脫糖基蛋白質核心。該帶下面的帶與圖11A中脫糖基帶｀b′相對應。
在[32P]-正磷酸鹽存在下培養TGF β3-2000細胞，然後在SD S-聚丙烯醯胺凝膠上分級分離，發現rTGF-β1前體，而不是成熟12kd單體，被磷酸化(圖11E)。對酸解產物薄層電泳發現大多數磷酸鹽不與絲氨酸，蘇氨酸或酪氨酸(圖11F中的點X、Y、Z)相連接。在下面的第9部分的實例中所得到的數據表明磷酸鹽被結合進天門冬醯胺連接的複合糖基團，如甘露糖-6-磷酸中。對該發現的意義也進行了討論。
8.2.生物活性的TGF-β1的純化將表達rTGF-β1的CHO細胞轉染子(TGF-β3-2000細胞)如上面第7部分中所述那般繁殖和傳代。將在一個150cm2圓形融合組織培養皿中的TGF-β3-2000細胞接種到含有50ml Dulbecco′s改良Eagles′培養基(DMEM)的筒狀瓶(850cm3)中，所述的培養基中補充有胎牛血清(10%v/v)、青黴素(100U/ml)、鏈黴素(100μg/ml)、L-脯氨酸(150μg/ml)和氨甲蝶呤(20μM)，並在37℃下生長。當細胞結合併達到融合後，用50ml如上述那樣補充的無血清培養基將融合細胞漂洗二次，然後在50ml另外再補充有濃度分別為100μg/ml和2μg/ml的抗壞血酸酯和還原穀胱甘肽的無血清培養基中培養24小時。
從筒狀瓶中收集無血清的上清液，在200xg下離心除去細胞碎片，並立即加至10mg/升苯甲基磺醯基氟、50個胰蛋白酶抑制單位/升抑肽酶(Sigma)和0.2M乙酸中。通過超濾(YM10膜，可截留10，000分子量;Amicon)將上清液濃縮40倍，並將得到的濃縮液在0.2M乙酸中充分透析。在純化前，將透析物凍幹並保存於-20℃。
條件培養基首先通過凝膠滲透色譜分級分離。典型的洗脫圖示於圖14中。根據標記蛋白質，在分子量約為15，000處，95%以上的生物活性物質被洗脫。對nTGF-β1採用相同的柱，觀察到相同的洗脫圖。TGF-β1的明顯低的分子量(由凝膠滲透色譜法確定的)可能是因為二聚體生長因子分子緊密的摺疊式結構或因為非特異性吸附。在柱的無效容量中觀察到高分子量的活性，並被認為其活性小於總的可利用的活性的5%。庫A和B在非還原條件下進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)顯示出所洗脫的大部分生物活性組分是24KDal多肽，而所洗脫的較少的生物活性組分是95-110KDal分子量的大組分(數據未顯示)。
為了證實24KDal的組分代表了經適當加工的rTGF-β1，我們採用反相HPLC(高壓液相色譜)將該組分純化至均質以作隨後的特徵鑑定。庫B在C18μBondapak載體上分級分離(圖15)。在較淺的乙腈梯度(載體)上所洗脫的生物活性組分呈現一個均勻的峰，具有與nTGF-β1相同的滯留時間。採用SDS-聚丙烯醯胺凝膠(電泳)在非還原和還原條件下分析發現該活性組分是均勻的，與從牛脾中分離得的nTGF-β1共同遷移(圖16)。通過蛋白質順序分析進一步確定rTGF-β1的特徵(表Ⅴ)。
在測序前，用溴化氫將純化的多肽化學裂解。因為成熟的TGF-β1僅含有一個在殘基382處的蛋氨酸，故同時得到兩個順序;一個對應於生長因子的氨基末端順序(在Ala-279處開始)，另一上代表羧基末端的8個胺基酸(在ILe-383處開始)。我們的結果(表Ⅴ)表明生物活性的rTGF-β1是經過合適的加工的。
rTGF-β1純化步驟的概括示於表Ⅵ中。在兩個純化步驟中，生長因子被純化30倍以上。在這個特例中，總產率為54%，結果為每升條件培養基含0.65mgrTGF-β1。其它製備的加工使生物活性重組蛋白質有85%以上被回收，產率大於1mg/升。
表Ⅵ從條件培養基中純化成熟rTGF-β1分離部分蛋白質b(mg) 單位a比活性單位/mg 產率(%)條件培養基c39.0 14×1073.6×106100T SK(部分B) 1.37 8.3×10761×10659HPLC-C18 0.65d7.5×107119×10654a在實驗過程中確定的活性單位。
b在280nm下假設測定的蛋白質有1個吸附單位＝1mg/ml蛋白質c用1升條件培養基開始。
d通過胺基酸分析計算。
8.3rTGF-β1前體的純化和性能rTGF-β1前體是利用它的糖基化性質來進行純化的。將在T SK-250柱無效容量中洗脫的前體(庫A)在中性緩衝液(50mMNH4HCO3，pH7.8)中透析，在伴刀豆球蛋白A外源凝集素柱中分級分離前，先在15，000×g下離心分離。用磷酸緩衝鹽(PBS)充分地洗滌含有1ml與瓊脂糖4B Pharmacia)共價連接的伴刀豆球蛋白A的柱，並用50m M NH4HCO3，pH7.0進行平衡。加入欲被吸附的樣品，在用10倍體積的PBS洗滌以前，循環過柱四次。用在PBS中的100mM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷洗脫特異性結合物。
與伴刀豆球蛋白A連接的前體可用α-甲基甘露糖苷特異地洗脫。用考馬斯蘭染色的純化前體SDS-聚丙烯醯胺凝膠圖示於圖16中。洗脫的蛋白質遷移位置在95-120KDal的分子量之間。大的形式可以與抗前體順序和成熟的生長因子的抗體反應。在該製備過程中，未檢測到汙染的成熟rTGF-β1，即使在樣品過量的SDS-聚丙烯醯胺凝膠上也未檢測到。
儘管製備產物中不存在成熟的二聚體生長因子，但當用還原SDS-PAGE分析純化前體時，顯示一個與單體rTGF-β1共同遷移的14KDal物質(圖16)。兩種前體pro-TGF-β1(30-390)和前體的30-42KDal前區域(30-278;也可參見圖17)在凝膠上是明顯的。進一步嘗試將這個較大的複合物分成各個獨立的組分未獲成功。伴刀豆球蛋白A純化的物質的胺基酸末端順序分析顯示出兩個氨基末端順序，一種在Leu-30處開始，另一種則在Ala-279處開始。這些結果有力表明從CHO細胞條件培養基中純化的95-120KDalrTGF-β1前體代表了一個包含pro-TGF-β1(30-390)、前體的前區域(30-278)以及全部由二硫鍵內部連接的成熟rTGF-β1的鏈的混合物。為了證實這個觀察結果，我們用CNBr裂解該前體並純化該CNBr肽以確定該複合物的化學性質。將TGF-β1-前體(800pmol)溶解於30μl70%的甲酸中，並加入16μl在100mul70%甲酸中含15mgCNBr的溶液(Gross和Witkop，1962，J.Biol.Chem.237(856-1860)。反應在黑暗中，在氮氣環境，於30℃進行4小時。消化產物在以如上所述的用含有40%乙腈的0.1%三氟乙酸(TFA)(Ikeda等人，1987，Biochemistry262406-2410)平衡的Bio-SilTSK-250凝膠滲透層析柱中層析分離。反相HPLC是在μBondpakc-18柱(39×300mm，10μm粒徑;Waters)中，用由0.05%TFA水溶液作為初始緩衝液和0.045%TFA乙腈作為終止緩衝液所組成的線性梯度而進行。在聚丙烯試管中收集分部部分以使非特異性吸收的損失最小。用CNBr裂解的rTGF-β1前體的TSK-250洗脫圖示於圖18中。各個峰通過測胺基酸的順序而鑑定。一個含有前體半胱氨酸殘基和成熟生長因子的半胱氨酸殘基之間二硫鍵的主要CNBr肽片段是M(30-38/279-382/383-390)，其氨基末端順序分析示於表Ⅴ.Ⅱ中。這個特別的肽片段包含前體的Cys-33和成熟生長因子的一個半胱氨酸殘基。該CNBr肽M氨基末端(30-38/262-382/383-390)代表一個包含pro-TGF-β1的二硫鍵連接肽。
8.4.rTGF-β1多肽的氨基末端順序自動順序分析在一個475A型胺基酸測序器(AppliedBiosystems)上進行。如所述的(Marquardt等人，1987，J.BiolChem.26212127-12136)，苯基海硫因-胺基酸衍生物通過在線反相HPLC，在120APTH分析器(AppliedBiosystems)中分離。
將得自能表達高水平猴rTGF-β1的CHO-TGF-β1-3/2000的無血清條件培養基在還原條件下，在SDS-PAGE上進行電泳。考馬斯蘭染色發現由這些細胞分泌的三種rTGF-β1分子形式(圖17)。最大的形式，在44-56KDal(圖17中以a示之)範圍內廣泛遷移，且具有來自TGF-β1前體和成熟TGF-β1的免疫表位(見前面，第7.5部分)，很可能代表未加工的TGF-β1前體。30-42KDal多肽(圖17中以「b「示之)僅含有從前體衍生的表位(見前面，第7.5部分)表明該物質已經過旨在將它和成熟TGF-β1形式分離的蛋白質水解。14KDal物質(圖17中以「C」示之)表示成熟的，完全加工後的TGF-β1單體。將重組前體蛋白質(圖17中以「a」和「b」示之)從丙烯醯胺薄層電洗脫下來，並且通過氨基末端順序分析確定其特徵。結果示於上面的表Ⅴ中。順序分析發現兩個較大的前體形式具有相同的氨基末端順序。將該順序與預計從猴TGF-β1cDNA中所得到的順序(Sharples等人，1987.DNA6239-244)相比較，表明兩種較大的蛋白質均經過特異性蛋白水解，在Gly29/Leu-30位置上去除完整的pre-pro-TGF-β1分子的前面29個胺基酸。這個疏水的29個胺基酸頂端順序的切除很可能是信號肽酶作用的結果。Gly-29/Leu-30肽鍵是預計的信號肽裂解位點(VonHeijne，1986，NucleicAcidsRes，144683-4690)。根據這些結果，44-56KDalTGF-β1多肽(圖17中以「a」示之)代表pro-TGF-β1(30-390)，而30-42KDal物質(圖17中以「b」示之)則對應於缺乏信號肽和成熟TGF-β1順序的前體前區域(30-278)。14KDal多肽的順序分析(數據未顯示)顯示了在成熟生長因子的Ala-279位開始的完整氨基末端，這表明CHO-TGF-β1-3/2000細胞在二元裂解位點上對猴rTGF-β1進行了適當的加工。經設計的加工TGF-β1的方案的概要顯示於圖20中。
8.5.體外生物活性如7.1.6.部分中所述測試純化的成熟和前體形式的rTGF-β1對水貂肺上皮細胞的生物活性。成熟和前體rTGF-β1以及得自牛脾的天然TGF-β1的生物活性圖示於圖19中。摩爾濃度計算根據預計的胺基酸組成(對於前體rTGF-β1來說，採用的是pro-TGF-β1的胺基酸組成)。結果表明，成熟rTGF-β1是水貂肺細胞增殖的有效抑制劑(1-2pM可達到半數最大抑制)，且它的活性曲線與從天然TGF-β1中得到的活性曲線重疊。換句話說，本發明的重組TGF-β1和天然TGF-β1具有相同的比活性。與之相對照，前體產物的活性比成熟生長因子的活性小50倍(50-60pM可達到半數最大抑制)，圖19中抑制情況的比較顯示了劑量反應曲線的微小差異，這表明在成熟和前體形式之間受體親和力不同。
