抗人血小板生成素受體激動劑抗體的製作方法

2023-04-27 22:54:21 3

專利名稱：：抗人血小板生成素受體激動劑抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗人血小板生成素受體(別名人c-Mpl)的激動劑抗體(agonistantibody)。本發明進一步涉及一種在臨床需要增加血小板的情況下用於患者/疾病的治療劑，特別是用於血小板減少症的治療劑，其包含作為活性成分的、所述抗-人c-Mpl激動劑抗體。
背景技術：
：<TPO和TPO受體〉血小板生成素(TPO)是一種促進巨核細胞和血小板體內增殖的血細胞生成因子。人TPO是一種全長包含332個胺基酸殘基的糖蛋白，並且已知其N-末端序列對於人TPO活性起重要作用。人TPO顯示其結合細胞膜上TPO受體的功能。c-Mpl是目前所知唯一的TPO受體。人c-Mpl是一種具有一個跨膜域的糖蛋白，如果該糖蛋白含有信號肽則包含635個胺基酸，其成熟形式包含610個胺基酸，並且其屬於I型細胞因子受體家族。已報導了人c-Mpl的mRNA序列和蛋白序歹ll(Genbank:NM—005373,NP一005364)。同一家族分子的實例包括促紅細胞生成素受體(EpoR)、G-CSF受體(G-CSFR)和白介素3受體(IL-3R)。人c-Mpl在其胞外區域具有2個CRH(細胞因子受體同系物)域(從N-末端起稱為CRH1和CRH2),並且上述域包含該細胞因子受體家族所特有的WSXWS基序。胞內域包含2條序列一Boxl和Box2,它們是信號轉導所必需的。這提示TPO結合CRHl並使c-Mpl二聚體化，由此轉導信號；然而，該結合及激活的特定方式尚未闡明。一旦c-Mpl二聚體化，就激活已結合於胞內域的信號激酶，並在細胞內傳遞磷酸化信號。已知TPO-Mpl信號激活Jak-STAT、PI3K-Akt和Ras-MAPK途徑。據報導，相對於野生型小鼠，TPO或c-Mpl缺失的小鼠血小板計數減少大約10%-20%，表明該TPO-Mpl系統是調節血小板計數的關鍵系統。不僅在巨核細胞中，在未分化的造血祖細胞或造血幹細胞中也觀察到c-Mpl表達。已知與c-Mpl-陰性級分相比，骨髓中c-Mpl-陽性細胞級分具有更高的重建骨髓能力。還已知c-Mpl-缺陷小鼠具有減少數量的造血幹細胞以及;鹹少悽t量的巨才亥糹田月包和血小4反(HiroshiMiyazaki，"FutureProspectsforThrombopoietin,"JapaneseJournalofTransfusionMedicine,46(3)，311-316，2000;和Murone,M.等，StemCell16:1-6,1998)。這些發現暗示在幹細胞水平上或其後，TPO-Mpl系統與造血系統有關。由於TPO的克隆，因此已預計到其作為血小板減少症治療劑的應用，並且在過去已進行關於兩種重組TPOs:全長人TPO(rhTPO)和包含構成人TPO活性部位的、N-末端163個胺基酸的聚乙二醇化肽序列的PEG-rHuMGDF(聚乙二醇化的重組人巨核細胞增殖和發育因子)的臨床試驗(Kuter,DJ等，Blood100(10):3457-69,2002)。在該臨床試驗中，發現重組TPOs成功地增加了健康志願者和特發性血小板減少性紫瘕(ITP)患者的血小板。同樣地，已證明了減輕由非清髓性化學療法引起的血小板減少症的效果。儘管病例數目少，但已報導了重組TPOs對再生障礙性貧血(AA)或骨髓增生異常症候群(MDS)患者的效果(Yonemura,Y.等，IntJHemat(82)307-309,2005;和Komatsu，N.等,Blood96,296a,2000)。已研究了多種具有與TPO—樣的、c-Mpl-介導的信號傳導性質，但具有完全不同分子性質的TPO模擬物(Broudy，VC等，Cytokine25(2):52-60,2004;和WangB.等,ClinPharmacolTher.，76(6):628-38,2004)。已知的模擬物大致分為，例如肽低分子、非肽低分子、抗體衍生的分子、激動劑抗體等。已知的抗-c-Mpl激動劑人抗體的實例包括12B5、12E10和12D5(WO99/10494)。以諸如完整IgG這樣的完整抗體不具有抗原代人細胞的活性。在本申請中，術語"原代人細胞"指作為TPO在體內的作用對象的細胞，例如來源於人臍帶血或骨髓的CD34+細胞，但不是對TPO高敏感的、特別建立的細胞系，或其中已導入並高水平表達TPO受體基因的細胞。該術語指作為TPO在體內的作用對象的細胞，例如來源於人臍帶血或骨髓的CD34+細胞。已知的鼠激動劑抗體的實例包括BAH-l(WO99/03495;和DengB.等，Blood92(6):1981-1988,1998)和VB22B(WO2005/056604)。已知鼠抗體在人血中顯示抗原性並因此不適合作為藥物。一般而言，很難利用，例如CDR嫁接，來以完整抗體形式將激動劑抗體人源化並同時保持活性(WO2005/056604;和JiHeeSon等，JournalofImmunologicalMethods286:187-201,2004)。即使存在這樣的已知激動劑抗體，也不容易產生作用於原代細胞的激動劑人抗體。如上所述與TPO模擬物有關的、抗體衍生的低分子也代表了某一類型的激動劑抗體。已報導通過修飾抗體的一部分製備了雙抗體和單鏈(Fv)2(sc(Fv)2)(WO99/10494;和WO2005/056604)。然而，通過這樣的技術所產生的、經修飾的抗體可具有由分子深度修飾引起的抗原性，因此不利於應用。同樣地，它們在血中的半衰期應較完整抗體短。因此，使用這樣的修飾抗體作為藥物仍存在問題。由此，完整抗體具有用作藥物的特性，例如低抗原性或在血中半衰期持久；然而，如上所述，很難以完整抗體形式產生具有足夠活性的激動劑人抗體。因此，本發明人已嘗試獲得具有足夠活性而無需深度修飾抗體結構的激動劑人抗體。結果，本發明人現已成功獲得如下所述的目的抗體。此外，本發明人現已成功修飾了抗體鉸鏈區，由此改善了激動活性。根據本發明產生的抗體適合作為血小板減少症治療劑。
發明內容本發明的一個目的是提供一種新的抗-人c-Mpl激動劑抗體。在本發明中，"抗體"能將基本上相當於天然配體一TPO的信號轉導至人c-Mpl(現有技術中用完整抗體難以實現該信號轉導)並對原代人細胞具有增殖刺激活性。本發明的另一個目的是提供用於改善激動劑抗體活性而無需將抗體片段化的技術，提供了具有適合藥物所需特性，如抗原分子原本具有的長半衰期和低抗原性的，新的抗-人c-Mpl激動劑抗體。為了達到上述目的，本發明人已對抗-人c-Mpl激動劑抗體進行了集中研究。結果，本發明人成功獲得以完整抗體形式的、產生基本上相當於天然配體所產生的信號、並具有針對人原代細胞活性的人抗體。此外，本發明人已對所獲得的激動劑抗體進行了集中研究。結果，找到用於改善抗體激動活性而無需使其片段化的修飾技術，由此完成了本發明。具體來說，本發明包括下列特徵。1.抗人血小板生成素受體的激動劑抗體根據本發明的抗人血小板生成素受體激動劑抗體包括下列抗體(1)-(6)。(1)抗人血小板生成素受體激動劑抗體，其中該抗體包括含有下列(i)-(iii)任一胺基酸序列的抗體恆定區(i)人抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區的胺基酸序列，(ii)具有人抗體亞類之間域取代的重鏈恆定區的胺基酸序列和人抗體輕鏈恆定區的胺基酸序列，或(iii)在胺基酸序列(i)或(ii)中具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和能結合併激活人血小板生成素受體的抗體可變區；以及其中，所述抗體具有下列特性(a)和/或(b):(a)如利用人臍帶血衍生的CD34+細胞進行的CFU-MK集落形成試驗所測定的、該抗體在10,000ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成；和/或(b)在利用UT7/TPO細胞進行的細胞增殖試驗中，該抗體的活性是結構如下所述的PEG-rHuMGDF的50%以上、且50%有效濃度(EC50)為100nM或以下。在本申請中，人抗體亞類包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。人免疫球蛋白恆定區等的序列可獲得自，例如NCBI網站(如GenBank或UniGene)。實例包括人IgGl重鏈恆定區，登錄號J00228;人IgG2重鏈恆定區，登錄號J00230;人IgG3重鏈恆定區，登錄號X03604;人lgG4重鏈恆定區，登錄號K01316;人輕鏈K恆定區，登錄號V00557、X64135和X64133;以及人輕鏈X恆定區，登錄號X64132和X64134。在本申請中，術語"利用人臍帶血衍生的CD34+細胞的CFU-MK集落形成試驗"指如以下實施例6中所描述的試驗技術，並且可基於所述試驗技術測定集落形成所需抗體濃度。在本申請中，術語"利用UT7/TPO細胞進行的細胞增殖試驗"指如以下實施例5中所描述的試驗技術，並且可基於所述試驗技術測定增殖活性和EC50。在本申請中，術語"PEG-rHuMGDF"指包含如SEQIDNO:1所示的胺基酸序列的分子，所述分子是對由下述大腸桿菌產生的多肽進行提取、再摺疊、純化並將聚乙二醇(PEG)部分共價連接至其氨基末端製備的，上述大腸桿菌經包含編碼下述截短蛋白的cDNA的質粒轉化，所述的截短蛋白包含人TPO氨基末端受體結合域(Ulich等，Blood86:971-976,1995)，該分子具有下列結構PEG-NH-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVMAARGQLGPTCLSSLLGQLSGQVRLLLGALQSLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVRRAPPTTAVPS-COOH.在本申請中，術語"激活人c-Mpl"指在表達人c-Mpl的細胞中胞內轉導人c-Mpl-相關信號。在本申請中，術語"幾個"指例如2-約10,如2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3的整數。(2)在具有如通過集落形成試驗所測定的誘導集落形成活性，和/或如通過利用UT7/TPO細胞進行的細胞增殖試驗所測定的細胞增殖活性的抗體之中，具備在10,000ng/ml或更低、優選1，000ng/ml或更低，更優選100ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成活性的根據上述(l)的抗體。(3)具有PEG-rHuMGDF的50%以上、優選70%以上，更優選90%以上的細胞增殖活性，且50。/。有效濃度(EC50)為100nM以下、優選10nM以下，更優選lnM以下的、根據上述(l)的抗體。(4)根據上述(l)的抗體，其顯示如通過集落形成試驗和細胞增殖試驗所測定的下述活性(i)具有下列特性(a)和(b)的抗人血小板生成素受體激動劑抗體(a)如通過利用人臍帶血衍生的CD34+細胞的CFU-MK集落形成試驗所測定的，該抗體在10,000ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成；和(b)在利用UT7/TPO細胞進行的細胞增殖試驗中，該抗體的最大活性是具有以下結構的PEG-rHuMGDF的50%或以上，50%有效濃度(EC50)為100nM或以下。(ii)具有下列特性(a)和(b)的抗人c-Mpl激動劑抗體(a)如通過利用人臍帶血衍生的CD34+細胞的CFU-MK集落形成試驗所測定的，該抗體在1,000ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成；和(b)在利用UT7/TPO細胞進行的細胞增殖試驗中，該抗體的最大活性是具有以下結構的PEG-rHuMGDF的70%或以上，50%有效濃度(EC50)為10nM或以下。(iii)具有下列(a)和(b)特性的抗人c-Mpl激動劑抗體(a)如通過利用人臍帶血衍生的CD34+細胞的CFU-MK集落形成試驗所測定的，該抗體在100ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成；和(b)在利用UT7/TPO細胞進行的細胞增殖試驗中，該抗體的最大活性是具有以下結構的PEG-rHuMGDF的90%或以上，50%有效濃度(EC50)為lnM或以下。(5)包含重鏈可變區胺基酸序列和輕鏈可變區胺基酸序列的、根據上述(1)的抗體，其中所述胺基酸序列選自下述的胺基酸序列(a)-(h)(在此括號中是可變區序列所來源的、以下實施例中所描述的抗體名稱)(a)包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈可變區和包含如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(抗體名稱7-10);(b)包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重鏈可變區和包含如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(抗體名稱4-49);(c)包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈可變區和包含如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(抗體名稱6-4-50);(d)包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈可變區和包含如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列的輕鏈可變區(抗體名稱6-5-2);(e)包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含下述胺基酸序列的輕鏈可變區，所述胺基酸序列為在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(f)包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含下述胺基酸序列的輕鏈可變區，所述胺基酸序列為在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(g)包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含下述胺基酸序列的輕鏈可變區，所述胺基酸序列為在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和(h)包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含下述胺基酸序列的輕鏈可變區，所述胺基酸序列為在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列。(6)根據上述(l)-(5)任一項的抗體，其中抗人c-Mpl激動劑抗體為人抗體。2.重M/修飾的激動劑抗體根據本發明，重鏈修飾的激動劑抗體包括下列抗體。(1)激動劑抗體，其中重鏈恆定區的上鉸鏈區包含下列胺基酸序列(a)和(b)中的任一項(a)如SEQIDNO:10所示的胺基酸序列；或(b)如SEQIDNO:11所示的胺基酸序列，和其中從中間鉸鏈區至C末端包含人免疫球蛋白G4胺基酸序列，或在人免疫球蛋白G4胺基酸序列中涉及抗體依賴的細胞毒性(ADCC)活性等的、與對於激動劑抗體而言較不可取的特性有關的區域中具有突變的胺基酸序列。在本申請中，術語"上鉸鏈"指根據KabatEU編號系統(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.，1991)從第216位至第226位的N-末端序列。術語"中間鉸鏈"指根據KabatEU編號系統從第226位至第231位的N-末端序列。圖4B顯示了關於包含人免疫球蛋白G4的各亞型的上鉸鏈部分的胺基酸序列、中間鉸鏈部分的胺基酸序列和所述部分前後的胺基酸序列。在該圖中，CH1指鄰接上鉸鏈的CH1區的一部分，CH2指在CH2區中稱為下鉸鏈的部分。(2)包含重鏈的抗體，其中重鏈恆定區從中間鉸鏈區至C末端的區包含下述胺基酸序列，所述胺基酸序列為在人免疫球蛋白G4胺基酸序列中第228位用脯氨酸取代絲氨酸、第235位用穀氨酸取代亮氨酸的胺基酸序列，在此所述位置基於KabatEU編號系統。(3)根據上述(2)的重鏈修飾的抗體，其是如下列(i)或(ii)所示的抗人c-Mpl激動劑人抗體。(i)包含重鏈的抗人c-Mpl激動劑抗體，其中重鏈恆定區的上鉸鏈區包含胺基酸序列(a)或(b)中的任一項(a)如SEQIDNO:10所示的胺基酸序列；或(b)如SEQIDNO:11所示的胺基酸序列，和其中重鏈恆定區從中間鉸鏈區至C末端的區包含下述胺基酸序列，所述胺基酸序列為人免疫球蛋白G4胺基酸序列，或在人免疫球蛋白G4胺基酸序列中第228位用脯氨酸取代絲氨酸、在第235位用穀氨酸取代亮氨酸的胺基酸序列，在此所述位置基於KabatEU編號系統。(ii)根據更優選的實施方案，上述(i)的抗人c-Mpl激動劑抗體選自抗體(a)-(h):(a)含有下述重鏈和輕鏈的抗體，所述的重鏈包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列，所述的輕鏈包含如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列；(b)含有下述重鏈和輕鏈的抗體，所述的重鏈包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列，所述的輕鏈包含如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列；(c)含有下述重鏈和輕鏈的抗體，所述的重鏈包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列，所述的輕鏈包含如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列；(d)含有下述重鏈和輕鏈的抗體，所述的重鏈包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列，所述的輕鏈包含如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列；(e)含有下述重鏈和輕鏈的抗體，所述的重鏈包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列，所述的輕鏈包含在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中具有一個或幾個構架區胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(f)含有下述重鏈和輕鏈的抗體，所述的重鏈包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列，所述的輕鏈包含在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(g)含有下述重鏈和輕鏈的抗體，所述的重鏈包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列，所述的輕鏈包含在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和(h)含有下述重鏈和輕鏈的抗體，所述的重鏈包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列，所述的輕鏈包含在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列。3.抗人c-Mpl激動劑抗體的製藥用途和藥物組合物本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體能在體內和在體外結合併激活c-Mpl受體，和/或能刺激血小板(即血小板生成活性)及血小板祖細胞產生(即血巨核細胞生成活性)。包含作為活性成分的、本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體的藥物組合物及其製藥用途的具體實例包括(1)藥物組合物，包含作為活性成分的、上述第l節(l)-(6)中和上述第2節(3)中所述的任一抗體。(2)用於增加血小板的藥劑，其包含作為活性成分的、上述第1節(l)-(6)中和上述第2節(3)中所述的任一抗體。(3)根據上述(2)的用於增加血小板的藥劑，其在實施骨髓移植或臍帶血移植時用於促進血小板恢復。(4)用於血小板減少症的治療劑，其包含作為活性成分的、上述第1節(l)-(6)中和上述第2節(3)中所述的任一抗體。(5)根據上述(4)的用於血小板減少症的治療劑，其中血小板減少症是下列疾病(a)-(f)中的任一項(a)特發性血小板減少性紫癜(ITP);(b)癌症化療後血小板減少症；(c)再生障礙性貧血；(d)骨髓增生異常症候群(MDS);(e)可歸因於肝病的血小板減少症；或(f)骨髓移植或臍帶血移植後的血小板減少症。(6)用於增加血細胞的藥劑，包含作為活性成分的、用於在造血幹細胞移植後促進血細胞恢復的人c-Mpl激動劑抗體。