重組抗體及組合物及其製備和使用方法

2023-04-27 23:03:26 3

專利名稱：重組抗體及組合物及其製備和使用方法
技術領域：
本發明涉及抗體，包括人狂犬病毒中和抗體的核酸和胺基酸序列，以及使用重組表達載體對其進行的製備。更具體地，本發明涉及針對狂犬病毒的抗體混合物的應用，該混合物可在受試者暴露於狂犬病毒後用於預防治療。
背景技術：
狂犬病是由於中樞神經系統受到狂犬病毒的感染而引起的急性神經性疾病，狂犬病毒是棒狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)中的病毒。在於病毒的古老以及疾病的可怕性而具有重要歷史意義的狂犬病毒一直是人類和動物感染的重要威脅，因為其在各種野生動物中存在著廣泛的宿主。在世界的大部分地區，狂犬病毒在地區物種中是地方病，而不同地區的病毒變異體之間相似性很小。雖然在包括聯合王國，澳大利亞，日本，以及各個島嶼上沒有地方性狂犬病，英國和澳大利亞也已發現了狂犬病和蝙蝠相關的狂犬相關病毒。
儘管抗體能夠提供即時免疫，被動免疫已被廣泛地用於治療傳染性疾病，包括狂犬病(Casadeval，A.，Emerg.Infect.Dis.2002，8833-41)。根據世界衛生組織(WHO)指導方針，3類狂犬病的暴露需要狂犬病暴露後預防(PEP)，這些暴露被定義為或單次或多次經皮咬傷或黏膜被患有狂犬病動物的唾液汙染(Human rabiesprevention-United States，2000Recommendations of the AdvisoryCommittee on Immunization Practices.MMWR 2000)。狂犬病的暴露後預防包括疫苗和抗狂犬病免疫球蛋白(RIG)的給藥。目前，從狂犬病毒免疫的人(人RIG[HRIG])或狂犬病毒免疫的馬(馬RIG[ERIG])的血清樣品中製備用於暴露後預防的RIG。由於與ERIG的使用相關的潛在不良效應(例如過敏性休克)，在美國僅使用HRIG，暴露於狂犬病動物的人(每年～39,000人)接受HRIG和狂犬病毒(RV)疫苗的治療(Human rabies prevention-United States，2000Recommendations ofthe Advisory Committee on Immunization Practices.MMWR 2000)。然而，在發展中國家，因為沒有足夠量的可供使用的HRIG和ERIG或因為它們，特別是HRIG，過於昂貴，所有PEP中＜1％包括了RIG的給藥(Human rabies prevention-United States，1999Recommendations of theAdvisory Committee on Immunization Practices(ACIP).MMWR Recomm.Rep.1999，481-21)。此外，一些動物保護團體對於飼養動物用於血清製備的行為進行了聲討(Human rabies prevention-United States，1999Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices(ACIP).MMWR Recomm.Rep.1999 481-21)。另外，由已知或未知病原體造成HRIG汙染的可能性是管理機構關心的問題。通過製備人RV-中和單克隆抗體(MAbs)可以克服經濟有效而安全的RIG在全球有限的供應，該抗體可被用於與生物反應器技術結合的高產表達系統(例如使用transfectomas的系統)。
一旦個體暴露於狂犬病毒，可以通過合適的治療包括被動和主動免疫，容易地防止疾病(Human rabies prevention-United States，2000Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.MMWR 2000)。人們相信抗體的被動給藥對於在進入位點中和病毒以及幹擾病毒向中樞神經系統(CNS)的擴散很重要(Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，897252-6)。這兩種作用很可能為發展對病毒的主動免疫提供時間，該免疫最終清除病毒。
RV-中和鼠或人單克隆抗體(MAbs)的給藥在鼠的暴露後預防中顯得很有效(WHO consultation on a monoclonal antibody cocktail forrabies post exposure treatment，WHO，2002年5月23-24日；Schumacher等，J.Clin.Invest.1989 84971-5；Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90)。隨著人單克隆抗體製備技術的進步，考慮在人體中使用鼠單克隆抗體可能是不必要的。在人體中使用鼠單克隆抗體可能帶來問題，因為它們對於人而言是是免疫原性的且其半衰期是有限的，可能造成血清病或過敏性休克。此外，人單克隆抗體和Fc受體之間的相互作用和相應的鼠試劑之間的作用相比可能是更合適的。
目前，使用從混合人血清或從免疫的馬中製備的抗體治療受試者。但是，這些試劑中沒有任何試劑是可以輕易獲得、完全安全或生物活性穩定的。
對於暴露於狂犬病毒的個體的暴露後預防治療需要新的方法。同樣需要新的方法治療存在暴露於狂犬病毒的風險的受試者。本發明滿足了這些需要。

發明內容
本發明為狂犬病的治療和預防提供了狂犬病毒中和抗體的混合物。本發明還提供了含有編碼抗狂犬病抗體的核酸的重組棒狀病毒表達系統以及這些抗體的組合物和在哺乳動物細胞內製備這些抗體的方法。
在此提供的重組狂犬病毒中和人抗體包括人抗體SOJA、SOJB和SO57。這三個抗體也分別被稱作MAb JA、MAb JB.1和MAb 57。
本發明因此提供了包含一種藥學上可接受的載體和至少兩種狂犬病毒中和人抗體的藥物組合物，其中至少兩種抗體中的至少一種選自a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQ IDNO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQ IDNO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQ IDNO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
本發明提供了對需要治療的受試者治療或預防狂犬病毒感染的方法。該方法包括對受試者以至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體的有效量給藥，其中抗體選自a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQ IDNO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQ IDNO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQ IDNO9成分同源的序列的抗體重鏈的抗體。
在一個具體實施方案中，至少兩種，更優選三種抗體選自前述組。
在一個具體實施方案中，用至少三種不同的重組狂犬病毒中和人抗體進行給藥。
在一個具體實施方案中，抗體以至少兩種不同組合物的方式分別給藥。
在一個具體實施方案中，重組狂犬病毒中和人抗體對至少兩種或多種狂犬病毒呈現中和活性。
在本發明的一個方面中，不同的重組狂犬病毒中和人抗體以大約等摩爾濃度給藥。
在一個具體實施方案中，用重組狂犬病毒中和人抗體給藥，其中各重組狂犬病毒中和人抗體以與給藥的其它重組狂犬病毒中和人抗體大約相等的蛋白量給藥。一方面，重組狂犬病毒中和人抗體的給藥量在大約0.001mg/kg體重至大約100mg/kg體重之間。在本發明的另一方面中，重組狂犬病毒中和人抗體的給藥量在大約0.01mg/kg體重至大約60mg/kg體重之間。
在另一個具體實施方案中，重組狂犬病毒中和人抗體的給藥量基於重組狂犬病毒中和人抗體混合物的狂犬病毒中和活性。一方面，混合物活性在大約1IU/kg體重至大約50IU/kg體重之間。
在一個具體實施方案中，本發明提供了通過重組狂犬病毒中和抗體混合物給藥對受試者進行治療的方法，其中受治療的病毒為一種狂犬病毒街毒。在一些具體實施方案中，病毒選自銀毛蝠狂犬病毒、土狼狂犬病毒街毒/墨西哥狗狂犬病毒和狗狂犬病毒。
在另一個具體實施方案中，本發明提供了通過重組狂犬病毒中和抗體混合物的給藥對受試者進行治療的方法，其中受治療的病毒是狂犬病毒固定毒。
接受治療的受試者優選是人。
在一個具體實施方案中，本發明提供了重組棒狀病毒表達載體，包含編碼皰疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列，且進一步包含含有編碼重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈和抗體重鏈的核酸序列的核酸。在另一個具體實施方案中，核酸序列編碼狂犬病毒中和人抗體的輕鏈而不是重鏈。在另一個具體實施方案中，核酸序列編碼狂犬病毒中和人抗體的重鏈而不是輕鏈。一方面，抗體是SOJA單克隆抗體。另一方面，抗體是SOJB單克隆抗體。再一方面，抗體是SO57單克隆抗體。一方面，核酸只編碼抗體輕鏈。另一方面，核酸僅編碼抗體重鏈。
在本發明的實踐中，提供了包含本發明重組棒狀病毒表達載體的哺乳動物宿主細胞。在本發明的一個具體實施方案中，哺乳動物宿主細胞是BSR細胞、幼倉鼠腎細胞、VERO細胞、或中國倉鼠卵巢細胞。
