新的內切葡聚糖酶的製作方法

2023-04-27 21:33:51

專利名稱：：新的內切葡聚糖酶的製作方法新的內切葡聚糖酶本發明涉及新的酶製劑，該酶製劑包含顯示內切葡聚糖蘇活性的酶，其在工業應用(如洗衣組合物、生物拋光(biopolishing)新製造的織物、提供纖維素織物或衣物磨損的外觀和處理紙漿)中性能良好。此外，本發明涉及編碼這種酶的DNA構建體、提供編碼這種酶的基因的方法、產生所述酶的方法、包含這種酶的酶製劑以及這些酶在許多工業應用中的用途。
背景技術：
：纖維素酶或溶纖酶是涉及纖維素水解的酶。在天然纖維素的水解中，已知涉及三種主要類型的纖維素酶，即纖維二糖水解酶(l，4-P-D-葡聚糖纖維二糖水)^EC3.2.1.91)、內切-P-1，4-葡聚糖酶(內切1，4-p-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶EC3.2.1.4)和p-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。纖維素酶由大量徵生物(包括真菌，放線菌，粘細菌和真細菌)合成，也由植物合成。已筌別了各種特異性的特定的內切葡聚糖酶。溶纖酶的一種十分重要的工業用途是用來處理纖維素織物原料或織物，例如作為洗滌劑組合物或織物軟化劑組合物中的組分、用於生物-拋光新織物(衣物修飾)和用於獲得含纖維素織物(尤其斜紋粗棉布)的"石洗(stone-washing)"外乂見。在例如下列文獻中提出了幾種這樣的處理方法GB-A-l368599，EP+0307564和EP-A-0435876，W091/172431W091/10732，W091/17244，PCT/DK95/000108和PCT歸5/00132。溶纖酶的另一個重要的工業用途是用於紙裝處理，例如為了改善導液(drainage)或使再利用紙脫墨。尤其是，對所論及的工業用途而言，內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)構成了有意義的一組水解酶。內切葡聚糖酶催化下列鍵的內切水解纖維素、纖維素衍生物(如氛基甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣澱粉中的1,4-p-D-酉t^鍵；混合的p-1，3葡聚糖(如穀類p-D-葡聚糖或&瞎葡聚糖)和其它含纖維素部分的植物材料中的P-1，4鍵。公認的名稱是內切-l，4-(3-D-葡聚糖軒葡聚糖基(glucano)水解酶，本發明中使用縮寫術語內切葡聚糖酶(endoglucanase).可以參見T.-M.Enveri，"徵生物纖維素酶"W.M.Fogarty，微生物酶和生物技術，應用科學出版社，p.183-224(1983);酶學方法，U988)Vo1.160，p.200-391(Wood,W.A.和KeUogg，S.T.編);B"uin,P.,"纖維素降解的分子生物學，徵生物學年評(1990),Vol.44,pp.219-248;BSguin，P.和Aubert,J-P.,"纖維素的生物降解"，FEMS微生物學回顧13(1994)p.25-58;Henrissat，B.，"纖維素酶和它們與纖維素的相互作用"，纖維素(1994),Vol.1，pp.169-196。許多出版物中已描述了真菌內切葡聚糖酶，特別是來源於例如尖鐮孢、7>/c/ofl^/7areese/,7y/c/oflte/7K3/0/g/^rac力/afw/w，棘抱曲審，yVeoca/〃啦"/f和例如/Vixwyces、腐質黴屬，毀絲黴屬，fe"r/c咖，青黴屬，耙菌屬，鬼傘屬的種的那些內切葡聚糖酶。例如，真菌內切葡聚糖酶已由下列文獻描述SheppardP.O.,等，用保守纖維素酶家族-特異性的序列從尖鐮孢克隆纖維素酶同系物cDNA，基因，(1994)，vol.15，pp.163-167;SaLoheimo，A.，等，"在酵母中表達的7Wc力Of/er鵬reese/的新小內切葡聚糖蘇基因egl5"，分子微生物學，(1994)voi.13(2)，pp.219-228;vanArsdell,J.N.等，(1987)，7Wc力Of/ei7zareese/在哞酒糖酵母內切葡聚糖酶1的克隆，特徵確定和表達，生物/技術5:60-64;PeritUl'd，M.等，(1986)，"7Wc/7orferfflareese;'纖維素酶基因之間的同源性內切葡聚糖酶I基因的完整的核苷蔽亭列"，基因45:253263;Saloheirao，M.等，(1988)，"EGIII，一種新的7Wc力oflfer則ree"/內切葡聚糖酶基因和蘇兩者的筌定"，基因63:1121;Gonzales,R.等-,"7Wc力oc/"側/0/7^76/\3眾可從Internet上獲得的DDBJ資料庫)包括從徵紫青黴克隆的編碼內切葡聚糖酵的兩個DNA序列(分別由A.Koch和G.Mernitz克隆)和從灰腐質黴變種/7e/V77oA/ea克隆的編碼內切葡聚糖酶DNA序列(由T.Uozumi克^0。兩種他cr(9/7力o頂/7a/^aseo//^的內切葡聚糖酶已被克l^測序，參見Wang,H.Y.和Jones,R.W.:"植物致病真菌ytfec/"o//;o/ff//7a/^aseo///^的內切葡聚糖S^編碼基因的克隆，特徵確定和功能性表達"，基因，158:125128，1995;和Wang，H.Y.和Jones,R.W.:"從植物致病真菌他"0/7力0//7/加pA^ec^/'/w克隆的單一內切葡聚糖S^編碼基因"，應用和環境微生物學，61:2004-2006,1995。這些內切葡聚糖酶中的一個顯示與真菌7y/c/Oflter啦re"e/egl3內切葡聚糖酶的高同源性，另、一個顯示與微生物植物病原體/^ewd。/77(m3Ssoh/7acea,鵬egll的同源性，說明兩種內切葡聚糖酶都屬於糖基水解酶5族(B.Henrissat，生物化學J280:3(19-316(1991))。Scha畫ckerF.等(1995)公開了二態真菌玉米黑粉菌的纖維素翁b基因的絲-特異性(fi1ament-specific)表達。W091/17243(NordiskA/S)公開了一種纖維素酵製劑，該製劑由與抗高度純化的43kDa內切葡聚糖酶(得自〃〃邁/co/a//7^/e/wDSM1800)的抗體免^^應性的同源內切葡聚糖蘇組成。W091/17244(NordiskA/S)公開了一種新的(半)纖維素降解酶，如內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或(3-葡糖苷酶，其可以來源於非木黴屬和展齒革菌屬的真菌；W093/2019321公開了可以構孢麴黴獲得的內切葡聚糖酶；W094/21801(Genencor公司)涉及一種纖維素酶系統，該系統是從顯示內切葡聚糖酶活性的7Wc力M"啦/o"g/6/"ac力/afi/ffl分離到的；W094/26880(GistBrocadesN.V.)公開了一種分離的纖維素降解酶混合物(優選地是從木黴屬、/"e/^/〃"s或"/印o/"of/7c力咖獲得的)，其具有內切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和木糖葡聚糖酵活'汰；W095/02043(NordiskA/S)描述了一種具有內切葡聚糖酶活寸生的來源於7Wc/of/e/"啦/w/"z/a/m/77的酶，該每可以用於許多目的，包括例如植物細胞壁的降解或^f務飾。已知纖維素酶可以也可以不具有纖維素結合域(CBD)。CBD增加酶對包舍纖維素纖維的結合，並增加膝的催化活性部分的功效。仍然需要提供可以用於需要纖維素酶尤其是內切葡聚糖酶活性的場合的新的纖維素酶製劑。