(7)根據上述(6)的用於增加血細胞的藥劑，其包含作為活性成分的、上述第1節(l)-(6)中和上述第2節(3)中所述的任一抗體。4.產生本發明抗體的方法可利用產生本發明抗體的雜交瘤製備本發明的抗體。可選地，可從抗體產生細胞，如雜交瘤，克隆編碼單克隆抗體的基因，並可利用基因重組技術將克隆的基因整合入適當的載體中來產生重組抗體。產生本發明抗體的方法的優選實例包括下述方法。產生抗人c-Mpl激動劑抗體的方法，包括製備哺乳動物細胞，培養哺乳動物細胞，以及從培養所述細胞的培養基中分離和純化編碼包含所述重鏈和輕鏈的抗體的DNA的表達產物，所述哺乳動物細胞帶有包含編碼重鏈的核苷酸序列的DNA和包含編碼輕鏈的核苷酸序列的DNA,以及包含控制所述DNA表達的核苷酸序列的一種或多種DNA，其中上述的核苷酸序列選自下述的(a)-(h):(a)編碼包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列；(b)編碼包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重t連的核苷酸序列，和編碼包含如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列；(c)編碼包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列；(d)編碼包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列的輕鏈的核苦酸序列；(e)編碼包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含下述胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列，所述胺基酸序列為在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中具有一個或幾個構架區胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(f)編碼包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含下述胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列，所述胺基酸序列為在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(g)編碼包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含下述胺基酸序列的輕鏈的核香酸序列，所述胺基酸序列為在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和(h)編碼包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈的核香酸序列，和編碼包含下述胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列，所述胺基酸序列為在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列。5.本發明的DNA本發明的DNA的實例如下。(1)包含編碼抗人Mpl激動劑抗體重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列新的DNA，其包含編碼選自下列(a)-(d)的胺基酸序列的核苷酸序列(a)如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列;(b)如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列;(c)如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列；和(d)如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列。(2)包含編碼抗人Mpl激動劑抗體輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列的新的DNA，其包含編碼選自下列(a)-(h)的胺基酸序列的核普酸序列(a)如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列;(b)如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列；(c)如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列；(d)如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列;(e)在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(f)在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(g)在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和(h)在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列。(3)根據上述(1)或(2)的DNA，其編碼包含可變區和恆定區的抗體重鏈或輕鏈。(4)根據上述(3)的編碼抗體重鏈的DNA，其中抗體重鏈恆定區的上鉸鏈區包含下列胺基酸序列(a)和(b)任一項(a)如SEQIDNO:10所示的胺基酸序列；或(b)如SEQIDNO:11所示的胺基酸序列，和其中重鏈恆定區從中間鉸鏈區至C末端的區包含人免疫球蛋白G4胺基酸序列，或在人免疫球蛋白G4胺基酸序列中第228位用脯氨酸取代絲氨酸、第235位用穀氨酸取代亮氨酸的胺基酸序列，在此所述位置基於KabatEU編號系統。本說明書包括如本申請優先權文件日本專利申請第2006-81322號和第2006-299554號說明書和/或附圖中所披露的所有或部分內容。附圖簡述圖1顯示了激動劑抗體的結合活性。利用FDCP-hMpl細胞和FDCP2細胞(FDCP親本細胞)通過流式細胞術檢查所示抗體的結合活性(參見實施例2)。結果顯示每種抗體都能特異性結合人c-Mpl。圖2A-D顯示了UT7/TPO試驗結果，特別是在UT7/TPO細胞增殖試驗中純化的抗體(IgGl)的增殖曲線(參見實施例5)。圖3顯示了CFU-Mk試驗結果，其是利用人臍帶血衍生的CD34+細胞的集落形成試驗結果(參見實施例6)。圖4A顯示了與重組抗體製備相關的N5KG1載體結構。"C"代表巨細胞病毒啟動子/增強子，"B"代表牛增殖激素多腺苷酸化區，"N1"代表新黴素磷酸轉移酶的外顯子1，"K"代表人免疫球蛋白k恆定區，"G1"代表人免疫球蛋白恆定區，"BT"代表鼠P球蛋白主要啟動子，"N2"代表新黴素磷酸轉移酶的外顯子2,"D"代表二氫葉酸還原酶，"VH"代表重鏈可變區以及"VL"代表輕鏈可變區。圖4B顯示了天然人免疫球蛋白胺基酸序列，以及與重組抗體製備有關的IgG4PE、IgG4344、IgG4344hl、IgG4344uh和IgG4344uhm的CH1區和鉸鏈區(即上鉸鏈和中間鉸鏈區)胺基酸序列。圖4C(即圖4C-l-圖4C-3)顯示了製備用於重組抗體製備的表達載體N5KG1—7-10和N5KG1—4-49的過程。圖4D(即圖4D-l-圖4D-3)顯示了製備用於重組抗體製備的表達載體N5KG1—6-4-50和N5KG1—6-5-2的過程。圖4E顯示了與重組抗體製備有關的不同修飾重鏈的恆定區序列。圖4F(即圖4F-1和圖4F-2)顯示了與重組抗體製備有關的7-10G4344uhm重鏈的核酸和胺基酸序列。圖4G顯示了與重組抗體製備有關的7-10G4344uhm輕鏈的核酸和胺基酸序列。圖5顯示了鉸鏈修飾抗體的活性。圖5A代表通過UT7/TPO細胞增殖試驗測定的4-49Gl、4-49G3311和4-49G3331的活性，以及圖5B代表通過UT7/TPO細胞增殖試驗測定的7-10G4344uhm和4-49G4344uhm的活性。圖6A顯示了涉及激動劑抗體7-10G4344uhm和4-49G4344uhm的信號傳導分析結果(參見實施例11)。圖6B顯示了涉及激動劑抗體6-5-2G1和6-5-2G3344的信號傳導分析結果(參見實施例11)。圖7顯示了人血小板引發效應(primingeffect),其是實施例12中所述測試的結果。顯示了激動劑抗體7-10G3311或4-49G3311對人血小板的引發效應。同樣地，僅有各自激動劑抗體(沒有ADP)不會發生血小板凝集。圖8是顯示在施用激動劑抗體於食蟹猴後，其血小板計數改變的圖。如實施例13中所描述的，將激動劑抗體施用於食蟹猴，然後監測血小板計數。箭頭指示第一次施用(PEG-rHuMGDF)和第二次施用(激動劑抗體)的日期。圖9A顯示了在1,000個CD34+細胞(右圖)或10,000個CD34+細胞(左圖)移植入NOG臍帶血移植小鼠模型，隨後施用分析物後，隨時間推移的外周人血小板計數改變。"Pre"指示施用前的血小板計數。圖9B顯示了在1,000個CD34+細胞(右圖)或10,000個CD34+細胞(左圖)移植入NOG臍帶血移植小鼠模型，隨後施用測試物質後6周其骨髓中人祖細胞計數(菌落計數；GM+E+GEM)。"祖細胞計數"指除巨核細胞之外的總菌數，"GM"指粒細胞和巨噬細胞，"E"指紅細胞以及"GEM"指粒細胞-巨噬細胞-紅細胞集落生成單位。結果表示為平均值士標準差(平均值士SD)。"媒介物(Vehicle)"代表作為對照的PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)以及"NT"代表未處理的。圖9C顯示了在1,000個CD34+細胞(右圖)或10,000個CD34+細胞(左圖)移植入NOG臍帶血移植小鼠模型，隨後施用分析物後6周外周人細胞的嵌合率。"媒介物"代表作為對照的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)以及"NT"代表未處理的。圖10顯示了在施用激動劑抗體於人MplTg小鼠後血小板計數曰變化。將TPO或媒介物(PBS)施用於作為對照的Tg小鼠，將10pg7-10G4344uhm施用於非-Tg小鼠(野生型；非-Tg)，試驗結果示於圖中。結果顯示為平均值士SEM。圖11顯示了激動劑抗體7-10G4344uhm的輕鏈修飾的抗體與FM3A-hMpl細月包的結合。圖12顯示了激動劑抗體7-10G4344uhm的輕鏈修飾的抗體的UT-7/TPO細胞增殖試驗結果。實施發明的最佳方式以下，本發明將更詳細地描述。本發明提供了作用於原代人細胞的抗-人c-Mpl激動劑人抗體。可通過用人Mpl重組蛋白或人Mpl表達細胞免疫產生人抗體的小鼠(如KM小鼠tm，KirinBreweryCo.,Ltd.),由常規製備單克隆抗體的方法分離本發明的抗體。可選地，抗體基因可分離自雜交瘤，可構建表達載體，可製備表達細胞，也可在上述過程期間製備具有不同恆定區的重組抗體。1.本發明的抗體在本申請中，術語"抗體"指包含Fab、鉸鏈和Fc區的抗體。抗體的實例包括天然存在的抗體，或通過經已知技術獲得的產生單克隆抗體的雜交瘤產生的、具有類似於天然存在抗體的結構的抗體，從事先獲得的抗體基因遺傳工程化的抗體，以及通過定點誘變部分修飾遺傳工程化的抗體。本發明的抗人cMpl激動劑抗體和重鏈修飾的激動劑抗體描述如上。一般而言，激動劑抗體結合細胞膜上的靶分子形成複合物，由此傳遞信號。由於二價抗體與兩個分子結合，可預期抗形成同型二聚體的細胞因子受體家族，如促紅細胞生成素受體(EpoR)、G-CSF受體(G-CSFR)或血小板生成素受體(c-Mpl)的激動劑抗體形成二聚體。許多僅具有Fab片段的激動劑抗體不顯示活性的事實暗示了這一點。在複合物形成時兩個抗原結合部位容易彼此接近很重要。以完整抗體形式存在不具有足夠活性的抗體，當其轉變為低分子形式，例如sc(Fv)2時，顯示升高的激動活性的事實暗示了這一點。然而，這樣的低分子抗體由於其相當程度的修飾可能產生抗原性問題，並且其血液半衰期可能縮短。因此，利用低分子抗體作為藥物尚有待解決的問題。為了在實踐中利用完整抗體所具有的、作為藥物使用有益的，例如低抗原性或血液半衰期長的這樣的特性，亟待具有高活性而無明顯結構修飾的激動劑抗體。如以下實施例2中所描述的，本發明人現已改良了常規免疫方法，獲得了以完整抗體形式存在的、具有高活性的抗-人c-Mpl激動劑抗體。上述改良的免疫的實例是用高表達細胞林免疫，以及用持續活化的突變受體表達細胞免疫。如以下實施例6中所述，通過利用人臍帶血衍生的CD34+細胞的集落培養，證實了所述的激動劑抗體誘導了集落形成，暗示該抗體可用作藥物。本發明人現已進一步努力改善鉸鏈部分柔性，以增加複合物形成效率並增加激動活性。高柔性序列的實例例如甘氨酸接頭。作為替代性的實例，還可利用在人IgGs中具有最高柔性的IgG3鉸鏈區。最好利用天然序列以致不削弱抗體的低抗原性。因此，IgG3鉸鏈序列是更優選的。此外，可通過遺傳工程修飾製備下述抗體，其具有最適於作為具有低細胞毒性和高鉸鏈柔性的激動劑抗體恆定區的人IgG3上鉸鏈區，以及作為來自中間鉸鏈至C-末端的區的人IgG4序列。更具體地說，通過本領域公知的遺傳工程修飾將抗體轉變為不同亞類的抗體(如參見EP314161)，即通過遺傳工程操作編碼本發明抗體可變區的DNA可將抗體修飾為不同亞類的抗體。此外，人IgG4重鏈恆定區第228位的絲氨酸可改變為脯氨酸，由此抑制由IgG4分子內交聯(S-S鍵)形成單體，上述的位置基於EU編號系統(參見Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,NIH出版物編號91-3242)。同樣地，第235位的亮氨酸可改變為穀氨酸，由此降低抗體依賴的細胞毒性(ADCC)的活性。包含這樣的2個突變的IgG4稱為IgG4PE。如上所述，本發明人已生產了最適於激動劑抗體、且具有低細胞毒性和高鉸鏈柔性的恆定區。該恆定區具有人IgG3的上鉸鏈區，從中間鉸鏈至C-末端的區具有人IgG4序列。該恆定區可與抗-c-Mpl激動劑抗體的可變區相結合來產生具有更高安全性和活性的激動劑抗體。2.製備本發明抗體的方法可通過多種技術產生本發明的抗體。首先，製備本發明抗體需要雜交瘤。可通過使用如以下實施例1中所描述的、與本發明有關抗原的免疫小鼠或其他動物產生人抗體，具體來說，免疫諸如產生人抗體的轉基因小鼠之類的非人哺乳動物。可根據常規技術獲得單克隆抗體，即通過讓獲得自致敏動物的抗體產生細胞與不具有產生自身抗體能力的骨髓瘤細胞融合，由此獲得雜交瘤，培養雜交瘤並選擇產生顯示與用作免疫的抗原具有特異性親和力的單克隆抗體的克隆。根據需要，從所獲得的抗體中進一步選擇激動劑抗體，可通過用於評價與激動劑抗體的耙受體起反應的配體活性技術的方法進行該選擇。可通過用於評價TPO活性方法的方法，例如以下實施例5中所描述的UT7/TPO細胞增殖試驗，適當地選擇抗人c-Mpl激動劑抗體。本發明抗人c-Mpl激動劑抗體、特別是單克隆抗體的產生包括下列步驟。更具體而言，(1)純化用作免疫原的生物多聚物和/或製備包含在細胞表面過表達的抗原蛋白的細胞；(2)通過注射抗原免疫動物、採血、測定抗體效價並決定提取脾等時間，然後製備抗體產生細胞；(3)製備骨髓瘤細胞；(4)抗體產生細胞和骨髓瘤細胞之間的細胞融合；(5)選擇產生目的抗體的雜交瘤；(6)分離單細胞克隆(純培養抹)；(7)任選地，培養雜交瘤用於大量生產單克隆抗體，或繁殖其中已移植了雜交瘤的動物；(8)檢查由此產生的單克隆抗體的生理活性和識別/特異性，或作為標記試劑用於性質測定；(9)克隆單克隆抗體基因，並製備重組抗體；等等。以下，根據上述步驟詳細描述用於製備抗人c-Mpl的激動劑單克隆抗體的方法，但用於產生這樣的抗體的方法並不受限於此。例如，還可利用除脾細胞之外的抗體產生細胞和骨髓瘤細胞。(1)抗原一般而言，當要獲得人c-Mpl抗體時，由於人c-Mpl蛋白的一級結構是已知的(參見GenBank:NP—005364),因此通過本領域公知的方法由c-Mpl胺基酸序列化學合成肽，所獲得的肽可用作抗原。同樣地，缺少c-Mpl跨膜區和膜內區的可溶性c-Mpl重組蛋白可用作抗原。可選地，多種人血巨核細胞細胞系或人c-Mpl表達細胞系，例如強制表達c-Mpl的細胞系，可用作所述抗原。儘管多種人血巨核細胞細胞系或強制表達細胞系被認為是人c-Mpl表達細胞系，但在這樣的細胞系中的c-Mpl表達水平僅為每細胞中幾千分子，因此這樣的細胞系不適合用作抗原。當用包含向FDCP2(即，鼠造血細胞系)中導入了人c-Mpl的表達細胞系FDCP-hMpl(參見FEBSLett.Oct21,1996;395(2-3):228-234)免疫產生人抗體的小鼠(如KM小鼠T,時，抗體效價增加實際上並不足夠，且無法獲得該hMpl-特異性人抗體。當人血巨核細胞細胞系用作為抗原時，還誘導出與其他膜分子反應的抗體，以致於利用所述細胞系並不總能適合於有效誘導c-Mpl-特異性抗體。當將抗原蛋白表達細胞系，非人c-Mpl抗體，用於獲得具有激動活性抗體的目的進行免疫時，優選顯示高表達水平的細胞。特別優選利用已導入並以高水平表達人c-Mpl的鼠細胞系，特別是MHC-相容的細胞系，作為宿主細胞。鼠細胞系的實例包括以下實施例1中所描述的細胞，即通過利用攜帶有全長人c-Mpl基因的pEF-MPL635或pCMV-MPL635作為表達載體、鼠L929或FM3A細胞系作為宿主細胞獲得的細胞。除野生型人c-Mpl之外，可以使用以相同方式強制表達人c-Mpl的持續活化突變體的細胞系(如在第508位的Trp已突變為Ser，且以配體依賴的方式持續傳遞激動信號的突變體；AbeM.等，Leukemia,2002年8月；16(8):1500-1506)。由於預計這樣的突變體具有不同於野生型的三維結構，因此針對這樣的持續活化突變體顯示高親和力的抗體可顯示強激動活性。上述顯示強制表達的細胞系可任選地與人cMPL、其胞外可溶區等共同用作為抗原。(2)用於製備抗體產生細胞的方法將上述(l)中獲得的抗原與弗氏完全或不全佐劑，或諸如鉀礬的佐劑混合，並將所得到的混合物施用於試驗動物作為免疫原。最佳的試驗動物是通過遺傳修飾能產生人抗體的小鼠(即人抗體產生小鼠)。用於本發明中的人抗體產生小鼠(如KM小鼠tm)缺少內源性小鼠免疫球蛋白(Ig)重鏈和小鼠K輕鏈，並且這樣的小鼠包含同時含有人Ig重鏈基因(SC20)的染色體14片段和人IgK鏈轉基因(KCo5)。通過將具有人Ig重鏈基因座的譜系A小鼠與具有人IgK鏈轉基因的譜系B小鼠雜交製備該小鼠。譜系A是內源性Ig重鏈和遭破壞的K輕鏈兩者的純合子，並且是攜帶有子代可傳遞的染色體14片段(SC20)的小鼠譜系(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，2000.Vol.97:722)。譜系B是內源性小鼠Ig重鏈和K輕鏈都缺陷的純合子，並且是攜帶有人IgK鏈轉基因(KCo5)的小鼠譜系(NatBiotechnol.,1996,Vol.14:845)。因此，缺少鼠Ig重鏈和K鏈的KM小鼠能產生人抗體。當免疫小鼠時，通過皮下注射、腹膜內注射、靜脈注射、皮內注射、肌內注射或爪墊注射，優選腹膜內注射、爪墊注射或靜脈注射的任一種施用免疫原。免疫可實施一次獲以合適的時間間隔(優選以2-4周的時間間隔)實施幾次。此後，測定免疫動物血清中針對抗原的抗體效價，顯示足夠高的抗體效價的動物可用作抗體產生細胞的來源，由此增加隨後操作的效果。一般而言，在最後一次免疫後3-5天獲得自動物的抗體產生細胞優選用於隨後的細胞融合。可使用的測定抗體效價方法的實例包括各種已知技術，例如流式細胞術、放射性同位素免疫測定(在下文中稱為"RIA法")、固相酶免疫測定(在下文中稱為"ELISA，，)、螢光抗體法和被動血凝反應。從檢測靈敏度、即時性、準確度或操作自動化可能性的觀點來看，例如流式細胞術或ELISA是更優選的。在本發明中，可以下述方法測定抗體效價，例如，在流式細胞術情況下。首先，讓抗原表達細胞與含人抗體樣品(如小鼠血清、雜交瘤培養物上清液或純化的抗體)反應。接著，添加作為第二抗體的已用螢光進行標記的抗人抗體的抗體以結合人抗體，洗滌所得到的產物，並通過螢光測定結合細胞的第二抗體的量。由此測定抗體效價。(3)製備骨髓瘤細胞方法來源於哺乳動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人的沒有產生自身抗體能力的細胞可用作為骨髓瘤細胞。一般而言，優選使用建立自小鼠的骨髓瘤細胞系，例如8-氮鳥嘌呤抗性小鼠(BALB/c)4汙生的骨髓瘤細胞系P3X63Ag8U.1(P3-U1)(Yelton，D.E.等，CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,81,1-7,1978)、P3/NSI/l-Ag4-l(NS畫1)(Kohler,G.等，EuropeanJ.Immunology,6,511-519,1976)、Sp2/0-Agl4(SP-2)(Shulman,M.等,Nature,276,269-270,1978)、P3X63Ag8.653(653)(Kearney,J,F.等，J.Immunology,123，1548-1550,1979)、P3X63Ag8(X63)(Horibata，K.andHarris,A.W.Nature,256,495-497,1975)等。