香蕉束頂病毒中國漳州分離物基因組1和4的全序列的製作方法

2023-04-27 09:18:31

專利名稱：香蕉束頂病毒中國漳州分離物基因組1和4的全序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及香蕉束頂病毒(Banana Bunchy Top Virus，BBTV)基因組基因工程領域。具體地說，本發明涉及BBTV DNA 1和4的全序列；BBTV DNA1和4各開放閱讀框架其編碼的胺基酸的序列；BBTV DNA 1和4開放閱讀框架其編碼的胺基酸的正向和反向的核苷酸序列及其由此衍生的重組質粒或轉基因植物，以增強香蕉抗BBTV能力；BBTV DNA 1和4開放閱讀框架其編碼胺基酸的全部核苷酸序列或部分核苷酸序列及其互補序列，並用於BBTV的PCR診斷；BBTV DNA 1和4基因間區(非編碼區)的序列或互補序列有高達20％的變異度；含有BBTV DNA 1和4非編碼區核苷酸序列及其缺失核苷酸序列的重組質粒，並提供在目的基因上遊，以調節目的基因在轉基因的單子葉或雙子葉植物中的組成性或組織特異性的表達。
香蕉束頂病是香蕉病害中最為嚴重的一種，其症狀為葉片外緣黃化，葉脈、葉柄和假莖具墨綠色條紋，束頂及明顯矮化，嚴重時造成毀滅性災害，此病正在世界(包括中國)的香蕉種植區蔓延。Harding[1]和Thomas[2]等人1991年報導從感病香蕉組織中純化到18～20nm等軸球形病毒顆粒，其外殼蛋白分子量為20,100。Thomas[2]等人用蕉芽(Pentalonianigronervosa)成功地進行了此提純物的回接試驗，證明BBTV是引起香蕉束頂病的病原。Harding等人[3]1993年報導克隆了BBTV的一個基因組(BBTV DNA 1)，同時證明BBTV基因組是環狀單鏈DNA。基於存在一個dNTP-位點(GGEGKT)，推測主要閱讀框架可能編碼一個複製酶。然而並沒有找到能編碼外殼蛋白這樣大小的閱讀框架，估計BBTV基因組不止這一個組分。此後，Burns等人[4](1994)研究表明BBTV基因組至少含有5個或可能7個組分。Karan等人[5](1994)克隆了來自10個不同地域BBTV分離物的BBTV DNA 1，分析表明可分成兩個組，南太平洋組(澳大利亞、埃及、斐濟、印度等7個分離物)和亞洲組(菲律賓、中國臺灣和越南3個分離物)，平均序列差異每組內為1.9～3.0％，兩組之間大約10％，主要開放閱讀框架編碼的蛋白質差異大約為5.0％。Xie等人[6](1994)從夏威夷分離物克隆了BBTV DNA 1，2和5，序列分析表明均屬南太平洋組。Burns等人[7](1995)分析了BBTV DNA 1～6序列。Wanitchakorn等人[8](1997)確認BBTV DNA 3可編碼20kDa的外殼蛋白。Dugdale等人[9](1998)曾報導了BBTV DNA 1～6基因間區(非編碼區)在轉基因植物中具有不同的啟動子活性。肖火根等人[11]在1999年也報導了中國廣東分離物BBTV DNA 1全序列以及DNA 3和4編碼區的序列(屬亞洲組)。
澳大利亞昆士蘭大學(Queensland University)《BBTV DNA序列》專利(WO96/38564)曾報導BBTV DNA 3，4和6的序列、相應於開放閱讀框架的DNA和胺基酸序列。以及在《BBTV基因間區》專利(WO96/38554)中報導BBTV DNA 1～6元件基因間區一部分片段或衍生自所說的基因間區DNA分子或其互補序列有高達20％的變異度；含有上述DNA分子，能增強在單子葉和雙子葉植物細胞中表達目的基因。
而本發明具體涉及的中國漳州地區分離物BBTV DNA1和BBTV DNA4它們有別於已有報導。本發明在純化BBTV中國漳州分離物和研究其理化特性[10]基礎上參考亞洲組BBTV DNA 1編碼區序列[5]設計了兩個非相鄰的引物，以漳州地區具典型香蕉束頂病症狀的香蕉組織總DNA為模板，通過PCR擴增得到約500bp片段，構建了重組質粒pBV1-1/2，測序後序列分析確定是BBTV DNA 1的部分(半長)序列。按測知的半長序列設計了一對相鄰引物，以漳州地區感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板，經PCR擴增獲得約1kb片段，構建了重組質粒pBV1，測序表明漳州分離物BBTV DNA 1全長為1,104個核苷酸(已被GenBank/EMBL/DDBJ接收，Accession numberAF110266，將於1999年12月31日公開)。與澳大利亞、中國臺灣和廣東分離物BBTV DNA 1比較，其核苷酸序列同源性分別為89％、96％和95％；編碼區核苷酸序列同源性分別為91％、96％和95％；與澳大利亞分離物BBTVDNA 1比較其非編碼區的主要共同(CR-M)區序列同源性為69％。所以漳州分離物BBTV DNA 1應歸屬於亞洲組的新分離物。