本發明的目的是提供新的酶製劑，該酶製劑實質上在酸性、中'昧或i^性條件下具有溶纖活性，並在紙漿處理，織物處理和洗衣過程中或者在動物詞養中具有改進的功效，優選地是新的纖維素蘇，更優選地是性能良好的內切葡聚糖酶的酶製劑，所述S^被嘗試由重組技術生產或產生.發明概述令人驚奇地是，現已發現一組內切葡聚糖蘇具有某些獨特的特徵，在通常使用內切葡聚糖酶的那些工業應用中性能良好。這些獨特的特徵可以以酶蛋白質g酸序列的保守區進行描述，本發明發現，具有某些保守區的溶纖酶(即顯示溶纖活性的酶)在處理要洗的衣物、處理新製造的織物和處理造紙紙漿中十分有效。因此，本發明第一方面涉及一種酵淛劑，該製劑實質上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶包含具有以下序列的由"個M酸殘基組成的第一g財列ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa123456789.1011121314和具有以下序列的由5個#^^基組成的第二#^*列TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，M^:Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4號位置上，g酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的8號位置上，g^Arg、Lys或His;在第一序列9、10、12和H號的^(i置上，在第二序列的4號位置上，M酸是20個天然a酸殘基中的任何一個，其條件是在第一m宇列中，(i)當12號位置上的^酸殘基是Ser時，14號位置上的a酸殘基不是Ser，和(ii)當12號位置上的M酸殘基是Gly時，14號位置上的M酸殘基不是ALa'儘管在性能良好的內切葡聚糖酵內發現其它相當顯著的變異，但可清楚識別保守區的這一驚人的發現是大量真菌DNA序列研究的結果，所述DNA序列編碼具有有效的溶纖(尤其是內切葡聚糖酶)活性之酶的特定g^列。基於這一發現，開發了一種用於特異性篩選以編碼本發明的酶為特徵的基因組DNA或cDNA的分子方法。構建了作為其工具的三套簡併引物。因此，本發明在其第二方面涉及^R供編碼真有上述保守區^Ji:纖酶基因的方法。通過使用這種方法(即供基因組DNAPCR篩選的引物套)，令人驚奇地發現編碼所述酶的DNA可以從寬範閨的真菌中發現，所述真菌屬於分類學上很不相同的生物體，並且棲息於生態學上十分不同的小生境中。進一步地，通過使用這一方法，發現編碼所迷酶核心區(催化活性區或旬而無^T連接的纖維素結合域(CBD)之DNA序列已經可能，所述酶的核心區將不通過採用基於篩選方法的常規手段來選擇。發明人經實發逸實CBD區與本發明的酶核心區(包括所述酶的催化活性區或樹的連接導致多域酶的功效明顯改善，例如，高出50倍的功效。因此，本發明提供了新的纖維素酶，尤其內切葡聚糖酶，以其天然形式或者同源或異源形式產生的這些酶在工業應用中具有改善的功效。另一方面，本發明涉及新的溶纖酶製劑，該製劑是可以從分類學上的特定門(phyli)、綱、目、科、屬和種產生的，例如可以從擔子菌門的(Basidiomycotous)層菌綱(〃//e/70/zy/cefe力、接合菌門(Zj^cw/cofa)、壺菌門(CAf"/V/o/^co&);或從綱盤菌綱(Z/"o/z7/c^e"、腔菌綱(屋潛溯、不整囊菌綱(/Ve"cw7/ce/^y);Jrc力aea5"ccw/c"es、半子囊菌綱(Hemiascoraycetes)或者從間座殼目、炭角菌目(7Wc/^^力ae/7a/e力、黑痣菌目(屍////ac/o/"a或從科叢赤殼科(yVe"r/ae3e)、糞殼科(SoiY/a".3ceae)、毛殼科(6Vwefo/w/ace3e，)、Cer2&"0鵬ce3e、毛球殼科("".osp/^er/aceae);或從屬柱抱屬(C/〃/7f/roca/770/7)、粘帚黴屬(67/oc/af//"/77)、周刺座黴屬(f^/wfe〃a)、5"c/fa/油'咖、頂孢黴屬(爿cre卿"/u/7)、或從種番痴鐮孢(F"5^廠/〃/T7//CO/e/^/c/)、屍iASa/7i7/Z7/7aS5"/Z7o廠3、腐皮鐮抱(屍"X3/"/〃/77510/3/7/)、蛇形鐮孢(y^A9a/"/w/w3/7《"/o/fl^y)、早熟禾嫌抱(/^5"<3,/"/77/70<3<5)、黑腐質審(〃"/7/<%/<3/H'g/esce/^)、灰腐質黴(〃i7/7/co/agr/sea)產生的，尤其是實質上由包含逸自以下序列的^J^^列的酶組成的那些XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567和XaaThrArg'XaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7號位置上，Xaa是20個天然#^自基中的任何一個。更具體地說，本發明的絝製劑優選地是可以從以上提到的分類學上的特定門(phyli)、綱、目、科、屬和種產生的，所述的所有微生物都產生內切葡聚糖酶，該酶包含具有以下序列的由n個gg基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個M^基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，^酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4號位置上，aaTrp、Tyr或Phe;在第一序列的8號位置上，M酸是Arg、Lys或His;在第一序列9、10和12號的^置上，在第二序列的4號位置上，g酸是20個天然g^基中的任何一個。本發明另一方面提供了包含編碼顯示內切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列之DNA構建體，所述DNA序列包含分別在SEQIDNO:1、4、5、10、12、16和19中所示的DNA序列或者它們的類似物。本發明也涉及包含本發明DNA構建體的重組表達栽體；涉及包含本發明DNA構建體或重組表達栽體的細胞；涉及產生本發明酶(例如，重組體酶)的方法；涉及通過使用本發明的fi^f吏要洗的衣物顏色澄清的方法；涉及包含本發明的酶的洗衣組合物；涉;5U^發明的酶在降解或改.^b度物材料(例如細胞壁)，處理織物原料、織物或衣物，處理紙漿中的用途；並涉及富含本發明的酶的酶製劑。附圖簡要描迷圖1是下列徵生物的推定編碼的胺基酸序列的序列對比化reM//w/T7/^/■awoo/w/ws/j.(77)，i^Fce_//o/7/^7<7/\2f力e/7770/7力/A3，r々/e/ar/'<3Ze/ve"/"/s，yf/acro/Acw//7a//"<30//加。用Pileup程序(Feng和D00LiUle1987)(GCG包，8.0)產生最好的序列對比。在至少四個序列中相同的殘基(方框中)在相應的g酸周圍表示出來'圖2圖2a，b，ci兌明在真菌界內的本文所討論的所有微生物(其能夠產生本發明的酶製劑和酶)的分類學分類。本文^f吏用的分類學分類基於用於NIH資料庫(Entrez1996春天妃的系統，該系統可以從WorldWideWeb:(http:〃www3.ncbLnlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX)獲得。對未包含在Entrez資料庫中的生物體的分類，使用了下列一般可獲得的和世界範圍內接受的參考書對於子嚢菌綱""o邁ycefe力Eriksson,0.E.&Hawksworth，D丄子囊菌綱系統，vol12(1993)。對於擔子菌綱O"/"/offly"fes):JiUich，W，擔子菌綱的較高分類群，BibUothecaMycologia85，485pp(1981)。