本發明還提供了使用本發明的重組棒狀病毒表達載體在哺乳動物宿主細胞中製備重組狂犬病毒中和人抗體的方法。本方法包括用本發明的重組棒狀病毒表達載體感染哺乳動物細胞，該載體包含含有編碼重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈和抗體重鏈的核酸序列的核酸，以及在允許抗體表達的條件下培養哺乳動物細胞。一方面，抗體是SOJA單克隆抗體。另一方面，抗體是SOJB單克隆抗體。再一方面，抗體是SO57單克隆抗體。一方面，核酸僅編碼抗體輕鏈。另一方面，核酸僅編碼重鏈。
在本發明的一個具體實施方案中，製備重組狂犬病毒中和人抗體的哺乳動物細胞是BSR細胞、幼倉鼠腎細胞、VERO細胞、或中國倉鼠卵巢細胞。
縮寫和簡寫形式在本說明書中使用以下縮寫和簡寫形式。
「BHK」指幼倉鼠腎。
「BSR」指BHK細胞亞克隆。
「CHO」指中國倉鼠卵巢。
「CNS」指中樞神經系統。
「COSRV」指犬類狂犬病毒變體。
「CVS」指標準攻擊毒株(challenge-virrus standard)。
「DRV-4」指狗狂犬病毒4。
「EBV-2」指歐洲蝙蝠病毒2。
「ED50」指50％受治療動物被保護的有效量。
「ERIG」指馬狂犬病免疫球蛋白。
「G」指糖蛋白。
「GSP」指基因特異性啟動子。
「HRIG」指人狂犬病免疫球蛋白。
「huMAb」指人單克隆抗體。
「Ig H」指免疫球蛋白重鏈。
「Lg L」指免疫球蛋白輕鏈。
「IU」指國際單位。
「MAb」指單克隆抗體。
「MIC LD50」指殺死50％的顱內受感染小鼠的病毒劑量，即，小鼠顱內LD50。
「MOI」指感染的多重性。
「PCR」指聚合酶鏈式反應。
「PEP」指暴露後預防。
「RIG」指狂犬病免疫球蛋白。
「rhuMAb」指重組人單克隆抗體。
「RhV」指棒狀病毒載體。
「RV」指狂犬病毒。
「SHBRV」指銀毛蝠狂犬病毒。
「VNA」指病毒中和抗體。
「VSV」指皰疹性口炎病毒。
「WHO」指世界衛生組織。
定義本申請中使用的定義以說明為目的不對本發明的範圍進行限制。
在此使用的冠詞「一」指該冠詞的一或多於一個(即至少一個)的語法賓語。舉例來說，「一種成分」指一種或多於一種成分。
在此使用的各「胺基酸」由其全稱表示、通過其相應的三字母代碼表示、或由其相應的單字母代碼表示，如下表所示

在此使用的表達「胺基酸」包括天然的和合成的胺基酸，以及D型和L型胺基酸。「標準胺基酸」指在天然生成的肽中經常發現的20種L-胺基酸中的任何一種。「非標準胺基酸」指除了標準胺基酸之外的任何胺基酸，無論其是通過合成製備的還是從天然來源衍生出來的。在此使用的「合成胺基酸」也包括化學修飾的胺基酸，包括但不限於鹽、胺基酸衍生物(例如醯胺)以及取代物。本發明的肽所包含的胺基酸，特別是位於羧基末端或氨基末端的胺基酸，可通過甲基化、醯胺化、乙醯化或由能夠改變肽的循環半衰期而對肽活性不發生負面影響的其它化學基團取代而進行修飾。此外，在本發明的肽中可以出現或不出現二硫鍵。
術語「胺基酸」可與「胺基酸殘基」交替使用，可指代游離胺基酸和肽的胺基酸殘基。從使用該術語的上下文可以明顯看出該術語指游離胺基酸或肽的殘基。
胺基酸具有以下普遍的結構 根據側鏈R可將胺基酸分為七類(1)脂肪族側鏈，(2)含有羥基(OH)的側鏈，(3)含有硫原子的側鏈，(4)含有酸性或醯胺基團的側鏈，(5)含有鹼性基團的側鏈，(6)含有芳香環的側鏈，以及(7)脯氨酸，其側鏈與氨基基團結合的亞胺基酸。
用於描述本發明的肽化合物的命名法沿襲傳統習慣，其中氨基基團和羧基基團分別位於各胺基酸殘基的左邊和右邊。在表示所選的本發明特定具體實施方案的結構式中，儘管沒有特別表示，除非特別說明，應當明白氨基和羧基末端基團以其在生理pH值呈現的形式存在。
在此使用的「抗體」，包括多克隆和單克隆抗體；重組抗體；以及嵌合、單鏈、人源化抗體，以及人抗體。「抗體」不僅包括完整的抗原結合免疫球蛋白分子，還包括其與抗原結合的片段，如Fv、Fab、Fab』以及F(ab』)2片段、單鏈Fv或免疫球蛋白表達文庫的產物。
在此使用的「抗體重鏈」指存在於所有抗體分子中的兩類多肽鏈中較大的一類。
在此使用的「抗體輕鏈」指存在於所有抗體分子中的兩類多肽鏈中較小的一類。
在此使用的關於狂犬病毒中和重組抗體的「生物活性」指用作狂犬病毒活性中和劑的能力。
在此使用的狂犬病毒中和抗體的「有效量」或「治療有效量」是在暴露於狂犬病的受試者體內足以抑制狂犬病毒感染進程的量或在有暴露於狂犬病風險的受試者體內足以預防狂犬病毒進程的量。
使用的關於狂犬病毒中和抗體mRNA的術語「表達」指狂犬病毒中和重鏈或輕鏈核酸序列的轉錄，造成狂犬病毒中和抗體mRNA的合成。使用的關於狂犬病毒中和抗體的「表達」指狂犬病毒中和抗體mRNA的翻譯，造成狂犬病毒中和抗體的合成。
在此使用的「同源」指兩個聚合分子之間的亞單元序列相似性，例如在兩個核酸分子如兩個DNA分子或兩個RNA分子之間，或在兩個多肽分子之間。當兩分子中的亞單元位點被相同的單體亞單元佔據，例如兩DNA分子中的位置均被腺嘌呤佔據，在該位點它們就是同源的。兩序列間的同源性是匹配或同源位點數目的直接函數；例如如果兩序列中一半的位點(例如，長度為10個亞單元的聚合物中的5個位點)是同源的，兩序列為50％同源的；如果90％的位點(例如10個中的9個)是匹配或同源的，兩序列為90％同源的。舉例來說，DNA序列3』ATTGCC 5』和3』TATGGC 5』為50％同源的。
在此使用的核酸分子的「亞單元」是核苷酸，多肽的「亞單元」是胺基酸。
在此使用的「同源性」與「等同性」同義。
在此使用的術語「抑制」指相對於對照值以至少10％的比例抑制或阻斷活性或功能。優選地，活性與對照值相比被抑制或阻斷50％，更優選地為75％，甚至更優選地為95％。
「分離的」指通過人的行為從天然狀態改變的或離開的。例如，天然存在於活體動物內的核酸或肽不是「分離的」，但從其天然狀態的共存材料中部分或完全分離出的相同的核酸或肽是「分離的」。分離的核酸或蛋白質可以充分純化的形式存在，或存在於非天然環境中，例如宿主細胞中。
在此使用的關於狂犬病毒的「中和」，指在暴露於狂犬病的受試者體內降低或抑制狂犬病毒的感染進程或在有暴露於狂犬病毒風險的受試者體內降低或預防進程。
「核酸」指聚核苷酸，包括聚核糖核苷酸和聚脫氧核糖核苷酸。
在此使用的術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可交替使用，指由胺基酸殘基通過肽鍵共價連接組成的化合物。蛋白質或肽必須包含至少2個胺基酸，對於可以組成蛋白質或肽序列的胺基酸的最大數目沒有設限。
「藥學上可接受的」指對於人或動物應用在生理學上可容忍的。
在此使用的「藥物組合物」包括用於人或動物的配方。
「預防性的」或「預防的」治療是對沒有出現狂犬病毒暴露或感染的症狀或僅出現早期症狀的受試者進行的治療。進行預防的或預防性的治療的目的是降低發展狂犬病毒感染相關病原體的風險。
在此使用的「狂犬病毒相關紊亂」指狂犬病毒的存在和狂犬病臨床症狀之間存在關聯的紊亂。
在此使用的關於重組人抗體「狂犬病毒中和」指能夠降低狂犬病毒感染細胞或引起狂犬病程度的抗體或抗體的混合物。「狂犬病毒中和」和「狂犬病毒中和活性」可以交替使用。
在此使用的「樣品」指取自受試者的生物樣品，包括正常組織樣品、血液、唾液、糞便或尿液。樣品還可以是取自受試者的其它任何含有感興趣的化合物或細胞的材料。
在此使用的「受試者」可以是人或非人動物。非人動物包括，例如家畜和寵物，如綿羊、牛、豬、犬科、貓科和鼠科哺乳動物以及爬行動物、鳥類和魚。優選地，受試者是人。
「充分純化的」指由於去除了初始存在的其它化合物(例如其它肽、核酸、碳水化合物、脂肪)或其它細胞而在性質上基本上同源的肽或核酸序列。「充分純化的」不意味著將人工的或合成的混合物與其它化合物一起排除，也不排除對生物活性不發生幹擾的雜質的存在，以及例如因為不完全純化、穩定劑的加入或配製藥學上可接受的製劑而可能存在的雜質。
在此使用的「基本上同源的胺基酸序列」包括與參照抗體鏈的胺基酸序列至少具有大約95％同源性，優選地至少有大約96％同源性，更優選地至少有大約97％同源性，甚至更優選地至少有大約98％同源性，以及最優地至少具有大約99％或更高同源性的胺基酸序列。胺基酸序列的相似性或等同性可以通過採用BLASTP和TBLASTN程序計算，這些程序採用BLAST(基本局部相似性比對搜索工具)2.0.14運算法則。用於這些程序的默認設置適用於為本發明目的而識別充分相似的胺基酸序列。
「基本上同源核酸序列」指與參照核酸序列對應的核酸序列，其中對應序列編碼的肽與參照核酸序列編碼的肽具有基本上相同的結構和功能；例如，僅有不會顯著影響肽功能的胺基酸發生改變的情況下。優選地，充分相似的核酸序列編碼由參照核酸序列編碼的肽。充分相似的核酸序列和參照核酸序列之間的等同性的百分比為至少大約50％、65％、75％、85％、95％、99％或更高。核酸序列的充分相似性可以通過比較兩序列的序列等同性確定，例如通過物理/化學方法(即雜交法)或通過計算機算法的序列相似性比對。確定核苷酸序列和參照核苷酸序列充分相似的合適的核酸雜交條件為50℃的7％十二烷基磺酸鈉SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA，並於50℃用2X標準檸檬酸鈉(SSC)、0.1％SDS洗滌；優選地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中並於50℃用1X SSC、0.1％SDS洗滌；優選地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中並於50℃用0.5X SSC、0.1％SDS洗滌；以及更優選地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中並於65℃用0.1X SSC、0.1％SDS洗滌。合適的用於確定兩核酸序列之間充分相似性的計算機算法包括GCS程序包(Devereux等，1984 Nucl.Acids Res.12387)以及BLASTN或FASTA程序(Altschul等，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990 87145509-13；Altschul等，J.Mol.Biol.1990 2153403-10；Altschul等，1997 NucleicAcids Res.253389-3402)。這些程序提供的默認設置適於為本發明目的確定核酸序列間的充分相似性。