按照漳州分離物BBTV DNA 1非編碼區的(CR-M)區序列設計了三對非相鄰的引物，以漳州分離物BBTV DNA為模板，進行PCR擴增。只有用其中一對非相鄰的引物擴增出約1kb的片段，重組質粒命名為pCM21，pCM22，在已測知序列編碼區又設計了一對相鄰引物，以漳州分離物BBTV DNA為模板，經PCR擴增得獲得約1kb片段，重組質粒命名為p400，p700，p160，測序表明漳州分離物BBTV DNA 4全長為1,039個核苷酸。序列分析指出與澳大利亞分離物BBTV DNA 4核苷酸序列同源性為79％。與澳大利亞和中國廣東分離物編碼區胺基酸序列同源性分別為81％和87％。其非編碼區的CR-M區與澳大利亞分離物BBTV DNA 4的CR-M區序列同源性為70％。因此漳州分離物BBTV DNA 4也應歸屬於亞洲組，而且是亞洲組內第一次報導BBTV DNA 4的全序列。
綜上所述，本發明與澳大利亞昆士蘭大學專利所涉及的BBTV DNA序列不屬於同一組，並且序列變異度超出20％。本發明提供了漳州分離物BBTVDNA 1和4的全序列；DNA 1由1,104nt組成(

圖1)；DNA 4由1,039nt組成(圖5)；兩個序列非編碼區的CR-M區同源性為82％；DNA 1有一個861核苷酸序列編碼286個胺基酸殘基組成的分子量為33kDa的蛋白質(含有dNTP-結合位點GGEKT(圖2)，推測可能編碼與BBTV複製有關的蛋白質)和129核苷酸序列編碼42個胺基酸殘基組成的分子量為5kDa的小蛋白質；DNA 4有一個351核苷酸序列編碼116個胺基酸殘基組成的分子量為15.5kDa的蛋白質，其N末端含有大約30個疏水性胺基酸殘基(圖6)，推測可能編碼一個運動蛋白質；本發明還包括漳州分離物BBTV DNA 1和4基因間區(非編碼區)的序列或互補序列並有高達20％的變異度。
圖1BBTV漳州分離物DNA 1的全長核苷酸序列。劃虛線的部分核苷酸為CR-M區圖2BBTV漳州分離物DNA 1開放閱讀框架編碼33kDa大蛋白的胺基酸序列。
圖3CTAB法提取的香蕉病株和健康株組織的總DNA的PCR結果比較11kb DNA Lader2以健康香蕉組織的總DNA為模板的PCR；3作1103稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR4作1104稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR
5作1105稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR6作1106稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR7作1107稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR圖4含BBTV漳州分離物DNA 1編碼區重組質粒構建模式圖。
圖5BBTV漳州分離物DNA 4的全長核苷酸序列。
圖6BBTV漳州分離物DNA 4開放閱讀框架編碼15.5kDa蛋白的胺基酸序列。
圖7BBTV漳州分離物DNA 4非編碼區核苷酸序列。
圖8BBTV漳州分離物DNA 4非編碼區部分缺失核苷酸序列1圖9BBTV漳州分離物DNA 4非編碼區部分缺失核苷酸序列2圖10含漳州分離物DNA 4表達編碼區基因的雙元載體的構建模圖。
引物A5』-CTCCATGGCGCGATATGTGGT-3』Nco I引物B5』-CTGCAGACCCAAATA/TATG/TCTTCGAT-3』Pst I引物C5』-CAGGCGCACACCTTGAGAAACG-3』引物D5』-GGAAGAAGCCTCTCATCTGCTTC-3』1.2 pBluescript II SK T-載體的製備取3μg pBluscript II SK質粒，在100μl體系中用0.5μl EcoR V(10u/μl)37℃酶切反應1h，取2μl電泳檢查。酚∶氯仿∶異戊醇混合溶液(25∶24∶1)抽提上述溶液並用乙醇沉澱、70％乙醇洗滌。