對於#菌綱O'Donnell，K.:培養中的接合菌綱，喬治亞大學，美國，257pp(1979)。一般4生的微生物學參考書Hawksworth,D.L.，Kirk，P.M.，Sutton,B.C.和Pegler，D.N.:真菌詞典，國際真菌學研5C所，616pp(1995);VonArx，J.A,:培養中形成孢子的真菌屬，424pp(1981)。迄今仍不清楚腐質黴屬(^/頂/co/a)的分類學位置(impLaceraent).然而，糞殼目(化r^r/We^廣泛選擇的18SRNA的研究已給出腐質黴屬歸於糞殼目的有力的提示(Taylor,CUusen&0xenb(il，？MC表).此外，這些數椐表明腐質黴屬與蛾柱黴屬(^^"//心咖)一起與糞殼科、毛殼科，長咮殼科(Ce/^/o〃o鵬"ceae)和4^殼考+僅有相當遠的關係。依據上述，在這裡將腐質黴屬和5^/"//力'鄉置於糞殼目內，科未知。圖3是推定的部分M酸序列的序列對比，所述序列來源於實施例5中描述的46種徵生物中選擇的26種。發明詳述在本文中，術語"2種天然Ma基"指通常在蛋白質中發現的20種M^1照慣例被認為是丙氨酸(Ala或A)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(Ile或1)、脯氨酸(Pro或P)、笨丙氨酸(Phe或F)、色氨酸(Trp或W)、甲疏氨酸(Met或M)、甘氨酸(Gly或G)、絲氨酸(Ser或5)、蘇氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬跣胺(Asn或N)、穀氨敞胺(Gln或Q)、天門冬氨酸(Asp或D)、穀氨酸(Glu或E)、賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、和組氨酸(H"或H)。按照本發明，本發明提供了新的性能良好的內切葡聚糖酶，其包含保守#^*列區，尤其是具有以下序列的由l4個M^基組成的第一g耕列ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa1234567891011121314和具有以下序列的由5個#^^^基組成的第^#^蔽亭列TrpCysCysXaaCys12345中，第一序列的3號位置上，g^Trp、Tyr或Phe;第一序列的4號位置上，M^Trp、Tyr或Phe;第一序列的8號位置上，M酸是Arg、Lys或His;其在在在在第一序列9、10、12和"號的M置上，在第二序列的4號位置上，M^^A20個天然M^^基中的任何一個，其條件是在第一M^^列中，(i)當12號位置上的g^基是Ser時，14號位置上的g酸殘基不是Ser，和(ii)當12號位置上的M酸殘基是Gly時，14號位置上的M酸殘基不是Ala。優逸地，本發明的蘇是徵生物來源的，即是可以從微生物(如真菌)獲得的。在一個優選的實施方案中，在第一序列的9號位置上的g酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬亂疾、穀氨醯胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優a選自脯氨酸和蘇氨酸。在另一個優選的實施方案中，在第一序列的10號位置上的M酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬敞胺、穀氨跣胺、酪氨酸、絲氨酸、甲疏氨酸和色氨酸，優選地是絲氨酸.在另一個優選的實施方案，在第一序列的12號位置上a^aiJ^自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半耽氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優i4i也選自丙氨酸和甘氨酸。在另一個比選的實施方案中，在第一序列的14號位置上的g酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、幾氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬醜胺、穀氨缺胺、酪氨酸、絲氨酸、甲磁，氨酸、色氨酸、穀氨酸和天冬氨酸，優選地選自脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、穀氨酸和天冬氨酸.優逸地，在第二序列的4號位置上的a^^自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬跣胺、穀氨跣胺、酪氨酸、絲氨酸、甲琉氨酸、色氨酸、穀氨酸和天冬氨酸，更優選地選自丙氨酸、甘氨酸和穀氨耽胺.更優選的實施方案的例子是這樣的一些，其中，在第一序列中，第3號位置上的絲艦基是酸氨酸；或在第4號位置上的狄絲基是色氨酸;或在第8號位置上的g^^基是賴氨酸。在一個特別優逸的實施方案中，本發明的酶包括逸自以下序列的氛基酸序列ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysAlaTrp12345678910111213,ThrArgTyrTrpAspCysCysLysThrSerCysAlaTrp12345678910111213,和ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysGlyTrp12345678910111213在第二方面，本發明提供了用於發現和克隆編碼這種酶的基因的方法，該方法包括在標準條件下與來源於任何保守區的寡核苷酸雜交(例如PCR擴增)，如圖1所i兌明的。一種有用的寡核苷酸包含編碼包含在選自以下序列的肽中的至少五肽的核苷^列a.ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa1234567891011121314在3或4在號位置上的^酸是Trp、Tyr或Phe;在8號位置上的Jt^^Arg、Lys或His;在9、10、12和14號位置上的^^酸分別是20個天然城絲基中的任何一個；和b.TrpCysCysXaaCysTyr123456在4號位置上的g酸是20個天然M酸殘基中的任何一個；和c.XaaProGlyGlyGlyXaaGlyXaaPhe1234567891號位置上的a^:Met或Ile;6和8號位置上的胺基酸分別是Leu、lie或Yal;和d.GlyCysXaaXaaArgXaaAspTrpXaa123456789在3號位置上的M^20個天然^^酸殘基中的任何一個；在4和6號位置上的氛基酸分別是Trp、Tyr或Phe;並且在9號位置上的^^APhe或Met。所述有用的寡核苷酸也包括與以上所述序列互補的核苷酸序列.在本發明的方法的一個優選的實施方案中，所迷寡核苷酸相應於選自以下PCR引物的PCR引物有義，5，-CCCCAAGCTTACIA/cG工TAC/tTGGGAC/tTGC/tTGC/tAAA/g八/cC-3,反義l,5'-CTAGTCTAGATAA/0CAIGCV。CAA/。CACC-3';反義2,CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/0ICCI^於黑膠耳、6V/'/7/;7e〃/、sca辦e//3、；M^層孔菌和5>)o/^//7e〃/ssa的菌抹，特別是可以從黑膠耳CBS277.96、6W/7/^/〃s"We/"CBS280.96、木蹄層孔菌CBS276.96和i"/w/^/》e"Aw.CBS283.96獲得的內切葡聚糖酶。按照布達佩斯條約，黑膠耳於1996年3月12日以保藏號CBS277.