8.6.體內生物活性TGF-β1在體內的效應基本上不知道，儘管其在抑制乳腺生長(Silberstein和Daniel，1987，Science237291)，傷口癒合(Sporn等人，1983，Science2191329)和胚胎發育上的作用已被揭示了，從天然來自骨中的TGF-β1和TGF-β2(Seyedin等人，1986.J.Biol.Chem.2615693;Seyedin等人，1987，J.Biol.Chem.2621946)和在CHO-TGF-β1-3-2000細胞中克隆(Sharples等人，1987，DNA6239-244)和表達的(Gentry等人，1987.Mol.Cell.Biol.73418)重組猴TGF-β1均是多種已建立的人體上皮起源的腫瘤細胞系DNA合成的有效抑制劑(Ranchalis等人，1987.Biochem.Biophys.Res.Comm.148783)。在該研究中，我們陳述體內的證據，即TGF-β1也是在無胸腺裸鼠中生長的人體肺腫瘤生長的腫瘤抑制劑。尤其驚人的是TGF-β可以在被抑制的腫瘤細胞中誘導類分化的細胞表型。來自患有肺腺癌的高加索男人的，被稱為A549的人肺癌細胞系是可通過皮摩爾濃度的天然TGF-β1或TGF-β2和本發明的重組TGF-β1被抑制的響應靶(在體外)。無胸腺裸鼠用A549細胞進行皮下接種;在三個星期內，約80%的動物內發育了可觸知的腫瘤。圖21顯示了用TGF-β1和TGF-β2處理對A549腫瘤在這些鼠中進一步生長的效果。每一個實驗組包括5個動物，縱坐標的值代表以三維量(體積)表示的平均腫瘤測定值。天數1對應於實驗組接受處理的第一天;試驗化合物被皮下注射至腫瘤的附近，但不注射入腫瘤本身。對照組動物接受注射牛血清白蛋白，後者在與經TGF-β處理的帶腫瘤動物組相同的載體溶液中。對照組中腫瘤的體積每隔約7-8天增加一倍。在另外的實驗中，在接受無生物活性的合成肽的帶腫瘤動物中也觀察到相似的腫瘤體積增加一倍的時間。與之相比較，在與橫座標上所標出的那些天相應的時間連續注射200ngTGF-β1和TGF-β2(對每一個動物來講，每一個處理方式的總量為1.4μg)可以使腫瘤停滯並阻止腫瘤進一步生長。如圖21中所示的，TGF-β1的效果比TGF-β2稍好。在另外一個實驗中，觀察了TGF-β1抑制A549腫瘤的劑量反應(圖21)。所得到的數值是相對於得自模擬處理動物的腫瘤體而言的TGF-β處理動物的平均腫瘤體積。在最低的TGF-β1試驗劑量(每次注射12.5ng)時，觀察到約25%抑制。在較高的劑量，即每次注射50和200ng時，觀察到抑制腫瘤生長作用相應增大(依次為37%和60%)。在一些試驗中，在第1天時腫瘤體積越大，與對照組腫瘤相比，被抑制的腫瘤體積減少的百分率越低。即使接受最高劑量的TGF-β(20天後總共為1.4μg)的動物也未顯示出大的TGF-β毒性表現。如圖23中所示，經TGF-β1處理的動物表現出正常的特性;在活組織檢查中，對於主要器官作大體的檢查未發現明顯的異常。插圖是在實驗結束時(20天)，在作病理檢查前，從每一組中得到的腫瘤大小的代表。從試驗動物中取出的腫瘤(21天，圖21)平均淨重減輕90%以上。
當用這些研究中所用的包括A549腫瘤細胞在內的各種腫瘤細胞作試驗時，來自無血清培養基上清液的純化至均質的重組猴TGF-β1在體外具有與天然(牛骨)分子相似的劑量反應抑制曲線。重組和天然TGF-β1對無胸腺小鼠中A549人肺癌的生長作用的比較示於表Ⅷ中。在抑制腫瘤生長方面，重組產物比從(牛)骨中衍生的TGF-β1更有效，前者為60%抑制，後者為46%抑制。
表Ⅷ重組和天然TGF-β1對於腫瘤生長作用的比較TGF-β1腫瘤大小抑制(%)對照處理重組105.442.660.0骨中衍生83.445.446.0＊這些實驗的方案除了僅以二組數據測量腫瘤外，與圖21的圖解說明中所描述的相同。數值代表每一組的動物中的平均腫瘤面積。在腫瘤外圍注射純化的rTGF-β1和得自牛骨的天然TGF-β1(Seyedin等人，1986，J.Biol.Chem.2615693)(200ng/每次注射，總量為1μg)。測量值代表在處理後17天的平均腫瘤大小。
從對照和處理的動物組中切除腫瘤，固定並進行組織病理檢查。如圖24中所示，組A，在低倍鏡下，三色染色的對照腫瘤切片顯示出絕大多數壞死區分散於不同細胞類型，大多是柱狀上皮的相當不均勻的區域。對大多數血管也進行了觀察。與之相比較，用相似方法製得的TGF-β1抑制的腫瘤標本的切片(圖24中以「b」示之)顯示出幾乎無壞死、更明顯的組織性以及各細胞類型有不同的分布。尤其明顯的是與對照腫瘤樣品相比，結締組織帶(染成藍色)增加。此外，與對照腫瘤相應，通常的血管分布出現減少。當在較高的放大率下檢查時，對照腫瘤(圖24中以「c」示之)的未壞死區顯示類上皮和分化差的細胞類型混合，高密度的染色核也是明顯的，這表明腫瘤細胞以高速度繁值。與之相比較，經TGF-β處理的腫瘤標本(圖25中以「d」示之)顯示了很大的不同。所看到的主要細胞類型是大的和圓的;核多數分散於核區中，並顯示了杯狀細胞(一種正常的肺細胞類型，它可分泌粘蛋白)的月牙形態特徵。儘管一些分泌粘液的細胞在對照腫瘤標本中也被觀察到，它們僅代表了次要的細胞亞種群。組成環繞血管的柱狀上皮細胞的散在點在TGF-β抑制腫瘤(圖25中以「d」示之，插入物)的切片中也是較普遍存在的。
得自經處理的腫瘤的類杯狀細胞型分泌粘液的性質可通過高碘酸席夫鹼染色劑(PAS)所證實。對照腫瘤切片(圖25中以「a」示之)顯示出幾個高糖蛋白密度的分散區。TGF-β處理的腫瘤切片(圖25中以「b」示之)的各個部分中均可看到被大大地放大的PAS染色強度。可見到一個更分化的和組織化的表型。對對照和經TGF-β處理的腫瘤切片用Alcian蘭染色，PH2.5下進行氨基葡糖聚糖(glycosaminoglycans)(GAGs)的檢查。對照標本(圖25中以「c」示之)顯示出著色很弱，而經處理的標本(圖25中以「d」示之)則顯示出明顯強的著色，這表明有較高水平的透明質酸合成和沉積。
9.實例在rTGF-β1前體的兩個天冬醯胺連接的糖鏈中甘露糖-6-磷酸的鑑定下面的實例顯示了在猴rTGF-β1中的全部三個潛在的糖基化位點(Asn-82，-136和-176)均被用作糖類加入的位點，並顯示磷酸化是在低聚糖側鏈中發生的。結果表明了rTGF-β1前體的獨立功能作用。
9.1.材料和方法9.1.1.材料測序器用的試劑是從AppliedBiosystems取得的。HPLC用的溶劑是從Burdick和Jackson取得的。CNBr得自Kodak;4-乙基吡啶得自AldrichChemicalCo;所有其它的化學物質均是試劑級的。金黃色葡萄球菌V8蛋白酶是從MilesLaberatories取得的，經L-(甲苯磺醯氨基-2-苯基)乙基氯甲基酮處理的胰蛋白酶是從Worthington得到的。
9.1.2.細胞培養TGF-β-3-2000細胞系如前面第7.1.1.部分中所述的進行繁殖。單個的克隆在96號測定板中通過限制性稀釋而分離。發現一個克隆，TGF-β-3-2000-17(此後統稱為克隆17)可產生約2μg活性TGF-β1/ml，它被用於進一步分析。這些細胞在含有10%胎牛血清、150μg/mlL-脯氨酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素和20μM氨甲蝶呤的Dulbecco′s改良Eagle′s培養基中常規地傳代。
9.1.3.放射標記克隆17生長至融合，用除去血清的無磷酸鹽培養基洗滌三次，並在同樣的培養基中，在37℃下培養30分鐘。然後用新鮮的蛋氨酸、半胱氨酸和含有200 μCi/ml[35S]-蛋氨酸和[35S]-半胱氨酸的無血清培養基(NEN，Boston，MA)代替原先的培養基，在37℃下，將細胞培養4小時。為了用[3H]-糖進行標記，將細胞生長至融合，用無血清的培養基洗滌並在含有100 μci/ml[3H]-葡糖胺或[3H]-甘露糖的無血清培養基(NEN，Boston，MA)中標記20小時。收集經放射標記的無血清上清液，在4000×g下離心10分鐘，在0.2M乙酸中充分透析並凍幹。
9.1.4.聚丙烯醯胺凝膠電泳經乾燥的沉澱物在還原條件下，在15%的SD S-聚丙烯醯胺凝膠上或7.5-15%梯度SD S-聚丙烯醯胺凝膠上進行分析，如已描述的(Laemmli，1970，Nature 227680-685)。凝膠用考馬斯蘭染色，進行螢光X線照相(對[35S]-和[3H]-標記的蛋白質)(Chamberlain 1979，Anal.Biochem.98132-136)並在Cronex-4 X光膠片上曝光。或者，在聚丙烯醯胺凝膠電泳前，經凍幹的樣品用N-聚糖酶(Genzyme，Boston，MA)，在37℃下採用由製造商所推薦的條件，消化16小時。
9.1.5.酸水解[32P]-標記的rTGF-β1前體和[32P]-標記的糖肽在6NHCl中，95℃下水解2小時。在pH1.9和3.5下，通過電泳分離產物，並通過所述的(Cooper等人，1983，Meth Enzymol.99387-402)放射自顯影檢測。或者，在pH8.9(1%碳酸銨)下進行電泳，然後層析分離(65%異丁酸、5%吡啶、3%乙酸、2%丁醇、25%水)。內部胺基酸(磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸)通過水合茚三酮染色進行檢測。甘露糖-6-磷酸通過用70%高氯酸∶1MHCl∶4%鉬酸銨∶丙酮(5∶10∶25∶60)噴淋、乾燥並在紫外線下曝光而檢測。
9.1.6.s-吡啶乙基化為了進行還原，用在含有6M鹽酸胍、0.1%Na2EDTA的100μl 0.4 M Tris-HCl緩衝液中的二硫蘇糖醇(20mM)，pH8.5，處理50 μg TGF-β1前體和來自克隆17的無血清上清液的225，000cpm[32P]-標記的rTGF-β1前體，在50℃下作用2小時，接著，用4-乙基吡啶(100m M)進行s-吡啶乙基化，在22℃下處理4小時。用20% TFA將此反應混合物酸化至pH2.0，並在RP-300柱(2.1×30mm;Applied Biosystems)上脫鹽，採用TFA/乙腈梯度洗脫。乙腈的濃度線性增加，從0.1%TFA水溶液增加到含0.08%TFA的60%乙腈，在100 μl/分的流速和35℃下，洗脫1.5小時。
9.1.7.化學和酶裂解為了在甲硫醯氨基處進行CNBr裂解，將650pmol s-吡啶乙基化的TGF-β1前體和160，000cpm[32P]標記的S-吡啶乙基化的TGF-β1前體溶解於30 μl 70%的甲酸中，並加入41在100 μl 70%的甲酸中含60mgCNBr的溶液(Gross和Witkop，1962，J.Biol.Chem.2371856-1860)。反應在30℃下，在氮緩衝環境下進行4小時，然後在黑暗中，在22℃下再進行18小時反應。
採用金黃色葡萄球菌V8蛋白酶進行的裂解在含有3M脲的40μl0，1MTris-乙酸緩衝液(pH8.0)中進行，在37℃下反應10小時。酶/底物之比為1∶10(wt/wt)。庫A和庫B的胰蛋白酶消化(圖31-A)在含30%乙腈的40μl0.1MTris-乙酸緩衝液(pH8.0)中，在酶與底物比為1∶20的條件下，於37℃進行15小時。用20%TFA將酶消化物酸化至pH2.0並通過rpHPLC分離。