此酶切載體在100μl PCR擴增體系(含10u/μlTaq0.5μl、2mmol/L dTTP)中，72℃反應2h，對此反應液進行酚抽提純化並在50μl連接反應體系(含10u/μlT4DNA連接酶2μl)中，16℃反應12h後電泳回收約3kb DNA片段。1.3 感染BBTV香蕉組織總DNA的提取從-70℃冰箱中取出經液氮研磨好的來自漳州的感染BBTV香蕉組織50mg，加入300μl CTAB提取緩衝液(100mmol/L Tris，pH8.0、1.4mol/LNaCl、20mmol/L EDTA、2％ CTAB)，65℃溫浴30min。加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液，顛倒混勻，12000r/min離心5min，取上清液並加入等體積4℃預冷的氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液，顛倒混勻，12000r/min離心5min，向回收的上清溶液中加入預冷的等體積異丙醇或兩倍體積的無水乙醇，12000r/min 離心5min，再用70％乙醇洗滌一次，乙醇揮發乾後加入50μl滅菌去離子水，取5μl電泳檢查。1.4 BBTV DNA 1的半長克隆的構建PCR擴增體系中，每種dNTP為2mmol/L，兩個半長克隆的引物A、B分別是0.4μmol/L，Taq plus II 0.03u/μl，DNA模板1％(V/V)。PCR擴增條件是94℃預變性4min；94℃ 1min，51℃ 1min，72℃ 30s，循環30次；72℃ 10min。
PCR擴增產物(500多bp的片段)經純化回收後，與pBluscript II SKT-載體以8∶1的摩爾數比在16℃下進行連接反應8h後，取0.5μl電擊轉化感受態細胞E.coliJM109後，塗於含X-Gal和IPTG的氨苄青黴素(50μg/μl)LB固體培養基上，37℃培養8h，挑選白色菌落，提取質粒後用EcoR I和Hind III酶切後電泳分析，選出陽性重組質粒pBV1-1/2。1.5 BBTV DNA 1的全長克隆的構建PCR擴增體系與以上類同，引物C與引物D代替引物A與引物B。PCR擴增條件是94℃預變性4min；94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 30s，循環30次；72℃ 10min。引物C、D的PCR擴增產物(1,104kb片段)克隆方法如1.4。通過EcoR I和Hind III雙酶切分析，選出陽性重組質粒pBV1。1.6漳州分離物BBTV DNA 1編碼大蛋白質的開放閱讀框架克隆的構建PCR擴增體系中，每種dNTP為2mmol/L，兩個引物A、E分別是0.4μmol/L，Taq plus II 0.03u/μl，感病香蕉組織總DNA為1％(V/V)。PCR條件是94℃預變性4min；94℃ 1min，51℃ 1min，72℃ 1min，循環30次；72℃ 10min。
PCR擴增產物(500多bp的片段)經純化回收後，經Klenow補平後，再用EcoR I酶切並回收大片段。pBluscript II SK經Smal I和EcoR I雙酶切後，回收大片段。回收後的兩個片段在16℃下進行連接反應8h後，取0.5μl電擊轉化感受態細胞E.coliJM109後，塗於含X-Gal和IPTG的氨苄青黴素(50μg/μl)LB固體培養基上，37℃培養8h，挑選白色菌落，提取質粒後用EcoR I和HindIII酶切後電泳分析，選出陽性重組質粒pBtvorf1(圖4)。
PCR擴增條件為(1)94℃ 4min。(2)94℃ 50s，63℃ 50s，72℃ 1min。總共35個循環。(3)72℃ 10min。
PCR擴增體系如下每種引物濃度為10pmol，dNTPs為200μmol/L，Taq plus II為1u，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，0.1％ Triton X-100， BBTV DNA為1μl，反應體積為50μl。