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1,Postbus273，NL-3740AGBaarn，4肯蘭；CV////^//^sca^/A3於1996年3月12日以保藏號CBS280.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷蘭；^M^層孔菌於1996年3月12日以保藏號CBS276.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷蘭；Spongipellissp.於1996年3月12日以保藏號CBS283.96保i^真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL—3740AGBaarn，荷蘭。本發明的酶製劑是也可以從屬於壺菌門的菌珠優i^Mk^於壺菌綱的菌抹，更優選地屬於Sp/ze/^/h/ce/^/es目的菌抹，特別優選地屬於5/7/ze〃o/z7yce"ceae考牛的菌^尤其是屬於囊壺菌屬的菌^^得的'所H兌菌抹的特定的例子是屬於紅根嚢壺菌的菌抹，尤其是紅根囊壺菌CBS282.96。按照布達佩斯條約，MIL嚢壺菌於1996年3月12曰以保藏號CBS282.96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn,4肓蘭。本發明的酶製劑也可以M於掩^菌門的菌歉優^M^於接合菌綱的菌^更優g從毛黴目的菌^尤其是從屬於毛黴科和枝黴科的菌^尤其是屬於根毛黴屬、須黴屬和刺枝黴屬的菌抹獲得。特定菌抹的例子是屬於i//Z0/ZW/C0/"，閃光須黴和弗雷生刺枝黴的菌抹，特別是^/z湖wcor/7"s/7/MIF04578、閃光須黴IF04814和弗雷生刺枝黴NRRL2305。此外，本發明的酵製劑也可以從屬於打c/wea"o/ff/ce"s、盤菌綱，半子囊菌亞綱，腔菌綱和不整囊菌綱的菌珠優選地從屬於由盤菌目、斑痣盤菌目0/^〃s鵬fa/es)、座嚢菌目和狀嚢菌目的菌抹獲得。尤其是所迷酶可以從屬於葫聲黴科、糞盤菌科、斑痣盤菌科和發菌科的菌^優選地從屬於色二^&^、/i//c/x"/7aerc/7s/s、"/o"ora、殼球:&^，糞盤菌屬，5^cco^/ws、青黴屬和77er/7/咖/ces的菌抹獲得'特定的例子是可以從以下菌抹獲得的酶，所述菌抹是屬於由棉色二孢、Wcros/)/aero/^"、^5"cc^o7w5"5^/c/o/'o^51、i^cco6o/oy/wfe//us、盤菌屬(屍ez/z3)、虎孢青黴、產黃青黴和77er/770/77/cwp^r/""cos^的菌歉特別是棉色二孢CBS274.96、〃/os/o/^NKBC1444、ylfecrcipAcw//7a/7/aseo///^CBS281.96、5"縱o6o/"sCBS275.96、虎孢青黴ATCC623%、產黃青黴ATCC9480和T77e磨/^c"w藩o馬CBS285-96。按照布達佩斯條約，棉色二孢於1996年3月12曰以保藏號CBS2".96保l^真菌菌種保藏中心；船"op力o/p/朋/^^eo//^於1996年3月12曰以保藏號CBS281.96保藏在真菌菌種保藏中心；5^ccoto/"s(///tUe〃"s於1996年3月12曰以保藏號CBS"5.96保l^真菌菌種保藏中心；777e/wo頂/ceszerr"c^us於1996年3月12日以保藏號CBS285.96保藏在真菌菌種保藏中心。此外，所述酶可以從屬於間座殼目、炭角菌目、假毛球殼目和黑痣菌目的菌來優選M屬於炭角菌科、黑腐皮殼科和,//y/ac/oraceae的菌椒更優i^^屬於由間座殼屬、刺盤孢屬、黑孢屬、炭角菌屬、和孔座殼屬的菌抹獲得。特定的菌抹的例子是屬於歷'a/w/^力esj7^e;es/a.葫，牙4"刺盤孢、鹿角團炭角菌、/V/>/^i770/\3577.、〃6^/〃//s/70/xw和.泉孑L座殼的菌椒特另'l是Z/a/wrf/7esj/^e/es/aCBS278.96、葫,科刺盤孢ATCC52609、A7groypo"CBS272.96、鹿角團炭角菌CBS284,96.按照布達佩斯條約，"/a/oi^力esy/^e/es/a於1996年3月12日以保藏號CBS278.96保藏在真菌菌種保藏中心；/V/>/Y^/7ora於19%年3月U曰以保藏號CBS272.96保艮在真菌菌種保藏中心；鹿角團炭角菌於1996年3月12曰以保藏號CBS284.96保M真菌菌種保藏中心.所迷醃也可從按照布達佩斯於1996年3月12日分別以保藏號CBS270.96、CBS271.96和CBS273.96保藏在真菌菌種保藏中心的未鑑別的真菌(有絲分裂孢子的，coleomycetous)獲得。所述酶也可從以下菌抹獲得，所述菌抹是屬於柱孢屬、粘帚黴屬、赤殼屬、周刺座黴屬、糞殼屬、Xc/"〃g7lw7、後孢殼屬、5"/5^aWos/ora、67s^〃///7〃/7、毛殼屬、#/ce〃/7/f/7ora和頂孢黴屬的菌來特別是屬於0^///7GV0ca777朋早、Afe"/7a///7<<3、K(o/wfe//<3"//etofr/c^o/fl^、類生類殼，大抱類殼、r力/eA3r/a/erres/r/s、,力/e/ar/a//e/777c/7//7<3、CW//CO/0/77/77、//e/7770/7//7a、鏈抱粘帝審、5V7//^//(77〃/77fAe/7op///a和/fcre/noo/u邁s/的菌珠尤其是Afecfr/a/7y'/7eaCBS279.96、&/"e//aco〃"ofr/由/'ctesCBS400.58、糞生糞殼ATCC52644、大孢類殼ATCC60255、r力/e/ay/afe/屍esf/7sNRRL8126、r力/e/aK/3/^e/7wo/7力/7aCBS174.70、牆毛殼CBS163.52、CAaefOflz/w/nr/resce/7SCBS547.75、C力a"薩'"/w6ra"7/譜/sCBS122.65、C/ae論/卿cw/7/'co/o廠w/zCBS799.83、Syspas/ospora60/7/"e/7s/sN1CBC1515、C/<2J<zr/////7w/z7廠oec/7y/2o7s5"/歷〃/zATCC62373、W/ce//o/7^f/7(/"a*層/)///3CBS117.65、5"Wa/W^^e飾/7A/7aATCC28085、鏈孢粘帚黴ATCC10523和力cr湖朋/"邁CBS478.94。按照布達佩斯條約，/Vecfr/ap/"ea於1996年3月12日以保藏號CBS279.96保^L真菌菌種保藏中心；/Tcre邁卯/鵬".於1994年9月28曰以保藏號CBS478.94保藏。所述酶也可以從屬於腐皮鐮孢、蛇形鐮孢、早熟禾鐮孢、尖鐮孢s羊^KCo/em.c/、尖銀孢S57./7a^/Z7o/"a、黑腐質黴和灰腐質黴的菌抹，尤其是番茄尖鐮孢"pj^co/^"/c/CBS645.78、尖鐮孢"ppa^/77oraCBS744.79、腐皮鐮孢IMI107,511、蛇形鐮孢IFO4467、早熟禾鐮孢ATCC60883、黑腐質黴CBS819.73和灰腐質黴ATCC22726獲得.應當注意灰腐質黴不同於灰腐質黴Me/vz/o/^a變種.在一個優選的實施方案中，本發明的酶製劑來源於所公開的綱、目、科、屬和種，並且實質上由下述酶組成，所迷酶包含具有以下序列的由13個氨基^基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個^&^^基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，M^:Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4號位置上，M酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的8號位置上，#^^LArg、Lys或His;在第一序列9、10和12號的^Mi置上，在第二序列的4號位置上，g酸是20個天然Ma基中的任何一個。