在合適的培養基，例如8-氮鳥噪呤培養基(即含8-氮鳥嘌呤、補充有穀氨醯胺、2-巰基乙醇、慶大黴素和胎牛血清的RPMI-1640培養基(在下文中稱為"FCS"))、Iscove氏改良的Dulbecco氏培養基(在下文中稱為"IMDM"),或Dulbecco氏改良的Eagle培養基(在下文中稱為"DMEM")中對這樣的細胞系進行傳代培養。在細胞融合前，在常規培養基(如含10%FCS的DMEM培養基)中對所述細胞系傳代培養3或4天，以便確保在細胞融合之曰2><107個或更多細胞的數量。(4)細力包融合抗體產生細胞是血漿細胞及其祖細胞，即淋巴細胞。這樣的細胞可獲得自個體的任何部位。一般而言，抗體產生細胞可獲得自脾細胞、淋巴結、骨髓、扁桃體、外周血或任何它們合適的組合。最通常使用脾細胞。在最後一次免疫後，從顯示特定抗體效價的小鼠上切下含有抗體產生細胞的部位，例如脾，來製備產生抗體的脾細胞。隨後，可將脾細胞與骨髓瘤細胞融合。目前，最常用於使脾細胞與步驟(3)中獲得的骨髓瘤細胞融合的技術是一種涉及使用聚乙二醇的方法，該聚乙二醇細胞毒性相對低並提供了簡單的融合操作。舉例來說，該方法包括下列步驟。用無血清培養基(如DMEM)或磷酸鹽緩衝鹽水(在下文中稱為"PBS，，)徹底洗滌脾細胞和骨髓瘤細胞，將脾細胞與骨髓瘤細胞以約5:1-10:1比例混合，然後離心所得到的產物。除去上清液，使沉澱的細胞團塊充分鬆散，並在攪拌的同時向其中逐滴添加含1ml50%(w/v)聚乙二醇(分子量1000-4000)的無血清培養基。此後，緩慢添加10ml無血清培養基，隨後離心。再次棄去上清液，將沉澱的細胞懸浮於含適當量的次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(在下文中稱為"HAT")和人白介素-6(在下文中稱為"IL-6")(在下文中稱為"HAT培養基")的常規培養基中，將所得到的懸液分配到培養平板(在下文中稱為"平板")的每個孔中，接著在5%(:02下於37。C培養約2周。在培養期間，添加足夠的HAT培養基。(5)雜交瘤選擇當上述骨髓瘤細胞為8-氮鳥。票呤抗性細胞系，即次黃噪呤/鳥噪呤/轉磷酸核糖基酶(HGPRT)-缺失細胞系時，非融合的骨髓瘤細胞和骨髓瘤/骨髓瘤融合細胞無法在含HAT培養基中生存。儘管抗體產生細胞之間的融合細胞或抗體產生細胞和骨髓瘤細胞之間的雜交瘤可以生存，但抗體產生細胞之間的融合細胞的壽命有限。因此，通過在含HAT培養基中持續培養，只有作為抗體產生細胞和骨髓瘤細胞之間的融合細胞的雜交瘤才能生存，由此進行雜交瘤的選擇。對於已成長為菌落的雜交瘤，用通過從HAT培養基中除去氨基蝶呤製備的培養基(在下文中稱為"HT培養基")交換HAT培養基。此後，對培養物上清液部分進行取樣，並通過例如流式細胞術測定抗-人c-Mpl抗體效價。以上描述了一種涉及使用8-氮鳥噪呤抗性細胞系的方法。應當注意到取決於選擇雜交瘤的方法其他細胞系也可使用，並且在這樣的情況下培養基組分也可改變。(6)克隆步驟將已發現產生作為以與上述(2)中相同的方法測定抗體效價的結果的特異性抗體的雜交瘤轉移到另一個平板中，然後進行克隆。克隆技術的實例包括有限稀釋，其中以這樣一種方式稀釋雜交瘤使得每個孔含有一個雜交瘤，然後進行培養；軟瓊脂法，在軟瓊脂培養基中培養雜交瘤，然後回收菌落；使用顯微操作器提取每個細胞並接著培養的方法；以及使用細胞分選儀分離.細胞的分選克隆。有限稀釋簡單因此常使用。通過例如有限稀釋對其中觀察到抗體效價的孔重複克隆2-4次，並選擇其中穩定觀察到抗體效價的孔作為產生抗-人c_Mpl單克隆抗體的雜交瘤系。(7)選擇激動劑抗體可通過各種TPO活性試驗系統分析所獲得的、產生抗-人c-Mpl單克隆抗體的雜交瘤細胞的培養物上清液，或根據以下(8)中所描述的方法從上清液中純化的抗體來選擇激動性抗體。優選的篩選技術的一個實例是在哺乳動物細胞中表達人Mpl,接下來進行細胞增殖試驗的方法。例如，使用表達人Mpl的BaF3小鼠細胞系的增殖試驗(Orita等Blood.2005年1月15日；105(2):562-6)。由於小鼠細胞並不總是反映人細胞的反應，因此，更優選應用表達人Mpl的人細胞的增殖試驗技術，以便選擇對人細胞具有更強活性的抗體。涉及使用人細胞的系統的具體實例如以下實施例5中所描述的〗吏用UT7/TPO細胞的細胞增殖試驗。(8)通過培養雜交瘤製備單克隆抗體通過用常規培養基交換HT培養基培養已克隆的雜交瘤。可經使用大培養瓶的振蕩培養、旋動培養或使用中空纖維系統的培養進行大量培養。可通過本領域公知的方法，例如凝膠過濾純化經上述大量培養獲得的上清液，來獲得抗-人c-Mpl單克隆抗體。可選地，所述雜交瘤可在相同譜系(如BALB/c)小鼠或nu/nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或兔腹腔中生長，以獲得含有大量抗-人c-Mpl單克隆抗體的腹水。用於簡單純化單克隆抗體的技術的實例，例如使用市售單克隆抗體純化^式劑盒。口MAbTrapGII^式劑盒；AmershamPharmaciaBiotech)。由jt匕獲得的單克隆抗體具有高的、針對人c-Mpl的抗原特異性。(9)檢測單克隆抗體可以下列方法測定如上所獲得的單克隆抗體的同種型和亞類。相關技術的實例包括Ouchterlony法、ELISA和RIA。儘管Ouchterlony法簡單，但如果單克隆抗體濃度低則該技術需要濃縮步驟。當使用ELISA或RIA時，培養物上清液同樣可與吸附抗原的固相起反應，並使用與不同免疫球蛋白同種型和亞類起反應的第二抗體。因此，可鑑定單克隆抗體的同種型和亞類。此外，可通過Follin-Lowry法或基於280nm處的吸光度(1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/ml)定量蛋白。同樣地，可由雜交瘤克隆單克隆抗體編碼基因以測定該序列。因此，可鑑定亞類。(10)克隆編碼單克隆抗體的基因以及製備重組抗體從抗體產生細胞，如雜交瘤，克隆單克隆抗體編碼基因，將克隆基因整合入適當的載體，並將所得到的載體導入宿主細胞(如哺乳動物細胞系、酵母細胞或昆蟲細胞)。因此，可通過基因重組技術製備重組抗體(P.J.Delves,,Antibodyproductionessentialtechniques,1997,WILEY,P.Shepherd和C.Dean,，MonoclonalAntibodies,2000OXFORDUNIVERSITYPRESS,J.W.Goding,MonoclonalAntibodies:principlesandpractice,1993,ACADEMICPRESS)。本發明包括含有產生本發明抗體的雜交瘤所攜帶的抗體的編碼基因序列的核酸，特別是，本發明雜交瘤所產生抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的核酸。本申請中使用的術語"核酸"包括DNA和RNA。為了製備編碼來自雜交瘤的單克隆抗體的基因，通過PCR或其他方法製備分別編碼單克隆抗體L鏈V區、L鏈C區、H鏈V區和H鏈C區的DNAs。根據抗體基因或胺基酸序列設計的寡DNA可用作為引物，自雜交瘤製備的DNA可用作為模板。將這樣的DNAs整合入合適的載體，並將所得到的載體導入宿主細胞中用於表達。可選地，將這樣的DNAs分別整合入合適的載體中用於共表達。使用可在宿主微生物中自主生長的噬菌體或質粒載體。質粒DNAs的實例包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母衍生的質粒。噬菌體DNA的一個實例是i噬菌體。由於可正確形成抗體的三維結構，真核細胞可作為宿主用於轉化。其實例包括酵母、動物細胞例如COS或CHO細胞以及昆蟲細胞。當使用動物宿主細胞時，具體來i兌，例如可4吏用N5KG1-ValLark載體(IDECPharmaceuticals:美國專利第6,001,358號)。該載體是一種用來在動物細胞中表達重組抗體的表達栽體，其包含兩個CMV啟動子/增強子以及在其下遊的重鏈和輕鏈可變區克隆位點。此外，該載體最初包含在上述位點下遊的、編碼人yl鏈恆定區和人k鏈恆定區的基因序列。任意重鏈和輕鏈可變區可以符合讀框的方式整合入該載體可變區克隆位點中。因此，可表達包含連接至人k鏈恆定區的輕鏈可變區以及連接至人yl鏈恆定區重鏈可變區的抗體。導入了所述載體的動物細胞在培養液中產生了抗體(人IgGl)。同樣地，可以使用包含不同重鏈恆定區基因的載體。例如，N5KG4PE載體(IDECPharmaceuticals)包含作為恆定區基因的、包含上述導入人中的兩個突變(即Ser228Pro和Leu235Glu)的序列。任意重鏈和輕鏈可變區基因序列均可整合入N5KG4PE載體中以表達包含任意可變區的IgG4PE。此外，可修飾重鏈或輕鏈基因以製備包含不同恆定區的抗體。並不pk^那些上述表達載體。例如，可使用包含;乍為用於調節表達的核苷酸序列的CMV啟動子/增強子的其他表達載體。可選地，與上述的的啟動子/增強子不同的、已知的啟動子/增強子可用作為表達調節序列。啟動子的實例包括那些獲得自諸如多瘤病毒、雞痘病毒(UK2211504，公開於1989年7月5日)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、雞肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒和最優選的猿猴病毒40(SV40)的病毒基因組的啟動子，以及異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子和熱休克蛋白啟動子。作用於啟動子以改善轉錄的增強子的實例包括來自已知的哺乳動物基因(即珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、a-曱胎蛋白和胰島素)的增強子和來自真核細胞病毒的增強子(如可使用處在複製起點的SV40晚期增強子、增強子(bp100-270)、處在複製起點的多瘤病毒晚期增強子和多瘤病毒增強子以及腺病毒增強子)。表達載體可包含為mRNA轉錄終止和穩定化所需的序列。這樣的序列可通常獲得自真核生物或病毒DNA或cDNA的5，-非翻譯區，有時獲得自3'-非翻譯區。可通過任何方法將基因導入宿主中，這樣的方法的實例包括鈣離子法、電穿孔、原生質球法、乙酸鋰法、磷酸《丐法和脂質轉染法。用於將基因導入下述動物中的方法對實例包括顯微注射、包括利用電穿孔或脂質轉染將基因導入ES細胞的方法以及核移植。在本發明中，可通過培養轉化體並從培養物上清液中取樣目的抗體從而獲得目的抗體。使用適合使用的宿主的培養基經靜置培養、搖瓶培養等培養轉化體。培養後，使用培養液本身或藉助於離心或其它手段除去細胞純化分泌至胞外的抗體。此後，可單獨使用或任選地組合使用藉助於各種用於蛋白分離/純化的層析技術的常規生化技術以從培養產物中分離並純化把抗體。此外，可利用製備轉基因動物的技術來製備包含整合到其內源基因中的、編碼目的抗體基因的動物宿主，例如轉基因牛、山羊、綿羊或豬。此後，可從轉基因動物所分泌的乳汁中大量獲得來源於上述抗體基因的單克隆抗體(Wright,G.,等，1991，Bio/Technology9，830-834)。用於製備本發明的抗人Mpl激動劑抗體的優選方法，包括但不限於，如上述用於解決所述技術問題的方法中使用的、示例性的基因重組技術的方法。3.本發明的DNA如上所述，本發明提供了(1)包含編碼選自下列(a)-(d)的胺基酸序列的核苷酸序列的DNA，其是編碼抗人Mpl激動劑抗體重鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列(a)如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列;(b)如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列；(c)如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列；和(d)如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列；以及(2)包含編碼選自下列(a)-(h)的胺基酸序列的核香酸序列的DNA,其是編碼抗人Mpl激動劑抗體輕鏈可變區胺基酸序列的鹼基序列(a)如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列;(b)如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列;(c)如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列；(d)如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列；(e)在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(f)在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(g)在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和(h)在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列。這些DNA可用於如上述第2節中所描述的、產生本發明的抗人Mpl激動劑抗體的方法中，更具體而言，可用於使用基因重組技術產生抗體的方法中。編碼上述可變區的胺基酸序列(a)-(d)的DNA可通過下述方法獲得，即由上述獲得用於產生抗人Mpl激動劑抗體的雜交瘤的方法製備的雜交瘤，如下述實施例7所述，通過常規技術提取mRNA，使用基於已知抗體恆定區胺基酸序列製備的引物由通過5'-RACE法獲得。依照布達佩斯條約，在2006年3月14日將包含編碼可變區的DNAs的質粒保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology)(TsukubaCentral6，l-l畫lHigashi，Tsukuba,Ibaraki,305-8566,Japan)。表1tableseeoriginaldocumentpage33作為構成本發明的激動劑抗體的輕鏈可變區的具體實例，例如包含SEQIDN0:3、5、7或9所示的胺基酸序列。所述的胺基酸序列的構架區可包含一個或幾個胺基酸殘基的缺失、取代、添加或插入。同樣地，所述的胺基酸序列可包含與構架區序列具有至少85%、86%、87%、88%或89%,優選至少90%、92%、93%或94%，以及更優選至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在本申請中，術語"構架區"指從可變區，如SEQIDN0:3、5或7所示的胺基酸序列中除三個互補決定區(CDRs)即RASQGISS(A或T)LA(胺基酸第24-34位)、DASSLES(胺基酸第50-56位)和QQFNSYP(L或Y或W)T(胺基酸第89-97位)外的區域。對如SEQIDNO:9所示的胺基酸區的情況下，術語"構架區，，指可變區中除RASQSVSSSYLA(胺基酸第24-35位)、DASSRAT(胺基酸第51-57位)和QQYGSSPIT(胺基酸第90-98位)外的區域。如之後實施例17中所證實的，本發明的突變抗體可具有基本上等效於未突變抗體的激動活性，甚至在構架區中存在胺基酸突變的情況下亦是如此。更具體地說，該突變抗體可具有結合細胞如FM3A-hMpl細胞的人血小板生成素受體、由此激活該受體的能力，和/或擴增UT-7/TPO細胞的能力。所述突變的一個實例是在保守胺基酸之間的取代。保守胺基酸具有彼此類似的特性例如電荷、結構或極性。這樣的保守胺基酸可分類為例如鹼性胺基酸(Arg、His或Lys);酸性胺基酸(Glu或Asp);非極性胺基酸(Ala、Leu、Ile、Val、Gly或Pro);極性胺基酸(Ser、Thr、Cys、Met、Asn或Gln)和芳香族胺基酸(Phe、Tyr或Trp)。序列同一性是導入或沒有導入缺口(gap)的兩條或多條胺基酸(或核苷酸)序列比對中匹配殘基的百分數。序列同一性通常是相對於胺基酸(或核苷酸)總數的相同胺基酸(或核苷酸)數量的百分數。根據需要，可通過訪問資料庫例如NCBI(U.S.A.)並利用已知算法例如BLAST或FASTA用於序列檢索從而確定序列同一性。可通過例如定點誘變或PCR(利用含突變的引物)將突變導入編碼無突變胺基酸序列的DNA中。用於導入突變的方法描述於例如，Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryMannual，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中。除可變區之外，本發明的DNA可進一步包含編碼重鏈或輕鏈恆定區的核苦酸序列。基於所保藏的DNA以及已知的人抗體恆定區的序列，可通過公述的重鏈恆定區的修飾。4.抗人c-Md1激動劑抗體的製藥用途和藥物組合物本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體具有在體內和在體外結合併激活c-MPL受體的能力和/或刺激血小板產生的能力(即血小板生成活性)以及刺激血小板祖細胞產生的能力(即血巨核細胞生成活性)。推測人c-Mpl受體在造血幹細胞和巨核細胞中表達。據報導施用PEG-rHuMGDF增加了正常動物骨髓中成紅細胞或粒細胞/巨噬細胞的祖細胞(StemCell,14:651-660,1996)。然而，移植了人臍帶血的小鼠中施用PEG-rHuMGDF，儘管沒有觀察到人祖細胞生長，但導致除鼠巨核細胞之外的祖細胞生長。在施用抗人c-Mpl激動劑抗體，骨髓中人成紅細胞或粒細胞/巨噬細胞的祖細胞的數量顯著提高(實施例14)。這表明抗人c-Mpl激動劑抗體有選擇性地將信號導入人細胞中以改善巨核細胞以及其他細胞的活力。包含作為活性成分的、本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體的藥物組合物治療的病症通常伴有的巨核細胞/血小板不足或預期或預計在未來巨核細胞/血小板不足(如由計劃的外科手術或血小板捐獻所引起的不足)。這樣的病症起因於暫時或持久的體內活性Mpl配體不足。因此，本發明的組合物可用於預防性或治療性治療有待對血小板不足(即血小板減少症)進行治療的患者的血小4反減少症。此外，所述組合物可用於預防性或治療性治療在涉及長期各類細胞減少的造血幹細胞移植後，需要進行恢復血細胞治療的患者的各類細胞減少症，所述造血幹細胞移植例如骨髓移植、臍帶血移植或外周血幹細胞移植。血小板減少症(血小板不足)可由多種原因引起，包括化學療法和使用多種藥物的其他治療方法、放射療法、外科手術、意外出血以及其他具體的病理狀況。可通過本發明治療的並發血小板減少症的典型病理狀況的具體實例包括再生障礙性貧血；特發性或免疫性血小板減少症(ITP)，例如特發性血小板減少性紫癜伴髮乳腺癌；ITP伴發HIV和血栓性血小板減少性紫癜伴發HIV;轉移性胂瘤引起的血小板減少症；全身性紅斑狼瘡，例如新生兒狼瘡症候群伴發脾腫大；範可尼貧血；維生素B12缺乏；葉酸缺乏；May-Hegglin二氏血小^反異常；Wiskott-Aldridge症候群；慢性肝衰竭；骨髓增生異常症候群伴發血小板減少症；陣發性睡眠性血紅蛋白尿症；C7E3Fab(阿昔單抗)治療後急性重度血小板減少症；同種免疫性血小板減少症，例如母體同種免疫性血小板減少症；血小板減少症伴發抗磷脂抗體及血栓形成；自身免疫性血小板減少症；藥物誘導的免疫性血小板減少症，例如卡波鉑誘導的血小板減少症或肝素誘導的血小板減少症；胎兒血小板減少症；妊娠期間的血小板減少症；Hughes'症候群；類狼瘡血小板減少症；意外和/或大量出血；骨髓增生病；患惡性病患者中血小板減少症；血栓性血小板減少性紫瘕，例如在癌症患者中作為血栓形成性血小板減少性紫癜/溶血性尿毒症症候群出現的血栓形成性微血管病；自身免疫性溶血性貧性血小板減少症；流行性腎病；利福平相關的急性腎衰竭；Paris-Trousseau血小板減少症；新生兒同種免疫性血小板減少症；陣發性夜間血紅蛋白尿；胃癌中的血液學改變；兒童溶血性尿毒症症候群；以及與病毒感染有關的血液學表現包括曱型肝炎病毒和CMV-有關的血小板減少症。同樣地，某些用於AIDS的治療導致了血小板減少症(如AZT)。某些傷口癒合障礙也可能受益於血小板計數增加。這樣的疾病包括那些並發其它類型血液不足以及血小板減少症的疾病。在血小板成為必需的一段幾小時到幾天的時間之前，可施用作為活性成分的本發明的激動劑抗體來治療預期的血小板減少症(如由於未來的外科手術)。在遇到緊急情況時(如意外和大出血)，本發明的激動劑抗體可與血液或純化的血小4反一起施用。同樣地，可施用作為活性成分的本發明的激動劑抗體來治療各類細胞減少症(如由臍帶血移植引起的)。特別優選的治療靶標的實例包括(l)特發性血小板減少性紫癜或血小板減少症合併肝衰竭，和(2)由癌化學療法引起的血小板減少症和/或各類細胞減少症、再生障礙性貧血、脊髓發育不良症候群(MDS)、骨髓移植或臍帶血移植。本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體可用於保持血小板和/或巨核細胞以及相關細胞的活力或l&存壽命。因此，在包含這樣的細胞的組合物中包含有效量的激動劑抗體是有用的。