只有用引物1和引物2這對引物才擴增出約1kb的片段。為了保證擴增特異性，採用了較高的退火溫度(63℃)，同時調節了引物濃度，以及BBTV DNA的量。從瓊脂糖凝膠中回收並純化約1kb大小的PCR擴增產物，然後用Klenow酶補平其兩端，同時純化經EcoR V酶切的pBluescriptII-KS載體。將上述兩片段在16℃的溫度下連接12-16h，並轉化採用CaCl2法製備的感受態細胞DH5α。將轉化細胞塗布於塗有40μl X-gal(20mg/ml)，4μl IPTG(200mg/ml)的氨苄青黴素(60μg/ml)的LB固體培養基上，然後在37℃溫箱中培養12-16h。挑選白色菌落在上述LB固體培養基上劃線繼續培養12-16h，之後轉移到含氨苄青黴(60μg/ml)的LB液體培養基中繼續培養12-16h。採用煮沸法或者鹼法提取質粒。能用雙酶(Kpn I，EcoRI)切出，同時PCR也能擴增出約1kb大小片段的質粒的克隆為陽性克隆。通過這種方法檢測得到了二個陽性克隆pCM21和pCM22。通過手工測序和機器測序並進行序列分析，得知這二個陽性克隆的序列完全一致，而且其序列與澳大利亞分離物BBTV DNA 4具有同源性。3.4 漳州分離物BBTV DNA 4全長克隆的構建引物設計根據上述所得到的BBTV DNA 4非全長克隆編碼區序列又設計了如下一對相鄰外向引物Primer 5GAGGTATTGTGGAAGAGPrimer 6TGACGAGCTCTGCATCTPCR擴增條件為(1)94℃ 4min(2)94℃ 1min，63℃ 1min，72℃ 1min。總共35個循環。(3)72℃ 10min。
PCR擴增體系如下每種引物濃度為10pmol，dNTPS為200μmol/L，Taqplus II為1u，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，0.1％ Triton X-100，BBTV DNA為1μl，反應體積為50μl。
按3.3方法構建漳州分離物BBTV DNA 4全長克隆，獲得三個陽性克隆P400、P700和P160。測序結果表明這三個陽性克隆的序列完全一致，其序列全長為1,039nt。與澳大利亞分離物BBTV DNA 4序列同源性為79％，就其非編碼區的主要共同(CR-M)區序列同源性為70％。漳州分離物BBTV DNA4應歸屬於亞洲組。而且是亞洲組內第一次報導BBTV DNA 4的全序列。從推導胺基酸序列得知中國漳州地區BBTV DNA4的N端有一段約由30個疏水性胺基酸組成的β摺疊區，所以BBTV基因組4的開放閱讀框架很可能編碼BBTV的運動蛋白。3.5 漳州分離物BBTV DNA 4編碼區正向序列的克隆的構建引物設計及PCR反應根據已克隆的漳州分離物BBTV DNA 4全序列，在編碼區5』端和3』端分別設計了兩對引物。其中Primer PB和PrimerPS是一對引物，Primer NB和Primer NS是一對引物。Primer PBCGGGATCCAACCATGGCATTGACAACAGAGCPrimer PSCGCGTCGACGTATTAAAACATAGGGCCGPrimer NBCGGGATCCGTATTAAAACATAGGGCCGPrimer NSCGCGTCGACATGGCATTGACAACAGAGCPCR擴增條件為(1)94℃，4min。(2)94℃ 30s，63℃ 30s，72℃30s，總共35個循環。(3)72℃，10min。
PCR擴增體系如下每種引物濃度為10pmol，dNTPS為200μmol/L，Taq plus I為1u，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，0.1％Triton X-100，p400質粒DNA為1μl，反應體積為50μl。
從Primer PB和Primer PS的PCR擴增產物中回收並純化約351bp大小的片段，然後用BamH I和Sal I雙酶切其兩端，同時純化經BamH I和Sal I雙酶切的pBluescript II-KS載體。將上述兩片段在16℃的溫度下連接12-16h，並轉化用CaCl2法製備的感受態細胞DH5α。將轉化細胞塗布於塗有40ul X-gal(20mg/ml)，4μl IPTG(200mg/ml)的氨苄青黴素(60μg/ml)的LB固體培養基上，然後在37℃溫箱中培養12-16h。挑選白色菌落在上述LB固體培養基上劃線繼續培養12-16h。之後轉移到含氨苄青黴素(60μg/ml)的LB液體培養基中繼續培養12-16h。採用煮浮法或者鹼法提質粒。能用雙酶(BamH I和Sal I)切出，同時PCR也可擴增出約350bp大小的片段的質粒的克隆為陽性克隆。通過這種方法檢測得到的陽性克隆為P14。然後採用USB公司的測序試劑盒對這兩個陽性克隆進行手工測序，並進行測序分析。測序分析表明P14中編碼區序列與P400中編碼區序列列完全一致，其序列全長為351nt。推導的N端胺基酸序列有一段約由30個疏水性胺基酸組成的β摺疊區，所以BBTV DNA 4很可能編碼BBTV的運動蛋白。3.6 漳州分離物BBTV DNA 4編碼區反向序列的克隆的構建從Primer NB和Primer NS的PCR擴增產物中回收並純化約351bp大小的片段，並採用3.5的方法得到了陽性克隆N17。測序分析表明N17中編碼區反向克隆序列與P400中編碼區反向序列列完全一致，其序列全長為351nt。