9.1.8.肽純化HPLC是在包含兩隻M6000A泵、一個系統控制器，一個U6K注射器、一個441型固定波長檢測器(214nm)的WatersHPLC系統中，或在130A型分離系統(AppliedBiosystems)中，和有一個圖表記錄器而進行的。凝膠滲透色譜在一個Bio-silTSK-250柱(7.5×600mm，Bio-RadLaboratories)上，含40%乙腈的0.1%TFA中以0.25ml/分的流速進行。採用rpHPLC的肽純化在35℃，RP-300柱(2.1×30mm;AppliedBiosystems)上進行。由此0.1%TFA水溶液為起始緩衝液，含0.08%TFA的乙腈為終止緩衝液組成的線性乙腈梯度被用來進行洗脫。人工收集多肽，V8蛋白酶肽以E表示，胰蛋白酶肽以T表示，這兩種肽均無需再純化而用作順序分析。
9.1.9.胺基酸順序分析自動順序分析是採用RUN470-1程序在一個475A型胺基酸測序器(Appliedbiosystems)上進行。
總共採用1.5mgBioBrenePlus(AppliedBiosystems)，在樣品加入前，先進行兩次Edman降解預循環。噻唑啉酮衍生物向苯基海硫因胺基酸的轉化是與25%的TFA一起進行的。苯基海硫因胺基酸衍生物通過在線rpHPLC，在120A型PTH分析器(AppliedBiosystems)中分離，如已描述的(Marquardt等人，1987.J.Biol.Chem.26212127-12131)。
9.1.10.結合研究TGF-β1前體通過在Biol-Sil T SK-250柱中凝膠滲透色譜和在Vydac C4柱中rpHPLC而純化。用1mCi[125I]對約6 μg的純化前體進行碘化處理，如已描述的(Frolik等人，1984，J.Biol.Chem.25910995-11000)。用固相受體分析測定[125I]-TGF-β1前體和甘露糖-6-磷酸/IGF-Ⅱ受體的連接(Roth等人，1987.Biochem.Biophys，Res.Commun，149600-606)。對聚氯乙烯微量滴定井中相繼包被40 μl蛋白A(20 μl在20 mMNa HCO3中，pH9.6)、抗IGF-Ⅱ受體的兔抗體(50 μg/ml)和500ng純化的人胎腦受體(id.)。用於全部洗滌的緩衝液含50mMHEPES(pH7.8)、50mMNaCl、0.1%Triton-X-100、0.1%Tween20和0.1%牛血清白蛋白。然後用5%不含脂肪(脫脂)的幹牛奶在包被井中，在4℃下孵育20分鐘，往每一個井中加入放射標記的TGF-β1前體。在4℃下3小時後，將井洗滌四次，切下並計數。非特異性的連接可在不存在受體時測定，並在計算抑制百分數之前減去。
9.2.結果由克隆17細胞分泌的三種結構形式的rTGF-β1通過圖26A中的線圖來列舉。在圖26A中還列出了從猴TGF-β1前體的DNA順序預測的三個潛在的天冬醯胺連接的糖基化位點Asn-82、-136和-176(圖1和sharples等人，1987，DNA6239-244)。
圖26B顯示了可用SD S-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析的由克隆17細胞分泌的[35S]-標記蛋白放射自顯影圖。蛋白質a、b和c可以容易地看見。前體蛋白質a和b可以用[3H]-葡糖胺、[3H]-甘露糖和[32P]-磷酸鹽標記(圖26C、26D和26E)，表明rTGF-β1前體蛋白質a和b，不包括rTGF-β1(蛋白質c)，均是磷酸化和糖基化的。用N-聚糖酶酶切[35S]-標記的前體蛋白質，可引起電泳帶a和b的遷移發生變化，成為更細和更快的電泳帶，最大的帶的分子量接近39，000(圖27A，2道)，這與對TGF-β1前體蛋白質a所計算的分子量為41，200是一致的。用N-聚糖酶消化[32P]-標記的蛋白質，然後通過SD S-聚丙烯醯胺凝膠電泳分級分離消化產物，發現酶已經從rTGF-β1前體蛋白質中移去了全部的標記(圖27B，2道)，這表明[32P]標記被摻入天冬醯胺連接的低聚糖中。
將經糖基化和磷酸化的rTGF-β1前體蛋白質a和b進行氫溴酸裂解，然後進行酶消化以進一步確定磷酸化位點的特性。經標記的糖肽通過凝膠滲透色譜和rpHPLC純化。圖28中列出的三個片段的順序分析表明Asn-82、Asn-136和Asn-176被糖基化了。95%以上的標記在肽E(77-91)和E(134-139)中被(11)幀k模(174-180)中含有的標記小於總摻入的[32P]-標記的5%。
用CNBr在蛋氨酸殘基處裂解S-吡啶乙基化的rTGF-β1前體。CNBr片段在Bio-Sil T SK-250柱上凝膠滲透色譜分離使[32P]-M(134-253)和[32P]-M(39-113)分解。典型的色譜圖示於圖29中。
用金黃色葡萄球菌V8蛋白酶使M(39-113)進一步分解為小片段。酸化酶消化產物並通過rpHPLC分離肽。典型的色譜圖示於圖30中。已確定了[32P]-E(76-91)和[32P]-E(76-94)的完整順序。兩個肽中都含有一個羧基末端穀氨酸，這與蛋白酶的特異性一致。兩種肽在82號位均含有未確定的殘基(表Ⅸ)。DNA順序預示在TGF-β1前體轉譯產物的82號位存在天冬醯胺殘基，是一個N-連接糖基化作用的潛在位點。在實驗7中所預計的P TH-Asn的產量，是要使其足以進行未修飾天冬醯胺的鑑定。82號位的P TH-Asn的產量約是以鄰近的殘基的產量作標準而預計的產量的0.5%。低產量的P TH-Asn-82可能是由於與其它噻唑啉酮胺基酸相比較，經修飾的噻唑啉酮衍生物在抽提溶劑丁基氯中的溶解度降低了。酸解和隨後的[32P]-E(76-91)雙向電泳檢測到甘露糖-6-[32P]-磷酸，圖31。
用金黃色葡萄球菌V8蛋白酶將M(134-253)進一步分解成小片段，產生兩種主要的[32P]-標記的肽，如圖31A中所示。檢測所列出的肽的順序，兩者均含有一個羧基末端穀氨酸，這與蛋白酶的特異性一致。肽[32P]-E(134-139)在136號位有一個未確定的殘基(表Ⅸ)預計的P TH-Asn的產量約是以鄰近殘基的產量作基準所期望的產量的2%，由此可推斷它是糖基化的Asn。酸解和隨後的[P]-E(134-139)雙向電泳檢測得甘露糖-6-[32P]-磷酸(圖32)
收集含有E(170-194)的峰A，乾燥，然後用胰蛋白酶使之分解成小片段。消化產物酸化並通過rpHPLC分離肽。典型的色譜圖示於圖31B中。T(174-180)的順序被確定(表Ⅸ)。肽T(174-180)又在176號位含有一個未確定的殘基。預計的P TH-Asn的產量約為以鄰近的殘基Asn-177的產量作基準所期望的產量的1%，這表明Asn-176糖基化了。T(174-180)的色譜異質性也是明顯的。該肽含有不到5%的[32P]-摻入的前體蛋白質。酸解和隨後的2次電泳檢測得甘露糖-6-[32P]-磷酸(未顯示)。
峰B(圖31A)被乾燥，並先用金黃色葡萄球菌V8蛋白酶，接著用胰蛋白酶再消化，肽通過rpHPLC分離。類似的肽圖，如圖31A和圖31B中所示，表明用V8蛋白酶未完全裂解M(134-253)。
總前體蛋白質(a和b)以及純化的糖肽的薄層電泳分析顯示[32P]-磷酸鹽被摻入甘露糖-6-磷酸;無[32P]-磷酸鹽摻入Ser、Thr、Tyr(圖32A-C)。在pH1.9、pH3.5和pH8.9的緩衝液，和兩種不同的色譜緩衝液中電泳，可觀察到摻入了[32P]-標記的肽和甘露糖-6-磷酸標準物的共同遷移(圖32D，數據未顯示)。酸水解也可以從用糖基磷脂醯肌醇修飾的蛋白質中產生甘露糖-6-磷酸(Lon和Saltiel，1988，Science 239268-295)，但這僅在蛋白質的羧基末端發現，因而它與rTGF-β1前體中的甘露糖-6-磷酸無關。
表Ⅸ得自S-吡啶乙基化的rTGF-β1前體的糖肽的胺基酸順序數據肽肽(編號)(編號)
位置殘基產量(pmol)位置殘基產量(pmol)E(76-91)E(134-139)76Ala(1)87.0134Phe(1)99.477Val(2)91.3135The(2)98.378Leu(3)111.2136Asn(3)2.179Ala(4)100.5137Thr(4)55.580Leu(5)75.7138Ser(5)28.181Tyr(6)71.4139Glu(6)52.882Asn(7)0.283Ser(8)28.5T(174-180)84Thr(9)42.585Arg(10)43.6174Tyr(1)10.086Asp(11)45.8175Ser(2)3.887Arg(12)47.6176Asn(3)0.188Val(13)39.0177Asn(4)8.589Ala(14)37.9178Ser(5)3.390Gly(15)23.3179Trp(6)5.191Glu(16)10.7180Arg(7)1.7還進行了用來檢定TGF-β1前體是否能與甘露糖-6-磷酸受體連接的實驗。用純化的甘露糖-6-磷酸受體與125I-標記的TGF-β1前體一起孵育，圖34中列出的結果表明該前體可以連到純化受體上，因為與無受體的對照孵育產物相比，約有30倍的放射配體與受體相連接。該連接是特異性的，因為它幾乎完全被100nM TGF-β1前體或50 μM甘露糖-6-磷酸所抑制(90%)。
10.實例TGF-β1變異體在COS細胞中的表達位點直接誘變被用於改變TGF-β1的初級結構，此改變發生在TGF-β1前體的pro區的三個半胱氨酸殘基處，其方法是在33、223和225(圖1)號胺基酸位置上將編碼半胱氨酸殘基的順序改變為編碼絲氨酸的順序。突變體被用於轉染COS細胞，並對由轉染子產生的重組TGF-β1變異體蛋白進行分析。結果表明CYS-33可能參與成熟TGF-β1加工的調節。CYS-33修飾可產生一種前體，該前體最終可導致產生較高水平的成熟TGF-β1。
10.1.材料和方法10.1.1 CNBr肽M(134-253)2的定性由CHO細胞合成的rTGF-β1前體通過凝膠滲透色譜純化，用CNBr裂解之，並如已描述的(第8部分等)純化肽。在用三丁基膦還原和用7-氟苯並-2-氧代-1，3-重氮-4-磺酸銨偶合[Sueyoshi等人，1985，J.Biochem.(Tokyo)971811-1813)後，檢定含半胱氨酸的肽，並通過反相HPLC在μBondapakC18柱中(WatersAssociates，Inc，Milford，Mass)純化至均質。
在15%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離肽並用考馬斯亮藍R-250染色。用AppliedBiosystems475A型測序器分析二硫鍵連接的肽。在AppliedBiosystems120A型PTH-分析器中測定苯基海硫因-胺基酸衍生物，如已描述的(Gentry等人，1988，Mol，CellBiol.84162-4168)。
10.1.2.編碼TGF-β1變異體表達載體的構建和DNA轉染用PstI和EcoRI酶切pTGF-β-2(sbarples等人，1987，DNA6239-244)，並將含有完整TGF-β1編碼區的1400bp片段連接至事先用PstI和EcoRI酶切的質粒pSP64中。用該構建物轉化E.ColiHB101，分離出質粒pSP64/TGF-β1。從pSP64/TGF-β1中切下TGF-β1cDNA的PstI和EcoRI片段並將該片段插入M13mP18中，將HindⅢ限制位點5′放在PstI位點。分離出含有MP18鏈和TGF-β1非編碼鏈的單鏈DNA，作為位點直接誘變的模板。採用商業化的體外寡核苷酸直接誘變系統(Amersham)將CYS-33、CYS-223和CYS-225分別轉變為SER編碼子。