包含作為活性成分的本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體的藥物組合物可注射、口服、經鼻、經皮或其他劑型施用，包括如靜脈內、皮內、肌內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼內、眼球後和肺內(如氣溶膠藥物)施用，或皮下注射(包括用於長期釋放的貯藏(depot)施用)；以及舌下、直腸和陰道施用，或外科手術植入，如包埋在脾被膜下、腦中或角膜中。可在一段給定時間內通過單次劑量或多劑量實施治療。一般而言，本發明包括有效量的本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體以及藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體的藥物組合物。這樣的組合物包括各種緩衝成分(如Tris-HCl、乙酸鹽或磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑；添加劑例如表面活性劑和增溶劑(如吐溫80或聚山梨醇酯80),抗氧化劑(如抗壞血酸或焦亞硫酸鈉)，防腐劑(如硫柳汞(Thimersol)或苯曱醛)以及填充劑(如乳糖或甘露糖醇)；其中包裹了所述活性物質的聚合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)粉粒製劑或脂質體。藥物組合物還可任選地包括用作藥物載體、賦形劑或介質的其他藥學上可接受的液體、半固體或固體稀釋劑。其實例包括但不限於，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯、硬脂酸鎂、曱基及丙基羥基苯曱酸、澱粉、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯膠、磷酸鈣、礦物油、可可豆油以及可可屬(theobroma)油類。所述組合物可製備為液體形式、或可製備為乾粉形式例如凍乾粉形式。也包括可植入的持續釋放形式和經皮形式。考慮到各種改變藥物作用的因素如患者的年齡、狀況、體重、性別和飲食，任何感染的嚴重程度，給藥時間和其他臨床因素，由主治醫師決定包括於治療上述病症方法中的給藥方案。一般而言，劑量應當在100iag-lmg本發明抗體/公斤體重/天的範圍內，優選10-100pg/kg;以及更優選1-10pg/kg，以日劑量給予，或以較長或較短的時間間隔如每隔一天、一周兩次、每周一次或每日兩次或三次以等效劑量給予。在治療以其他症狀及血小板不足為特徵的病狀中，包含作為活性成分的根據本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體的藥物組合物可單獨使用或與其他細胞因子、可溶性Mpl受體、造血因子、白細胞介素或生長因子結合使用。與通常的造血刺激物例如IL-3或GM-CSF相結合的根據本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體預計在治療某些類型的血小板減少症中是有用的。其他巨核細胞刺激因子例如meg-CSF、幹細胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)或其他具有巨核細胞刺激活性的分子也可與Mpl配體一起使用。用於上述聯合給藥的附加示範性細胞因子或血細胞生成因子包括IL-la，IL-l|3,IL-2，IL-3,IL-4,IL誦5，IL-6,IL-ll，集落刺激因子畫1(CSF-1)，M-CSF,SCF，GM-CSF,粒細胞集落刺激因子(G-CSF),EPO,幹擾素-a(IFN-a)，複合幹擾素，IFN國(3，IFN曙y,IL-7，IL國8，IL畫9，IL-10,IL國12，IL-13,IL-14,IL-15，IL-16,IL-17,IL-18,血小板生成素(TPO)，血管生成素例如Ang-l、Ang-2、Ang-3、Ang-4、Ang-Y,人血管生成素樣多肽，血管內皮生長因子(VEGF),血管生成素，骨形態發生蛋白-1,骨形態發生蛋白-2，骨形態發生蛋白-3,骨形態發生蛋白-4，骨形態發生蛋白-5,骨形態發生蛋白-6,骨形態發生蛋白-7,骨形態發生蛋白-8，骨形態發生蛋白-9,骨形態發生蛋白-10，骨形態發生蛋白-11,骨形態發生蛋白-12,骨形態發生蛋白-13，骨形態發生蛋白-14,骨形態發生蛋白-15,骨形態發生蛋白受體IA,骨形態發生蛋白受體IB，腦衍生的神經營養因子，睫狀節神經細胞營養因子，睫狀節神經細胞營養因子a，細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子1，細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子2a,細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子2|3，(3內皮細胞生長因子，內皮縮血管肽l,表皮生長因子，上皮衍生的中性粒細胞引誘劑，成纖維細胞生長因子4,成纖維細胞生長因子5，成纖維細胞生長因子6,成纖維細胞生長因子7，成纖維細胞生長因子8，成纖維細胞生長因子8b，成纖維細胞生長因子8c，成纖維細胞生長因子9，成纖維細胞生長因子IO,酸性成纖維細胞生長因子，鹼性成纖維細胞生長因子，神經膠質細胞系衍生的神經營養因子受體al,神經膠質細胞系衍生的神經營養因子受體oc2，生長相關蛋白，生長相關蛋白a，生長相關蛋白P,生長相關蛋白y,肝素結合表皮生長因子，肝細胞生長因子，肝細胞生長因子受體，胰島素樣生長因子I,胰島素樣生長因子受體，胰島素樣生長因子II，胰島素樣生長因子結合蛋白，角質化細胞生長因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受體a,神經生長因子，神經生長因子受體，神經營養因子-3，神經營養因子-4,胎盤生長因子，胎盤生長因子2，血小板衍生的內皮細胞生長因子，血小板衍生的生長因子，血小板衍生的生長因子A鏈，血小板衍生的生長因子AA,血小板衍生的生長因子AB，血小板衍生的生長因子B鏈，血小板衍生的生長因子BB,血小板衍生的生長因子受體a,血小板衍生的生長因子受體p，前B細胞生長刺激因子，幹細胞因子受體，TNF包括TNF0、TNF1和TNF2，轉化生長因子a，轉化生長因子p，轉化生長因子pl,轉化生長因子(31.2，轉化生長因子(32，轉化生長因子卩3，轉化生長因子P5,潛在轉化生長因子(31結合蛋白I,轉化生長因子卩結合蛋白II,轉化生長因子卩結合蛋白III,腫瘤壞死因子受體I型，腫瘤壞死因子受體n型，尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑受體，血管內皮生長因子以及它們的嵌合蛋白。因此，預計施用包含作為活性成分的、本發明的抗人c-Mpl激動劑抗體的藥物組合物(用於增加成熟血巨核細胞數量)是一種特別有效的刺激血小板產生的方法。還預計這樣的施用是一種刺激造血幹細胞產生的有效手段。應當調節前述劑量以補償治療組合物中的這樣的額外組分。可通過常規方法監測所治療患者的進展。以下，根據下述實施例本發明將得到更詳細的描述；然而，本發明的技術範圍並不限於實施例。實施例實施例1抗原製備1-1:製備人c-Mpl-表達細胞一般而言，當抗原蛋白表達細胞系用於免疫時，使用顯示更高表達水平的細胞系製備抗體是更有利的。已知多種類型的人巨核細胞細胞系或強制表達細胞系是人c-Mpl-表達細胞系；但在這樣的細胞系中的c-Mpl表達水平僅為每細胞中幾千分子，因此這樣的細胞系不適合用作抗原。當用包含向FDCP2(即，鼠造血細胞系)中導入了人c-Mpl的表達細胞系FDCP-hMpl(參見FEBSLett.Oct21,1996;395(2-3):228-234)免疫產生人抗體的小鼠(如KM小鼠TM)時，抗體效價增加實際上並不足夠，且無法獲得該hMpl-特異性人抗體。當人血巨核細胞細胞系用作為抗原時，還誘導出與其他膜分子反應的抗體。因此，優選鼠利用已導入並以高水平表達人c-Mpl的鼠細胞系，最好是MHC-相容的細胞系作為宿主，以便有效誘導c-Mpl-特異性抗體。為了製備表達高水平人c-Mpl(hMpl)的細胞，以下列方法製備hMpl表達載體，並將所得到的載體導入兩種類型的鼠細胞系(即L929和FM3A)中。此外，已報導了以不依賴配體方式持續傳遞激動信號的hMpl突變受體(其中位於第508位的Trp已為Ser所取代的突變體；Abe,M.等，Leukemia,2002年8月；16(8):1500-1506)。推斷這樣的突變體具有不同於野生型的構象。對持續活化突變體具有高親和力的抗體可顯示強有力的激動活性。因此，製備了持續活化突變體(在下文中稱為"hMpl-Ser，，)的表達載體，然後還製備了包含該載體的表達細胞供免疫使用。1)製備抗-人c-Mpl(hMpl)表達載體將humpl-Pas12的DNA,即攜帶有hMpl全長cDNA(Bartley，T.D.等，Cell,Jul.1，1994;77(7):1117-1124或Morita，H.等，FEBSLett.Oct.21,1996;395(2-3):228-234)的質粒DNA，用作模板來進行PCR用於擴增完整的hMpl編碼區。使用設計成在其末端包含限制性內切酶位點(即在5'末端的EcoRI和在3'末端的Xbal)的Mpl—Fl和Mpl—R2引物和KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo,Japan)通過PCR擴增該區。在下列實例中，使用GeneAmpPCRSystem9700(PerkinElmerJ叩an)調節PCR反應溫度。反應溫度條件為在94。C起始溫度加熱5分鐘；隨後98。C持續10秒和68。C持續3分鐘的30個循環；以及最後在72°C加熱7分鐘。通過乙醇沉澱回收擴增的PCR片段，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然後使用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Quiagen)純化，該試劑盒是一種使用膜的DNA純化試劑盒。將純化的DNA片段亞克隆入pCR4Blunt-TOPO載體(Toyobo),並分析質粒中克隆的插入DNA片段的核苷酸序列，在該分析中M13-20FW和M13RV引物用於DNA核苷酸測序。分析插入部分的DNA核苷酸序列，並選擇其中插入部分與hMpl序列(GenBank登錄號M90102)—致、且具有所設計的序列的引物部分的質粒DNA。隨後，純化包含hMpl核苷酸序列的質粒DNA,用EcoRI和Xbal限制性內切酶消化，並經瓊脂糖凝月交電泳回收並純化稍小於約2kb的DNA片段。獨立地，也用EcoRI和Xbal限制性內切酶消化具有人EF啟動子和殺稻瘟菌素(Bsd)選擇標記的表達載體pEF6/Myc-His(Invitrogen)和具有CMV啟動子和新黴素(Neo)選擇標記的pEGEP-Nl載體(BDBiosciencesClontech)，並用石威性磷酸酶(大腸桿菌C75;TaKaRaBio,Japan)處理脫磷酸。然後使用瓊脂糖凝膠電泳和DNA純化試劑盒回收DNA。使用T4DNA連接酶將純化的完整hMpl區的DNA片段連接到每一表達載體DNA，並將所得到的產物導入大腸桿菌DH10B以獲得轉化體。分析含插入DNA片段的轉化體中質粒DNA的DNA核苷酸序列，並獲得插入了全長hMplcDNA的pEF-MPL635和pCMV-MPL635。Mpl一Fl:5,-AGAGAGAGAGGAATTCGCCACCATGCCCTCCTGGGCCCTCTT-3,(SEQIDNO:12)Mpl一R2:5，-AGAGAGAGAGCGGCCGCTCAAGGCTGCTGCCAATAGCTTAGTG-3'(SEQIDNO:13)M13-20FW:5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'(SEQIDNO:14)M13RV:5'陽CAGGAAACAGCTATGAC-3'(SEQIDNO:15)2)製備持續活化的人c-Mpl(hMpl-Ser)表達載體製備hMpl突變體表達載體，已報導了以不依賴TPO的方式激活胞內信號的該突變體(即其中位於第508位的Tip已為Ser所取代的突變體；Abe，M.等，Leukemia,2002年8月；16(8):1500-1506)。為了改變編碼第508位胺基酸殘基的密碼子(即從TGG到TCG),使用GeneEditorTM體外定點誘變系統(Promega)將pEF-MPL635的DNA用作模板來進行定點誘變。Mut一MplSer508用作誘變寡核苷酸(在此5，-末端已被磷酸化)。將包括在試劑盒中的目的誘變寡核苷酸和選擇核苷酸與模板DNA退火以合成帶有導入突變的鏈。通過利用在GeneEditor抗生素選擇混合物存在下只有突變體倍增的事實選擇突變體。更具體地說，在dsDNA模板於室溫在鹼性環境(0.2MNaOH,0.2mMEDTA(終濃度))下溫育後5分鐘後，添加1/10體積的2M乙酸銨(pH4.6)中和含鹼變性模板DNA的溶液，然後通過乙醇沉澱回收鹼變性的模板DNA。向鹼變性的模板DNA添加試劑盒所帶的誘變寡核苷酸、新的抗生素抗性獲得選擇寡核苷酸(在此5，-末端已被磷酸化)和退火緩衝液，在75°C下加熱所得到的產物5分鐘，並通過緩慢降低溫度至37。C進行退火。隨後，使用試劑盒所帶的Synthesis10x緩沖液、T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶在37°C下反應90分鐘用於突變的鏈的合成和連接。在存在GeneEditorTM抗生素選擇混合物的情況下，通過轉化、培養感受態BMH71-18mutS細胞製備的大腸桿菌轉化抹製備質粒DNA，隨後用該質粒DNA轉化感受態JM109細胞，接著在包含GeneEditor抗生素選擇混合物的LB平板上接種細胞。培養平板上出現的轉化體，並分析質粒DNA的DNA核苷酸序列，由此獲得表達其中第508位胺基酸殘基已被取代(即Ser取代Trp)的hMpl的pEF-MPL635-Ser載體。Mut_MplSer508:5，-CTGCTGCTGCTGAGGTCGCAGTTTCCTGCACACTAC-3,(SEQIDNO:16)3)製備表達全長人c-Mpl的L929細胞將製備的pEF-MPL635載體(lng)先與脂質轉染胺試劑(購自Invitrogen)和脂質轉染胺PLUS試劑(購自Invitrogen)混合，然後再與無血清Dulbecco氏改良的Eagle培養基(DMEM)混合。將混合物添加到在6-孔板上培養的L929細胞(1.5x105個細胞/孔)中，並處理培養物3小時以便將質粒DNA導入細胞中。然後在含100/胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中培養所得到細胞過夜。在第二天，添加lO^g/ml殺稻瘟菌素(購自Invitrogen)到培養基中來選擇抗藥細胞。此後，利用抗-c-Mpl抗體通過焚光激活細胞分選(FACS)法分離c-Mpl-表達細胞，由此建立表達全長人c-Mpl的L929細胞系(在下文中稱為"L929-hMpl")。使用FACS-Vantage(BectonDickinson)實施FACS。在選擇後，在含5[ig/ml殺稻痘菌素和10。/。FBS的DMEM培養基中培養並維持細胞。4)製備表達全長人c-Mpl的FM3A細胞用和上述3)—樣的方法，將pEF-MPL635載體導入FM3A細胞中以建立表達全長人c-Mpl的FM3A細胞系(在下文中稱為"FM3A-hMpl")。在含5ng/ml殺稻瘟菌素和10%FBS的RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)培養基中培養並維持所建立的細胞。5)製備持續活化的、表達人Mpl的FM3A細胞用和上述3)—樣的方法，將如上所述的pEF-MPL635-Ser載體導入FM3A細胞中以建立表達hMpl-Ser的FM3A細胞系(在下文中稱為"FM3A掘pl-Ser")。在含5[ig/ml殺稻瘋菌素和10%FBS的RPMI培養基中培養並維持細胞。1-2:製備可溶性人c-Mpl重組蛋白將編碼缺少人c-Mpl跨膜區和胞內域、並具有下列序列的可溶性人c-Mpl的DNA連接入表達載體pEAK8(EdgeBioSystems),然後通過transfectam試劑(可獲得自Promega)將該表達載體導入Hek293細胞。在選擇穩定表達細胞後，通過抗-Mpl抗體柱子純化其培養物上清液來製備可溶性人c-Mpl重組蛋白(以下縮寫成"可溶性Mpl-x"或"sMpl國x，，)。NH2-MPSWALFMVTSCLLLAPQNLAQVSSQDVSLLASDSEPLKCFSRTFEDLTCFWDEEEAAPSGTYQLLYAYPREKPRACPLSSQSMPHFGTRYVCQFPDQEEVRLFFPLHLWVKNVFLNQTRTQRVLFVDSVGLPAPPSIIKAMGGSQPGELQISWEEPAPEISDFLRYELRYGPRDPKNSTGPTVIQLIATETCCPALQRPHSASALDQSPCAQPTMPWQDGPKQTSPSREASALTAEGGSCLISGLQPGNSYWLQLRSEPDGISLGGSWGSWSLPVTVDLPGDAVALGLQCFTLDLKNVTCQWQQQDHASSQGFFYHSRARCCPRDRYPIWENCEEEEKTNPGLQTPQFSRCHFKSRNDSIIHILVEVTTAPGTVHSYLGSPFWIHQAVRLPTPNLHWREISSGHLELEWQHPSSWAAQETCYQLRYTGEGHQDWKVLEPPLGARGGTLELRPRSRYRLQLRARLNGPTYQGPWSSWSDPTRVETATETAW-COOH(SEQIDNO:17)實施例2製備單克隆抗體用抗原免疫產生人抗體的小鼠(KM小鼠tm)製備單克隆抗體，從而獲得本發明的抗體，上述小鼠能通過遺傳修飾產生人抗體。KM小鼠缺少內源性小鼠免疫球蛋白(Ig)重鏈和小鼠k輕鏈，同時攜帶有具有人Ig重鏈基因(SC20)的染色體14片段和人IgK鏈轉基因(KCo5)。特別是，KM小鼠具有產生人抗體的能力並且缺少鼠Ig重鏈和k鏈。通過在具有人Ig重鏈基因座的譜系A小鼠和具有人IgK鏈轉基因的譜系B小鼠之間進行雜交製備該小鼠。譜系A小鼠是缺陷內源性Ig重鏈和K輕鏈基因的純合子，其攜帶有可傳遞到子代的染色體14片段(SC20)鐠(參見Tomizuka.等,Proc.Natl.Acad.Sci"U.S.A.，2000,Vol97:722)。譜系B小鼠是內源性小鼠Ig重鏈和k輕鏈基因都缺陷的純合子，其攜帶有人IgK鏈轉基因(KCo5)(參見Nat.Biotechnol,，1996,Vol14:845)。在本實施例中，通過已知技術製備單克隆抗體(IntroductiontoMonoclonalAntibodyExperimentProtocols,Ando，Tamie等,Kodansha(Tokyo,Japan),1991)。1)免疫按實施例1中所製備的L929-hMpl細胞、FM3A-hMpl細胞、表達持續活化的c-Mpl的FM3A-hMpl-Ser細胞以及sMpl-x重組蛋白用作人c-Mpl免疫原。實施例2中製備的產生人抗體的小鼠用作待免疫的動物，並以如下方法實施免疫，其中，所述的小鼠產生人免疫球蛋白。免疫(方法1):將實施例1中製備的L929-hMpl細胞(5《106個細胞)與Ribi佐劑混合，並將混合物用於腹膜內初次免疫9周齡的產生人抗體的小鼠。初次免疫後，用相同的細胞(2x106個細胞)和白細胞介素6(IL-6)(5ng)每隔一周通過它們的尾靜脈免疫小鼠7次，最後在從每隻小鼠切除脾和淋巴結前用相同的細胞通過它們的尾靜脈進行最終免疫。免疫(方法2):將實施例1中製備的FM3A掘pl-Ser細胞(5xl06個細胞)用紫外線照射，向其中添加Ribi佐劑，並將所得到的混合物用於腹膜內初次免疫9周齡產生人抗體的小鼠。初次免疫後，用相同的細胞(5xl06個細胞)每隔一周腹膜內免疫小鼠7次，最後在從每隻小鼠切除脾和淋巴結前3天用實施例1中製備的FM3A-hMpl細胞(2xl06個細胞)和IL-6(5pg)通過它們的尾靜脈最終免疫。免疫(方法3):混合實施例1中製備的sMpl-x重組蛋白(IOpg)和完全弗氏佐劑(CFA),並將混合物用於皮下初次免疫9周齡產生人抗體的小鼠。通過用sMpl-x重組蛋白(5iag)和不完全弗氏佐劑(IFA)的混合物皮下免疫小鼠每周一次進行第2-5次免疫。通過腹膜內施用L929-hMpl細胞(5乂106個細胞)進行第6-8次免疫。最後，在從每隻小鼠上切除脾和淋巴結前3天，sMpl-x重組蛋白(5pg)和IL-6(5iig)用於經尾靜脈最終免疫小鼠。2)製備雜交瘤在最後一次免疫後3天通過外科手術從小鼠上切下脾和/或淋巴結，置於10ml含350mg/ml碳酸氳鈉、50單位/ml青黴素和50jxg/ml鏈黴素的無血清DMEM培養基中，並在篩網(細胞過濾器，Falcon)上使用刮刀壓碎。離心已通過篩網的細胞懸液以沉澱細胞，然後在無血清DMEM培養基中洗滌兩次，懸浮於無血清DMEM培養基中，並測定細胞計數。獨立地，也用無血清DMEM培養基洗滌不大於lx108個細胞/ml細胞密度的骨髓瘤細胞SP2/0(ATCCNo.CRL-1581),該骨髓瘤細胞已在5%二氧化碳存在下於37。C在含10%FCS的DMEM培養基中進行培養，然後懸浮於無血清DMEM培養基中，並測定細胞計數。將回收的細胞懸液與鼠骨髓瘤細胞懸液以5:1細胞計數比例混合，離心混合物，並完全除去上清液。