優選地，在第一序列的9號位置上的^^基選自脯氨酸、蘇氨酸、繩氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬統胺、穀氨跣胺、酪氨酸、絲氨酸、甲i^酸和色氨酸，更優選地選自脯氨酸和蘇氨酸；在第一序列的10號位置上的^^^M自脯氨酸、蘇氨酸、幾氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬統胺、穀氨統胺、酪氨酸、絲氨酸、甲碟氨酸和色氨酸，優選地是絲氨酸；在第一序列的12號位置上的Mg;i^自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、酪氨酸、絲氨酸、甲坑氨酸和色氨酸，優選地選自丙氨酸和甘氨酸；在第二序列的4號位置上的^A^JJ^自脯氨酸、蘇氨酸、幾氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、酪氨酸、絲氨酸、甲琉氨酸、色氨酸、穀氨酸和天冬氨酸，更優選地選自丙氨酸、甘氨酸和穀氨耽胺.另一方面，本發明換:供了一種DNA構建體，該構建體包含編碼顯示內切葡聚糖酶活性^的DNA序列，所述DNA序列包括a)分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從哞酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSMi0571、DSM10576中的質粒獲得的DNA序列，或者b)分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的類々義物或可以分別從哞酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物U同源於分別在SEQNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質粒獲得的DNA序列，ii)與分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質粒獲得的DNA序列的相同核普酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源於由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質粒獲得的DNA序列，iv)綿碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體免疫學反應性的，所述內切葡聚糖酶由分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的質粒獲得的DNA序列編碼。按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10512已於1996年2月2日保^DSM(德意志魂生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10511已於1996年2月2曰保藏在DSM(德意志雀生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10571已於1996年3月6日保^DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16,D-38124Braunschweig,德國).按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10576已於1996年3月12曰保藏在隨(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10583已於1996年3月13日保gDSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10584已於1996年3月13日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10585已於1996年3月13日保gDSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10586已於1996年3月13日保MDSM(德意志雀生物保藏中心，MascheroderWeg16，D_38124Braunschweig,德國)'按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10587已於1996年3月13日保M醒(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16,D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，大腸桿菌DSM10588已於1996年3月13日保gDSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，啤酒糖酵母DSM9770已於1995年2月24日保藏在DSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，譁酒糖酵母DSM10082已於1995年6月30日保藏在DSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，,酒糖酵母DSM10080已於1995年6月30日保藏在DSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)。按照布達佩斯條約，啤酒糖酵母DSM10081已於l"5年6月30曰保藏在DSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)，與SEQIDNO:1有關的本發明DNA構建體可以A^絲黴屬的菌珠特別是#.Me,卿///7a的菌來尤其是Mf/e/v770///A3CBS117.65的DNA文庫分離或者基於該文庫產生。與SEQIDN0:4和6有關的本發明DNA構建體可以從頂孢黴屬的菌抹，尤其是力"e/770/j/柳s/j.CBS478.94的DNA文庫分離或者基於該文庫產生。與SEQIDNO:8有關的本發明DNA構建體可以從梭孢殼屬的菌珠特另'J是T7/'e/3"3/^/ve5^/v:的菌#^尤其是r々/e/aK/<3/^/vesf/7irNRRL8126的DNAi^分離或者基於該il^產生.與SEQIDNO:10有關的本發明DNA構建體可以從殼球孢屬的菌珠特別是脫//jaseo7/"a的菌昧尤其是JZ-//weoh加CBS281.96的DNA文庫分離或者基於該iL^產生。與SEQIDNO:12有關的本發明DNA構建體可以從毛皮傘屬的菌A特別是C"We/As的菌珠尤其是C."We//aCBS280.96的DNA文庫分離或者基於該文庫產生。與SEQIDNO:19有關的本發明DNA構建體可以從糞殼屬的菌來特別是糞生糞殼的菌抹的DNA文庫分離或者基於該文庫產生。在本發明中，分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的"類似物"意指^T編碼顯示內切葡聚糖酶活性的酶的DN八序列，其具有性質i)-iv)的任一或全部.