下面的寡核苷酸被用於構建突變體5′－ACTATCCACCAGCAAGACTAT-3構建 ER-23;
5′-TAGCGCCCACAGCTCCTGTGA-3′構建SER-223;
5′-CACTGCTCCTCTGACAGCAAA-3′構建 SER-225;和5′－TAGCGCCCACAGCTCCTCTGAC--AGCAAA-3′構建SER-223/225在每一種情況下，核苷酸的改變伴隨著CYS改為SER密碼子。為了得到所需要的誘變，採用最終突變體的單個跟蹤測序篩選出510個噬菌斑，所述最終突變體是用雙脫氧鏈終止方法作進一步測序而確定的(Sanger等人，1977，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.848573-8577)。
分離含有突變cDNAs的複製形式，用EcoR I酶切，修復平頭，並用Hind Ⅲ酶切。將所得到的cDNA片段連接到p πH3 M(Aruffo和Seed，1987，Proc，Natl，Acad，Sci，U.S.A.848573-8577;Seed和Aruffo，1986，Proc，Natl，Acad.Sci，U.S.A 843365-3369)的Hind Ⅲ和Xho Ⅰ(平頭)位點以構建質粒p πH3 M/β1-SE R-33(編碼pre-pro-TGF-β1S33)，p πH3 M/β1-SE R-223(編碼pre-pro-TGF-β1S223)，p πH3 M/β1-SE R-225(編碼pre-pro-TGF-β1S225)和p πH3 M/β1-SE R-223/225(編碼pre-pro-TGF-β1S223/225)。用這些質粒以及質粒p πH3 M/β1(編碼野生型TGF-β1)，經過下列修飾轉染CO S細胞，如已描述的(Aruffo和Seed，1987，Proc.Natl，Acad，Sci.U.S.A.848573-8577;Seed和Aruffo，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.843365-3369)。轉染在具有106個細胞的100mm培養皿中進行，採用5ml轉染物質在37℃下進行2.5小時。在轉染後48小時時，將細胞置於無血清培養基中，收集72小時後的條件培養基，在0.2M乙酸中透析三次，用如前面的第7.1.7.部分中所描述的成熟和前體特異性肽抗體免疫印跡進行分析。通過前面第7.1.6.部分所描述的生長抑制試驗來檢測生物活性。
10.2.結果10.2.1.由突變TGF-β1編碼順序所編碼的＜p質的分析在COS轉染子生長的經透析的無血清培養基中所測得的生物活性概括於下面的表Ⅹ中。用編碼TGF-β1變異前體的質粒pπH3M/β1-SER-33轉染的細胞比用編碼野生型TGF-β1的質粒pπH3M/β1轉染的細胞分泌的生物活性蛋白質多3到5倍。與之相反，用編碼SER-223和SER-225變異體的質粒轉染的細胞與用野生型構建物轉染的細胞相比，前者不能分泌高水平的生物活性蛋白質。
表Ⅹ由用各種編碼TGF-β1質粒轉染的COS細胞條件培養基的生物活性COS轉染體質粒生物活性(ng/ml)ABCOS-TGF-β1pπH3M/β13950COS-TGF-β1/pπH3M/β1209174SER-33SER-33
COS-TGF-β1/pπH3M/β13937SER-223SER-223COS-TGF-β1/pπH3M/β12628SER-225SER-225COS細胞用編碼野生型TGF-β1的質粒(pπH3M/β1)、編碼以SER代替CYS-33的TGF-β1的質粒(pπH3M/β1SER-33)、編碼以SER代替CYS-223的TGF-β1的質粒(pπH3M/β1SER-223)或編碼以SER代替CYS-225的TGF-β1的質粒(pπH3M/β1SER225)轉染。所列出的數據表示兩種獨立生物抑制試驗(前面第7.1.6部分)的結果。
免疫印跡分析採用抗-TGF-β1369-381+抗-TGR-β181-94進行，如前面章節7.1.8.中所描述的，以檢測TGF-β1相關蛋白質。結果示於圖33A-G中。在還原條件下(圖33D)，突變蛋白質表現出與野生型蛋白質相同。可用抗體檢測12K Da成熟單體(圖33β中以『c』示之)以及44～56KDa和30-42KDa前體形式(圖33β中以『a』和『b』示之)。此外，示於圖33D中的免疫印跡表明所分泌的TGF-β1蛋白質的絕對量未受到突變體的顯著影響。
當在非還原條件下檢查時，突變和野生型TGF-β1蛋白質之間的差異是明顯的(圖33E)。成熟TGF-β1二聚體(24KDa)存在於所有的轉染子上清液中。但是，用pπH3M/β1SER-33轉染的細胞與野生型轉染子相比，產生24KDa二聚體的水平有所提高(圖33E，3道和4道)，而pπH3M/β1SER-33、pπH3M/β1SER-225和pπH3M/β1SER223/225轉染子則產生與野生型接近的水平。24KDa二聚體的增加不是蛋白質合成/分泌的增加或成熟TGF-β1從pro-TGF-β1中裂解增加的結果，因為在還原條件下的免疫印跡表明pπH3M/β1和pπH3M/β1SER-33轉染子可以分泌幾乎相同量的成熟或前體形式(圖33D)。
此外，TGF-β1S33蛋白質不像野生型蛋白質那樣形成99～110KDa前體複合物(圖33E)。代之的是一個130～150KDa和一個75～85KDa的蛋白質(圖33E，4道)如圖33F和圖33G中所示，TGF-β1S3330～150KDa蛋白質可由前區域和成熟(TGF-β1)的特異性抗體所識別，很可能代表二聚體pro-TGF-β1S33。75～85KDa多肽只能被前區域特異性抗體檢測(圖33G，4道)，可能代表TGF-β1S33前體的前區域二聚體。
與之相反，由p πH3 M/β1 SE R-223和p πH3 M/β1 SE R-225編碼的突變蛋白質可形成90～110KDa的前體複合物(圖33E、33F和33G中的5道和6道)，儘管也存在一些單體形式的前體。對TGF-β1前體的前區域特異的抗體可檢測44～56KDa和30～42KDa蛋白質(圖33G，5道和6道)，而對成熟順序特異的抗體只能檢測44～56KDa的蛋白質(圖33F，5道和6道)。用p πH3 M/β1 SE R-223/225轉染的細胞只產生單體形式的前體(圖33E、33F和33G中7道)，而成熟TGF-β1仍然可以以pro-TGF-β1S223/225中經蛋白質水解而裂解，並形成24KDa二聚體。
申請人發現，從TGF-β1前體中除去CYS-33殘基最終可提高TGF-β1分泌的產量，其機理可能是防止新生的TGF-β1單體的重要群體在胞內被限制於高分子量前體複合物中，這一發現可能構成了一種製備重組生物活性TGF-β1的改進的方法。此外，該方法可用於提高重組生物活性的TGF-β2、TGF-β3、其它形式的TGF-β、TGF-β類似物或其它有關蛋白質的產量。
10.2.2.TGF-β1前體殘基CYS-223和CYS-225形成鏈內二硫鍵。
採用CN βr在蛋氨酸殘基處裂解純化的r TGF-β1前體，所得到的肽通過凝膠滲透色譜純化。含有CYS的肽被檢測，如已描述的(Sueyoshi等人，1985，J.βiochem.(Tokyo)971811-1813)，並通過反相HPLC被純化至均質。Edman降解結果表明了CN βr肽在TGF-β1前體順序中的位置。肽M(134-253)2含有2個半胱氨酸殘基(由胺基酸分析測得)，但缺少游離的巰基(在非還原條件下用螢光二硫醇特異性試劑測得)。M(134-253)中的二硫鍵是由該肽的二聚體特性所推得的。如圖33A中所示，在非還原條件下，M(134-253)3的大小估計是41KDa;在還原條件下，M(134-253)的分子量為24KDa。還原後M(134-253)2的分子量發生變化可識別出二個連接相同的鏈的內部亞基二硫鏈，這與肽M(134-253)2的單一胺基酸順序以及通過胺基酸分析測出有2個半胱氨酸殘基的結果是一致的。在SD S-聚丙烯醯胺凝膠電泳上觀察到的M(134-253)2的異質性可能反映了在Asn-136和Asn-176的糖基化作用。
10.2.3.變異TGF-β1前體產生生物活性的TGF-β1生物活性與由免疫印跡測得的24KDa的成熟TGF-β1的量之間有很好的對應關係。在酸活化後，從用質粒pπH3M/β1SER-223、pπH3M/β1SER-225和pπH3M/β1SER-223/225轉染的細胞中收集的上清液可產生接近野生型水平的抑制活性(表Ⅺ)。與之相反，pπH3M/β1SER-33轉染子可產生比pπH3M/β1轉染子約高3～5倍的活性。這些觀察結果與在各別進行轉染時，用pπH3M/β1SER-33轉染的COS細胞總是產生比用野生型質粒pπH3M/β1轉染的細胞高3～5倍以上的抑制活性是相一致的。
表Ⅺ
通過COS細胞轉染子篩選的生物活性TGF-β1的量ng/ml質粒+酸-酸pπH3M.β190.34.7pπH3M/β1SER-33304.812.5pπH3M/β1SER-22398.420.3pπH3M/β1SER-22577.911.2pπH3M/β1SER-223/22587.965.31COS細胞用編碼TGF-β1及其變異體的質粒轉染;轉染48小時後，用無血清的培養基取代上清液;72小時後，收集條件培養基並直接用於分析(-酸)或在0.2M乙酸中透析後再分析(+酸)其對於CCL64細胞的生長抑制。
10.2.4.不經酸化的條件下，TGF-β1S223/225變異體產生生物活性的TGF-β1由COS細胞合成的rTGF-β1是以潛伏形式分泌的(表.Ⅺ.)。相似地，由血小板所釋放的TGF-β1是一種潛伏型的高分子量複合物(Miyazono等人，1988，J.Biol.Chem.2636407-6415;Wakefield等人，1988，J.Biol.Chem.2637646-7654)。
rTGF-β1的活化可以通過酸化來達到。在酸化前，TGF-β1和TGF-β1S33≥90%無生物活性，而TGF-β1S223和TGF-β1S225則為≥80%無生物活性。但是，TGF-β1S223/225在未經酸處理時至少為70%有活性，在另外的試驗中表明酸化前後的活性水平是相等的，這表明對於r TGF-β1的潛伏性來說，TGF-β1前體的前區域是必要的。最近發現，來自血小板的TGF-β1與包括二聚前體前區域和其它蛋白質的複合物是非共價連接的(Miyazono等人，1988，J.Biol.Chem.2636707-6415;Wakefield等人，1988，J.Biol.Chem.2637646-7654)。TGF-β1S223/225前體僅以單體存在(圖33E、33F和33G中通道7);因此，由CYS-223和CYS-225兩者的置換所引起的構象變化可能不允許在成熟TGF-β1和它的前體之間進行相互作用而導致潛伏物的產生。
11.實例TGF-β1前體與類胰島素生長因子/甘露糖-6-磷酸前體的相互作用如下所描述的實驗證明TGF-β1前體與類胰島素生長因子(IGF)-Ⅱ/甘露糖G磷酸(man6p)受體結合。這些研究部分得到NationalInstitutesofHealthGrantDK34926的支持並獲RepublicFoundationofScience，SRSrbia，Yugoslavia的一項資助。