用移液管尖端攪拌的同時向沉澱中緩慢添加作為融合試劑的1ml50。/。(w/v)聚乙二醇1500(BoehringerMannheim),分兩次緩慢添加預熱至37。C的1ml無血清DMEM培養基，然後再添加7ml無血清DMEM培養基。離心後，除去上清液並使用如下所述的有限稀釋對殘留的融合細胞篩選目的雜交瘤。簡言之，通過在含10y。胎牛血清(FCS)和次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸苷(T)(在下文中稱為"HAT,"Sigma)的DMEM培養基中進行培養選擇雜交瘤。此外，通過使用含10%FCS和HT(Sigma)的DMEM培養基的有限稀釋獲得單個克隆。在96-孔微量滴定板(BectonDickinson)上進行培養。選擇(或篩選)產生抗-人c-Mpl人單克隆抗體的雜交瘤克隆，通過如實施例4中所描述的流式細胞術，或如實施例5中所描述的4吏用UT7/TPO細胞的細胞增殖試驗鑑定各雜交瘤所產生的人單克隆抗體。作為用於評價激動劑抗體活性的系統，可在諸如BaF3的小鼠細胞系中表達人Mpl，然後進行細胞增殖試驗(Orita等，Blood,2005年l月15日；105(2):562-6)。然而，這樣的細胞反應無法總是反映人細胞的反應。由於UT7/TPO是一種人衍生的細胞系，因此其用於篩選被認為利於選擇具有對人細胞更強活性的抗體。作為篩選的結果，選擇了4個克隆的、產生抗-人Mpl激動劑抗體的雜交瘤，即雜交瘤7-10(通過方法1獲得的)、雜交瘤4-49(通過方法2獲得的)以及雜交瘤6-4-50和6-5-2(通過方法3獲得的)。產生非激動劑抗體的雜交瘤一雜交瘤2-35(通過方法1獲得的)被選作為對照。實施例3從雜交瘤培養物上清液製備純化的抗體以下列方法從雜交瘤培養物上清液中純化抗-人c-Mpl單克隆抗體。<吏用rmp蛋白A(AmershamPharmaciaBiotech),0.8x40cm片主(Bio-Rad),PBS作為吸附緩沖液以及0.02M甘氨酸緩沖液(pH3)作為洗脫緩沖液，對含抗體的培養物上清液進行親和純化。通過添加1MTris(pH9.0)將洗脫級分的pH調節至7.2左右。使用透析膜(10,000截斷值，SpectrumLaboratories)用PBS替換所製備的抗體溶液，並通過膜濾器MILLEX-GV(Millipore),孔徑0.22|im經過濾滅菌獲得純化的抗-人c-Mpl單克隆抗體。通過測定280nm處吸光度並通過將1mg/ml規定為等於1.4OD計算確定該純化的抗體的濃度。以下列方法製備含抗-人c-Mpl單克隆抗體的培養物上清液。首先，在含10ng/ml重組人IL-6(R&DSystems)和10%低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培養基(KyokutoPharmaceuticalIndustrial)中調節產生抗體的雜交瘤。低溫保存經調節的雜交瘤。隨後，在含牛胰島素(5jxg/ml，Gibco-BRL)、人轉鐵蛋白(5昭/ml,Gibco-BRL)、乙醇胺(0.01mM,Sigma)、亞硒酸鈉(2.5xl(T5mM，Sigma)、10ng/ml重組人IL-6(R&DSystems)和1%低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培養基(KyokutoPharmaceuticalIndustrial)中對它們中的某些進行調節。在燒瓶中培養每種雜交瘤，當雜交瘤的％活力達到90%時回收培養物上清液。將回收的上清液施加於濾器接著OJ-pm濾器(GelmanScience)以除去汙染物。實施例4通過流式細胞術評價抗-人c-Mpl抗體的結合活性使用雜交瘤培養物上清液或純化的抗體通過流式細胞術測定抗-人c-Mpl抗體的結合活性。使用FM3A-hMpl細胞或表達人Mpl的FDCP2細胞(FDCP-hMpl)(FEBS,Lett.,Oct21,1996,395(2-3):228-34)。對於每次反應，將細胞(4乂105個細胞)懸浮於50^FACS染色培養基(2%FBS，0.1%NaN3，1mMEDTA溶於PBS),添加50pi雜交瘤培養物上清液或純化的人抗體溶液(終濃度0.1-1pg/ml),在冰上反應30分鐘。在用FACS染色培養基洗滌後，添加第二抗體一R-藻紅蛋白(RPE)標記的山羊抗-人IgyF(ab，)抗體(Cat#2043-09,SouthernBiotechnology),在光屏蔽條件下再次在冰上反應30分鐘，接著再次洗塗。為了分析抗體的結合活性，將細胞懸浮於含碘化吡啶(PI)的FACS染色培養基中。使用FACSCalibur(BectonDickinson)進行該分析。圖1顯示了使用不同的純化抗體的流式細胞術結果。每種抗體都結合FDCP-hMpl細胞，但不結合其親本細胞株FDCP2細胞("FDCP親本")。因此，證實了那些抗體各自特異性結合人Mpl。實施例5使用UT7/TPO細胞評價抗-人c-Mpl抗體的激動活性使用雜交瘤上清液或純化的抗體進行UT7/TPO細胞增殖試驗來評價激動活性。UT7/TPO細胞是一種TPO-依賴的人巨核細胞細胞系(參見OzakiK等,Blood,Dec15,1998;92(12):4652-62)。一般而言，在含10%FBS和5ng/mlPEG-rHuMGDF的Iscove氏改良的Dulbecco氏培養基(IMDM)中培養並維持細胞。以下列方法進行細胞增殖試驗。(1)將UT7/TPO細胞培養物置於50-ml試管中並離心製備細胞沉澱(離心條件1,500rpm,5min,4。C)。除去培養基，將沉澱懸浮在無細胞因子、含10%FBS的IMDM培養基(在下文中稱為"增殖試驗培養基")中。再次離心細胞並懸浮於新鮮的增殖試驗培養基中。再次重複離心和懸浮。(2)在5%C02存在下於37。C培養上述(l)中懸浮於增殖試驗培養基中的細胞6小時。(3)培養後，離心細胞製備沉澱，然後懸浮於增殖試驗培養基中。在該情況下，將細胞密度調節至6x105個細胞/ml，並將50pl細胞懸液置於96-孔板的每個孔中。(4)隨後，添加40pl增殖試驗培養基到10nl雜交瘤培養物上清液中，並將所得到的產物添加到每個孔中。當使用純化的抗體時，以2x終濃度的濃度將樣品添加到50(il增殖試驗培養基中，並將所得到的產物添加到孔中。(5)在5。/qC02存在下於37。C培養48小時。(6)以10pl/孔濃度添加WST-8試劑(DojindoLaboratories),並培養2小時。(7)使用吸光酶標儀(SunriseRainbow;Tecan)(測量波長450nm;參比波長超過600nm)測定每個孔的吸光度。圖2顯示了使用純化的抗體7-10(圖2A)、4-49(圖2B)、6-4-50(圖2C)和6-5-2(圖2D)通過UT7/TPO細胞增殖試驗獲得的增殖曲線。下表2顯示了抗-人c-Mpl抗體亞類和被確定為篩選結果的活性強度(通過UT7/TPO細胞增殖試驗測定的50。/。有效濃度(EC50)和最大活性(Max)),以及製備抗體的實施例2中所描述的免疫方法。表2tableseeoriginaldocumentpage48+:EC50:1-10iiM++:ECso:0.1-1nM實施例6集落形成試驗使用人臍帶血衍生的CD34+細胞進行CFU-Mk集落形成試驗，並檢查純化的抗體對人原代細胞的作用。以下列方法使用MegaCultTM-C(Cat#04972,StemCellTechnologies)進行試驗。(1)添加MegaCultTM-C培養基(0.85ml)到0.15ml含樣品的IMDM中，使得總體積為1ml。(2)將製備自人臍帶血的CD34+細胞以1.1x105個細胞/ml的濃度懸浮於IMDM中，並將來自懸液的0.05ml等分試樣添加到含有上述(l)的培養基的獨立試管中。(3)渦旋含有細胞的試管，添加0.6ml水冷的膠原溶液，然後再次渦旋混合物。(4)以0.75ml的量添加上述(l)-(3)的細胞樣品混合物到室玻片(chamberslide)的每個孑L中。(5)將室玻片置於100-mm培養皿中。為了防止室玻片乾燥，將含3ml純水的35-mm培養亞置於上述100-mm培養皿中。(6)將含室玻片的培養皿放在恆溫箱架子上，在5%0)2存在下於37。C培養10-12天。(7)培養後，用固定液(曱醛:丙酮=l:3)固定細胞。(8)使用抗-人CD41抗體進行免疫染色以;險測CFU-Mk集落。用顯微鏡計算菌落計數，彼此比較試樣形成CFU-Mk集落的能力。圖3顯示了集落培養的結果。7-10—IgGl或4-49—IgGl誘導了集落形成。實施例7抗體基因的克隆和測序為了製備重組抗體，從選擇的產生抗-人c-Mpl激動劑抗體的雜交瘤分離抗體基因，特別是編碼重鏈(H鏈)的人IgYcDNA和編碼輕鏈(L鏈)的人IgKcDNA,並測定它們的序列。1)單克隆抗體cDNA的合成為了獲得包含雜交瘤中表達的、人抗體重鏈和輕鏈可變區的DNA片段，使用特異於人Igy和人IgK恆定區的引物，通過5'-RACE(5'cDNA末端快速擴增)法進行克隆。具體來說，根據所附使用說明書，使用BDSMARTRACEcDNA擴增試劑盒(BDBiosciencesClontech)進行克隆。作為用於cDNA合成的原料，向雜交瘤7-10、4-49、6-4-50和6-5-2細胞添加用於RNA提取的Isogen(NipponGene，Japan),並根據廠商使用說明書純化總RNA。使用約1pg純化的總RNA作為模板製備第一鏈cDNA。以下列方法合成第一鏈cDNA。在70°C下溫育含1pi總RNA、1nl5，CDS和1plSMART01igo的反應溶液2分鐘。其後，2[il5x緩衝液、1plDTT、1]LilDNTP混合物和1|ilPowerScript逆轉錄酶添加到其中，並在42。C下溫育混合物1.5小時。此外，添加50(il的tricine-EDTA緩沖液，並在72。C下溫育混合物7分鐘以獲得第一鏈cDNA。2)通過PCR擴增重鏈基因和輕鏈基因並確認核苷酸序列2-1)通過PCR擴增重鏈和輕鏈基因為了擴增人抗體基因cDNA，將具有人抗體特異性序列的3，-引物(特別是下述的)和下述的5'引物用作PCR引物組，所述的5'引物與使用BDSMARTRACEcDNA擴增試劑盒(通用引物A混合物)合成的cDNA5'末端附加的序列特異性雜交，將KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)用作PCR酶來製備具有以下所示組成的反應溶液。該溶液用於PCR。無菌112028nlcDNA2.5plKOD-Plus-緩衝液(10x)5^1dNTPs混合物(2mM)5(xlMgS04(25mM)2plKOD-Plus-(1單位/pl)1pl通用引物A混合物(UPM)(10x)5pl基因特異性引物(GSP)(10pM)1.5pi總體積50|al使用UPM引物和IgGlp引物擴增重鏈基因，所述引物包括在SMARTRACEcDNA擴增試劑盒中。另一方面，使用UPM引物和hk-2引物組成的引物組擴增輕鏈基因。IgGlp引物5,-TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG-3，(SEQIDNO:18)hk-2:5，-GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC-3,(SEQIDNO:19)在下列溫度條件下進行該反應94°C持續30秒和72。C持續3分鐘的循環重複5次，94。C持續30秒、70。C持續30秒和72°C持續3分鐘的循環重複5次，以及94。C持續30秒、68。C持續30秒和72°C持續3分鐘的循環重複25次。此外，向上述2iil反應溶液中添加98pi的tricine-EDTA緩衝液，使用5pl稀釋溶液作為模板，並使用較第一次PCR更向內的引物組進行第二次PCR(嵌套式PCR)。PCR溶液組分顯示如下。無菌112030^1第一PCR反應溶液(50-倍稀釋的)5^1KOD-Plus-緩衝液(10x)5pidNTPs混合物(2mM)5piMgS04(25mM)2piKOD-Plus-(1單位/ial)1pi嵌套通用引物A(NUP;10pM)1pi基因特異性引物(GSP)(10pM)1|xl總體積50pi當進行重鏈基因擴增時，NUPM引物(SMARTRACEcDNA擴增試劑盒附帶的；BDBiosciencesClontech)與hh2引物(在雜交瘤4-49、6-4-50和6-5-2情況下)或IgG2p—134引物(在雜交瘤7-10情況下)結合使用。當進行輕鏈基因擴增時，使用UPM引物和hk-5引物。通過在94。C起始溫度加熱1分鐘，接著是在94°C加熱5秒、在68。C持續IO秒以及在72。C持續3分鐘的20個循環，然後是在72。C加熱7分鐘進行反應。2-2)測定抗體基因的核苷酸序列通過上述方法擴增的重鏈的PCR片段(在下文中稱為"HV[C]")由重鏈的5，-非翻譯區、前導序列(分泌信號序列)、可變區(HV)以及部分的恆定區([C])組成。類似地，輕鏈的PCR-擴增片段(在下文中稱為"LV[C]")由輕鏈的5，-非翻譯區、前導序列(分泌信號序列)、可變區(LV)以及部分的恆定區([C])組成。本文中使用的術語"前導序列(分泌信號)"指為抗體分泌所需要的並且從成熟抗體蛋白中切割下的胺基酸序列。通過乙醇沉澱、瓊脂糖凝膠電泳分離並接著由應用膜的DNA純化試劑盒(QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen))純化，從PCR溶液中回收HV[C]片段和LV[C]片段。將純化的擴增的HV[C]片段和擴增的LV[C]片段分別亞克隆入ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen)的pCR4Bhmt-TOPO載體(Toyobo)中。分析插入所獲得克隆的質粒中的DNA的核苷酸序列。為了測定DNA的核苷酸序列，使用M13-20FW和M13RV引物。hk-5:5'-AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC-3'(SEQIDNO:20)hh2引物5，-GCTGGAGGGCACGGTCACCACGCTG-3'(SEQIDNO:21)IgG2p—134:5'-TGCACGCCGCTGGTCAGGGCGCCTGAGTTCC-3'(SEQIDNO:22)編碼激動劑抗體7-10重鏈可變區和輕鏈可變區DNA的核苷酸序列以及重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列顯示如下。(ATG起始密碼子至編碼可變區C-末端胺基酸殘基的DNA序列)ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAAATCTATGGTTCGGGGAGTTCCGTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(SEQIDNO:23)<7-10的重鏈胺基酸序列〉(前導序列至可變區)(下劃線的胺基酸殘基構成作為分泌信號的前導序列)MELGLSWIFLLAILKGVOCEVOLVESGGGLVOPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQ廳SLRAEDTALYYCAKNLWFGEFRYWYFDLWGRGTLVTVSS(SEQIDNO:24)<7-10的輕鏈核酸序列〉(ATG起始密碼子至編碼可變區C-末端胺基酸殘基的DNA序列)ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQIDNO:25)(前導序列至可變區)(下劃線的胺基酸殘基構成作為分泌信號的前導序列)MELGLSWIFLLAILKGVOCEVOLVESGGGLVOPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWALYYCAKNLWFGEFRYWYFDLWGRGTLVTVSS(SEQIDNO:26)編碼激動劑抗體4-49重鏈可變區和輕鏈可變區DNA的核苷酸序列以及重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列顯示如下。<4-49的重鏈核酸序列〉(ATG起始密碼子至編碼可變區C-末端胺基酸殘基的DNA序列)ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGAGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGTACTGGGTCCGGCAAGTTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAACAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCGTTTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTATATTACTGTGCAAAAGCCCTATGGTTCGGGGAGTTCCCCCACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO:27)<4-49的重鏈胺基酸序列〉(前導序列至可變區)(下劃線的胺基酸殘基構成作為分泌信號的前導序列)MELGLSWIFLVAILKGVOCEEOLVESGGGLVOPrTRSLRLSCTASGFTFDDYAMYWVRQVPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKALWFGEFPHYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:28)<4-49輕鏈核酸序列〉(ATG起始密碼子至編碼可變區C-末端胺基酸殘基的DNA序列)GGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTACTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGT(SEQIDNO:29)(前導序列至可變區)(下劃線的胺基酸殘基構成作為分泌信號的前導序列)MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCAIOLTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSTLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPYTFGQGTKLEIKR(SEQIDNO:30)編碼激動劑抗體6-4-50重鏈可變區和輕鏈可變區DNA的核苷酸序列以及重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列顯示如下。(ATG起始密碼子至編碼可變區C-末端胺基酸殘基的DNA序列)ATGGAATTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACCTTTGATAATTATGCCATGTACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTGACATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGGGATGCGGGGTTCGGGGAGTTCCACTACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO:31)(前導序列至可變區)(下劃線的胺基酸殘基構成作為分泌信號的前導序列)MELGLSWIFLLAILKGVOCEVOLVESGGGLVOPGRSLRLSCATSGFTFDNYAMYWVRQAPGKGLEWVSGIS畫SGDIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDAGFGEFHYGLDVWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:32)(ATG起始密碼子至編碼可變區C-末端胺基酸殘基的DNA序列)ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT(SEQIDNO:33)(前導序列至可變區)(下劃線的胺基酸殘基構成作為分泌信號的前導序列)MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCAIOLTOSPSSLSASVGDRVTTTCRASQGTSSAT,ANSYPWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:34)編碼激動劑抗體6-5-2重鏈可變區和輕鏈可變區DNA的核苷酸序列以及重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列顯示如下。