PCR擴增體系如下引物濃度為10pmol，dNTPs為2mmol/L，Taq plusI為1u，p400質粒DNA為1μl，反應體積為50μl。
從採用Primer PRP，Primer PRP41S的PCR擴增產物中回收並純化約688bp大小的片段，然後用BamH I和EcoR I雙酶切其兩端，同時純化經BamH I和EcoRI雙切的pBluescript II-KS載體。將上述兩片段在16℃的溫度下連接12-16h，並轉化用CaCl2法製備的感受態細胞DH5α。將轉化細胞塗布於塗有40μl X-gal(20mg/ml)，4ul IPTG(200mg/ml)的氨苄青黴素(60μg/ml)的LB固體培養基上，然後在37℃溫箱中培養12-16h。挑選白色菌落在上述LB固體培養基上劃線繼續培養12-16h。之後轉移到含氨苄青黴素(60μg/ml)的LB液體培養基中繼續培養12-16h。採用煮沸法或者鹼法提取質粒。能用雙酶(BamH I和EcoR I)切出，同時PCR也可擴增出約688bp大小的片段的質粒的克隆為陽性克隆。通過這種方法檢測得到的陽性克隆為PP400。然後採用USB公司的測序試劑盒對這兩個陽性克隆進行手工測序，並進行測序分析。測序分析表明PP400中克隆序列與P400中非編碼區序列列完全一致，其序列全長為688nt。5.2 非編碼區第一個缺失改造克隆的構建引物設計Primer PRP41PGGAATTCTGTACGGGAAAGTGATCPrimer PRP41SCGGGATCCATGGTTCACTGCCTCTTATTTPCR擴增條件為(1)94℃ 4min。(2)94℃ 30s，63℃ 30s，72℃30s。總共35個循環。(3)72℃ 10min。PCR擴增體系同7.1。
從採用Primer PRP41P，PrimerPRP41S的PCR擴增產物中回收並純化約351bp大小的片段，並採用5.1的方法得到了陽性克隆PRP413。測序分析表明PRP413中克隆序列與P400中非編碼區3′端部分序列完全一致，其序列全長為351nt。5.3 非編碼區第二個缺失改造克隆的構建引物Primer PRP42PGGAATTCCATCACGTGCAACTAACPrimer PRP41SCGGGATCCATGGTTCACTGCCTCTTATTTPCR擴增條件為(1)94℃，4min(2)94℃，25s，63℃，25s，72℃，25s。總共35個循環。(3)72℃，10min。PCR擴增體系同7.1。
從採用Primer PRP42P，PrimerPRP41S的PCR擴增產物中回收並純化約240bp大小的片段，並採用5.1的方法得到了陽性克隆PRP422。測序分析表明PRP422中克隆序列與P400中非編碼區3′端部分序列列完全一致，其序列全長為240nt。
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1.一種香蕉束頂病毒(Banana Bunchy Top Virus，BBTV)中國漳州分離物基因組1的開放閱讀框架，其特徵在於長度為具有861核苷酸，其編碼33kDa蛋白質的胺基酸序列為M A R Y V V C W M F T I N N P A S L P V M R D E I K Y M V Y Q V E34R G Q E G T R H V Q G Y V E M K R R S S L K Q M R G F F P G A H L67E K R K G S Q E E A R A Y C M K E D T R I E G P F E F G A F K L S100C N D N L F D V I Q D M R E A H K R P L E Y L Y D C P N T F D R S133K D T L Y R V Q A E L N K T K A M N S W K T S F N A W T S E V E N166I M A E P C Y R S I I W V Y G P N E G E G K P T Y A K Y L M K P K199N A F Y S P G G K S L D I C R L Y N Y E D I V I F D I P R C K E E232Y L N Y G L L E E F K N G I I Q S G K Y E P V L K I V E Y V E V R265L M A N F L P K E G I F S E D R I K L V A C和長度為具有129核苷酸，其編碼5kDa小蛋白質的胺基酸序列為M I I Y L M S Y R I C V K L I N G L W N I Y M I V R I P S T E V R34I H Y T E C K Q S