11.1.材料和方法11.1.1.材料重組IGF-Ⅱ由Dr.M.Smith(EliLillyCo)提供並如已描述那般被碘化(Steele-Perkins等人，1988，J.Biol.Chem.26311486-11492)。重組TGF-β1前體分別按前面的第8.3部分和9.1.3部分中所述的進行製備和碘化(190Ci/g)。將純化的潛伏性TGF-β1從血小板中分離出來(Miyazono等人，1988，J.Biol.Chem.2636407-6415)並在瓊脂糖6柱上脫鹽。IGF-Ⅱ/man6P受體和該蛋白質的多克隆抗體如先前所述(Hari等人，1987，EMBOJ.63367-3371)。超表達人類IGF-Ⅱ/man6P受體的CHO細胞如先前對於人IGF-Ⅰ受體所描述的那樣製備(Steele-Perkins等人，1988，J.Biol.Chem.26311486-11492)。抗IGF-Ⅱ/man6P受體的單克隆抗體由Dr.A.Hasilik(Uni-versitatMunster)提供。抗TGF-β1的前體順序的多克隆抗肽抗體(抗81-94殘基)如前面第7.1.8部分中所述的製得。
11.1.2受體結合和內在化研究切下雄性Sprague-Dawley鼠的附睪脂墊，搗碎並用膠原酶消化，如已描述的(Rodberg，1964，J.Biol.Chem.239375-380)。在具有3%牛血清白蛋白的0.7ml Krebs-Ringer緩衝液(107m M NaCl，5mM KCl、3mM Ca Cl2、1mM Mg SO4、7mM NaHCO3、10 mM葡萄糖和20 mM Hepes，pH 7.8)中，於37℃下，用或不用1μM胰島素將分離出來的脂肪細胞預孵育10分鐘。加入指示標記的配體，培養物在37℃下繼續孵育45分鐘。用矽油通過離心將細胞從培養基中分離出來，計算細胞層的放射性。
採用經轉染的和對照CHO細胞進行的結合和內在化研究是在24號培養板中進行的。洗滌融合的細胞並與在0.3ml結合緩衝液(100mM Hepes，pH 7.6、120mM Na Cl、1.2mM Mg SO415mM乙酸鈉、5mM葡萄糖)中的標記配體一起在4℃下孵育5小時。然後，將細胞洗滌兩次，用0.1%十二烷基磺酸鈉溶解之並計數。為了進行內在化研究，將標記配體加入在含有0.1%牛血清白蛋白20 mM Hepes(PH 7.6)的無血清Ham′s F-12培養基中的細胞中。在37℃下，經過指定的一段時間後，將細胞置於冰塊上並用含有0.3mMCa Cl2的預冷Hepes緩衝鹽洗滌。為了測定耐酸分部(即內在化的配體)，將細胞在4℃下，與0.2MCH3COOH、0.5MNa Cl，pH3.0孵育5分鐘(Haigler等人，1980，J.Biol.Chem.2551239-1240)。然後如上所述洗滌細胞，溶解並計數。
結合研究也可以用經分離的IGF-Ⅱ/man6P受體進行(Purchio等人，1988，J.Biol.Chem.26314211-14215)。為了進行這些研究，經純化的受體吸附在已用100nM特異性抗人IGF-Ⅱ/man6P受體的單克隆抗體(2C2)包被的微量滴定井中(Braukle等人，1987，J.Cell.Biol1041735-1742)。然後，在已知濃度的競爭配體存在下，在4℃，經標記的重組TGF-β1前體與受體一起孵育3小時。然後洗滌井，切下並計數。
11.1.3.WesternBlot分析將純化的重組和來自血小板的TGF-β1前體在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺(12.5%)還原凝膠上電泳。將樣品轉移到硝基纖維素濾紙(Schleicher和Schuell)上，然後，濾紙在阻斷溶液中(3%牛血清白蛋白和0.1%TritonX-100在Tris-緩衝鹽水中，PH7.5)，在24℃下孵育30分鐘。然後濾紙與1)抗TGF-β1前體順序的兔抗肽抗體(1∶100稀釋)(10);或2)先與純化的IGF-Ⅱ/man6P受體，然後用抗該受體的多克隆抗體，在4℃下孵育過夜(Hari等人，1987，EMBOJ63367-3371)。洗滌四次後，在4℃下，濾紙與結合鹼性磷酸酶的抗兔Ig(1∶5000，Promega)一起孵育1小時，洗滌，然後用磷酸酶底物顯色(Promega)。
11.2.結果11.2.1.重組TGF-β1前體與脂肪細胞上的IGF-Ⅱ/man6P受體結合併且是內在化的。
125Ⅰ-IGF-Ⅱ和重組TGF-β1前體與初級大鼠脂肪細胞的結合可採用加或不加用胰島素預處理來進行。如先前所報導的(OKa等人，1985，J Biol.Chem.2609435-9442;Appell等人，1988，J.Biol.Chem.26310824-10829)，胰島素會引起IGF-Ⅱ與脂肪細胞的特異性結合增加2～3倍(平均＝2.4±0.3，n＝4)(圖35A)。如圖35B中所示，胰島素也會引起重組TGF-β1與脂肪細胞的結合類似地增加(平均＝2.7±0.3，n-4)。採用3mM man6 P，TGF-β1前體與對照的結合以及與經胰島素處理的脂肪細胞的結合分別被抑制65%和81%(圖35B)。這些結果表明重組TGF-β1前體與在脂肪細胞上的IGF-Ⅱ/man6P受體結合。
另外的結合研究採用CHO細胞系進行，所述的CHO細胞用編碼IGF-Ⅱ/man6P受體(Morgan等人，1987，Nature329301-307)的cDNA轉染，並被選出超表達受體蛋白。這些經轉染的細胞比親代CHO細胞特異性地結合IGF-Ⅱ多10倍以上(圖36A)和結合重組TGF-β1前體多15倍以上;TGF-β1前體的結合基本上被man6P抑制(圖36B)。man6P的抑制是劑量依賴性的，在10μM時可觀察到最大抑制作用的一半。(圖37A)。甘露糖-1-磷酸在抑制TGF-β1前體的結合上的效果至少要低1，000倍(圖37A)。前體與轉染的細胞的結合也可以被未標記的TGF-β1前體所抑制，但不被成熟的TGF-β1抑制(圖37B)。100nMIGF-Ⅱ對前體TGF-β1結合的抑制率為34%。
對結合後的TGF-β1前體在經轉染的細胞中內在化的能力也進行了試驗。在37℃放置不同的時間，通過酸洗細胞除去細胞表面的TGF-β1前體並測定耐酸的(即內在化的)TGF-β1前體(Hagler等人，1980，J，BiolChem.2551239-1241)。15分鐘後，在耐酸區發現75%以上的特異性結合TGF-β1前體(圖38)。20分鐘後，觀察到總結合量和內在化的量進一步增加，這似乎是由非特異性結合引起的，因為man6P不能阻礙這個增加(圖38)。
11.2.2.甘露糖-6-磷酸存在於潛伏性TGF-β1中為了測定從血小板中分離出來的潛伏性TGF-β1是否也會有man6P，對高度純化的血小板TGF-β1前體進行了測試，測試其抑制標記重組TGF-β1前體和分離的IGF-Ⅱ/man6P受體結合的能力。發現潛伏性血小板TGF-β1複合物是這種結合的有效抑制劑，在約0.2nM的劑量下，可達到最大值抑制的一半(圖39)。
為了進一步檢查血小板TGF-β1複合物中存在的man6P，將這些材料在SDS-聚丙烯醯胺還原凝膠上電泳，並將其轉移至硝酸纖維素膜上，相繼與純化的IGF-Ⅱ/man6P受體、抗受體的兔抗體、結合鹼性磷酸鹽的抗兔Ig和鹼性磷酸酶的組織化學染色劑一起孵育。儘管用該技術可以檢測在未裂解的重組TGF-β1前體中的man6P(圖40，帶a)和前體殘餘物中的man6P(圖40，帶b)，但對血小板TGF-β1，未檢測到合適的分子量帶。在對照實驗中，一個特異性抗TGF-β1前體順序的抗體可檢測血小板TGF-β1前體殘餘物(圖40，帶c)。
12.TGF-β1前體上糖的功能的實例分析下面的研究旨在檢查在成熟TGF-β加工中pre-pro-TGF-β1的糖表位的重要性。結果證明低聚糖加入和重新組合在TGF-β1分泌過程中起必不可少的作用，但是，它對於pre-pro-TGF-β1的特異性蛋白質水解則不起作用，結果還證明，TGF-β1前體的蛋白質水解過程是在胞內酸性泡囊中發生的。
12.1.材料和方法12.1.1.材料糖基化作用的抑制劑八氫吲嗪三醇(SW)，衣黴素(TU)，慄精胺(CA)、脫氧人野尻黴素(deoxymannojirimycin)(dMM)和脫氧野尻黴素(dN)以及糖基化修飾酶內糖苷酶H(endoH)和唾液酸苷酶是從Boehringer-ManheimBiochemicals，Indianapolis，I.N.購得的。N-聚糖酶是從Genzyme，Bosten，MA得到的。二磷酸氯喹、莫能菌素和二乙基氨基乙基葡聚糖(DEAE-dextran;500，000MW)是從SigmaChemicalCompany，St.Louis，MO購得的。N-血清(Nuserum)是從CollaborativeResearch，Lexington，MA得到的。所有其它細胞培養劑均購自GIBCOLaboratories，GrandIsland，NY.(35-s)-L-半胱氨酸和(35-S)-L-蛋氨酸是由NENResearchProducts，Boston，MA生產的，並分別具有＞600和＞800ci/mM的比活性。(32-P)-正磷酸鹽(無載體)得自ICNBiomedicals，Costa，Mesa，CA。限制酶和其它DNA修飾酶是從BethesdaResearchLaboratories，Bethesda，MD得到的。
12.1.2.細胞培養CHO-TGF-β3-2000細胞(克隆17)如前面第7.1.1.部分所述的生長和傳代。COS-1細胞(ATCCCRL1650)在添加了10%胎牛血清、100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的Dulbe-cco改良Eagles培養基(DMEM)中生長並通過胰酶消化而傳代。
12.1.3.分泌的TGF-β1的代謝標記和分析TGF-β3-2000細胞在含有2ml完全培養基的35mm培養皿中生長至融合。然後用缺乏蛋氨酸、半胱氨酸和血清的培養基代替完全培養基培養1小時。然後用濃度各為100μci/ml的(35-S)-蛋氨酸和(35-S)-半胱氨酸標記細胞0.5小時。標記後，細胞用Hanks平衡鹽溶液洗滌三次，然後置於無血清的完全培養基DMEM中追加。在上述的全部培養過程中，在組織培養基中存在糖基化作用抑制劑、弱鹼或離子載體。上清液在SDS-PAGE樣品製備緩衝液中煮沸後，通過SDS-PAGE直接分析。採用梯度為7.5-20%的丙烯醯胺凝膠。
為了進行(32-P)磷酸鹽標記，將細胞在含有1ml磷酸鹽和無血清DMEM的35mm培養皿中培養1小時。用1mci/ml的(32-P)-正磷酸鹽標記細胞6小時。收集無細胞培養基，過量的(32-P)磷酸鹽通過在用50mM碳酸氫鈉平衡的10mlSephadexG-25柱中脫鹽而除去。收集具有放射性的最前面的3個0.75ml分部，凍幹，將凍幹的沉澱溶解於100μl樣品製備緩衝液中，取出10μl進行SDS-PAGE和放射自顯影分析。
12.1.4.用SDS-PAGE對TGF-β1定量在培養上清液中TGF-β1的量是在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上，凝膠螢光X線照相後，通過光密度計來測定的。在大多數情況下，成熟TGF-β1與前體形式的量的比例是不變的。因此，所觀察到的成熟的12KDalTGF-β1的量可用於測量所分泌的全部生長因子。