在此使用的術語「治療(動詞)」或「治療(名詞)」指進行狂犬病毒中和抗體或化合物的給藥以降低經受狂犬病毒感染的效應或症狀的頻率，減輕症狀的嚴重性，或防止效應或症狀的發生。
具體實施例方式
在本發明的實踐中，通過對需要治療的受試者進行重組狂犬病毒中和人抗體的給藥對狂犬病毒感染進行了治療或預防。重組狂犬病毒中和人抗體與各種狂犬病毒株的糖蛋白特異性的結合。使用兩種或多種不同抗體的暴露後治療可以在進入位點中和狂犬病毒並能防止病毒擴散進中樞神經系統(CNS)。因為病毒複製幾乎專門地限制在神經細胞中，用本發明的抗體在病毒進入CNS前中和及清除病毒是有效的暴露後預防。
在本發明的實踐中，用重組狂犬病毒中和人抗體混合物的暴露後預防治療對狂犬病毒相關紊亂進行治療。該治療獲得安全的水平以及重複了HRIG的保護活性。
在一個具體實施方案中，用兩種或多種不同的重組狂犬病毒中和人抗體對受試者給藥。重組狂犬病毒中和人抗體不必以單一組合物給藥。例如，各不同的重組狂犬病毒中和人抗體可以通過分離的組合物給藥，或重組狂犬病毒中和人抗體以含有兩種或多種重組狂犬病毒中和人抗體的組合物形式一同給藥。另一方面，將三種或更多種不同的重組狂犬病毒中和人抗體給予受試者。
在本發明的一個具體實施方案中，通過至少兩種不同的重組狂犬病毒中和人抗體的給藥，在暴露於狂犬病毒的受試者體內防止了狂犬病毒感染、或狂犬病臨床症狀的發展。在本發明的另一個具體實施方案中，通過至少兩種不同重組狂犬病毒中和人抗體的給藥，在存在暴露於狂犬病毒的風險的受試者體內預防了狂犬病毒的感染。
被選擇用於給藥的人抗體混合物優選地應當1)是IgG同型抗體；2)中和多於一種狂犬病毒株，優選地為數種及其它狂犬病毒；以及3)其抗原決定簇識別專一性存在差異，以防止中和一抗性變體的逃脫(WHO consultation on a monoclonal antibody cocktail for rabies postexposure treatment，WHO，2002年5月23-24日)。
在本發明的一個具體實施方案中，重組狂犬病毒中和人抗體衍生自雜交瘤JA、JB和J57的單克隆抗體。重組狂犬病毒中和人抗體分別命名為「SOJA」、「SOJB」和「SO57」。各人抗體中和多於一種狂大病毒株1)人單克隆抗體SO57中和RV固定毒株(例如Pitman-Moore、標準攻擊毒株[CVS]以及Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)和街毒株(例如狗RV4[DRV-4]和銀毛蝠狂犬病毒18[SHBRV-18])(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90)；2)人單克隆抗體SOJB中和歐洲蝙蝠病毒2(EBV-2)；以及3)人單克隆抗體SOJA中和EBV-2、Lagos蝙蝠病毒和Mokola病毒(Champion等，J.Immunol.Methods 2000 23581-90；Hanlon等，Vaccine 2001 193834-42)。這表明這三種人單克隆抗體識別不同的抗原決定簇。
單克隆抗體SOJA包括含有胺基酸序列SEQ ID NO2(Genbank進入號AAO17825)的輕鏈和含有胺基酸序列SEQ ID NO1(Genbank進入號AAO17823)的重鏈。單克隆抗體SOJB包括含有胺基酸序列SEQ ID NO6(Genbank進入號AAO17826)的輕鏈和含有胺基酸序列SEQ ID NO4(Genbank進入號AAO17822)的重鏈。單克隆抗體SO57包括含有胺基酸序列SEQ ID NO7(Genbank進入號AAO17824)的輕鏈和含有胺基酸序列SEQ ID NO9(Genbank進入號AAO17821)的重鏈。
單克隆抗體SOJA的輕鏈由含有核酸序列SEQ ID NO10(Genbank進入號AY172961)的核酸編碼且重鏈由含有核酸序列SEQ ID NO11(Genbank進入號AY172959)的核酸編碼。單克隆抗體SOJB的輕鏈由含有核酸序列SEQ ID NO5(Genbank進入號AY172962)的核酸編碼且重鏈由含有核酸序列SEQ ID NO3(Genbank進入號AY172958)的核酸編碼。單克隆抗體SO57的輕鏈由含有核酸序列SEQ ID NO12(Genbank進入號AY172960)的核酸編碼且重鏈由含有核酸序列SEQID NO8(Genbank進入號AY172957)的核酸編碼。
在本發明的一個具體實施方案中，使用的重組狂犬病毒中和人抗體輕鏈或抗體重鏈是與參照抗體輕鏈或抗體重鏈的胺基酸序列具有實質的序列同源性或等同性的抗體輕鏈或抗體重鏈。參照胺基酸序列是SEQ ID NOs1、2、4、6、7和9。基本上同源的胺基酸序列指與參照肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多胺基酸序列等同性或相似性的肽或肽的部分。
多於一個核酸序列能編碼特定的胺基酸序列。因此，多於一個核酸序列能編碼一抗體輕鏈且多於一個核酸序列能編碼一抗體重鏈。由於在某些情況下核苷酸可以在不造成初始編碼胺基酸序列改變的情況下由其它核苷酸取代，簡併序列可以在遺傳密碼意義內簡併。
在一個優選具體實施方案中，給藥的不同重組狂犬病毒中和人抗體是SOJA、SOJB和SO57。重組SOJA和SO57 IgG1抗體是IgG1抗體，而SOJB是IgG3抗體。
根據一些具體實施方案，重組抗體是單鏈抗體，其中重鏈可變區域和輕鏈可變區域由一間隔基團(spacer group)優選地為肽連接。單鏈重組抗體可進一步包含效應分子和/或信號序列，這些序列促進位備抗體的宿主細胞對抗體的加工。
在一個具體實施方案中，重組狂犬病毒中和人抗體通過重組DNA技術製備，該技術包括在允許重組抗體表達的條件下培養轉化後的宿主細胞並分離抗體。
一方面，通過培養宿主細胞製備重組狂犬病毒中和人抗體，該宿主細胞已被轉化了含有表達框的雜交載體。該表達框含有啟動子和編碼重組抗體的核酸序列。另一方面，啟動子與編碼信號肽的第一核酸序列連接，該序列在合適的閱讀框內與編碼重組抗體的第二核酸序列連接。啟動子控制表達。隨後分離重組狂犬病毒中和人抗體。
通過體外製備技術可以獲得相對純的抗體製劑，該技術可以使製備擴大以產生大量的需要的抗體。本領域已知細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞培養技術，包括均勻懸浮式培養，例如在氣舉式反應器或連續攪拌反應器內，或固定或截留細胞培養，例如在中空纖維、微囊體內、在瓊脂糖微粒或陶瓷芯上。
可通過本領域技術人員已知的其它技術製備抗體，包括例如標準重組核酸技術和化學合成技術。
隨後根據實施例中說明的分析方法以及本領域技術人員已知的方法可對純化後抗體的生物學活性進行分析。
在一個具體實施方案中，包含核酸的雜交載體可用於製備抗體，該核酸進一步地包含編碼重組狂犬病毒中和人抗體的核酸序列。選擇性地，雜交載體包含複製原點或自主複製序列、一個或多個顯性標記序列、表達控制序列、信號序列和附加的限制性酶切位點。
編碼抗體輕鏈、抗體重鏈或兩者的重組表達載體系統可以與相容宿主細胞一起行使兩項功能。一項功能是促進編碼抗體鏈的核酸的克隆，即製備可利用量的核酸(克隆載體)。另一項功能是通過保持為染色體外遺傳因子或整合進宿主染色體在合適的宿主內進行重組基因構建體的複製和表達(表達載體)。克隆載體包括上述的重組核酸構建體、複製原點或自主複製序列、顯性標記序列和選擇性地，信號序列和附加的限制性酶切位點。表達載體還包含重組核酸轉錄和翻譯所必需的表達控制序列，由此製備重組狂犬病毒中和人抗體。
使用重組技術，可以構建高水平表達(大約60pg/細胞)狂犬病毒中和人抗體的狂犬病毒載體(Morimoto等，J.Neurovirol.6373-812000；Morimoto等，J.Immunol.Methods 252199-206 2001；Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-3549 2000)。
在一個具體實施方案中，重組人抗體由棒狀病毒(RhV)表達系統製備，該系統從疫苗株狂犬病毒載體表達系統製備。製備狂犬病毒中和人抗體的RhV表達系統具有以下特徵1)因為本發明的RhV表達系統不會引起細胞病變，受感染細胞可以長時間(＞2周)連續製備抗體，該狀況實現了經濟有效的單克隆抗體製備；2)多種哺乳動物細胞培養物易受到重組RhV表達系統的感染，因此已被批准用作疫苗或抗體製備的細胞系(例如Vero非洲綠猴細胞和CHO細胞)可用於RhV對單克隆抗體的製備；以及3)使用UV照射或不改變抗體活性的化學試劑(例如非離子去汙劑或乙醇)可以輕易地破壞RhV。此外，可以修飾RhV使其含有皰疹性口炎病毒糖蛋白(G)蛋白基因，而不是攜有負責RV病原性的主要決定子的狂犬病毒G基因(Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 973544-49；Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983 8070-4)。因此，製備狂犬病毒中和人抗體的重組棒狀病毒表達系統僅呈現有限的生物安全顧慮。