類似的DNA序列a)可以基於分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列，採用例如本文所公開的方法，從產生具有內切葡聚糖酶活性之蘇的其它或者相關(例如，相同)生物體分離；同系物可以是包含本文所示的DNA序列的DNA序列的等位變體，即經突變產生的基因的另一種形式.突變可以是沉默的(在編碼的酶上無變化)或可以編碼具有改變的M酸序列的酶；所述DNA序列的同系物也可以是屬或種同系物，編碼來源於另一個種的具有類似性質的酶。b)可以基於分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列構建，例如通過引入不產生另一個由所述DNA序列編碼的內切葡聚糖酶的^&l宇列(但其相應於用於產生所迷酶的生物體的密碼子使用)的核苷酸取代，和能夠產生一種不同的g酸序列的核苷酸取代。然而，在後一種情況下，胺基酸的變化優選地是次務f生質的改變(其是保守胺基酸取代，不明顯地影響蛋白質的摺疊或活性)、小的缺失(典型地是1到約30個^J^0;小的雖^^-或M-末端延伸(如^-末端甲硤歲^《基)，至大約20-25個殘基的小的接頭肽或有利於純化的小的延伸(如聚-組氨^，抗原表M結合^U，總的情況參見Ford等，蛋白質表達和純化，2:95-107，1991。保守取代的例子在下列^^酸的範圍內鹼性胺基酸(如精氨酸，賴氨酸，組氨紛，酸性胺基酸(如穀氨酸和天冬氨紛，極性胺基酸(如穀氨跣胺和天冬StJ^)，疏水胺基酸(如亮氨酸，異亮氨酸，纈氨銜，芳族a酸(如笨丙氨酸，色氨酸，輅氨紛和小絲酸(如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲>^紛。對本領域技術人員明顯的是，可以進行這樣的取代，其在對所述分子的功能關鍵性的區域之外，並且仍然產生活性多肽。可以按照本領域已知的方法鑑別對本發明的DNA構建體編碼的多欣之活性必需的g酸，所述方法例如定向謙變或丙氨酸-掃描誘變(Cunningham和Wells,科學244，108卜1085,1989)。在後一技術中，在分子中的任何殘基上引入突變，試驗形成的突變體分子的生物學(即內切葡聚糖鰷)活性，以筌別對所說分子活性關鍵性的胺基酸殘基.底物-酶相互作用的位點也可以通過晶體結構(由核磁共振、結晶學或光親和性標記法之類的技術測定的)分析測定。參見例如deVos等，科學255:306-312，1992;Sraith等，分子生物學雜誌.224:899-904，1992;Wlodaver等，FEBSLett.309:59—64，1992。由本發明的DMA構建體的DM序列編碼的內切葡聚糖蘇可以包括纖維素結合域(CBD),以編碼完^S^—部分存在，或者其它來源的CBD可以引入進內切葡聚糖酶酶，由此產生酶雜合沐。在本文中，術語"纖維素-結合域"應如PeterTo咖e等"不溶性碳水化合物的S^t降解"中的"纖維素-結合域分類和性質"，JohnN.SaddlerandMichaelH.Penner(編者)，ACS專題研討系列No.618,1996所定義的來理解。這一定義把120種以上的纖維素-結合域(CBD)分類成10個家族([-)O，並且其i爻明CBD在各種蘇中發現,如纖維素蘇，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙醯酯酶和殼多糖酶。CBD^藻類中發現，例如，作為-非水解多糖類-結合的紅藻屍o/77力//^/7〃i77〃rea蛋白質，參見PeterTomme等，同上。然而，大多數CBD來源於纖維素餘和木聚糖酶。CBD在蛋白質的N或C末端或內部發現。酶雜合體在本領^A已知的，參見例如W090/00609和W095/16782，並且可以通過將包含至少一種編碼纖維素-結合域的DNA片段(其帶有或不帶有接頭，與編碼目的酶的DNA序列連接)的DNA構建體轉^ii宿主細胞中，並培養該宿主細胞以表達融合基因來製備。酶雜合體可以用下式來描述CBD-MR-X，其中CBD是相應於至少纖維素-結合域的#^^列的N-末端或C-末端區；MR是中間區(接頭)，和可以是化學鍵或者短的連接基團，這些基團優逸地具有約2至100個碳原子，更優逸地具有2至40碳原子；或者優選地是約2至約100個g酸，更優逸電是2至40個#^酸；X是由本發明的DNA序列編碼的多肽的N-末端或者C-末端區。以兩種序列之間的等同性的程度測定以上i)中H的同源性，表示第一序列和第二序列的差別。同源性可以用本領域已知的計算;b^序合適地測定，例如在GCG禾呈序包中^R供的GAP(Needleman,S.B.和Wunsch，C.D.，分子生物學雜誌，48:443-"3，1970).採用GAP和下列設置進行DNA序列比較GAP產生罰分5.O和GAP延伸罰分O.3,所述DNA序列的編碼區顯示與分別在SEQIDN0:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從哞酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌醒10512、隨10511、DSM10571或DSM10576中的質粒獲得的DNA序列具有優選地至少60%，更優逸地至少65%，更優M70%，更優選地至少80°/。，尤其是至少90%的等同性程度。以上ii)中M的雜交意指在某些特點的條件下(在此後的材料和方法中詳細描述)，類似的DNA序列雜交到編碼內切葡聚糖酶的DNA序列的相同探針上.所使用的寡核苷酸探針是相應於分別在SEQIDNO:1、4:6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質粒獲得的DNA序列之內切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列。以兩種序列之間的等同性的程度測定以上iii)中提及的同源性，表示第一序列和第二序列的差別。同源性可以用本領域已知的電腦程式合適地測定，例如在GCG程序包中提供的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，分子生物學雜誌，48:443-453，1970)。採用GAP和下列設置進行多肽序列比較GAP產生罰分3.O和GAP延伸罰分O.1，類似DM序列編碼的多肽顯示與包含分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從啤酒糖酵母DSM97"70、DSM10082、DSM10080、讀10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質粒獲得的DNA序列的DM構建體所編碼的酶具有優選地至少55%，更優選地至少60%，更優選地65%，更優選地至少70%，更優選地至少80%,尤其是至少90%的等同性程度。關於以上iv)提及的性質，意指分別由從啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌廳10512、DSM10511、廳10571或DSM10576分離的DM序列編碼和由用所i兌DNA序列轉化的宿主生物體產生的內切葡聚糖酶酶，或者分別由///ce/2'0;7力M0raMe/7ffop///s、CW;/^///sca6e"a、「。/We//a或糞生糞殼天然內切葡聚糖酶。可以用以下材料和方法部分描述的方法測定免疫學反應性。本發明的另一方面涉及具有本發明的DNA構建體的表達載體、包含所說DNA構建體和表達載體的細胞以及產生顯示內切葡聚糖酶活性之酶的方法，該方法包括在可以產生所說酶的條件下培養所說的細胞，並從培養物回收所說的酶.