為了測量加工過程中量的變化，在光密度計測量後，通過計算所有三種形式的重組生長因子的總和並對各種處理細胞的分泌水平進行標準化換算，來測定所分泌的TGF-β1的總水平。然後計算成熟的12KDalTGF-β1的相對量以確定蛋白質水解加工的水平。
12.1.5.用糖基化修飾酶消化用糖基化修飾酶處理以(35-S)-半胱氨酸和(35-S)-蛋氨酸標記的條件培養基。在37℃下，用5mUendoH或25mU唾液酸苷酶處理培養基(23μl)過夜。在30℃下，用N-聚糖酶進行消化，採用1.25U的酶。在所有情況下，總的反應體積是35μl。endoH和唾液酸苷酶反應緩衝液分別是包括25mMTris-HCl、0.2%SDS(W/V)(pH5.7)，以及50mM乙酸鈉、2mM氯化鈣、0.2mMEDTA(pH4.6)。N-聚糖酶消化是在由10mMEDTA、0.2%SDS(W/V)、0.1M2-巰基乙醇和1%諾乃洗滌劑-P40(V/V)(pH7.5)組成的最終緩衝液組合物中進行的。消化後，將樣品與等體積的2X-SDS樣品製備緩衝液混合，用SDS-PAGE分析16μl等分試樣。
12.1.6.TGF-β1的Sa(Ⅱ缺失突變體的製備和插入CDM8載體亞克隆進pUC19的TGF-β1cDNA被用於缺失突變。用SacⅡ酶切質粒DNA並重新連接移去了TGF-β1cDNA的編碼區的480個核苷酸形成具有一個框架內缺失的質粒DNA。用EcoRI酶切所得到的質粒，用DNA多聚酶I的Klenow片段修復平頭，然後再用HindⅡ酶切之。將該片段插入CDM8表達質粒。
用NotⅠ酶切CDM8表達質粒DNA(Seed，1987，Nature329840-842)，並用Klenow酶修復純化末端。然後用HindⅡ消化DNA並採用Geneclean將其在瓊脂糖凝膠中分離。然後將野生型TGF-β1cDNA和SacⅡ缺失突變體的HindⅢ-EcoRⅠ(平頭)片段連接到HindⅢ-NotⅠ(平頭)CDM8載體中。經CsCl純化的DNA被用於表達研究。
12.1.7.在COS細胞中的瞬時表達在COS-1細胞中的瞬時表達是通過DEAE-葡聚糖-氯喹轉染方式來完成的，如已描述的(Cullen，1987，Meth.Enzymol152684-704)。簡單地說，在加入DNA之前，先將在35mm培養皿中生長的COS-1細胞的半融合培養物在含有10%N-血清(Nuserum)的DMEM中孵育1-2小時。轉染混合劑是通過在10mg/ml的DEAE-葡聚糖無菌溶液中緩慢加入經CsCl純化的DNA而製備的，最後的濃度為0.2mgDNA/ml。然後將DEAE-葡聚糖/DNA混合物(100μl)加入細胞中至最終濃度為10μgDNA/ml。然後再加入氯喹至最終濃度為100μg/ml，在37℃下與細胞一起孵育3小時。之後除去含有DNA/DEAE-葡聚糖/氯喹的培養基，用在磷酸緩衝鹽水中的2ml10%的二甲基亞碸(V/V)處理細胞。室溫下2分鐘後，將細胞用磷酸緩衝鹽水中洗滌2次，並在完全DMEM生長48小時。
為了對表達TGF-β1進行免疫印跡分析，將無血清培養基加入細胞中，收集48小時時的培養基並在0.4%乙酸中透析。將經透析的培養基凍幹，溶解於30μl樣品製備緩衝液中，取出5μl作免疫印跡分析。經轉染的細胞也用免疫印跡分析。收集無血清培養基後，刮挖收集細胞，往每一個體積的SDS-樣品製備緩衝液中加入一個體積的細胞。煮沸5分鐘後，用免疫印跡法分析2μl溶胞產物。
12.2.結果12.2.1.衣黴素抑制來自轉染CHO細胞的重組TGF-β1的分泌在設計來說明在pre-pro-TGF-β1的轉運和分泌中糖基化加工的功能作用的初步實驗中，用衣黴素(TU)處理轉染CHO細胞，衣黴素是一種核苷抗生素，它可防止低聚糖進入新生的多肽鏈(Tacz和Lampen，1975，Biochem.Biophys.Res.Commun.65248-257)，並分析了條件培養基和用於表達TGF-β1的細胞。圖41顯示了採用免疫印跡法檢測在培養基或細胞中的TGF-β1蛋白質所得到的結果。對照細胞的培養基在還原條件下，在SDS凝膠上分級分離顯示出有三種形式的重組TGF-β1(參見第7部分等)存在。44-56KDal多肽代表pro-TGF-β1(圖41中以「a」示之)，30-42KDal蛋白質與前體的前區域相對應(在圖41中以「b」示之)，12KDal形式則代表成熟的，經適當加工的TGF-β1(圖41中以「c」示之)。但是，用衣黴素處理CHO細胞24小時，未顯示出能釋放可測定水平的免疫反應性TGF-β1。
在對照細胞中TGF-β1的主要胞內形式顯示在與部分糖基化的生長因子相應的位置上遷移。只有當增加量用於免疫印跡的細胞溶胞產物量時，在細胞內可測得很低水平的經加工的TGF-β1多肽。在TU處理後，發現TGF-β1肽的主要胞內形式的大小與未糖基化的前體相應。與對照細胞相比較，在經TU處理的細胞中該TGF-β1前體的水平始終較高，這很可能表明這種形式的前體在經處理的細胞內積聚。這些結果有力表明糖基化對分泌是重要的，沒有它，可能會導致在細胞內形成重組TGF-β1。
12.2.2CHO轉染子分泌TGF-β1的時間過程重組TGF-β1從轉染CHO細胞株中分泌的速率和程度是通過用(35-S)-蛋氨酸和(35-S)-半胱氨酸脈衝標記，並追加不同的時間而測定的。收集培養基，並通過SDS-PAGE分級分離，然後螢光X線照相。結果示於圖42A中。三種重組形式的TGF-β1在條件培養基中是逐漸出現的，因而在實驗過程中分泌的速率是較平緩的。成熟TGF-β1的量與前體形式的量的比率不變，表明蛋白質水解加工完全依賴於分泌，並且很有可能是在胞內發生的。
圖42B顯示了掃描螢光X線照相所測定的對應於三個獨立的脈衝追加實驗的TGF-β1分泌定量評價。在約1.5小時的分泌時間滯差後，TGF-β1多肽由CHO細胞迅速地分泌，6小時後，可測得50%以上的分泌重組蛋白質。該1.5小時的時間滯差比所報導的其它多肽時間滯差要長一些，這個差異可能反映了糖基化加工速率或所依賴的細胞類型的不同(Bauer等人，1985，Biochem.BiophysRes.Commun128308-375;Leford和Davis，1982，J.Biol.Chem.2583304-3308;Lodish等人，1984，J.Cell.Biol.981720-1729)。追加20小時後，在CHO條件培養基中測得的重組物質的分泌水平開始平穩。6小時這一點被選作進一步的研究，因為在這個時間時，50%以上的重組物質已經分泌了(圖42)。
12.2.3.糖基化或糖基化加工的抑制劑影響分泌rTGF-β1的水平為了進一步闡明糖基化對於由CHO細胞產生的TGF-β1的加工和分泌的作用，用幾種糖基化作用的抑制劑處理轉染細胞並測試它們對於重組生長因子分泌的影響。除衣黴素外，還使用了四種影響正在延長的低聚糖側鏈的末端加工的抑制劑。在加入核心低聚糖後，慄精胺(CA)和脫氧野尻黴素、(dN)幹擾在內質網中葡萄糖殘基的起始修飾(Heltkamp等人，1982，Biosci.Rep.2899-906;Saunier等人，J.Biol.Chem.25714155-14161;Schwartz和Datema，1984，TrendsBiochemSci.932-34)。另一方面，八氫吲嗪三醇(SW)和脫氧人野尻黴素(dMM)可分別抑制高爾基體的甘露糖苷酶Ⅰ和Ⅱ(Elbein等人，1984，Arch.Biochem.Biophys.235579-588)Tulsiani等人，1982，J.Biol.Chem.2577936-7939)。
用抑制劑處理來自表達TGF-β1的CHO細胞的條件培養基的螢光X線照相示於圖43A中。用抑制劑預處理CHO細胞1小時，然後脈衝標記並追加。6小時追加後，收集上清液。TU可大量減少TGF-β1的分泌，與圖41中所示的結果相一致。CA和dN對內質網中葡糖苷酶活性的抑制也會明顯地減少分泌。與之相反，用高爾基體的甘露糖苷酶活性抑制劑dMM或SW所處理的細胞可略微增加分泌。
圖43B顯示了從三個分別的實驗中得到的結果的概括。TU、CA和dN存在下，分泌水平是在對照細胞中觀察的水平的5-15%。SW和dMM引起分泌水平的增加，重組蛋白質增加約30%。實驗時間過程顯示與對照細胞有相似的分泌速率，表明通常只是分泌的增加或減少，而不是速率的變化。此外，TGF-β1的特異性蛋白水解加工不會改變隨後的抑制劑處理過程。在所有情況下，即使是缺乏糖類(圖43A以「TU」示之)時，pro-TGF-β1(圖43A中以「a」示之)與TGF-β1加工後形式(圖43A中以「b」和「c」示之)的比率相似是明顯的。這些結果表明只要維持葡萄糖殘基的起始修整完全重新組合TGF-β1低聚糖側鏈對分泌不是必需的，低聚糖的完整性對於pre-pro-TGF-β1的蛋白質水解加工是不重要的。
12.2.4.TGF-β1低聚糖側鏈的結構對存在於經抑制劑處理的CHO細胞分泌的TGF-β1多肽中的糖基的性質進行研究。收集來自具有或不具有抑制劑的脈衝標記CHO的條件培養基，並用N-聚糖酶、endoH和唾液酸苷酶處理。結果示於圖44中。能除去所有N-連接的糖的N-聚糖酶會引起TGF-β1前體多肽「a」和「b」在還原SDS凝膠上共同遷移，而不論是否經抑制劑處理。如所期望的，對照處理細胞對endoH(一種可除高甘露糖型低聚糖鏈的葡糖苷酶)基本不敏感，這就證實了所推側的複合糖結構。但是用Endo處理得自抑制劑處理的CHO細胞的上清液發現在採用dMM的情況下，TGF-β1前體的側鏈被完全除去，而採用CA、dN和SW處理時，酶只有部分敏感。唾液酸苷酶處理發現dMM、CA和dN不含明顯的唾液酸化殘基。但是，用SW處理發現在這些條件下所得到的TGF-β1前體多肽在其低聚糖側鏈中含有大量的唾液酸組分。
12.2.5.從抑制劑處理的CHO細胞中釋放的TGF-β1前體多肽的甘露糖-6-磷酸TGF-β1前體可以容易地用(32-P)-正磷酸鹽進行標記，這種摻入是由於甘露糖殘基的磷酸化產生甘露糖-6-磷酸;磷酸化作用發生於生長因子前體的最前面兩個糖的側鏈中(前面，第9部分)。因為通過用抑制劑處理而進行的糖基化途徑的修飾可能影響前體的甘露糖-6-磷酸化作用，用(32-P)-正磷酸鹽標記細胞並檢查TGF-β1前體多肽被標記的能力(圖45)。來自用SW和dMM處理的細胞的TGF-β1前體中主要的磷酸化作用是明顯的。而CA和dN的作用則不太明顯，這是因為TGF-β1多肽的分泌減少了。但是，在較長一段時間曝光後發現(32-P)標記出現在與前體共同遷移的蛋白中。因此，用抑制劑處理CHO細胞不影響TGF-β1多肽甘露糖-6-磷酸的磷酸化作用。
12.2.6.缺失誘變研究為了進一步提供有關糖基化作用對重組TGF-β1蛋白質分泌的作用的證據，刪除前體的一個大的部分，產生了一個缺少所有三個糖基化位點的框架內突變體。圖46A顯示了用於＜＠缺失的方法。用SacⅡ酶切DNA並重新連接而去除TGF-β1的前區域內160個胺基酸。重新連接是在Arg-50和Gly-211之間進行的，被稱為△51-210TGF-β1。然後將缺失突變體置於表達載體CDM8(Seed，1987Nature329840-842)中CMV啟動子的下遊，如所示的(圖46A)。