編碼人抗體重鏈和輕鏈肽的重鏈和輕鏈抗體序列可被插入重組棒狀病毒表達系統中糖蛋白基因和聚合酶基因之間經修飾的位點(Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-3549 2000)。此外，該重組棒狀病毒表達系統能感染各種哺乳動物細胞系且不是溶細胞的，由此允許使用常規用於製備狂犬病疫苗的細胞培養技術(Morimoto等，J.Neurovirol.6373-81 2000；Morimoto等，J.Immunol.Methods 252199-206 2001；Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-35492000)。
在一個具體實施方案中，通過構建含有外源的如來自猿猴病毒40(SV 40)或其它病毒源的複製原點的載體或通過宿主細胞的染色體機制提供複製原點或自主複製序列。
在另一個具體實施方案中，載體中的選擇標記實現了對含有載體的宿主細胞的選擇。選擇標記包括賦予重金屬如銅或抗生素如Geneticin(G-418)或潮黴素抗性的基因或彌補宿主細胞遺傳缺陷如缺乏胸苷激酶、次黃嘌呤磷醯基轉移酶、二氫葉酸還原酶等的基因。
在一些具體實施方案中，重組抗體的分泌被定向。例如信號序列可以是前序列或引導重組抗體分泌的分泌前導序列、剪切信號等。引導重組抗體分泌的信號序列的例子為衍生自ompA基因、pelB基因(果膠酸酯裂解酶)基因或phoA基因的序列。
抗體序列的轉錄由啟動子和轉錄起始和終止以及穩定mRNA所必需的序列調節，以及選擇性地，由增強子和進一步的調節序列調節。根據宿主細胞的性質可以使用多種啟動子序列。強啟動子且同時被很好調節的啟動子是最有用的。例如翻譯起始序列是Shine-Dalgarno序列。轉錄起始和終止以及穩定mRNA所必需的序列通常分別來自病毒或真核cDNA例如表達宿主的非編碼5』-區域和3』-區域。增強子是源自病毒的轉錄激活DNA序列，例如來自猿猴病毒、多瘤病毒、牛乳突淋瘤病毒或莫氏(Moloney)肉瘤病毒的，或源自基因組的，特別是鼠的。
載體的各種核酸片段可操作地連接，即這些片段相鄰並相互形成具有功能的關係。適用於在E.coli菌株中複製和表達的載體的實施例是噬菌體例如λ噬菌體的衍生物、或質粒例如特別是質粒ColE1及其衍生質粒例如pMB9、pSF2124、pBR317或pBR322以及衍生自pBR322的質粒例如pUC9、pUCK0、pHRil48和pLc24。合適的載體包含完整的複製子、標記基因、限制性核酸內切酶識別序列，因此外源DNA以及如果合適，表達控制序列以及選擇性的信號序列和增強子可被插入這些位點。
例如微生物啟動子是由溫度敏感抑制子控制的噬菌體λ的強左向啟動子PL。同樣合適的還有E.coli啟動子例如由lac抑制子調節並由異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導的lac(乳糖)啟動子，由trp抑制子調節並由例如色氨酸飢餓誘導的trp(色氨酸)啟動子，以及由lac抑制子調節的tac(雜交trp-lac啟動子)。
多種載體也適於在酵母中的複製和表達且載體含有酵母複製起點和酵母的選擇性遺傳標記。這些載體中的一組包含所謂ars序列(自主複製序列)作為複製原點。這些載體在轉化後在酵母細胞內保持在染色體外且自主複製。此外，可以使用含有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)全部或部分2μm質粒的載體。這些載體將通過重組整合進已經存在於細胞內的2μm質粒，或自主複製。在要實現高的轉化頻率和高拷貝數目時，2μm序列特別適用。
例如，適於在酵母內表達的表達控制序列是那些高水平表達的酵母基因的表達控制序列。因此，可以使用的啟動子有TRP1基因、ADHI或ADHII基因、酸性磷酸酯酶(PHO3或PHO5)基因、異細胞色素(isocytochrome)基因的啟動子或糖酵解通路中的啟動子，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶基因的啟動子。
優選的適於在哺乳動物細胞內複製和表達的載體來自衍生自病毒源DNA的啟動序列，例如來自猿猴病毒40(SV40)、魯斯氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、牛乳突淋瘤病毒(BPV)、乳多空泡病毒(papova-virus)BK突變體(BKV)、棒狀病毒、狂犬病毒、或鼠或人細胞巨化病毒(CMV)。可選擇地，載體可以包含來自哺乳動物表達產物的啟動子，例如肌動蛋白、膠原蛋白、肌漿球蛋白等，或與所需基因序列正常相關的天然啟動子和控制序列，即免疫球蛋白H-鏈或L-鏈啟動子。
其它載體適用於原核和真核宿主且基於病毒複製系統。特別優選的是含有猿猴病毒啟動子例如pSVgpt或pSVneo的載體，載體進一步包含增強子，例如與免疫球蛋白基因序列正常相關的增強子，特別是鼠Ig H-或L-鏈增強子。
可以按照不同的方法獲得完整的四聚體輕鏈和重鏈抗體。在一個具體實施方案中，抗體輕鏈和抗體重鏈在相同的細胞中共表達實現胞內結合和抗體輕鏈與抗體重鏈連接形成完整的四聚體輕鏈和重鏈抗體。
在一個具體實施方案中，編碼抗體輕鏈的核酸和編碼抗體重鏈的核酸出現在兩個相互兼容的表達載體上，其中各核酸受到不同或相同啟動子的控制。在該具體實施方案中，表達載體共轉化或分別轉化。
在本發明的具體實施方案中，用重組彈狀表達系統轉化宿主細胞，該表達系統含有編碼所需重組抗體的抗體輕鏈和/或抗體重鏈的核酸序列。因此，一方面，核酸序列能編碼單鏈重組抗體。
合適宿主的實施例為細菌，特別是大腸桿菌菌株例如E.coliX1776、E.coli Y1090、E.coli HB 101、E.coli W3110、E.coli HB101/LM1035、E.coli JA 221、E.coli DH5α、E.coli K12或E.coli CC118菌株，枯草桿菌、嗜熱桿菌、假單胞菌、嗜血桿菌、鏈球菌及其它，以及酵母例如釀酒酵母如釀酒酵母GRF 18。進一步適用的宿主細胞是更高等生物的細胞，特別是已建立的人或動物連續細胞系，例如人胚胎肺纖維原細胞L132、人惡性黑素瘤Bowes細胞、Hela細胞、被SV40病毒轉化的非洲綠猴COS-7腎細胞、BHK細胞、BSR細胞、VERO細胞、或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或源自淋巴的細胞，例如淋巴瘤、骨髓瘤、雜交瘤、三體瘤(trioma)或四體瘤(quadroma)細胞，例如PAI、Sp2/0或X63-Ag8.653細胞。
在一個具體實施方案中，製備了轉化後的宿主細胞，其中合適的受體宿主細胞被雜交載體轉化，且使用本領域已知標準選擇轉化後的細胞。按照文獻中的說明進行微生物的轉化，例如對釀酒酵母(A.Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929 1978)、枯草桿菌(Anagnostopoulos等，J.Bacteriol.81741 1961)和大腸桿菌(M.Mandel等，J.Mol.Biol.53159 1970)的轉化。
相應地，例如E.coli細胞的轉化步驟包括用Ca2+對細胞進行預處理從而允許DNA的攝入以及將細胞與雜交載體培育。隨後例如通過將細胞轉移至選擇性培養基可以實現對轉化後細胞的選擇，該培養基根據載體DNA的標記序列的性質可以將轉化細胞從親代細胞中分離出來。優選地，使用的培養基不允許不含載體的細胞的生長。例如酵母細胞的轉化包含步驟有使用葡糖苷酶酶解去除酵母細胞壁，在聚乙二醇和Ca2+離子存在下用載體處理獲得的原生質，以及將原生質埋入瓊脂再生細胞壁。優選地，以允許上述轉化細胞的再生和選擇同時進行的方法製備再生瓊脂。
對更高級的真核細胞例如哺乳動物細胞系的轉化通過諸如感染或轉染的方法實現。使用傳統技術進行轉染，例如磷酸鈣沉澱、微注射、原生質體融合、電穿孔法，即通過能瞬間提高細胞膜通透性的短電脈衝，或在幫助化合物例如二乙氨乙基葡聚糖、二甲亞碸、甘油或聚乙二醇等的存在下引入DNA。在轉染步驟之後，通過例如在根據選擇標記性質所選擇的選擇性培養基中培養細胞識別和選擇被轉染細胞，例如含有相應的抗生素的標準培養基如Dulbecco改良細胞培養基(DMEM)、最低必需培養基、RPMI 1640培養基等。
在一優選具體實施方案中，重組棒狀病毒表達系統包括使用核酸感染哺乳動物細胞例如BSR細胞、CHO細胞、VERO細胞和BHK細胞或其它經批准用於抗體製備的細胞，該核酸包含編碼抗體輕鏈或抗體重鏈或編碼兩者的核酸序列。細胞可以在允許製備本發明抗體的條件下培養。抗體可以使用本領域已知技術分離和純化。
用於給藥的重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈或抗體重鏈可以被其它物質修飾。使用其它物質修飾抗體的方法，特別是標記，是本領域技術人員所熟知的。抗體修飾可以改變抗體活性，例如通過改變其特徵諸如體內組織分配、肽的降解速率或狂犬病毒中和活性。修飾還可以賦予化合物額外的特性，例如被觀測、操作或定位的能力。
重組狂犬病毒中和人抗體可用聚合和大分子結構(例如脂質體、沸石、樹枝狀聚合物、磁性微粒以及金屬珠)或靶基團(例如信號肽序列、配體、外源凝集素或抗體)加以修飾。修飾物可以例如通過化學方法(例如通過共價鍵、靜電作用、範德華力、氫鍵、離子鍵、螯合作用等)或通過物理包埋與鏈相結合。例如抗體可以用標記物修飾(例如具有磁共振活性的物質；輻射密度物質；螢光物質；放射性物質；超聲可探測物質；可見、紅外或紫外光可探測物質)。合適的標記物包括例如異硫氰酸螢光素、肽發色團如藻紅蛋白或藻藍蛋白等；生物發光肽如源自北美螢火蟲(Photinus pyrali)的螢光素酶；或源自海腎(Renilla reniformi)的螢光蛋白。