2.根據權利要求1所述的BBTV中國漳州分離物基因組1的編碼33kDa蛋白質的胺基酸其核苷酸序列為ATGGCGCGAT ATGTGGTATG CTGGATGTTC ACCATCAACA ATCCCGCTTC GCTACCAGTG61ATGCGGGATG AGATTAAATA TATGGTATAT CAAGTGGAGA GGGGACAGGA GGGTACTCGT121CATGTGCAAG GATACGTCGA GATGAAGAGA CGAAGCTCTC TGAAGCACAT GAGAGGCTTC181TTCCCAGGCG CACACCTTGA GAAACGAAAG GGGAGCCAAG AGAGAGCACG GGCTTACTGT241ATGAAGGAAG ATACAAGAAT CGAAGGTCCC TTCGAGTTTG GTGCATTTAA ATTGTCATGT301AATGATAATT TATTTGATGT CATACTGGAT ATGCGTGAAG CTCATAAACG GCCTCTGGAA361TATTTATATG ATTGTCCGAA TACCTTCCAC AGAAGTAAGG ATACATTATA CAGAGTGCAA421GCAGAGCTGA ATAAAACGAA GGCGATGAAT AGCTGGAAGA CATCCTTCAA TGCATGGACA481TCTGAAGTAG AAAATATTAT GGCGGAGCCA TGTTATCGAA GCATTATTTG GGTCTATGGC541CCAAATGAAG GTGAAGGAAA GCCAACCTAT GCAAAATATT TAATGAAGCC TAAGAATGCG601TTTTATTCGC CAGGAGGAAA ATCATTGGAT ATATGTAGAT TGTATAATTA TGAGGATATA661GTTATATTTG ATATTCCCAG ATGCAAGGAG GAATATTTAA ACTATGGTTT ATTAGAAGAA721TTTAAAAATG GAATTATTCA AAGCGGGAAA TATGAACCCG TTTTGAAAAT TGTAGAATAT781GTGGAAGTCA GGCTAATGGC TAACTTCCTT CCGAAGGAAG GAATCTTTTC TGAAGATCGA841ATAAAGCTAG TTGCTTGCTG A和編碼5kDa小蛋白質胺基酸其核苷酸序列為ATGATAATTT ATTTGATGTC ATACTGGATA TGCGTGAAGC TCATAAACGG CCTCTGGAAT61ATTTATATGA TTGTCCGAAT ACCTTCCACA GAAGTAAGGA TACATTATAC AGAGTGCAAG121CAGAGCTGA
3.一種BBTV中國漳州分離物基因組4的開放閱讀框架，其特徵在於長度為具有351核苷酸，其編碼15.5kDa蛋白質的胺基酸序列為M A L T T E R V K L F F E W F L F I G A I F I A I T I L Y I L L A34L L F E V P K Y I K E V V K Y L V E Y M T R R R V W M Q K T Q L T67E A T G D A E L V R G I V E E R R D Q Q A A I I P Q A S H V N P S100Q A R R D D Q G R R G N I G P M F