本發明的另一方面涉及一種顯示內切葡聚糖酶活性的酶，這種酶a)由本發明的DM構建體編碼b)用本發明的方法產生C)與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體是免疫學反應性的，所述內切葡聚糖蘇由分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從哞酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸軒菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質粒獲得的DNA序列編碼。以上c)中^^的內切葡聚糖酶可以是由從,酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576分離的DNA序列編碼和由用所說DNA序列轉化的宿主生物體產生的內切葡聚糖酶，或者分別由/^/ce//oM^o/^f^e/7wc>;)/j//a、/fcre/wcw/w/wsp.、7T7/e/aK/'aferretf/"/:、Afecro//o/77//<3糞生糞殼天然相應的內切葡聚糖酶。一般地，在本文中，術語"酶"被理解為包括成熟蛋白質或其前體形式以及其實質上具有全長酴活性的功能性片段。此外，術語"酶"旨在包括所說酶的同系物。所述酶的同系物可以具有一個或多個g酸取代，缺失或者添加。這些變化優選地是次務li質的改變(其是保守g酸取代，不明顯地影響蛋白質的摺疊或活性)、小的缺失(典型地是1到約30個氬基^);小的募l-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲i^^基)，多至大約20-25個殘基的小的接頭肽或有利於純化的小的延伸(如聚-組氨酸束，抗原表位或結合樹，總的情況參見Ford等，蛋白質表il^純化，2:95-107，1991.保守取代的例子在下列胺基酸的範圍內鹼性氬基酸(如精氨酸，賴氨酸，組氨銜，酸性的胺基酸(如穀氨酸和天冬氨紀，極性胺基酸(如穀氨醯胺和天冬醯胺)，疏水氬基酸(如亮氨酸，異亮氨酸，幾氨紛，芳族氛基酸(如笨丙氨酸，色氨酸，酪氨紛和小a酸(如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，對^域技術人員明顯的是，可以iK亍il樣的取代，其在對所述分子的功能關鍵性的區域之外，並且仍然產生活性酶。可以按照本領域已知的方法鑑別對本發明的DNA構建體編碼的酶之活性必需的^酸，所述方法例如定向請變或丙氨酸-掃描請變(Curminghara和WeUs,科學244，1081-1085，1989)。在後一技術中，在分子中的任何殘基上引入突變，試驗形成的突變體分子的生物學(即內切葡聚糖酶)活性，以鑑別對所說分子活性關鍵性的4^^基.配體-受體相互作用的位點也可以通過晶體結構(由核磁共振、結晶學或光親和'汰標記法之類的技術測定的)分析測定。參見例如deVos等，1992;Smith等，1992;Wlodaver等，1992。同系物可以是等位變體，即經突變產生的基因的另一種形式或可以是由突變基因編碼的改變的酶(但具有與本發明的酶實質上相同的活性)。由此的酶。所述酶的同系物也可以是屬或種同系物，即來源於另一物種的具有類似性質的酶.所述酶的同系物可以通it^文描述的方法分離。經聚合^m^應分子篩^克隆使用從^il的來源(例如任何本文提及的生物體)分離的基因組DNA或者雙鏈cDNA和基於本文公開的DNA序列和^酸序列製備的合成自普酸引物，經聚合S^乏應(PCR)進行本發明的DNA序列的分子篩選。例如，合適的B苷酸引物可以是在材料和方法部分中所描迷的引物。依據眾所周知的方法，在分子篩選中所產生的PCR片段可以被分離和亞克隆進合適的載體中。經例如菌落或者噬斑雜交，PCR片段可以用於篩選DNA文庫。酵母中的克隆表達可以通過一般性的方法分離編碼顯示內切葡聚糖酶活性的酶的本發明的mu序列，所述方法包括-在合適的栽體中從合適的來源(例如任何本文提及的生物體)克隆DNA文庫，-用所說的載體轉化合適的酵母宿主細胞，-在^il的務陣之下培養所說宿主細胞，以表達由DNA文庫中的克隆編碼的^r^^酶，-通過測定由這些克隆產生的酶的任何內切葡聚糖酶活性篩選陽性克隆，-從這些克隆分離編碼所迷酶的DNA。在W094/14953中進一步/^開了一般'汰的方法，該文獻的內容本文一併參考。篩選方法更詳細的描l在以下實施例1中給出。可以分離編碼酶的DNA序列，所迷分離是例如通過篩選他cro/7/o/77/朋/7力a51(5(9///73、C/7/7//7e///ssca^e〃a、糞生糞殼或r。7i/fe//3"//e/^mc/^/V"的cDNA文庫，並選擇表達合適的蘇活性(即內切葡聚糖酶活性)的克隆進行分離；或者從按照布達佩斯條約於1996年2月2日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德國)的大腸桿菌DSM10512分離；或者從按照布達佩斯條約於1996年2月2日保藏在DSM的大腸扦菌DSM10511分離；或者從按照布達佩斯條約於1996年3月12日保^jlDSM的大腸桿菌DSM10576分離；或者A^按照布達佩斯條約於1996年3月6日保藏在DSM的大腸桿菌DSM10571分離；或者通過篩選yV/ce〃;7/^/or3^e/vz70/7/7//<3CBS117.65、//c/"e/z70/7/.w邁CBS478.94或T7/e/aK/afe/resf屍/sNRRL8126的cDNA文庫，並選擇表達合適的酶活性(即內切葡聚糖酶活性)的克J^ii行分離；或者從按照布達佩斯條約於1995年2月24曰保藏在DSM(德意恭徵生物保藏中心，MascheroderWeg16,D—38124Braunschweig,德-國)的哞酒糖酵母DSM9770分離；或者從按照布達佩斯條約於1995年6月30日保^DSM的,酒糖酵母DSM10082分離；或者A^按照布達佩斯條約於1995年6月30日保藏在DSM的譁酒糖酵母DSM10080分離；或者M^按照布達佩斯條約於1995年6月30曰保,DSM的哞酒糖酵母DSM10081分離。然後，可以用標準方法(如實施例1中所描迷的)從所述克隆分離合適的隨序列。核酸構建體本文使用的術語"核酸構建體"旨在指任何cDNA、基因組DNA、合成DNA或者RNA來源的核酸分子.術語"構建體"旨在指核酸區段，其可以是單^或雙鏈，並且其可以是基於編碼興趣酶的全部或部分天然核香酸序列，所述構建體可以含有可以不含有其它核酸區段。編碼本發明酶的核酸構建體可以殳基因組或cDNA來源的，例如通過製備基因組或者cDNA文庫，並按照標準技術(參見Sambrook等，1989)使用合成，苷酸^1針經雜交篩選編碼全部或部分酶的DNA序列獲得編碼蘇的核酸構建體也可以用已建立的標準的方法經合成製備，所迷方法例如由Beaucage和Caruthers(1981)描迷的氨基亞嗜酸酷方法，或Matthes等(198W描迷的方法。按照氛l亞磷酸酯方法，在例如自動DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火，連接和在合適的載體中克隆。此外，所述核酸構建體可以是合成和基因組，合成和cDNA或基因組和cDNA混合來源的，其是經按照標準技術連接合成、基因組或者cDNA來源的片段(相應於完整的核酸構建體的各種部分的片段)製備(以合適的方式)的。也可以採用特定的引物經聚合sm反應製備所述的核酸構建體，例如按照美國專利4,683,202或Saiki等(1988)描述的方法製備。核酸構建體優g是DNA構建體，這一術語將一直用於本說明書與權利要求書中.重組載體包含編碼本發明的酶的DNA構建體的重組栽體可以是任何易於進行DNA搡作的栽體，栽體的選擇常常取決於其所要引入的宿主細胞。這樣，載體可以是自主複製栽體，即作為染色體外實體存在的栽體，其複製不依賴於染色體複製，例如質粒。另外，載體可以是這樣一種，當其被引入宿主細胞時，#^^宿主細胞基因組，並且與其^ii的染色體一道複製。