本發明的一方面，抗體可以包含天冬氨酸(D)殘基以提高抗體的溶解度。另一方面，可以通過添加加合物如蔗糖或聚乙二醇以延長抗體壽命。
本領域技術人員在考慮到受試者的身材和體重、疾病滲透程度、受試者年齡、健康狀況和性別、給藥途徑、以及給藥是局部的還是系統的等因素後可以容易地確定對受試者給藥的重組狂犬病毒中和人抗體的有效量。一般地，對受試者的抗體給藥量依賴於需要被中和的狂犬病毒的量和抗體呈現的狂犬病毒中和活性量。本領域技術人員可以推導出給藥的合適劑量和計劃以適應特定情況和受試者的需要。例如，根據受試者暴露的狂犬病毒量或受試者存在暴露風險的狂犬病毒量可以估計用於共同給藥的各抗體的合適劑量。典型地，抗體劑量在大約0.001mg/kg和大約100mg/kg體重之間。在某些特定具體實施方案中，劑量在大約0.01mg/kg和大約60mg/kg體重之間。
應當明白有效量將依賴於受藥者的年齡、性別、健康狀況和體重，同期治療的種類，如果有的話，治療的頻率以及需要實現的效應性質。最優選的劑量將根據受試者個體裁定，本領域技術人員在沒有不當實驗的情況下可以理解和確定該劑量。
重組狂犬病毒中和人抗體的混合物可以等摩爾濃度對需要該治療的受試者給藥。在另一個實施例中，抗體可以非等摩爾濃度給藥。在其它實施例中，抗體可以相對於每千克體重的等質量蛋白給藥。例如，抗體可以根據受試者的體重等量給藥。在另一個實施例中，抗體可以非等量給藥。在其它實施例中，各抗體的給藥量可以根據抗體的中和活性。例如，給藥的混合物的狂犬病毒中和活性可在大約1IU/kg體重和大約50IU/kg體重之間。
一般地，狂犬病毒中和人抗體混合物給藥的計劃和時間根據所進行步驟可接受的操作確定。
當在體內使用時，抗體優選地作為藥物組合物給藥，該組合物包含一種混合物和一種藥學上可接受的載體。藥物組合物中存在的抗體量可以在0.001至99.9wt％，更優選地在大約0.01至99.0wt％，以及甚至更優選地在0.1至50wt％。為了實現好的血漿濃度，抗體或抗體的混合物例如可作為含有0.1至1.0％活性試劑的溶液通過靜脈注射給藥。
所有不同的重組狂犬病毒中和人抗體的給藥不必在單個組合物中一同給藥。不同的重組狂犬病毒中和人抗體可以在分開的組合物中給藥。例如，如果對三種不同抗體給藥，三種不同抗體可以三種在分開的組合物中給藥。此外，各抗體可以同時給藥，或抗體可以依次連續給藥。這樣，重組狂犬病毒中和人抗體混合物可以以單個組合物給藥，或以包含一種或多種重組狂犬病毒中和人抗體的多種組合物給藥。
重組狂犬病毒中和人抗體和包含這些化合物的藥物組合物可以通過經設計可使化合物具有生理學效應的任何方法給藥。可以以腸道或非腸道給藥；例如口服、直腸、瀦泡內(intracistemally)、陰道內、腹腔內、局部(例如粉劑、軟膏或滴液)給藥。腸道內給藥為優選。特別優選的腸道內給藥方法包括血管內給藥(例如靜脈內高劑量注射、靜脈灌注、動脈內高劑量注射、動脈灌注和用滴藥導管滴入脈管系統)、靶組織周邊和靶組織內注射、皮下注射或沉積包括皮下灌注(例如通過滲透泵)、肌肉內注射、腹腔內注射以及例如通過導管或其它放置裝置直接應用在靶區域。
藥學上可接受的載體包括生理學上可容忍或可接受的稀釋劑、賦形劑、溶劑或佐劑。組合物優選地是無菌的和非致熱性的。合適載體的實施例包括但不限於水、常規鹽、右旋糖、甘露醇、乳糖或其它糖、卵磷脂、白蛋白、穀氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸、乙醇、多羥基化合物(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(例如橄欖油)、可注射有機酯例如油酸乙酯、乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨醇及山梨醇酐酯、微晶纖維素、甲羥基鋁(aluminum methahydroxide)、膨潤土、高嶺土、瓊脂以及黃蓍膠或這些物質的混合物等。
藥物組合物還可以包含少量的無毒輔助藥物或賦形劑以及/或添加劑，例如潤溼劑、乳化劑、pH緩衝試劑、抗菌和抗真菌試劑(例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)。合適的添加劑包括但不限於生理學上生物相容的緩衝液(例如氨基丁三醇鹽酸)、螯合劑(例如DTPA或DPTA雙醯胺)或鈣螯合絡合物(例如鈣-DPTA或鈣鈉DPTA雙醯胺)的加入(例如0.01至10摩爾百分比)或選擇性地加入(例如1至50摩爾百分比)鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。如果需要，可以使用吸收增強或延緩試劑(例如脂質體、單硬脂酸鋁或凝膠)。組合物可以製備成傳統形式，抑或是液體溶液或懸浮劑、在注射前適於形成溶液或懸浮劑的固體形式或乳劑。肌肉內、腹腔內、皮下或靜脈內組合物是例如等滲水溶液或懸浮劑，選擇性地在使用之前不久從凍幹或濃縮製劑製備。油懸浮劑包含作為油性成分的常規用於注射的蔬菜、合成或半合成油。藥物化合物可以是無菌的且含有例如用於保存、穩定、潤溼、乳化或溶解成分的添加劑、調節滲透壓的鹽、調節粘度的緩衝液和/或化合物，例如羧基纖維素鈉、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮或凝膠。根據本發明的藥物化合物可以以本領域熟知的技術方式製備。
在抗體通過注射或直接使用進行給藥時，注射或直接使用可以是一劑或多劑。在化合物的給藥是通過灌注時，灌注可以是在延長的時間區間內的單劑持續劑或多次灌注。
本發明不應被理解為僅限於在此說明的實驗和方法，而應理解為也包括其它實驗和分析。本領域的技術人員將明白其它的實驗和方法可用於實現在此說明的步驟。
沒有進一步的說明，應當相信本領域的普通技術人員通過使用之前的說明和之後的說明性實施例能夠製備和利用重組狂犬病毒中和人抗體並操作權利要求的方法。因此以下的操作實施例特別指出了本發明的優選實施方案，但不應理解為以任何方式對公開的其它內容的限制。
實施例1-抗狂犬病毒重組表達人抗體(rhuMAbs)的製備和病毒中和活性抗體cDNA的製備三個雜交瘤，JA、JB和J57分泌命名為「SOJA」、「SOJB」和「SO57」的人單克隆抗體。這些單克隆抗體的生成和分析的具體細節在其它地方已被報導(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90；Champion等，J.Immunol.Methods 2000 23581-90)。從JA、JB和J57雜交瘤中分離免疫球蛋白重鏈(Ig H)和免疫球蛋白輕鏈(Ig L)mRNA，使用棒狀病毒載體(RhV)在BSR或CHO細胞中高水平表達抗體。
為獲得Ig H和Ig L mRNA的完整核酸序列，根據生產商的建議，使用Tri-Reagent手冊(Sigma)和RNeasy RNA提取試劑盒(Qiagen)從各雜交瘤細胞系中分離總RNA。
使用cDNA末端快速擴增試劑盒(GIBCO-BRL)和Ig H和Ig L基因恆定區3』端的基因專一性引物(GSPs)擴增Ig L和Ig H cDNA片段。簡言之，使用ThermoScript反轉錄酶(Life Technology)和GSP在55℃對2.5μg總RNA反轉錄60分鐘。隨後用核糖核酸酶H降解mRNA，且使用GlassMAX離心管(spin cartridges)純化cDNA。在用脫氧核苷末端轉移酶和dCTP在cDNA上加上dC尾巴後，用精簡錨定引物(GIBCO-BRL)和第二GSP對cDNA進行PCR擴增以獲得巢式產物。使用第三GSP對PCR產物再擴增，並用凝膠電泳純化產物並測序。作為最後一步，用DNASTAR軟體(DNAstar)和國家生物技術信息中心的網站工具對序列進行分析。
為克隆全長的Ig H和Ig L cDNAs，使用10pmol寡dT引物、200單位Superscript II以及20單位核糖核酸酶抑制劑在含有第一鏈緩衝液、200μM dNTP和10mM二硫蘇糖醇的40μl的反應體系中對1μg的總RNA進行反轉錄。隨後使用Expand高保真PCR系統(Roche)和10pmol與Ig L和Ig H cDNAs的5』端和3』端互補的引物對5μl反轉錄反應物進行擴增。
對克隆的Ig cDNAs進行測序且GenBank的進入號如下SOJA IgL，AY172961(SEQ ID NO10)；SOJA Ig H，AY172959(SEQ ID NO11)；SOJB Ig L，AY172962(SEQ ID NO5)；SOJB Ig H，AY172958(SEQ ID NO3)；SO57 Ig L，AY172960(SEQ ID NO12)；以及SO57 Ig H，AY172957(SEQ ID NO8)。為了基因組裝，使用對應於cDNAs的5』端(JAHF，5′-AAACGTACGATGGAGTTTGGG-CTGAGCTGGCTT-3′(SEQ ID NO13)；JBHF，5′-AACGTACGA-TGGACACACTTTGCTCCACGCTCCT-3′(SEQ ID NO14)；以及J57HF，5′-AAACGTACGACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCT-3′(SEQ ID NO15))的引物以及與各Ig H cDNAs的3』端互補和與由狂犬病毒轉錄中止/起始信號組成的連接序列互補的HR引物5′-GCTAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGACTCATTTACCCGGGGACAGGG A-3′(SEQ ID NO16)對JA、JB和J57 Ig H的cDNAs進行擴增(Morimoto等，J.Immunol.Methods 2001 252199-206)。