(ATG起始密碼子至編碼可變區C-末端胺基酸殘基的DNA序列)ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAACTGGTGGAGTGTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGTATAGGTTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAACCTATATGGTTCGGGGAGTGGGGAAACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO:35)(前導序列至可變區)(下劃線的胺基酸殘基構成作為分泌信號的前導序列)MELGLSWIFLLAILKGVOCEVOLVECGGGLVOPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQ畫SLRAEDTALYYCAKPIWFGEWGNYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:36)(ATG起始密碼子至編碼可變區C-末端胺基酸殘基的DNA序列)ACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGT(SEQIDNO:37)<6-5-2的輕鏈胺基酸序列〉(前導序列至可變區)(下劃線的胺基酸殘基構成作為分泌信號的前導序列)METPAOLLFLLLLWLPDTTGEIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASqSVSSSYTAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITFGQGTRLEIKR(SEQIDNO:38)構建重組抗體表達載體將以上述方法從雜交瘤中克隆的抗體可變區整合入人抗體表達載體，並製備具有不同恆定區的重組抗體表達載體。人抗體表達載體一N5KGl-ValLark(以下縮寫為"N5KG1")(IDECPharmaceuticals,參見美國專利第6,001，358號)是一種用於在動物細胞中表達重組抗體的質粒載體。N5KG1的結構示於圖4A中。N5KG1包含兩個CMV啟動子/增強子，以及在其下遊的重鏈和輕鏈可變區基因克隆位點。此外，N5KG1最初包含上述克隆位點下遊的、編碼人重鏈恆定區(Yl)和人輕鏈恆定區(k)的基因序列。任何重鏈和輕鏈可變區(包括前導序列或分泌信號序.列)都可以符合讀框的方式摻入該載體可變區克隆位點中，由此可表達包含連接至人k鏈恆定區的輕鏈可變區以及連接至人鏈恆定區的重鏈可變區的抗體。因此，其中導入了載體的動物細胞在培養基中產生了IgGl抗體。類似地，表達載體N5KG4PE(IDECPharmaceuticals)包含IgG4PE的重鏈恆定區。IgG4PE是具有導入IgG4中的兩個突變Ser228Pro和Leu235Glu的序列。Ser228Pro是抑制由IgG4分子內交聯(即S-S鍵)引起的單體形成的突變，Leu235Glu是降低抗體依賴的細胞毒性(ADCC)的活性的突變。將N5KG1的IgGl恆定區轉變為IgG3來製備N5KG3。在該實施例中，通過向重鏈恆定區(特別是鉸鏈區)添加不同的修飾，由N5KG1、N5KG3和N5KG4PE製備表達載體。在本實施例中向恆定區添加的修飾，首先，是抗體域在亞類之間的取代。抗體重鏈恆定區具有自N-末端側具有CHl-鉸鏈-CH2-CH3的域結構。在本實施例中，通過將這些域單元組合到亞類序列中製備重鏈恆定區。例如，製備了其中CH1和鉸鏈區序列來自人IgG3以及CH2和CH3序列來自人IgGl的重鏈恆定區。對具有以CHl/鉸鏈/CH2/CH3順序存在的重鏈恆定區的抗體進行亞類命名，其被命名為IgG3/3/1/1(以下稱為例如IgG3311,省略了'7")。還製備了其中鉸鏈區序列是，例如來自人IgG3，CH1、CH2和CH3序列來自人IgG4PE的另一種重鏈恆定區。具有這樣的重鏈恆定區的抗體被命名為IgG4344。第二，製備人igG3鉸鏈區的修飾。抗體鉸鏈區可分成上鉸鏈和中間鉸鏈。術語"上鉸鏈"指從殘基216至位於較殘基226的N-末端側的殘基的序列，在此殘基編號基於KabatEU編號系統(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda，Md.,1991)。術語"中間鉸鏈"指從殘基226至位於較殘基231的N-末端側的殘基的序列，在此殘基編號基於同一系統。人lgG3的鉸鏈區由上鉸鏈的12個胺基酸殘基和中間鉸鏈的50個胺基酸殘基組成，其中中間鉸鏈分成5個胺基酸和15個胺基酸的3次重複(即5+15x3=50)。在該實施例中，製備IgG3中間鉸鏈序列重複被縮短為一次的突變體。這樣的鉸鏈被命名為G3hl，並將具有該類型鉸鏈的抗體與所述域單元的突變相結合，所得到的組合被命名為IgGx3xxhl(在此x是任意的)。同樣地，製備缺失了IgG3中間鉸鏈後面的一半重複序列的重鏈恆定區。這樣的鉸鏈被命名為G3uh("上鉸鏈突變"的縮寫)，並稱為IgGx3xxuh。此外，將突變L217S和R228P添加到G3uh鉸鏈來製備重鏈恆定區。該突變旨在將G3uh鉸鏈帶到更接近於IgG4PE序列的位置。所得到的產物被命名為G3uhm("上鉸鏈突變，，的縮寫)，並將具有上述產物的抗體稱為IgGx3xxuhm。圖4B顯示了天然存在的人免疫球蛋白和IgG4PE、IgG4344、IgG4344hl、IgG4344uh和IgG4344uhm鉸鏈區的胺基酸序列。在該實施例中，抗-Mpl激動劑抗體的可變區用於製備表達具有下列恆定區的抗體的表達載體IgGl、IgG4PE、IgG3311、IgG3331、IgG3344、IgG3344hl、IgG4344、IgG4344hl、IgG4344uh和IgG4344uhm。以下，描述了用於製備表達載體的方法。1)製備IgGl亞類的抗-c-Mpl抗體表達載體1-1)製備抗-人c-Mpl抗體4-49—IgGl和抗體7-10—IgGl表達載體通過先後將重鏈可變區和輕鏈可變區插入N5KG1載體製備抗體7-10和4-49表達載體。圖4C顯示了製備表達載體的過程。將包含抗體7-10和4-49的HV[C]和LV[C]片段(如實施例7中所描述的)的質粒DNA用作模板，並將末端包含用於連接的限制性內切酶位點(在5，-末端側的Sall和在3'-末端側的Nhel)的一組引物，由KOD-Plus-DNA聚合酶通過PCR擴增重鏈和輕鏈的前導序列和可變區。將PCR-擴增的重鏈和輕鏈的前導序列加上可變區分別以HV片段和LV片段表示。將7-10HV和4-49HV片段插入N5KG1。用於擴增HV片段的引物如下所示。7畫10;用於HV片段的5，引物40-3H5Sal5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTT-3，(SEQIDNO:39)用於HV片段的3，引物40-3H3Nhe5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACAGTGACCAGGGTGCCA-3,(SEQIDNO:40)4國49;用於HV片段的5'引物F24HSal5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTT-3'(SEQIDNO:41)用於HV片段的3'引物C15H3Nhe5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3，(SEQIDNO:42)通過在94。C起始溫度加熱1分鐘，以及94°C持續5秒和68°C持續45秒的35個循環，然後在72。C加熱7分鐘進行該反應。用限制性內切酶Sail和Nhel消化擴增的DNA片革更，並經瓊脂糖凝膠電泳回收約430-bpDNA片段，接著進行純化。獨立地，依次用限制性內切酶Sail和Nhel消化N5KG1載體，並用^s鹹性磷酸酶(大腸桿菌C75)(TakaraShuzo，Japan)處理脫磷酸。此後，經瓊脂糖凝膠電泳並使用DNA純化試劑盒回收約8.9-kbDNA片段。使用T4DNA連接酶將這兩條片段彼此連接，然後導入大腸桿菌DH10B以獲得轉化體。分析來自所得到轉化體的質粒DNA的核苷酸序列，並獲得其中HV片段以符合讀框的方式插入重鏈恆定區5'上遊區的質粒DNAs—N5KG1—7-10—Hv和N5KG1—4-49—Hv。隨後，將LV片段(由輕鏈前導序列和可變區組成)插入質粒載體，所述的質粒載體包含插入其中的HV片段。用包含LV[C]片段的質粒DNA用作模板，在末端附加有用於連接的限制性內切酶位點(在5，-末端側的BglII和在3，-末端側的BsiWI)的引物，通過PCR擴增LV片段。用於擴增LV片段的引物如下所示。7-10;用於LV片段的5'引物165-1B—L18Bgl5,-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTC-3,(SEQIDNO:43)用於LV片段的3，引物165—IB—L18_Bsi5,-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC-3'(SEQIDNO:44)4-49;用於LV片段的5'引物DNP_LlBglp5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC-3'(SEQIDNO:45)用於LV片段的3'引物A27_R_N2025，-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC-3'(SEQIDNO:46)通過在94。C起始溫度加熱1分鐘，接著是在94。C加熱5秒以及在68°C持續45秒的35個循環，然後是在72°C加熱7分鐘進行該反應。將純化的LV的擴增的DNA片段亞克隆到pCR4Blunt-TOPO載體(Toyobo,Japan)中。分析插入獲得的克隆質粒中的DNA核苷酸序列。為了測定DNA核苷酸序列，使用M13-20FW和M13RV引物。分析插入片段的DNA核苷酸序列，並選擇並沒有不同於模板LV以及具有所設計的引物序列的質粒DNA(TOPO—7-10—Lv和TOPO—4-49—Lv)。隨後，用限制性內切酶BglII和BsiWI消化DNA,並經瓊脂糖凝膠電泳回收約400-bpDNA片^殳然後進行純化。通過T4DNA連接酶將純化的DNA片段，與用限制性內切酶BglII和BsiWI消化並脫磷酸的、包含插入了HV的7-10或4-49的載體連接(約9.3-kb)，將所得到的產物導入大腸桿菌DH10B以獲得轉化體。分析轉化體的DNA序列或限制性內切酶切割模式以選擇包含目的質粒DNA的克隆。此外，大量純化所獲得的抗體表達質粒DNA，以便證實在克隆過程期間在完整重鏈區、完整輕鏈區以及位於插入區附近的DNA核苷酸序列中沒有發生突變。表達載體7-10—IgGl和4-49—IgGl被命名為N5KG1—7-10和N5KGl一4-49。圖4C顯示了產生N5KG1—7-10和N5KG1—4-49的過程。l誦2)製備抗-人c-Mpl抗體6-4-50—IgGl和6-5-2—IgGl表達載體通過先後將輕鏈可變區和重鏈可變區插入人抗體表達載體製備6-4-50和6-5-2表達載體。利用包含抗體6-4-50和6-5-2的LV[C]片段(如實施例7中所描述的)的質粒DNA作為模板，末端附加有用於連接的限制性內切酶位點(在5，-末端側的BglII和在3，-末端側的BsiWI)的一組引物，由KOD-Plus-DNA聚合酶，通過PCR擴增LV片段(由輕鏈的前導序列和可變區組成)。所使用的引物如下所示。6-4-50;用於LV片段的5'引物208LF5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGC-3，(SEQIDNO:47)用於LV片段的3'引物62LP3Bsi5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG-3'(SEQIDNO:48)6曙5腸2;用於LV片段的5'引物A27—F5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTC-3'(SEQIDNO:49)用於LV片段的3，引物202LR5,-AGAGAGAGAGCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC-3，(SEQIDNO:50)通過在94。C起始溫度加熱1分鐘，接著在94。C加熱5秒以及在68。C持續45秒的35個循環，然後是在72°C加熱7分鐘進行反應。用限制性內切酶BglII和BsiWI消化擴增的DNA片段，並通過瓊脂糖凝膠電泳回收約400-bpDNA片段並純化。獨立地，依次用限制性內切酶BglII和BsiWI消化N5KG1載體並用石鹹性磷酸酶(大腸桿菌C75)(TakaraShuzo,Japan)處理脫磷酸。此後，經瓊脂糖凝膠電泳並使用DNA純化試劑盒回收約8.9-kbDNA片段。使用T4DNA連接酶將這兩條片段相互連接並導入大腸桿菌DH10B以獲得轉化體。分析包含插入DNA片段的所得到的轉化體的質粒DNA核苷酸序列，並獲得了其中LV片段以符合讀框的方式插入編碼N5KG1的人抗體輕鏈恆定區的5，-上遊區的質粒DNA,即N5KG1—6-4-50—Lv和N5KG1—6-5-2_Lv。隨後，將HV片萃爻(由重鏈的前導序列和可變區組成)插入質粒載體，所述的質粒載體包含插入其中的LV片段。利用包含HV[C]片段的質粒DNA(如實施例7中所述)作模板，一組在其末端附加有用於連接的限制性內切酶位點(在5，-末端側的Sail和在3，-末端側的NheI)的引物，通過PCR擴增HV片,爻。所^使用的引物如下所示。6-4-50;用於HV片段的5，-引物50-5-7Hsal5'國AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAATTGGGACTGAGCTGGATTTT-3，(SEQIDNO:51)用於HV片段的3，-引物C15H3Nhe5'.AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3，(SEQIDNO:52)6國5-2;用於HV片段的5，-引物F24HSal5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTT-3'(SEQIDNO:53)用於HV片段的3，-引物L66H3Nhe5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC-3'(SEQIDNO:54)通過在94。C起始溫度加熱1分鐘，接著在94。C加熱5秒和在68°C持續45秒的35個循環，然後在72。C加熱7分鐘進行反應。將擴增的純化的HV片段的DNA片段亞克隆到pCR4Blunt-TOPO載體(Toyobo，Japan)中。分析插入所獲得的質粒克隆中的DNA的核苷酸序列。為測定DNA核苷酸序列，使用M13-20FW和M13RV引物。分析插入片段的DNA核苷酸序列，並選擇並沒有不同於模板HV並且具有所設計的引物序歹'J的質粒DNA(TOPO—6-4-50—Hv和TOPO—6-5-2—Hv)。隨後，DNAs分別用限制性內切酶Sail和Nhel消化，然後經瓊脂糖凝膠電泳回收約430-bpDNA片段並純化。獨立地，將要被插入的DNA片段，與用限制性內切酶Sail和Nhel消化並脫磷酸的、LV的6-4-50或6-5-2的片段的載體(約9.3-kb)相連接，將所得到的產物導入大腸桿菌DH10B以獲得轉化體，從轉化體中選擇具有耙質粒DNA的克隆。此外，大量純化所得到的抗體表達質粒DNAs，以便證實在克隆過程期間在完整重鏈區、完整輕鏈區以及位於插入區附近的DNA核苷酸序列中沒有發生突變。抗體表達載體6-4-50一IgGl和6-5-2—IgGl^皮命名為N5KG1—6-4-50和N5KG1—6-5-2。圖4D顯示了產生N5KG1—6-4-50和N5KGl_6-5-2的過程。2)製備亞類IgG4PE的抗-人c-Mpl抗體使用前述N5KG4PE載體製備亞類IgG4PE抗體表達載體。用限制性內切酶Nhel和BamHI切割N5KG4PE的質粒DNA，並純化含重鏈恆定區的片段，然後連接到抗-cMpl抗體N5KG1—7-10和N5KG1—4-49的相同的卩艮制性內切酶位點上製備N5KG4PE_7-10和N5KG4PE_4-49。3)製備N5KG3通過用具有以下序列的IgG3恆定區取代N5KG1的IgGl重鏈恆定區，製備人IgG3表達載體N5KG3。IgG3恆定區的胺基酸序列STKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKLREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK*(SEQIDNO:55)IgG3恆定區的核苷酸序列CTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGTTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQIDNO:56)4)製備IgG3311表達載體使用N5KG3作為模板以linkH和13chl-R為引物，在98°C加熱1秒、60。C持續30秒以及72°C持續30秒，並重複該反應15次的反應製備IgG3311表達載體。與此同時，使用N5KG1作為模板，以13chl和linkH2引物的98。C持續1秒、60。C持續30秒以及72°C持續30秒的反應循環重複15次。使用PCR純化試劑盒純化擴增的DNA片段，將兩種純化的DNA片段等量混合，重複98°C持續1秒、60。C持續30秒以及72。C持續30秒的反應循環5次，並使用外加的linkH和linkH2引物進行額外的15個反應循環。用Nhel和BamHI切割擴增的DNA片段並用N5KG1載體IgGl恆定區取代。該表達載體被命名為N5KG3311。linkH:GGGTACGTCCTCACATTCAGTGATCAG(SEQIDNO:57)13chl-R:GTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCA(SEQIDNO:58)13chl:TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC(SEQIDNO:59)linkH2:TGATCATACGTAGATATCACGGC(SEQIDNO:60)5)製備IgG3331表達載體用N5KG3作為模板，以linkH和CH3consR為引物，在98。C加熱1秒、60。C持續30秒以及72。C持續30秒，並重複該反應15次的反應製備IgG3311表達載體。與此同時，使用N5KG1作為模板，以CH3cons和linkH2引物，98。C持續1秒、60。C持續30秒以及72。C持續30秒的反應循環重複15次。使用PCR純化試劑盒純化擴增的DNA片段，將純化的兩種DNA片段等量段混合，重複98°C持續1秒、60。C持續30秒以及72。C持續30秒的反應循環5次，並使用外加的linkH和linkH2S1物進行額外的15個反應循環。用Nhel和BamHI切割擴增的DNA片段並用N5KG1載體IgGl恆定區取代。該表達載體被命名為N5KG3311。CH3consR:GGTGTACACCTGTGGCTCTCGGGGCTGCCC(SEqIDNO:61)CH3cons:GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACC(SEQIDNO:62)以下，描述了製備IgG3344、IgG3344hl、IgG4344、IgG4344hl、IgG4344uh和IgG4344uhm的方法。通過PCR擴增它們的恆定區，克隆擴增產物獲得質粒。用N5KG1—7-10的IgGl恆定區等取代這樣的修飾的恆定區。6)製備IgG3344和IgG3344hl恆定區以下列方法使用N5KG3331和N5KG4PE作為模板，通過基於PCR的誘變(通過重疊延伸法的定點誘變)製備IgG3344表達載體。使用N5KG3331作為模板，以G3G4—PI—F和G3G4—P2—R作為引物，通過在94。C起始溫度加熱1分鐘，接著是在94°C加熱15秒、在55。C持續IO秒以及在68。C持續l分鐘的35個循環，然後是在72°C加熱7分鐘進行PCR。與此同時，在相同條件下使用前述表達載體N5KG4PE作為模板以及G3G4—P3—F和G3G4—P4—R作為引物進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的DNA片段，接著使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行純化。將等量的這些純化的DNA片段互相混合。退火這兩條DNA片段的重疊部分並進行5個延伸反應循環，所述循環包括在94°C起始溫度加熱1分鐘，和94°C持續10秒，55°C持續10秒以及68。C持續1.5分鐘。此後，添加G3G4_P1_F和G3G4—P4—R引物到反應溶液中以便擴增全長序列，並重複在94°C加熱5秒以及68。C持續2分鐘的循環20次，然後是在72。C加熱7分鐘。G3G4_P1_F和G3G4_P4_R引物包含限制性內切酶位點(在G3G4P1F中Nhel位點以及在G3G4_P4_R中BamHI位點)以便切割人抗體恆定區的編碼區，並用抗體表達載體的相應區取代該編碼區。通過瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的PCR片段，然後使用QIAquick凝膠提取試劑盒進行純化。將純化的擴增片段亞克隆到ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen)的pCR4Blunt-TOPO載體中，並分析插入所得到克隆質粒中DNA的核苷酸序列。