採用一個瞬時表達系統將突變DNA轉染進COS-1細胞，通過免疫印跡來檢查TGF-β1分泌的水平(圖46B)。含有野生型TGF-β1的表達載體在COS-1細胞中表達，並導致三種形式的重組生長因子多肽的分泌(圖46B，2道)。免疫印跡也發現對照物呈現出這些形式(圖46B，3道)。與之相反，在用缺失突變體轉染的COS-1細胞的上清液中未觀察到可測定水平的TGF-β1。在對照細胞中，少量TGF-β1前體在胞內被觀察到;這些結果與前面實驗(圖41)中得到的結果是相似的。對於△51-210TGF-β1轉染子來說，一種大小與預計的該缺失突變體相應的約20KDal的免疫反應性蛋白質在這些轉染子轉染的COS-1細胞中胞內表達。上述結果表明△51-210TGFβ1不能由細胞有效地分泌，在胞內積聚。儘管相當大部分的TGF-β1前體由於缺失而除去了，TGF-β1分泌的不足與抑制劑處理的結果是一致的，它暗示IGF-β1前體的糖類表位有重要的胞內靶子作用。
12.2.7.在酸性泡囊中的胞內蛋白質水解加工為產生成熟TGF-β1而進行的TGF-β1前體在鹼性殘基上的蛋白質水解加工很可能是在細胞內發生的。為了檢測參與TGF-β1加工的蛋白酶的性質，用弱鹼或一價離子載體處理轉染CHO細胞。兩種試劑均能增加泡囊內的pH，使之從酸環境而變為接近中性的環境，每一個都會影響轉運過程或蛋白質水解加工(Devault等人，1984，J.Biol.Chem.2595146-5151;Mellman等人，1986，Ann.Rev.Biochem.55663-700;Poole等人，1981，J.CellBiol.90665-690;Tartakoff和Vassalli，1977，J.Exp.Med.1461332-1345;Tartakoff和Vassalli，1978，J.Cell.Biol.79284-299)。用這些試劑處理轉染CHO細胞1小時，然後進行脈衝標記，並在含有這些試劑的無血清完全培養基中追加6小時。然後通過SDS-PAGE分析條件培養基;相應的螢光X線照相示於圖47A。弱鹼性的氯化按、氯喹以及離子載體莫能菌素會大大降低TGF-β1前體中觀察到的蛋白質水解加工的程度，另一方面，TGF-β1分子分泌的總水平不受或僅略微受到這些試劑的影響。令人感興趣的是，羧酸離子載體莫能菌素顯示出能阻止漿細胞分泌免疫球蛋白(Tartakoff和Vassalli，1977，J.Exp.Med.1461332-1345;Tartakoff和Vassalli，1978，J.Cell.Biol.79284-299)。
圖47B顯示了為了對這些效應定量而進行的三個分別的實驗。因為僅觀察到對於分泌有輕微影響，我們將用SDS凝膠螢光X線照相的光密度掃描計在脈衝追加實驗中觀察到的總的TGF-β1相加，對從CHO細胞中釋放的重組TGF-β1的總水平進行標準化換算。標準化以後，測定所分泌的成熟TGF-β1的量，它表明了蛋白質水解加工的水平。氯化銨在這些實驗中所使用的濃度下產生的影響最弱，顯示出對照值的約70%的裂解效率。另一方面，氯喹和莫能菌素能大大地降低加工的水平，降至約為對照物的20%。這些結果有力表明，產生成熟TGF-β1的前體的蛋白質裂解是由一個具有酸性最佳pH的蛋白酶完成的。
其它的報導也已指出上述試劑可能影響糖基化作用(Mellman等人，1986，Ann.Rev.Biochem.55663-700;Tartakoff和Vassalli，1977，J.Exp.Med.1461332-1345;Tartakoff和Vassalli，J.Cell.Biol.79284-299;Thorens等人，1986，Nature321618-620)。事實上，圖47A表示了莫能菌素和氯喹可能會改變低聚糖側鏈的結構，因為蛋白質在SDS凝膠上的遷移有所不同。為了對此進行進一步的研究，我們採用葡糖苷酶來分析分泌的TGF-β1前體的糖結構(圖48)。在所有情況下結果是相似的;經處理的樣品對N-聚糖酶、endoH和唾液酸苷酶呈現出相同的敏感性，如經處理的對照物一樣。用唾液酸苷酶消化後，TGF-β1前體蛋白質的遷移不變。因此，由莫能菌素和氯喹引起的TGF-β1前體的電泳遷移的變化很有可能是由於唾液酸化程度的變化所引起的。該結果與其它一些已注意到用這些作用劑處理後，末端糖基化作用發生改變的報導是一致的(Tartakoff和Vassalli，1977，J.Exp.Med.1461332-1345;Tartakoff和Vassalli，1978，J.Cell.Biol.79284-299Thorens等人，1986，Nature321618-620)。此外，莫能菌素處理的培養株仍能將(32)-P-正磷酸摻入前體分子中表明泡囊內的pH不影響甘露糖殘基的磷酸化作用。用莫能菌素和氯喹處理後所觀察到的糖結構的微小變化不可能影響蛋白質水解加工，因為能大大地改變糖類側鏈結構的葡糖苷酶修飾抑制劑對TGF-β1蛋白的水解加工尚不會有顯著的作用。
13.實例人類巨噬細胞分泌的潛伏性TGF-β1的r幹擾素誘導活化作用
13.1.材料和方法13.1.1.潛伏性TGF-β1的純化表達潛伏性rTGF-β1(LnTGF-β1)的CHO細胞株(1.4mg/l)在低濃度血清(0.2%)中生長，接種24小時後收集上清液。上清液通過低速離心使之澄清，蛋白質用硫酸銨沉澱(80%飽和，pH7.2)。將沉澱物重新懸浮於冷的磷酸緩衝液(PBS)中，在4℃下充分透析2天。將含有6.2mg蛋白質的樣品裝入在PBS100-200MESH中平衡的P-100柱(BioRad)中。在這個柱中，無活性的LnTGF-β1從殘餘的活性TGF-β1中分解出來，通過觀察染成銀色的SDS-PAGE凝膠而定位(Blobel和Dobberstein，1975.J.Cell.Biol.67835-851;Morrissey，1981，Analyt.Biochem.117307-310)，然後如在CCL-64水貂肺上皮細胞生長抑制試驗(QIA)(前面第7.1.6部分)中所述的檢測酸活化。
簡單地說，將細胞在96井組織培養板(Falcon 3072)中，在每μl含有10%胎牛血清的DMEM中有3×103個細胞的濃度下進行培養。TGF-β標準物試驗在0.2M乙酸中進行，且在12×75mm的無菌試管(Falcon 2063)中凍幹。將凍幹的樣品重新懸浮於含有10%胎牛血清的DMEM中，在平板培養5小時後，將50 μl樣品加入測試井中一式三份(未經酸化的樣品不需處理即可測試)。在37℃下，在溼潤的5%CO2-95%空氣的環境下培養72小時後，往50μl培養基中加入[125I]Id Udr(Amersham IM 355)(1μCi/ml)。再將細胞培養24小時，然後用PB S洗滌一次，在200 μl甲醇中固定10分鐘，空氣乾燥15分鐘。在65℃下將細胞溶解於200 μl1M NaOH中，歷經20分鐘，採用Titertek Supernatant Collection System(Flow Laboratories，78-210-05)收集標記物質。生長的抑制-刺激以經處理細胞中[125I]Id Udr摻入的減少或增加的百分數來表示，以未經處理的細胞的摻入情況作對照。
13.1.2.潛伏性TGF-β1活化試驗從分級分離的新鮮人血中製得單核細胞，活化之，並將其接種至Dulbecco′s改良Eagle′s培養基(DMEM)中(2×106個細胞/ml)。在純化的濃度為5 μg/ml的Ln TGF-β1和/或重組r幹擾素(rr INF)，100U/ml(AMGEN)存在或不存在下，將培養物在37℃下培養24小時。收集上清液，通過低速離心使之澄清，在乾冰中冰凍，然後連續稀釋，一式三份用於生長抑制試驗。(GIA)。採用由純化的血小板TGF-β所產生的標準GIA曲線來測定TGF-β的GIA值。
13.2.結果表Ⅻ顯示了在中性PH下純化的TGF-β前體呈現出最小的生物活性(即使在濃度為1μg/ml時)。但是，用乙酸進行瞬時預處理能活化約7.5%(以重量計)的前體，即250ng酸化前體可產生18.7ng活性TGF-β以摩爾為基準的話，則相當於40%活化。SDS-PAGE分析證實經酸活化的分子的質量與天然TGF-β(24Kd)相同，初步順序研究表明殘餘的未活化的TGF-β前體複合物是在前體和成熟TGF-β等二聚體中的半胱氨酸殘基之間的假二硫鍵形成的結果(Marquardt等人，正在印刷中)。將這種純化的多聚蛋白作為成熟外源TGF-β前體，我們檢測了各種培養細胞活化和將TGF-β釋放入培養上清液中的能力。採用幾個已建立的淋巴細胞系，包括HUT-78、CEM和單核細胞衍生的系，U937，未觀察到活化。類似地，新鮮培養的人體B和T細胞則顯示了很小的(如果有的活)活化作用。
表Ⅻ潛伏性TGF-β1的酸活化重組潛伏性TGF-βTGF活性(生長抑制)、ng/mlng/ml預處理無酸1000.610009.2250＜0.518.710006.080.14表Ⅻ中所示的結果表明在100 U/mlr γINF和5 μg Ln TGF-β1存在時，培養的人體單核細胞能活化潛伏性TGF-β1。人體外周血單核細胞釋放很少量的活化TGF-β1＜0.1 pM/ml培養上清液)。用5 μg Ln TGF-β1與單核細胞培養24小時可引起一些基本的活化(約0.1pM/ml，每1×107個細胞)。但是，在100 U/mlr γ-INF和5 μg Ln TGF-β1存在下培養的單核細胞會大量地增加上清液中可測得的活性TGF-β的量。活化的程度很大，為2.1-2.5pM TGF-β/ml，它等於單獨用酸處理時所得到的量的一半(實驗1和2中，細胞素/酸的活化比率分別為0.42和0.50)。單獨用r γ-INF處理的單核細胞的對照培養不會引起主要由一些培養的單核細胞所釋放的內源潛伏性TGF-β的任何明顯的活化(0.2-0.4 pM/ml)(Assoian等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.846020-6024)。活化量與加入的底物Ln TGF-β1的量是成正比的，在10 μg/ml底物濃度時，用107個單核細胞和100 μ/mlr γ-INF達到飽和。活化作用的動力學證明用帶有rγ-INF的LnTGF-β培養7～8小時後，TGF-β1的加工和釋放達到最大，這表明加工過程可能需要γ-INF誘導的基因轉錄，可能包括加工過程酶基因(一個或多個)的轉錄。
表ⅩⅢ由人體單核細胞釋放的LnTGF-β1的γ-幹擾素誘導的活化作用活化的TGF-β活化率Pmole/ml細胞素/酸＊實驗實驗ⅠⅡⅠⅡ單獨的單核細胞＜0.10.4--單核細胞+γINF 0.2 0.4 - -單核細胞+γINF單核細胞+γINF 2.1 2.5 0.42 0.50+Ln TGF-β1單核細胞+LnTGF-β10.1＜0.1--＊在22℃下，在1M乙酸中2小時如圖49中所示，單核細胞對Ln TGF-β1的活化作用取決於所用的γ-INF的劑量。採用小至10單位/ml的r γ-INF就可觀察到可測定的反應(由GIA測得為10ng/mlrTGF-β)。前面的實驗(表ⅩⅢ)是在100 U/mlr γ-INF(釋放20ng/ml TGF-β)的劑量下進行的，它能達到最大的飽和值，即1000U/mlr γ-INF。在一個另外的實驗中，重組IL-2能刺激新鮮的人體T細胞來加工Ln TGF-β1，但是，與用r γ-INF處理的單核細胞所觀察到的結果相比，反應是弱的(0.5pmoles/TGF-β/2×106個細胞/單位γIL-2)。