使用LF引物以及cDNAs的3』端引物(JALR，5′-AAAGCTAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3′(SEQ IDNO18)；JBLR，5′-AAAGCTAGCCTATGAACATTCTGTAGGGGCCA-CTGT-3′(SEQ ID NO19)以及J57LR，5′-AAATCTAGACTATGAACA-TTCTGTAGGGGCCAC-3′(SEQ ID NO20))對Ig L的cDNA進行再擴增，LF引物包含連接區域和對不同輕鏈cDNAs的5』端的具有專一性的區域(5′-GGTAAATGAGTCATGAAAAAAACTAACACCCC-TAGCNNNNNNNNNN NNNNNNNNNN-3′(SEQ ID NO17)，其中N是cDNA輕鏈的5』端)。
重組棒狀病毒載體的構建使用前述的狂犬病毒載體製備重組棒狀病毒載體(RhV)(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 20009714680-14685)。狂犬病毒糖蛋白基因(GenBank進入號NP 056796)的膜外和跨膜結構域(GenBank進入號NC 001542)由皰疹性口炎病毒糖蛋白基因(VSV G)(GenBank進入號J02428)的膜外和跨膜結構域取代(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-14685；Schnell等，J.Virology 1996 702318-2323；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 924477-4481)，在載體中生成嵌合的糖蛋白基因。生成的質粒命名為pSN-VSV-G。
狂犬病毒糖蛋白基因帶有負責狂犬病毒的病原性的主要決定子(Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983 8070-74)。通過使用皰疹性口炎病毒糖蛋白基因膜外和跨膜序列替換狂犬病毒糖蛋白基因膜外和跨膜序列，形成了只存在有限的生物安全顧慮的重組棒狀病毒表達系統。
為構建pSN-VSV-G載體，狂犬病毒G的胞質尾巴從pSN用引物RP8，5′-CCTCTAGATTACAGTCTGGTCTCACCCCC-3′(XbaI，粗體)(SEQ ID NO21)和RP29，5′-CCCGGGTTAACAGAAGA-GTCAATCGATCAGAAC-3′(HpaI，粗體)(SEQ ID NO22)PCR擴增(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-14685)。VSV G基因的膜外和跨膜結構域(GenBank進入號J02428)用引物RP33，5′-TTAAGTTAACCAAGAATAGTCCAATGA-3′(HpaI，粗體)(SEQ ID NO23)和RP34，5′-TCTCGAGCCCGGGACTATGAAGTGCCTT-TTGTAC-3′(XbaI，粗體)(SEQ ID NO24)從pVSV-XN1擴增(Schnell等，J.Virology 1996702318-2323)。兩PCR產物均用HpaI酶切並連接。連接產物用引物RP8和RP34再次擴增，且將PCR產物克隆進pSN的XmaI和XbaI位點。生成的質粒命名為pSV-VSV-G(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-1468)。
進一步修飾上述質粒pSN-VSV-G(此後稱作pSPBN)從而允許插入和表達包含編碼抗體輕鏈序列、重鏈序列或兩者的核酸。使用PCR策略在糖蛋白(G)基因和聚合酶(L)基因之間引入BsiWI和NheI位點對質粒進行修飾(見例如Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 20009714680-1468和Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 973544-3549)。生成的重組棒狀病毒載體被稱作RhV。
包含輕鏈和重鏈核酶序列的質粒和重組病毒的製備通過PCR連接以上製備的Ig H和Ig L的cDNAs，且用BsiWI和NheI酶切生成的Ig L+連接子+Ig H cDNA並插入上述質粒pSPNB的相應位點。插入三種不同的Ig L+Ig H cDNAs，生成質粒pSPBN-SOJA、pSPBN-SOJB以及pSPBN-SO57。
通過哺乳動物細胞製備抗體由上述質粒產生的重組病毒按別處說明的方法(Morimoto等，J.Neurovirol.20006373-81)回收並用於以0.1MOI感染幼倉鼠腎(BHK)細胞的亞克隆BSR細胞或感染CHO細胞。在感染後，用Cellgro-FREE培養基(Mediatech)在34℃培養細胞。在培養3天後，收集組織培養上清並進行UV照射將病毒滅活。
表1證實了由受感染BSR細胞分泌至組織培養上清液中的三種不同重組表達人抗體的量。可以看出由包含編碼SOJA、SOJB或SO57抗體的核酸的重組病毒感染的各BSR細胞以大約40μg/ml/48小時的速率生成重組人抗體。BSR細胞或CHO細胞的感染導致高水平的製備(≤40μg/ml/48小時)。
表1 抗狂犬病毒重組表達人單克隆抗體(rhuMAbs)的製備和病毒中和活性

注「CVS」是標準攻擊毒株；「DRV-4」是狗狂犬病毒4；「HRIG」是人狂犬病免疫球蛋白；「SHBRV-18」銀毛蝠狂犬病毒。
a在測試前，將純化的rhuMAbs和rhuMAb混合物(SOJA∶SOJB∶SO57蛋白質比例1∶1∶1)調節至1mg/ml的蛋白濃度。
bHRIG按生產商製備的進行使用(150IU/ml；Bayer)。
親和層析對抗體的純化隨後從培養上清中純化出分泌至組織培養基中的各重組人抗體且將各樣品校準並調整至相同的蛋白含量。
使用蛋白A柱(蛋白A瓊脂糖凝膠，Amersham Pharmacia Biotech)純化IgG1抗體。簡言之，經過0.45μm膜過濾使上清澄清並用1N NaOH將pH調整至8.0。上清以大約100cm/小時的線性流速經過柱體。用PBS(pH 8)洗滌後，用0.1M檸檬酸溶液將抗體從柱上洗脫並對PBS進行透析。
IgG3抗體用蛋白G柱(蛋白G瓊脂糖凝膠，Amersham PharmaciaBiotech)純化。含有IgG3的上清通過0.45μm膜過濾澄清且用1N NaOH將pH調至7.0。上清以大約11cm/小時的線性流速流經柱體。在用PBS洗滌後，用0.1M甘氨酸緩衝液，pH 3.0將抗體從柱上洗脫並隨後對PBS進行透析。
透析後的抗體製劑的蛋白濃度用以下蛋白質檢測實驗確定(Bio-Rad Laboratories，Hercules CA)。將100μl樣品加入5ml染料濃縮劑的1/5稀釋液並在室溫放置10分鐘。在各試驗中包括陰性PBS對照和各種牛血清白蛋白(BSA)標準。在放置後，用分光光度計在595nm對樣品讀數。測試樣品的蛋白濃度參考BSA標準的吸收值計算。所有抗體製劑的純度用還原條件下的12.5％聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定。純化後的抗體在SDS-PAGE上出現兩條主帶，對應於分離出的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。
病毒中和活性由包含重組狂犬病毒中和人抗體的重組棒狀病毒表達系統感染的哺乳動物細胞產生的病毒中和活性量由快速螢光聚焦抑制實驗(RFFIT)確定(Morimoto等，J.Immunol.Methods 2001 252199-206)。確定病毒滴度降低是否為真的一種方法是當病毒滴度降低＞100個感染單位實現的時候(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-3090)。此外，病毒中和抗體(VNA)滴度可以以國家健康研究所的參考血清作為標準用國際單位表達。中和活性典型地表達為單位每克蛋白或單位每毫升。用於病毒中和的狂犬病毒株在別處有所說明(Dietzschold等，J.Hum.Virol.2000 350-7；Morimoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998953152-6)。用RFFIT分析各轉化細胞系的上清樣品中狂犬病毒中和抗體的存在。在96孔平底板(Nunc)中稀釋上清樣品(50μl)。在各測試樣品中加入已知能造成指示細胞80-90％感染的狂犬病毒稀釋液，將板在37℃培養1小時。在各實驗中包括了陰性培養基和陽性狂犬病免疫血清對照樣品。在培養後，在各孔中加入30μl濃度為1.8×106細胞/ml的BHK細胞並在37℃將培養物過夜培養。隨後用冰冷的PBS將板洗滌一次並用冰冷的90％丙酮在-20℃固定20分鐘。在固定後，去除丙酮將板風乾。為檢測受感染的BHK細胞，將40μl FITC抗狂犬病核蛋白單克隆球蛋白(Centocor，Malvern PA)在37℃加入各孔45分鐘。隨後用蒸餾水將板洗滌3次並在螢光顯微鏡下檢測。