基於核苷酸序列分析結果，選擇具有IgG3344和IgG3344hl恆定區的克隆。G3G4_P1_F:5，-AGAGAGGCTAGCACCAAGGGCCCATCG-3，(SEQIDNO:63)G3G4—P2一R:5'-GAACTCAGGTGCTGGGCACCTTGGGCACG-3'(SEQIDNO:64)G3G4—P3—F:5，-CCAAGGTGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGA-3'(SEQIDNO:65)G3G4一P4一R:5,-AGAGAGGGATCCTCATTTACCCAGAGACAGGGA-3'(SEQIDNO:66)7)製備IgG4344恆定區用N5KG3331作為模板，以G434—P5—F和G434—P6—R作為引物，在94°C起始溫度加熱1分鐘，接著是在94。C加熱15秒、55。C持續10秒以及68。C持續1分鐘的35個循環，然後是在72。C加熱7分鐘的反應製備IgG4344表達載體。與此同時，使用N5KG4PE作為模板以及G434—P7—F和G3G4—P2—R作為引物在相同的條件下進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的DNA片段，然後通過QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行純化。對這兩條純化的DNA片萃殳以及已用N5KG4PE作為模板以及G3G4—P3—F和G3G4—P4_R作為引物擴增並純化的DNA片段(即三種類型的DNA片段)進行重疊延伸反應。具體而言，使三種類型DNA片段的重疊部分退火，通過在94。C起始溫度加熱1分鐘，並通過94。C持續10秒、55。C持續10秒以及68。C持續1.5分鐘的5個循環進行延伸。為了擴增全長序列，添加G434—P5_F和G3G4—P4—R引物到反應溶液中，然後進行在94。C加熱5秒以及在68°C持續2分鐘的20個循環，接著是在72°C加熱7分鐘。通過QIAquick凝膠提取試劑盒純化擴增的PCR片段並亞克隆入pCR4Blunt-TOPO載體中。然後分析插入所獲得的質粒克隆中的DNA的核苷酸序列。基於核苷酸序列分析結果，選擇具有IgG4344恆定區的克隆。G434一P5一F:5'-AGAGAGGCTAGCACCAAGGGGCCATCC-3，(SEQIDNO:67)G434一P6一R:5'-GGTTTTGAGCTCAACTCTCTTGTCCACCTTGGTGTTGC-3'(SEQIDNO:68)G434_P7—F:5，-GTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACAC-3，(SEQIDNO:69)8)製備IgG4344hl恆定區用N5KG4344作為模板，以G434—P5—F和G434—P6—R作為引物，通過PCR製備IgG4344hl表達載體，包括在98°C起始溫度加熱10秒，接著是在98°C加熱10秒、在55。C持續30秒以及在72°C持續l分鐘的7個循環，然後是在98。C加熱10秒以及在68。C持續1分鐘的30個循環，之後是在72。C加熱7分鐘。使用了PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio)。與此同時，使用N5KG3344hl作為模板，以G434—P7_F和G3G4—P4—R引物，在相同的條件下進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的DNA片段，然後通過QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行純化。將這些純化的DNA片段等量混合，使兩條DNA片段的重疊部分退火，通過在98°C起始溫度加熱10秒，接著在98。C加熱10秒、在55。C持續30秒以及在72。C持續1分鐘的7個循環延伸退火產物。添加G434—P5—F和G3G4_P4—R引物到反應溶液中以便擴增全長序列。此外，重複98。C持續10秒以及68。C持續1分鐘的循環30次，接著是在72。C加熱7分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的PCR片段，然後使用QIAquick凝膠提取試劑盒進行純化。將純化的擴增片段亞克隆入pCR4Blunt-TOPO載體中，並分析插入所獲得的克隆質粒中的DNA核苷酸序列。基於核苷酸序列分析結果，選擇具有G4344hl恆定區的克隆。9)製備IgG4344uh恆定區用N5KG4344作為模板，以G434—P5—F和17-1R作為引物，通過PCR製備G4344uh,包括在98°C起始溫度加熱10秒，接著是在98。C加熱10秒、在50°C持續30秒以及在72°C持續1分鐘的5個循環，然後是在98。C加熱10秒、在55。C持續30秒以及在72。C持續1分鐘的5個循環，之後是在98°C加熱10秒以及在68。C持續1分鐘的25個循環，然後是在72。C加熱7分鐘。使用了PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio,Japan)。與此同時，用N5KG334處1作為模板，以17-2F和G3G4—P4一R作為引物，在相同的條件下進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的DNA片段，然後通過QIAquick凝膠提取試劑盒進行純化。將這些純化的DNA片段等量混合，使兩條DNA片段的重疊部分退火，通過在98。C起始溫度加熱10秒，接著在98°C加熱10秒以及在68。C持續1分鐘的5個循環，然後在98。C加熱10秒、在55。C持續30秒以及在72。C持續1分鐘的5個循環延伸退火產物。此後，添加G434—P5—F和G3G4—P4—R引物到反應溶液中以便擴增全長序列。重複在94。C加熱30秒以及68。C持續1分鐘的循環30次，然後在72°C加熱7分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的PCR片段，然後使用QIAquick凝膠提取試劑盒進行純化。將純化的擴增片段亞克隆入pCR4Blunt-TOPO載體中，並分析插入所獲得的質粒克隆中的DNA核苷酸序列。基於核苦酸序列分析結果，選擇具有IgG4344uh恆定區的克隆。17-1R:5，-AGGTGCTGGGCACCGTGGGCATGTGTGAGTTGT-3'(SEQIDNO:70)17-2F:5'-CACACATGCCCACGGTGCCCAGCACCTGAGTTC-3，(SEQIDNO:71)10)製備IgG4344uhm恆定區通過PCR製備IgG4344uhm表達載體，用N5KG4PE作為模板，以G434—P5—F和17m-lR作為引物，包括在98。C起始溫度加熱10秒，接著是在98。C加熱10秒、在50。C持續30秒以及在72。C持續1分鐘的5個循環，然後是在98。C加熱10秒、在55。C持續30秒以及在72。C持續1分鐘的5個循環，接著是在98。C加熱10秒以及在68°C持續1分鐘的25個循環，然後是在72。C加熱7分鐘。使用了PyrobestDNA聚合酶。與此同時，在相同條件下進行PCR，使用N5KG4PE作為模才反以及17m-2F和G3G4—P4—R作為引物。通過瓊脂衝唐凝膠電泳回收擴增的DNA片段，並接著通過QIAquick凝膠提取試劑盒進行純化。將這些純化的DNA片段等量混合，使兩條DNA片段的重疊部分退火，並通過94。C持續30秒、55。C持續30秒和72。C持續1分鐘的7個循環延伸退火產物。此後，添加G434—P5—F和G3G4—P4—R引物到反應溶液中以便擴增全長序列，並重複在94。C加熱30秒以及68。C持續1分鐘的循環30次，之後在72。C加熱7分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳回收擴增的PCR片段，並接著利用QIAquick凝膠提取試劑盒進行純化。將純化的擴增片段亞克隆入pCR4Blunt-TOPO載體中，並分析插入所得到克隆的質粒的DNA核苷酸序列。基於核苷酸序列分析結果，選擇具有IgG4344uhm恆定區的克隆。17m-lR:5，-TGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGGGGTTTTGGACTCAACTCTCTTGTCCACCTTGGT-3，(SEQIDNO:72)17m-2F:5,-ACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAG-3'(SEQIDNO:73)圖4E顯示了各種修飾重鏈的胺基酸序列。11)製備包含不同修飾的重鏈恆定區的抗體表達載體用限制性內切酶Nhel和BamHI切割具有不同修飾的重鏈恆定區的質粒DNA,並純化分離恆定區序列。隨後，用相同的酶消化抗-人c-Mpl抗體表達載體N5KG1—7-10、N5KG1—4-49、N5KG1—6-4-50和N5KG1—6-5-2,並進行恆定區取代。圖4F顯示了7-10—IgG4344uhm的重鏈序列。圖4G顯示了7-10—IgG4344uhm的輕鏈序列。實施例9在293F細胞中瞬時表達並純化抗-人c-Mpl抗體使用EndoFree質粒試劑盒(Qiagen)製備實施例8中製備的表達載體的DNA,並使用FreeStyleTM293表達系統(InvitrogenLifeTechnologies)導入游離的293糹田胞(InvitrogenLifeTechnologies)中，經瞬時表達獲得含抗體的培養物上清液。將已通過膜濾器(孔徑0.22pm，Millipore)過濾的培養物上清液(含約500|xgIgG)施加於用於抗體純化的親和層析柱，即HiTraprProteinAFF(柱體積1ml)(AmershamBiosciences),用PBS(-)洗滌，用20mM檸檬酸鹽緩衝液(pH3.4)洗脫,然後回收到含200mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)的試管中。實施例10製備重組抗體將構建的抗體表達載體導入宿主細胞中來製備抗體表達細胞。通過在無血清EX-CELL325PF(JRH)培養基中調節dhfr-缺陷的CHODG44細胞(IDECPharmaceuticalsCorporation)製備的細胞系用作宿主細胞。經電穿孔將載體導入宿主細胞。用限制性內切酶AscI線性化抗體表達載體(約2|ig),使用Bio-Rad電穿孔儀(electrophoreter)在350V和5001iF下將該基因導入4xl(^個CHO細胞中，並將所得到的細胞接種在96-孔培養平板上。導入載體後，添加G418並持續培養。在觀察到菌落後，選擇抗體表達細胞系。在5%C02存在下，在EX-CELL325-PF培養基(JRH)(含2mM穀氨醯胺、100單位/ml青黴素、100ixg/ml鏈黴素和次黃噤呤和胸苷(HT)補充物(l:100)(Invitrogen))中培養所選擇的CHO細胞系。在Mabselect蛋白A柱(AmershamPharmaciaBiotech)上吸附培養物上清液，用PBS洗滌，然後用含50mMNaCl的20mM種檬酸鈉緩沖液(pH3.4)洗脫。用50mM磷酸鈉(pH7.0)中和洗脫液。用Milli-Q水將所得到的產物稀釋約1.5-倍以便將電導率調節至4.0ms/cm或更低。隨後，施加樣品並使之吸附於包含連接SP-Sepharose(HiTrapSPFF)(AmershamPharmaciaBiotech)的Q-Sepharose(HitrapQHP)(AmershamPharmaciaBiotech)柱上，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH5.0)洗滌，並用lxPBS緩衝液洗脫。製備的抗體溶液通過0.22^m膜濾器，MILLEX-GV(Millipore)經過濾滅菌。通過測定280nm處的吸光度並基於1.4OD等於1mg/ml4艮據吸光度值進行計算確定純化的抗體的濃度。通過UT7/TPO試驗(實施例5)測定修飾的重組抗體的活性。當與4-49—IgGl比4交時，發現IgG3311和IgG3331的活性增加了(圖5A)，並發現7-10—IgG4344uhm和4-49_IgG4344uhm的活性相當於71PEG-rHuMGDF的活性。表3中概述了各種修飾的抗體的活性。發現通過修飾恆定區所有激動劑抗體的活性都增加了。抗體7-10和4-49的IgGl和IgG4PE具有相當的活性，以及IgG4344uhm較IgG4PE具有更高的活性。在IgG4344uhm中，位於處於IgG4PE上鉸鏈區的7個胺基酸的胺基酸序列中第4-7位的C-末端胺基酸已被位於處於IgG3上鉸鏈區的12個胺基酸的胺基酸序列中第4-12位的序列所取代(參見圖4B)。因此認為該區對增加活性重要。表3tableseeoriginaldocumentpage72+:EC501-10nM十十EC5o0.1-1nM+++:EC500.01-0.1nMNT:未測試實施例11通過激動劑抗體的信號轉導當TPO結合C-Mpl受體時，發生胞內蛋白磷酸化。已知為TPO所激活的主要途徑的實例包括三個途徑，即Jak-STAT、Ras-MAPK和PI3K-Akt。使用特異於磷酸化蛋白的抗體，通過蛋白質印跡分析由激動劑抗體所引起的c-Mpl下遊磷酸化信號傳導。所使用的抗體如下抗-STAT5(Cat#9352，CellSignaling)、抗國磷酸國STAT5(Cat#9351L，CellSignaling),抗-JAK2(Cat弁06誦255,Upstate)、抗誦磷酸國JAK2(Cat#07-606,Upstate)、抗-Erkl/2(Cat#9272，CellSignaling,)、抗-磷酸-Erk1/2(Cat#9271L，CellSignaling)、抗國Akt(Cat#9102,CellSignaling)和抗國磷酸畫Akt(Cat#9101S,CellSignaling)。以下列方法使用這些抗體實施試驗。1)在無細胞因子IMDM培養基中洗滌UT7/TPO細胞並培養6小時。2)培養後，將細胞調節為1xio6個細胞/ml並以2ml/孔接種在6-孔板上。3)添加激動劑抗體或PEG-rHuMGDF(作為陽性對照)到孔中刺激細胞。4)在5分鐘至2小時的刺激後，回收細胞並用冰冷的PBS洗滌。5)通過離心沉澱細胞，棄去上清液，在PhosphoSafeTM提取試劑(Cat弁71296，Novagen)中溶解沉澱，再次進行離心，由此回收上清液(細胞提取物)。6)通過蛋白質印跡對上述5)中獲得的細胞提取物檢測磷酸化蛋白。結果示於圖6。通過激動劑抗體7-10G4344uhm和4-49G4344uhm觀察到的磷酸化是出現在類似於TPO信號傳導的途徑中的磷酸化(圖6A)。關於抗體6-5-2，在IgGl中沒有觀察到Jak2或STAT5的磷酸化，而在IgG3344中卻觀察到了(圖6B)。實施例12對人血小板的引發效應儘管TPO並不導致血小板凝集，但其具有促進由凝集誘發劑，如ADP，所引起的血小板凝集的效應(即引發效應)。通過下列步驟檢測激動劑抗體對人血小板的引發效應。1)在140g下將含1/10體積的作為抗凝血劑的3.1。/。(w/v)檸檬酸三鈉的、獲得自健康人志願者的外周血離心15分鐘，製備富血小板血漿(以下縮寫為"PRP")。2)再次進行離心(2,500g，15min)以沉澱血細胞，並收集血漿。3)測定PRP中血小板計數，然後用血漿調節至3x105個細胞/)11。4)添加樣品到100pl上述3)中製備的血小板懸液中，並在攪拌的同時溫育混合物3分鐘。5)添加5的30pMADP(SIGMA),在Hematracer801(MCMedical,Japan)上測定由血小板凝集引起的濁度減少。結果示於圖7。在存在添加的ADP情況下，觀察到激動劑抗體的引發效應。在僅有抗體(即無ADP)的情況下，不發生血小板凝集。實施例13施用於食蟹猴為了分析血小板計數改變，施用激動劑抗體於食蟹猴。為證實個體對TPO的應答，在第一天(O天)靜脈內施用PEG-rHuMGDF(lOpg/kg),觀察3周情況，並在最初施用後21天以1mg/kg的劑量靜脈內施用純化的激動劑抗體7-10G4PE(個體A)和7-10G3344hl(個體B)。結果示於圖8。在個體A和B中都觀察到了由PEG-rHuMGDF所引起的短暫的血小板計數增加。在施用激動劑抗體7-10G3344hl後，在個體B中觀察到血小板計數增加。同樣地，在施用該抗體後沒有觀察到嚴重的毒性。實施例14對人臍帶血移植模型的作用為證實實施例10中製備的激動劑抗體會促進人臍帶血移植模型中人造血系統的形成，以下列方法進行試驗。用作為移植預處理(2戈瑞(grays))的放射線輻照NOG(NOD/SCID/IL2國yRKO)小鼠(購自CentralInstituteforExperimentalAnimals(CIEA)(Kawasaki,Kanagawa，Japan)),然後通過尾靜脈注射1,000-10,000個人臍帶血衍生的CD34+細胞。分析物首先在移植的第二天施用，此後一周一次。分組、分析物和劑量顯示如下。每組由6隻小鼠組成，腹膜內施用。在每周一次的施用時測定體重。<分組、分析物和劑量〉I:移植數量10,000，施用PBS(作為對照)II:移植數量1，000，施用PBSIII:移植數量10，000，施用抗體7-10G4344uhm，100pg/頭部/周IV:移植數量1,000,施用抗體7-10G4344uhm,100ng/頭部/周V:移植數量10,000，施用TPO(PEG-rHuMGDF)，g/頭部/周VI:移才直數量l，OOO,施用TPO(PEG-rHuMGDF)，g/頭部/周在移植前一天以及移植後2、4和6周，以下列方法分析外周血。使用毛細管從小鼠眼眶靜脈中採集外周血(約70pl)。使用KX-21自動化血細胞分析儀(Sysmex)測定血細胞計數。為了測定人血小板和白細胞的嵌合率，用以下A和B中所示的抗體組合染色細胞，然後通過FACSCalibur進行分析。A(用於血小板分析)PE-標記的-抗-人CD41抗體(R7058,Dako)加FITC-標記的-抗-小鼠CD41抗體(#553848,BDPharmingen);和B(用於白細胞分析)APC-標記的-抗-人CD45抗體(IM2473,BeckmanCoulter,Inc.)加FITC-標記的-抗-小鼠CD45抗體(#553080,BDPharmingen)。在分析時，添加用於定量的螢光珠(Flow-Count珠)來分析給定量的血液。通過下列公式計算血小板或白細胞的嵌合率人細胞計數/(人細胞計數+小鼠細胞計數)x100(%)。外周血中總血小板計數乘以嵌合率給出了人血小板計數。在第6周處死小鼠，從股骨中移除骨髓細胞。對骨髓細胞進行集落培養以測定人血巨核細胞(MK)、紅細胞(E)或粒細胞/巨噬細胞(GM)的祖細胞的數量。通過在培養物中添加TPO(50ng/ml)和SCF(100ng/ml)進行用於檢測巨核細胞祖細胞(CFU-Mk)的集落培養。在5%C02存在下於37°C培養12天。用和實施例6中一樣的方法使用抗-人CD41抗體檢測菌落。使用Methocult系統(StemCellTechnologies)並在培養物中添加EPO(4IU/ml)，、SCF(100ng/ml)、IL-3(20ng/ml)和GM畫CSF(IOng/ml)進行用於檢測紅細胞或粒細胞/巨噬細胞的祖細胞的集落培養。在5%C02和5%02存在下於37。C培養14天。培養後，在顯微鏡下測定菌落計數。圖9A、9B和9C顯示了上述試驗的結果。在移植後6周，已施用抗體的組較其他組顯示明顯更高的外周血人血小板計數(圖9A)。這暗示在臍帶血移植時激動劑抗體7-10G4344uhm促進血小板恢復。此外，已施用抗體的組顯示在骨髓中明顯更高的人紅細胞和粒細胞/巨噬細胞祖細胞(圖9B)。同樣地，指示人白細胞/小鼠白細胞比率的CD45嵌合率相當高，清楚表明在已施用抗體的組中人白細胞增加(圖9C)。這暗示抗體7-10G4344uhm可促進其他譜系細胞以及巨核細胞的生存。紅細胞和粒細胞/巨噬細胞中每一個鐠系時間點上遊的細胞。考慮到Mpl在造血幹細胞中表達的發現，激動劑抗體非常有可能促進造血幹細胞增殖。然而，在該試驗中，已施用TPO的組並不顯示類似的作用。這可能是因為TPO還作用於小鼠造血細胞，因此已施用TPO的組可經歷骨髓中人細胞和小鼠細胞之間的竟爭，結果，可能並不僅僅觀察到對人細胞的作用。目的激動劑抗體具有選擇性作用人Mpl的特性。因此，在體內首次證實了Mpl-介導的信號對人臍帶血造血幹細胞擴增的作用。實施例15分析鉸鏈區修飾抗體的抗原性本發明的激動劑抗體具有通過修飾鉸鏈部分增加活性的特性；儘管由該修飾所引起的增加的抗原性是關注的問題。基於鉸鏈修飾的7-10G4344uhm的胺基酸序列，通過計算機模擬預測抗原性。已體內施用的異種蛋白摻入抗原呈遞細胞(APCs)例如樹突細胞或巨噬細胞，然後被降解。此後，通過主要組織相容性複合物(MHC)II類分子(就人而言，HLAII類、HLA-DR、DQ和DP)呈遞肽。為APCs所呈遞的肽被T細胞受體(TCR)所識別，並激活T細胞。激活的T細胞(輔助T細胞)活化了表達識別上述抗原的抗體的B細胞，產生了與異種蛋白起反應的抗體。在這樣的機制中，肽和MHCII類分子之間的親和力是決定抗原性的主要因素。已知由於人MHCII類分子具有76許多類型(或多態性)，因此相同的肽顯示了取決於II類分子類型的截然不同的親和力。分析具有7-10G4344uhm和IgG4PE恆定區的不同人抗體胺基酸序列對各種類型的人HLA-DR、DQ或DP分子的親和力(使用AlgoNomics提供的HLA分子資料庫和解析算法)。