進行了幾個實驗以確定從經rγ-INF處理的單核細胞培養物中得到的LnTGF-β1依賴型TGF-β的抑制生長的活性是否真的是TGF-β活性。TGF-β最先被分離，因為它會刺激正常的大鼠腎細胞(NRK)在存在少量EGF或TGF-α的軟瓊脂上長成菌落。如圖50中所示，酸純化的天然TGF-β1和EGF兩者對於刺激NRK細胞菌落的生長均是需要的(120個菌落/8個隨機低倍鏡視野)。收集經rγ-INF處理的單核細胞的培養上清液(未經酸化)與TGF-β1一起培養也能有效地誘導NRK細胞菌落形成;1和100ng單核細胞激活的γTGF-β1分別刺激90和190個NRK菌落的生長。當在抗牛骨衍生的TGF-β1的中性的單克隆抗體存在下進行試驗時，發現NRK菌落的形成被抑制了(當TGF-β濃度為100ng/ml時，有90%抑制)。菌落生長受mAb抑制的程度取決於進行分析時加入的TGF-β1起始濃度。
用3H-亮氨酸與表達Ln TGF-β1的CHO細胞孵育過夜，標記後的TGF-β1前體複合物如材料和方法中所述的純化。在無血清條件下，用r γ-INF處理的和未經處理的單核細胞與3H-亮氨酸標記的Ln TGF-β1一起培養，收集上清液並在非還原條件下，通過SD S-PAGE進行分析。結果示於圖51中。除110 Kd TGF-β1前體外，還看到一條與存在於經r γ-INF處理的培養物的上清液中的24Kd TGF-β標準物共同遷移的帶(A道)。該帶不如用3H-亮氨酸Ln TGF-β1單獨與單核細胞培養的上清液中的帶(B道)明顯。
這些結果表明γINF能有效地誘導人體單核細胞來介導活性TGF-β從潛伏性重組TGF-β複合物中釋放。釋放到外源性加入LnTGF-β1(的培養物)的上清液中的TGF-β與TGF-β1的功能是相同的(mAb可中和NRK菌落形成)，並且其質量(SDS-PAGE)也與在酸性PH下純化後，從血小板和骨中分離的天然TGF-β相同。
14.微生物保藏下面的轉化子已保藏至AmericanTypeCultureCollection，Rockville，Md，並已得到保藏號轉染體質粒保藏號CHO-TGF-β-3/2000pSV2-β-TGFCRL9434本發明並不局限於所保藏的細胞系範圍，因為保藏的具體例子只是列舉了本發明的一個方面，任何功能相當的微生物均在本發明的範圍內。事實上，除這裡所示的和描述的以外，本發明的各種修飾對於該領域的技術人員來說，從前面的描述和附圖中都將變得十分明顯。但這些修飾均將落入附加的權項的範圍。
也應該看到，所給出的鹼基對和胺基酸數以及核苷酸和肽的大小均是大約的，只是用於說明的目的。
權利要求
1.一種製備轉化的生長因子-β1的方法，其特徵在於它包括a)培養含有編碼猴轉化生長因子-β1的核苷酸順序的真核細胞，此順序在調整基因表達的第二個核苷酸順序的控制下，由此由真核細胞生產一種具有轉化生長因子-β1活性的肽或蛋白質；和b)從培養物中回收轉化生長因子-β1。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於編碼猴轉化生長因子-β1的核苷酸順序基本上包括圖1中所示的1-1173號核苷酸的核苷酸順序。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於編碼猴轉化生長因子＝β1的核苷酸順序基本上包括圖1中所示的1-1173號核苷酸，但其中編碼33號胺基酸殘基密碼子被改變為「AGC」。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於真核細胞包括中國倉鼠卵巢(ChineseHamsterOvary)細胞。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於控制基因表達的第二個核苷酸順序包括一個SV40啟動子。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於第二個核苷酸順序包括一個啟動子和一個編碼真核細胞中缺乏的可選擇標記的順序，這樣，含有猴轉化生長因子-β1編碼順序的真核細胞可以被識別。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於可選擇的標記包括二氫葉酸還原酶。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於它還包括將真核細胞暴露至氨甲蝶呤中，這樣可選擇出含有放大水平的編碼二氫葉酸還原酶和猴轉化生長因子-β1的編碼順序的抗性菌落。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於真核細胞包括二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞。
10.一種製備轉化生長因子-β1的方法，其特徵在於它包括a)培養保藏於ATCC中並獲得保藏號CRL9434的轉染子CHO-TGF-β1-3/2000;和b)從培養物中回收轉化生長因子-β1。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於轉染子是在氨甲蝶呤存在下培養的。
12.一種真核細胞，其特徵在於它包括在調節基因表達的第二個核苷酸順序控制下的編碼猴轉化生長因子-β1的核苷酸順序，這樣，真核細胞可產生活性轉化生長因子-β1。
13.如權利要求12所述的真核細胞，其特徵在於編碼猴轉化生長因子-β1的核苷酸順序包括基本上如圖1中所示的1-1173號核苷酸的核苷酸順序。
14.如權利要求12所述的真核細胞，其特徵在於編碼33號胺基酸殘基的密碼子被改變為「AGC」。
15.如權利要求12所述的真核細胞，其特徵在於它包括中國倉鼠卵巢細胞。
16.如權利要求12所述的真核細胞，其特徵在於控制基因表達的第二個核苷酸順序包括一個SV40啟動子。
17.如權利要求12所述的真核細胞，其特徵在於第二個核苷酸順序包括一個啟動子和一個編碼真核細胞中缺乏的可選擇標記的順序，這樣，含有編碼猴轉化生長因子-β1的順序可以被識別。
18.如權利要求17所述的真核細胞，其特徵在於可選擇的標記包括二氫葉酸還原酶。
19.如權利要求18所述的真核細胞，其特徵在於它包括二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞。
20.一種細胞系，其特徵在於它包括保藏於ATCC並獲保藏號CRL9434的CHO-TGF-β1-3/2000。
21.一種基本純的多肽，其特徵在於它包括基本上如圖1所示的胺基酸順序。
22.如權利要求21所述的基本純的多肽，其特徵在於它包括1-390號胺基酸殘基。
23.如權利要求21所述的基本純的多肽，其特徵在於它包括30-390號胺基酸殘基。
24.如權利要求21所述的基本純的多肽，其特徵在於它包括30-278號胺基酸殘基。
25.如權利要求21、22、23或24所述的基本純的多肽，其特徵在於它被糖基化。
26.如權利要求21、22、23或24所述的基本純的多肽，其特徵在於它被磷酸化。
27.如權利要求26所述的基本純的多肽，其特徵在於它至少包括一個甘露糖＝6＝磷酸。
28.如權利要求27所述的基本純的多肽，其特徵在於甘露糖＝6＝磷酸被連接到rTGF-β1前體的天冬醯胺連接的糖鏈中。
29.如權利要求28所述的基本純的多肽，其特徵在於天冬醯胺的位置是胺基酸殘基82號。
30.如權利要求28所述的基本純的多肽，其特徵在於天冬醯胺的位置是胺基酸殘基136號。
31.如權利要求28所述的基本純的多肽，其特徵在於天冬醯胺的位置是胺基酸殘基176號。
32.一種基本純的多肽，其特徵在於它包括基本上如圖1中所示的胺基酸順序，其中33號胺基酸殘基是絲氨酸。
33.一種基本純的多肽，其特徵在於它包括基本上如圖1中所示的胺基酸順序，其中223號胺基酸殘基是絲氨酸。
34.一種基本純的多肽，其特徵在於它包括基本上如圖1中所示的胺基酸順序，且其中225號胺基酸殘基是絲氨酸。
35.一種基本純的多肽，其特徵在於它包括基本上如圖1中所示的胺基酸順序，且其中223和225號胺基酸殘基是絲氨酸。
36.如權利要求32、33、34或35所述的基本純的多肽，其特徵在於它包括1-390號胺基酸殘基。
37.如權利要求32、33、34或35所述的基本純的多肽，其特徵在於它包括30-390號胺基酸殘基。
38.如權利要求32、33、34或35所述的基本純的多肽，其特徵在於它包括30-278號胺基酸殘基。
39.如權利要求32、33、34、35、36、37或38所述的基本純的多肽，其特徵在於它被糖基化。
40.如權利要求32、33、34、35、36、37或38所述的基本純的多肽，其特徵在於它被磷酸化。
41.如權利要求40所述的基本純的多肽，其特徵在於它至少包括一個甘露糖-6-磷酸。
42.如權利要求41所述的基本純的多肽，其特徵在於甘露糖-6-磷酸被連接到rTGF-β1前體的天冬醯胺連接的糖鏈中。
43.如權利要求42所述的基本純的多肽，其特徵在於天冬醯胺的位置是胺基酸殘基82號。
44.如權利要求42所述的基本純的多肽，其特徵在於天冬醯胺的位置是胺基酸殘基136號。
45.如權利要求42所述的基本純的多肽，其特徵在於天冬醯胺的位置是胺基酸殘基176號。
46.一種編碼轉化生長因子-β1前體的核苷酸順序，其特徵在於它包括編碼基本上如圖1所示的1-1173號核苷酸順序的核苷酸。
47.一種編碼轉化生長因子-β1前體的核苷酸順序，其特徵在於它包括編碼基本上如圖1所示的1-1173號核苷酸順序的核苷酸，其中編碼33號胺基酸殘基的密碼子被改變為「AGC」。
48.一種編碼轉化生長因子-β1前體的核苷酸順序，其特徵在於它包括編碼基本上如圖1所示的1-1173號核苷酸順序的核苷酸，其中編碼223號胺基酸殘基的密碼子被改變為「AGC」。
49.一種編碼轉化生長因子-β1前體的核苷酸順序，其特徵在於它包括編碼基本上如圖1所示的1-1173號核苷酸順序的核苷酸，其中編碼225號胺基酸殘基的密碼子被改變為「TCT」。
50.一種編碼轉化生長因子-β1前體的核苷酸順序，其特徵在於它包括編碼基本上如圖1所示的1-1173號核苷酸順序的核苷酸，其中編碼223和225號胺基酸殘基的密碼子分別被改變為「AGC」和「TCT」。
51.一種在體內治療腫瘤的方法，其特徵在於它包括施用有效的殺腫瘤細胞劑量的轉化生長因子-β1。
全文摘要
本發明揭示了重組轉化生長因子-β1(TGF-β1)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中高水平表達。在增加濃度的氨甲蝶呤中逐步選擇轉染CHO細胞會產生表達放大的TGF-β1核酸順序的細胞系。由這些細胞分泌的主要蛋白質包括潛伏性TGF-β1和TGF-β1前體多肽，由這些細胞所分泌的重組TCF-β1蛋白質的水平接近於30μg/24小時/10個細胞。本發明還描述了編碼指導在轉染哺乳細胞中合成和分泌TGF-β1的TGF-β1前體變異體的表達載體。
文檔編號C12N15/12GK1044125SQ8910544
公開日1990年7月25日 申請日期1989年12月16日 優先權日1988年12月16日
發明者安東尼·F·珀切爾, 拉裡·金特裡, 但尼爾·特沃茲克, 埃米·M·布尼納 申請人:安柯金兩合公司