對已從培養物上清中純化出的各重組人抗體測試它們中和狂犬病毒固定株(例如CVS-N2c和CVS-11)和街毒株(例如SHBRV-18和DRV-4)的能力。如同快速螢光聚焦抑制實驗所測試的，三種重組人抗體在中和不同狂犬病毒的能力上呈現出質和量上的差異(表1)。此外，通過含有等摩爾濃度的三種重組人抗體的混合物獲得的狂犬病毒株的病毒中和抗體(VNA)滴度相對率與從HRIG獲得的相似，除了抗SHBRV-18 HRIG VNA滴度略高之外。
實施例2 用抗狂犬病人單克隆抗體混合物對小鼠的暴露後預防為確定SOJA、SOJB和SO57的重組人抗體混合物在體內的保護活性，用10LD50狂犬病毒CVS-N2c鼻腔內感染雌性Swiss Webster小鼠(10隻/組)。1小時後，小鼠接受混合物或HRIG的單次治療。各治療後小組接受含有不同活性的混合物。製備的混合物中SOJA∶SOJB∶SO57蛋白比例為1∶1∶1。各抗體或抗體混合物的活性以國際單位(IU)表示。通過對WHO標準抗血清的滴定確定抗體的IU。小鼠接受的混合物的範圍在0-20IU/kg體重之間。隨後對小鼠進行5周觀察確定它們是否發展了狂犬病的臨床症狀。計算接受SOJA∶SOJB∶SO57混合物治療的動物和接受HRIG治療的動物的治療有效量，在該劑量50％動物受到保護避免致命攻擊(ED50)。
如果狂犬病的臨床症狀變得明顯，用CO2中毒對小鼠實施安樂死。在疑似患有狂犬病的動物腦組織印模上進行直接螢光抗體實驗對狂犬病的診斷進行確認。
用重組狂犬病毒中和人抗體混合物進行的暴露後預防治療在體內預防了致命的狂犬病毒感染(表2)。此外，發現人抗體混合物的保護活性與HRIG的保護活性相當(表2)。在使用20IU/kg時混合物保護了10隻小鼠中的8隻沒有發展狂犬病的臨床症狀，但在2.5IU/kg的濃度下，沒有任何小鼠受保護未發展狂犬病臨床症狀。小鼠發展狂犬病症狀的ED50劑量是3.38IU/kg的HRIG和4.47IU/kg的rhuMAB混合物。
表2.用人狂犬病毒免疫球蛋白(HRIG)和抗狂犬病重組表達人單克隆抗體(rhuMAB)混合物進行小鼠的暴露後預防

aHRIG或混合物的給藥量。bSOJA∶SOJB∶SO57蛋白比例1∶1∶1。數據表示為出現狂犬病臨床症狀的小鼠數目/測試小鼠數目。
實施例3-用重組抗狂犬病人單克隆抗體混合物進行倉鼠的暴露後預防在倉鼠暴露後預防模型中進一步檢測重組人抗體混合物的功效。
用50μl取自天然感染狂犬病的山狼的唾液腺組織勻漿攻擊2月大(100克；10隻/組)的雌性敘利亞倉鼠(Harlan-Sprague-Dawley)。在左腓腸肌對動物進行接種。在用狂犬病毒接種4小時後，在10隻倉鼠中起始含有20IU/kg rhuMAb混合物(如實施例2中所述)的暴露後預防治療。用50微升抗體製劑在動物接種病毒的相同位點進行一次給藥。沒有接受暴露後預防治療混合物的10隻倉鼠作為對照動物。
此後，每日觀察動物共90天。如果在一隻動物中的狂犬病臨床症狀變得明顯，通過CO2中毒對該動物施行安樂死。在安樂死後對狂犬病的診斷進行確認。使用直接螢光抗體實驗對狂犬病診斷進行確認，該實驗在疑似患有狂犬病的動物腦組織壓模上進行。
用SOJA/SOJB/SO57抗體混合物給藥的所有10隻倉鼠均存活。但是，所有的對照動物均死於狂犬病。使用的病毒劑量含有～106.8MICLD50/ml濃度的犬類RV變體(COSRV)，該變體在美國/墨西哥接壤地區流行，因此成為公共健康的重要關注。預計該劑量在肌肉內接種後導致80-100％的死亡率。
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序列表110託馬斯傑斐遜大學(Thomas Jefferson University)120重組抗體及組合物及其製備和使用方法130EP05-2817-XC20150US 10/461,1481512003-06-1316024170FastSEQ for Windows Version 4.02101211474212PRT213人4001Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly His Ser Thr Tyr Leu Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Glu Val Thr Met Ile Val Val Leu Asn115 120 125Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys145 150 155 160Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr165 170 175
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290 295 300Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro305 310 315 320Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr325 330 335Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val340 345 350Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala355 360 365Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg370 375 380Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly385 390 395 400Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro405 410 415Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser420 425 430Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln435 440 445Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His450 455 460Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470 47521010211705212DNA213人40010atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120ctcgcctgca gggccagtca gactgctagc aggtacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ccagactcct catctatgat acatccaaca gggccactgg catcccagcc 240aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctct ccatcagcag cctggagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtttcaact ggccgtggac gttcggccaa 360gggaccaagg tggaattcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 70521011
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acactggtgt gtctcataag tgacttctac ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca 540gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag accaccacac cctccaaaca aagcaacaac 600aagtacgcgg ccagcagcta cctgagcctg acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc 660tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc accgtggaga agacagtggc ccctacagaa 720tgttcatag 7292101321133212DNA213人工序列220
223引物40013aaacgtacga tggagtttgg gctgagctgg ctt 332101421134212DNA213人工序列220
223引物40014aacgtacgat ggacacactt tgctccacgc tcct 342101521135212DNA213人工序列220
223引物40015aaacgtacga ccatggactg gacctggagg ttcct352101621149212DNA213人工序列
220
223引物40016tgctaggggt gttagttttt ttcatgactc atttacccgg ggacaggga 492101721156212DNA213人工序列220
223引物，其中n是輕鏈cDNAs的5』端221misc_feature222(1)...(56)223n＝A，T，C or G40017ggtaaatgag tcatgaaaaa aactaacacc cctagcnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 562101821134212DNA213人工序列220