結果，沒有新表位出現在鉸鏈修飾中。這暗示本發明的修飾抗體當它們用作藥物時不會產生抗原性問題。實施例16施用抗體於人Mpl轉基因小鼠本發明的抗體不與小鼠Mpl交叉反應。因此，為了測定功效，製備其中業已導入了作為異源基因的人Mpl轉基因(Tg)小鼠，並施用抗體於該Tg小鼠。起先，通過PCR擴增小鼠Mpl的5.5-kb啟動子區，接著克隆入pBluescript質粒載體。隨後，通過PCR擴增人Mpl的翻譯區和3，-非翻譯區，並接著連接到小鼠Mpl啟動子下遊位點上。將所得到的構建體注射入C57BL/6小鼠受精卵中，將所得到的受精卵移植入代孕母鼠中，分娩後代。分娩後3周從尾部提取基因組DNA，並通過PCR選擇Tg小鼠。為了建立目的小鼠謙系，將所獲得的Tg小鼠與C57BL/6小鼠雜交。分析骨髓中人Mpl的表達。結果，獲得了具有多種人Mpl抗體的Tg小鼠譜系。在來自譜系39L的骨髓中，經RT-PCR觀察到人Mpl的表達。使用譜系39L小鼠i正實抗體功效。以單次劑量(3或10[ig/ml)施用激動劑抗體7-10G4344uhm於小鼠，並使用KX-21自動化血細胞分析儀分析外周血中血小板計數改變。每周一次從眼眶靜脈中採集外周血並進行分析。TPO(PEG-rHuMGDF)用作陽性對照。分組顯示如下(6隻小鼠/組)。組I:施用10pg7-10G4344uhm組II:施用3ng7-10G4344uhm組III:施用3ngTPO組IV:施用PBS組VI:施用10pg野生型7-10G4344uhm結果示於圖10。在已施用抗體的組和已施用TPO的組中血小板計數增加。在施用後2周已施用TPO的組中的血小板計數基本上回到基線。與此相反，在已施用抗體的組中血小板計數仍保持增加，甚至在施用後一個月亦是如此。這暗示激動劑抗體在血液中非常穩定並能以單次劑量在較長一段時間內促進血小板生成。因此，該激動劑抗體特別適合於治療慢性血小板減少症。實施例17評價7-10G4344uhm輕鏈突變體活性將突變導入激動劑抗體7-10輕鏈可變區(7-10VL)的構架區中，並研究對結合活性及激動活性的影響。突變輕鏈為激動劑抗體4-49(V104L)的輕鏈；以及各自包含單個胺基酸取代(即A43V和G100Q)的激動劑抗體6-4-50的突變輕鏈。將這些突變輕鏈與7-10G4344uhm的重鏈相結合來製備抗體。結果，發現它們的結合活性和激動活性與最初的7-10G4344uhm相當。然而，當突變(Y94F)被導入激動劑抗體7-10輕鏈可變區互補決定區(CDR)中時，結合活性和激動活性減少到最初水平的約1/10。這表明輕鏈胺基酸序列具有一定的自由度。各種突變體以及7-10VL的輕鏈胺基酸序列示於如下。突變位點以粗體和下劃線形式指示。7-10VL(SEQIDNO:3):AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC,NSYPLTFGGGTKVEIK7-10VL—V104L(4-49VL;SEQIDNO:85);AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ訓YPLTFGGGTKLEIK7-10VL_G100Q(6-4-50VL取代產物1;SEQIDNO:86):AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGQGTKVEIK7-10VL_A43V(6-4-50VL取代產物2;SEQIDNO:87):AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKYPKLUYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC,NSYPLTFGGGTKVEIK7-10VL_Y94F(CDR取代產物；SEQIDNO:88):AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGFNS￡PLTFGGGTKVEIK結合活性分析製備l、0.1和0.01jxg/ml抗體濃度，並使用FM3A-hMpl細胞進行流式細胞術。根據實施例4中所描述的方法進行該試驗。抗-DNP(二硝基苯酚)抗體(亞類IgG4;人抗體)用作對照。輕鏈突變抗體顯示相當於7-10G4344uhm抗體的結合活性(圖11)。激動活性分析根據實施例5中所描述的方法進行使用UT-7/TPO細胞的細胞增殖試驗。輕鏈突變體抗體顯示相當於抗體7-10G4344uhm的激動活性(圖12)。工業實用性本發明提供了能用作血小板減少症的各種治療劑的抗-人cMpl激動劑人抗體。本發明還提供了能用於其他激動劑抗體並能提供滿意的安全性和藥理學效應的抗體恆定區。本發明提供了以完整抗體形式存在的能激活人血小板生成素受體(c-Mpl)的抗人c-Mpl激動劑抗體。這樣的激動劑抗體可用作血小板減少症的各種治療劑，並且預計其可對醫藥工業具有顯著貢獻。所有在本文中引用的出版物、專利和專利申請皆以其全文在此引入作為參考。序列表文本SEQIDNO:ll:鉸鏈區突變體，UH2G3uhmSEQIDNOs:12-16:引物SEQIDNOs:18-22:引物SEQIDNOs:39-54:引物SEQIDNOs:57-73:引物SEQIDNO:74:G3344hlSEQIDNO:75:G3344SEQIDNO:76:G4344SEQIDNO:77:G4344hlSEQIDNO:78:G4344uhSEQIDNO:79:G4344uhmSEQIDNO:80:G4PESEQIDNO:81:7國10G4344uhmH鏈SEQIDNO:82:7-10G4344uhmH鏈SEQIDNO:83:7-10G4344uhmL鏈SEQIDNO:84:7-10G4344uhmL鏈SEQIDNO:85:7-10VL—V104L(突變體)SEQIDNO:86:7-10VL_G100Q(突變體)SEQIDNO:87:7曙10VL—A43V(突變體)權利要求1.一種抗人血小板生成素受體(c-Mpl)的激動劑抗體，其中激動劑抗體包含包含下列(1)、(2)或(3)的胺基酸序列的抗體恆定區(1)人抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區的胺基酸序列，(2)具有在人抗體亞類之間的域取代的重鏈恆定區的胺基酸序列和人抗體輕鏈恆定區的胺基酸序列，或(3)在上述胺基酸序列(1)或(2)中具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和能結合併激活人血小板生成素受體的抗體可變區；以及其中激動劑抗體具有特性(a)和(b)(a)如通過使用人臍帶血衍生的CD34+細胞的CFU-MK集落形成試驗所測定的，該抗體在10,000ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成；和(b)在使用UT7/TPO細胞的細胞增殖試驗中，該抗體的最大活性為PEG-rHuMGDF的50％或以上，50％有效濃度(EC50)為100nM或以下，所述PEG-rHuMGDF包含如SEQIDNO1中所示的胺基酸序列、具有下列結構並在N末端聚乙二醇化PEG-NH-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGEWKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVMAARGQLGPTCLSSLLGQLSGQVRLLLGALQSLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIFLSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVRRAPPTTAVPS-COOH。2.根據權利要求1的抗體，具有特性(a)和(b):(a)如通過使用人臍帶血衍生的CD34+細胞的CFU-MK集落形成試驗所測定的，該抗體在1，000ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成；和(b)在使用UT7/TPO細胞的細胞增殖試驗中，該抗體的最大活性為PEG-rHuMGDF的70%或以上，EC50為10nM或以下。3.根據權利要求1的抗體，具有特性(a)和(b):(a)如通過使用人臍帶血衍生的CD34+細胞的CFU-MK集落形成試驗所測定的，該抗體在100ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成；和(b)在使用UT7/TPO細胞的細胞增殖試驗中，該抗體的最大活性為PEG-rHuMGDF的90%或以上，EC50為1nM或以下。4.根據權利要求1的抗體，其中重鏈和輕鏈可變區選自下列(1H8):(1)包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈可變區和包含如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列的輕鏈可變區；(2)包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重鏈可變區和包含如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列的輕鏈可變區；(3)包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈可變區和包含如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列的輕鏈可變區；(4)包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈可變區和包含如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列的輕鏈可變區；(5)包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈可變區；(6)包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈可變區；(7)包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈可變區；和(8)包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和包含在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈可變區。5.根據權利要求l-4任一項的抗體，其中抗人c-Mpl激動劑抗體為人抗體。6.根據權利要求4的抗體，其中重鏈恆定區包括含有下列胺基酸序列(1)和(2)中任一項的上鉸鏈區(1)如SEQIDNO:10所示的胺基酸序列；或(2)如SEQIDNO:11所示的胺基酸序列，和其中從重鏈恆定區的中間鉸鏈部位至C末端的區包含人免疫球蛋白G4胺基酸序列，或在人免疫球蛋白G4胺基酸序列中第228位用脯氨酸取代絲氨酸，第235位用穀氨酸取代亮氨酸的胺基酸序列，其中胺基酸位置基於KabatEU編號系統。7.根據權利要求6的抗體，其中抗體選自下列(l)-(8):(1)含有包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列的輕鏈的抗體；(2)含有包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列的輕鏈的抗體；(3)含有包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列的輕鏈的抗體；(4)含有包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列的輕鏈的抗體；(5)含有包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈，和包含在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈的抗體；(6)含有包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重鏈，和包含在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈的抗體；(7)含有包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈，和包含在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈的抗體；和(8)含有包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈，和包含在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈的抗體；8.—種藥物組合物，其包含作為活性成分的、權利要求l-7任一項的抗體。9.一種用於增加血小板的試劑，其包含作為活性成分的、權利要求l-7任一項的抗體。10.根據權利要求9的用於增加血小板的試劑，其用於當進行骨髓移植或臍帶血移植時促進血小板血小板恢復。11.一種血小板減少症治療劑，包含作為活性成分的、權利要求l-7任一項的抗體。12.根據權利要求11的血小板減少症治療劑，其中血小板減少症是一種選自下列疾病(l)-(6)的疾病(1)特發性血小板減少性紫癜(ITP);(2)癌症化療後引起的血小板減少症；(3)再生障礙性貧血；(4)骨髓增生異常症候群(MDS);(5)可歸因於肝病的血小板減少症；和(6)骨髓移植或臍帶血移植後引起的血小板減少症。13.—種產生抗人c-Mpl激動劑抗體的方法，包括製備攜帶有包含編碼重《連核苷酸序列的DNA，包含編碼輕鏈核苷酸序列的DNA,以及包含一種或多種控制所述DNA表達的核苦酸序列的DNA的哺乳動物細胞，培養哺乳動物細胞，以及從培養所述細胞的培養基中分離和純化編碼包含所述重鏈和輕鏈的抗體的DNA的表達產物，其中核苷酸序列選自以下(1)-(8)，(1)編碼包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列的輕鏈的核普酸序列；(2)編碼包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重^T連的核苷酸序列，和編碼包含如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列的輕一T連的核普酸序列；(3)編碼包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列的輕鏈的核苦酸序列；(4)編碼包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列的輕鏈的核普酸序列；(5)編碼包含如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列；(6)編碼包含如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列；(7)編碼包含如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列；和(8)編碼包含如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列的重鏈的核苷酸序列，和編碼包含在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的輕鏈的核苷酸序列。14.包含編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列的DNA,所述胺基酸序列選自下列(1)-(4)的胺基酸序列(1)如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列；(2)如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列；(3)如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列；和(4)如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列。15.編碼抗體重鏈的DNA，所述的抗體重鏈包含選自下列(1)-(4)的胺基酸序列(1)如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列；(2)如SEQIDNO:4所示的胺基酸序列；(3)如SEQIDNO:6所示的胺基酸序列；和(4)如SEQIDNO:8所示的胺基酸序列。16.根據權利要求15的DNA，其中抗體重鏈含有上鉸鏈區，所述的上鉸鏈區包含下列(1)和(2)任一項的胺基酸序列(1)如SEQIDNO:10所示的胺基酸序列；和(2)如SEQIDNO:11所示的胺基酸序列，以及其中從抗體重鏈的中間鉸鏈區至C末端的區包含人免疫球蛋白G4胺基酸序列，或人免疫球蛋白G4胺基酸序列中第228位用脯氨酸取代絲氨酸、第235位用穀氨酸取代亮氨酸的胺基酸序列，其中胺基酸位置基於KabatEU編號系統。17.包含編碼下述胺基酸序列的核苷酸序列的DNA,所述的胺基酸序列選自下列(1)-(8)的胺基酸序列(1)如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列；(2)如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列；(3)如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列；(4)如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列；(5)在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(6)在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(7)在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和(8)在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列。18.編碼抗體輕鏈的DNA,所述的抗體輕鏈包含選自下列(1)-(8)的胺基酸序列(1)如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列；(2)如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列；(3)如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列；(4)如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列；(5)在如SEQIDNO:3所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(6)在如SEQIDNO:5所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；(7)在如SEQIDNO:7所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列；和(8)在如SEQIDNO:9所示的胺基酸序列中的構架區具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列。19.一種用於增加血細胞的試劑，其包含作為活性成分的、用於在造血千細胞移植後促進血細胞恢復的人c-Mpl激動劑抗體。20.根據權利要求19的用於增加血細胞的試劑，其包含作為活性成分的、權利要求l-7任一項的抗體。全文摘要本發明提供了一種抗人血小板生成素受體(別名人c-Mpl)的激動劑抗體。更具體地說，本發明提供了一種抗人血小板生成素受體激動劑抗體，其中激動劑抗體包含含有(1)人抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區的胺基酸序列，(2)具有在人抗體亞類之間的域取代的重鏈恆定區的胺基酸序列和人抗體輕鏈恆定區的胺基酸序列，或(3)在上述胺基酸序列(1)或(2)中具有一個或幾個胺基酸殘基缺失、取代、添加或插入的胺基酸序列的抗體恆定區；和能結合併激活人血小板生成素受體的抗體可變區；以及其中激動劑抗體具有特性(a)如通過使用人臍帶血衍生的CD34+細胞的CFU-MK集落形成試驗所測定的，該抗體在10,000ng/ml或更低的濃度下誘導集落形成；和(b)在使用UT7/TPO細胞的細胞增殖試驗中，該抗體的最大活性為PEG-rHuMGDF的50％或以上，50％有效濃度(EC50)為100nM或以下。還提供了用於治療血小板減少症的包含所述抗體的藥物組合物。文檔編號C12N15/09GK101448941SQ200780018809公開日2009年6月3日申請日期2007年3月20日優先權日2006年3月23日發明者元木一宏,吉田英明,片岡之郎,甲斐正之,萩原哲也申請人:麒麟醫藥株式會社