4.根據權利要求3所述的BBTV中國漳州分離物基因組4的編碼15.5kDa蛋白質的胺基酸其核苷酸序列為ATGGCATTGA CAACAGAGCG GGTGAAACTA TTCTTCGAAT GGTTTCTGTT TATTGGAGCA61ATATTCATTG CGATAACAAT ATTATATATA TTGTTGGCAT TGCTCTTTGA GGTTCCCAAG121TATATTAAGG AGGTTGTGAA GTATCTCGTA GAATACATGA CCAGACGACG TGTATGGATG181CAGAAAACGC AGTTGACGGA GGCAACCGGA GATGCAGAGC TCGTCAGAGG TATTGTGGAA241GAGAGACGCG ATCAACAAGC GGCTATCATA CCACAGGCAA GTCATGTTAA CCCTTCTCAA301GCAAGAAGGG ATGACCAAGG AAGACGAGGA AACATCGGCC CTATGTTTTA A
5.一個在權利要求2和4中所要求的核苷酸序列或部分核苷酸序列或其互補序列，並可以應用於BBTV的PCR診斷。
6.一組重組質粒，它含有在權利要求2和4中所要求的核苷酸序列及其反向核苷酸序列，並可以應用於培育抗BBTV轉基因香蕉植株。
7.一種BBTV中國漳州分離物基因組1基因間區(非編碼區)，其特徵在於其核苷酸序列為ACACGCTATG ACAATCGTAC GATATGACAA AAGGGGAAAA GCAAAGATTC GGGGGAAGAT61TGTGCTATCC TAACGATTAA GGGCCGCAGG CCCGTCAAGA TGGACGACGC GATCATATGT121CCCTAGTTAG TGCGCCACGT AAGCGCTGGG GCTTATTATT ACCCCCAGCG CTCGGGACGG181GACATTTGCA TCTATAAATA GACCTTCCCC CGCTCCACTA CAAGATCATC ATCGACGACA240GAA
8.一種BBTV中國漳州分離物基因組4基因間區(非編碼區)，其特徵在於其核苷酸序列為TACACTGTAT TATAATATAC GAGAATATAA ATGGATAAGG ATATTTACTG CAAACATATA61TAAGCGAAAA TAATATATGT TGTAAAAGAA ACATATTGTA ATATGTGANT TGTATACGAG121TGTTGTATTT ATAAACTATA CAACACGCTA TGACAAACGG GGAAAAATGA AGAATCGGGG181GTTGATTGGT CTATCGTATC GCTTAAGGGC CGCAGGCCCG TTGAAATGAT TCTTTATTAA241ACAAATATAC ATGATATGGA TAGTTGAATA TATAAACAAC TATGTATAAA TACAACAGAA301TGTTGTAAAC AATAAAATAA TGAGAAGATA AGTATATTTG TACGGGAAAG TGATCACACC361CACCACTTTA GTGGTGGGTC ATATGTCCCG AGTTAGTGCG CCACGTAAGC GCTGGGGCTT421ATTATTACCC CCAGCGCTCG GGACGGGACA TCACGTGCAA CTAACAAATG CACGTGACTG481ATATGTATGA TATAACGGTT CAATGAACCG GTATGTGAAG TTGTAACGAA ACGTCACGTA541TGAAAGAGAC ATAAACGTGA CGTAGTCAAA TGTATTGAAT AAACATTTGA CGTCCGGTAG601CTTCCGAAGG AAGCCATGAT TGCTTCGAGG CGAAGCAAAA CATTTATATA TTGGCCTGAA661CTGCTGCCTA TAAATAAGAG GCAGTGAA
9.一個在權利要求7和8中所要求的核苷酸序列或其缺失核苷酸序列或基本互補的序列有高達20％的變異度。
10.一組重組質粒，它含有在權利要求7和8中所要求的核苷酸序列或其缺失核苷酸序列及其互補核苷酸序列，提供其在一個目的基因上遊可能調節目的基因的轉錄，並在單子葉或雙子葉植物中組成性或組織特異性的表達。
全文摘要
本發明涉及中國漳州分離物BBTV基因組1和4的全序列及各開放閱讀框架其編碼的胺基酸的序列;編碼胺基酸的正向和反向的核苷酸序列及其由此衍生的重組質粒或轉基因植物,以增強香蕉抗BBTV能力;編碼胺基酸的全部或部分核苷酸序列及其互補序列,用於BBTV的PCR診斷;BBTVDNA1和4基因間區核苷酸序列及其缺失序列的重組質粒,以提供在目的基因上遊調節目的的基因在轉基因的單子葉或雙子葉植物中的組成性或組織特異性的表達。
文檔編號C12Q1/70GK1285406SQ99111668
公開日2001年2月28日 申請日期1999年8月20日 優先權日1999年8月20日
發明者蔡文啟, 孫德俊, 臘平 申請人:中國科學院微生物研究所