223引物40018aaagctagcc taacactctc ccctgttgaa gctc 342101921136212DNA213人工序列220
223引物40019aaagctagcc tatgaacatt ctgtaggggc cactgt 3621020
21133212DNA213人工序列220
223引物40020aaatctagac tatgaacatt ctgtaggggc cac 332102121129212DNA213人工序列220
223引物40021cctctagatt acagtctggt ctcaccccc 292102221133212DNA213人工序列220
223引物40022cccgggttaa cagaagagtc aatcgatcag aac 332102321127212DNA213人工序列220
223引物40023ttaagttaac caagaatagt ccaatga 2721024
21134212DNA213人工序列220
223引物40024tctcgagccc gggactatga agtgcctttt gtac 3權利要求
1.一種藥物組合物，含有藥學上可接受的載體和至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體，其中至少兩種抗體中的至少一種選自a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，包含a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
3.如權利要求2所述的藥物組合物，包含a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9的抗體重鏈的抗體。
4.一種在需要治療的受試者體內治療或預防狂犬病毒感染的方法，包括以至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體的有效量對受試者給藥，其中至少兩種抗體中至少一種選自a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
5.如權利要求4所述的方法，其中至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體呈現出對不同狂犬病毒的中和活性。
6.如權利要求5所述的方法，其中用至少兩種不同重組狂犬病毒中和人抗體分別給藥。
7.如權利要求5所述的方法，其中用至少三種不同重組狂犬病毒中和人抗體給藥。
8.如權利要求4所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體包含a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
9.如權利要求8所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體包含a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9的抗體重鏈的抗體。
10.如權利要求5所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體以大約等摩爾濃度的混合物給藥。
11.如權利要求5所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體以大約等重量給藥。
12.如權利要求11所述的方法，其中給藥的抗體量在大約0.001mg/kg體重至大約100mg/kg體重之間。
13.如權利要求12所述的方法，其中給藥的抗體量在大約0.01mg/kg體重至大約60mg/kg體重之間。
14.如權利要求5所述的方法，其中至少三種不同重組狂犬病毒中和人抗體包含大約1IU/kg體重至大約50IU/kg體重之間的狂犬病毒中和活性。
15.如權利要求5所述的方法，其中狂犬病毒是狂犬病毒固定毒株或街毒株。
16.如權利要求15所述的方法，其中狂犬病毒街毒株選自銀毛蝠狂犬病毒、山狼狂犬病毒街毒/墨西哥狗狂犬病毒以及狗狂犬病毒。
17.如權利要求16所述的方法，其中銀毛蝠狂犬病毒是銀毛蝠狂犬病毒-18。
18.如權利要求16所述的方法，其中狗狂犬病毒是狗狂犬病毒-4。
19.如權利要求5所述的方法，其中受試者是人。
20.如權利要求5所述的方法，其中至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體腸道外給藥。
21.如權利要求20所述的方法，其中腸道外給藥方式選自血管內給藥、組織周邊和組織內注射、腹腔內注射、皮下注射、皮下沉積和皮下灌注。
22.一種重組棒狀病毒表達載體，包含(i)編碼皰疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列；以及(ii)編碼重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈或抗體重鏈或抗體輕鏈和抗體重鏈兩者的核酸序列。
23.如權利要求22所述的重組棒狀病毒表達載體，其中載體進一步包含編碼啟動子序列的核酸序列，所述序列與(i)編碼皰疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列；以及(ii)編碼重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈、或抗體重鏈、或抗體輕鏈以及抗體重鏈兩者的核酸序列可操作地連接。
24.如權利要求23所述的重組棒狀病毒表達載體，其中載體編碼抗體輕鏈，所述抗體輕鏈選自a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈。
25.如權利要求23所述的重組棒狀病毒表達載體，其中載體編碼抗體重鏈，所述抗體重鏈選自a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQ ID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQ ID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQ ID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈。
26.一種宿主哺乳動物細胞，包含重組棒狀病毒表達載體，所述載體選自如權利要求22、23、24和25所述的重組棒狀病毒表達載體。
27.如權利要求26所述的宿主哺乳動物細胞，其中哺乳動物細胞選自BSR細胞、幼倉鼠細胞、VERO細胞和中國倉鼠卵巢細胞。
28.一種在哺乳動物細胞中製備重組狂犬病毒中和人抗體的方法，包含在允許重組狂犬病毒中和人抗體表達的條件下培養如權利要求26所述的細胞。
29.如權利要求28所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體在哺乳動物細胞內製備，所述哺乳動物細胞選自BSR細胞、幼倉鼠細胞、VERO細胞以及中國倉鼠卵巢細胞。
30.至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體的混合物在製備用於治療和預防需要治療的受試者體內的狂犬病毒感染的藥物上的應用，其中至少一種抗體選自a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
31.如權利要求30所述的抗體混合物的應用，其中至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體呈現出對不同狂犬病毒的中和活性。
32.如權利要求30所述的抗體混合物的應用，其中混合物包含至少三種不同的重組狂犬病毒中和抗體。
33.如權利要求32所述的抗體混合物的應用，其中抗體包含a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
34.如權利要求33所述的抗體混合物的應用，其中抗體包含a)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO2的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO1的抗體重鏈的抗體；b)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO6的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO4的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有胺基酸序列SEQ ID NO7的抗體輕鏈以及具有胺基酸序列SEQ ID NO9的抗體重鏈的抗體。
全文摘要
為狂犬病毒中和抗體在對暴露於狂犬病毒的受試者進行暴露後預防治療中的應用提供了方法和組合物。包含狂犬病毒中和抗體混合物的組合物以及編碼這些抗體的核苷酸和胺基酸序列可用於對暴露於狂犬病毒的受試者的治療。本發明還提供了使用重組表達載體在哺乳動物細胞內製備重組狂犬病毒中和人抗體的方法。
文檔編號C12N15/00GK1805757SQ200480016584
公開日2006年7月19日 申請日期2004年6月10日 優先權日2003年6月13日
發明者道格拉斯·C·胡珀, 伯恩哈德·迪奇奧德 申請人:託馬斯傑斐遜大學