所述載體優選地是表達載體，在其中編碼本發明的酶的DNA序列可:^作地連接到該DNA轉錄所需的附加區段上。一般來說，表達載體是來自質粒或病毒DNA的或可以包含它們的成分。術語"可，連接"指所述區段排列斧使它們對預期的目的協調起作用，例如轉fe^啟動子開始，並且經由編碼酶的DNA序列進行。啟動子可以是任何DNA序列，其在所選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性，並且可以來源於編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用於酵母宿主細胞的合適的啟動子的例子包括來源於酵母糖解基因(Hitzeraan等，生物4匕學雜誌.255(1980)，12073-12080;Alber和Kawasaki，分子應用遺傳學雜誌，1(1982)，419-434)或酒精脫氫酶基因(Young等，化學品的基因工程和微生物學(Hollaender等，編者)，Plenum出版社，紐約，1982)的啟動子，或者TPI1(US4,599，3U)或ADH2-4c(Russell等，自然，304(1983)，652-654)啟動子用於絲狀真菌細胞的合適的啟動子是例如啟動子(McKnight等，TheEMB0L4(1985)，2093-2099)或fpM啟動子。其它有用的啟動子的例子是來源於編碼下列酶的基因的那些，所述酶是米麴黴TAKA澱粉酶、//j/z咖"cor肌e/e/天冬氨蛋白酶、黑麴黴中性a-澱粉酶、黑麴黴酸穩定a-澱粉蘇、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉蘇(giuA)、^/^/z7〃co/"/w/e/e/'月旨酶、米麴黴威性蛋白酶、米曲^舜酸丙糖異構酶或構巢麴黴乙醯胺酶。優選的是TAKA-澱粉酶和gluA啟動子。用於細菌宿主細胞的合適的啟動子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥澱粉酶基因、地衣形芽旨菌a-澱粉酶基因、液/^f匕澱粉桿菌BAN澱粉酶基因、枯草桿菌鹼性蛋白酶基因或短小芽^f菌^MI苷酶基因的啟動子或噬菌體XP,或R啟動子或者大腸桿菌"c、或"c啟動子。如果需要，編碼本發明的酶的DNA序列也可以可操作地與合適的終止子連接》本發明的重組栽體還可以包含使得所述栽體在所說的宿主細胞中複製的DNA序列。所述栽體也可以包含選^H生標記，例如，其產物補充宿主細胞缺陷的基因，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母TPI基因(由P.R.Russell，基因40，1985，pp.125-130描述)。對於絲狀真菌，選^r,Ji^示記包括a/z7必，af/"61、<3,^5,"/氛《為了引導本發明的酶i^宿主細胞的分泌途徑，也可以在重組栽體中包含分泌信號序列(也稱作前導序列、前序列原或前序列)，將分泌信號序列在正確的讀框中與編碼酶的DNA序列連接。分泌信號序列一般被置於編碼酶的DNA序列的5'分泌信號序列可以是通常與所述酶相關的或者可以是來源於編碼另一個分泌蛋白質的基罔的.為了從酵母細胞分泌，分泌信號序列可以編碼伶阿信號肽，該肽確保所表達的酶以有效的方向ii^細胞的分泌途徑。信號肽可以是天然信號肽或其功能性部分，或者其可以是合成氛已發現合適的信號欣是a-因子信號肽(參見美國專利4，870，008)，小鼠唾液澱粉酶信號肽(參見0.HagenbuchLe等，自然2891981,pp.643-646)，^"飾的狻肽斷言號肽(參見L.A,Vails等，細胞48、1987，pp.887-897)，酵母BAR1信號肽(參見W087/02670)或酵母天冬氨蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Eget-Mitani等，酵母，6，1990，pp.127-137)。為了在酵母中有效地分泌，也可以將編碼前導肽的序列插入到信號序列的下遊和編碼酶的DNA序列的上遊。前導肽的功能在於允許所表達的酶從內質網被引導到達高爾基體，並進一步到達分泌泡以便分泌到培養基中(即酶穿過細胞壁或至少穿過細胞膜ii^酵母細胞的周質空間的輸出)。前導肽可以是酵母a-因子前導肽(其用it^在例如US4,546，082，EP16201，EP123294,EP123544和EP163529中描述)。另外，前導肽可以是合成的前導肽，這就是i充前導肽不是天然發現的。合成的前導肽可以按照例如WO89/02463或WO92/11378中的描述構建。對於在絲狀真菌中的使用，所述信號肽可以方便地來源於編碼/^/7e/^/7/〃s澱粉酶或葡糖澱粉酶的基因，編碼M/zo/7wcar/z;/e力e/月旨酶或蛋白酶，〃w/w/co/a/3"昭//20^脂酶的基因。所述信號肽優i^是來源於編碼米麴黴TAKA澱粉酶，黑麴黴中性a-澱粉酶，黑麴黴酸-穩定澱粉酶或黑麴黴葡糖澱粉酶的基因。分別用於連接編碼所述酶的DNA序列、啟動子以及可操作的終止子和/或分泌信號序列的方法和將它們插入到包含複製所需信息的合適載體中的方法是本領域技術人員已知的(參見，例如，Sambrook等，以上引用的)。宿主細胞引入到宿主細胞的編碼所述酶的DNA序列對所說的宿主細胞而言可以是同源的或者是異源的。如果對宿主細胞是同源的，即由宿主細胞天然，則其典型地被可操作連接到另一啟動子或者(可用的話)另一分泌信號序列和/或終止子序列上，而不是在其天然環境中。術語"同源的"旨在包括編碼所說宿主細胞天然酶的cDNA序列。術語"異源的"旨在包括所說宿主細胞天然不表達的DNA序列'這樣，所說的DNA序列可以來源於另一個生物體，或者其可以是合成的序列。本發明的DNA構建體或重組載體引入其中的宿主細胞可以是能夠產生本發明的酶的任何細胞，包括細菌，酵母，真菌和高等真核細胞。經培養能夠產生本發明的酶的細菌宿主細胞的例子是革蘭氏-陽性菌，例如芽胞桿菌屬的菌抹(如枯草芽胞桿菌、地衣形芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、^c/7/ma/h/o/7力/7"s、液斷匕澱粉桿菌、凝結芽私fr菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽私扦菌、巨大芽胞桿菌或蘇雲金芽孢桿菌菌抹)或鏈黴菌屬的菌抹(例如淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌的菌抹)，或者革蘭氏-陰性菌，例如大腸桿菌。可以用已知方法經原生質體轉化或者使用感受態細胞進行細菌的轉化(參見Sambrook等，同上)。當在細菌(如大腸桿菌)中表達酶時，酶可以被保留在細胞質中(典型地是以被稱作包含體的不溶4生顆粒)或由細菌分泌序列引導到周質空間中。在前一種情況下，裂解細胞，回收顆粒並變性，此後經稀釋變性劑使酶再摺疊。在後一種情況下，可以經裂解細胞從周質空間回收所i先酶，如通過超聲波或滲透衝擊以釋放周質空間的內含物並回收酶。合適的酵母細胞的例子包括Sacc/a,cw7ycei15//.或^c//zosa"/arcw/cess;/7.的細胞，哞酒糖酵母或者克魯弗酵母的特定菌抹。用於用異源DNA轉化酵母細胞並且從此產生異源酶的方法在例如IIS4，599，311，US4，931，373，US4，870，008，5，037，743，和US4，845，075(所有這些本文一併參考)中有描迷。轉化細胞由通過選擇性標記確定的表型選擇。所述選擇性標記一般是對藥物的抗性或者在缺少特殊營#(例如亮氨紛的情況下的生長能力.用於酵母的一個優選的栽體是US4,931,373中公開的P0T1栽體。編碼本發明的酶的DNA序列可以在信號序列和可有可無的前導序列之前，例如如以上所述的。合適的酵母細胞的例子是克魯維酵母屬(如乳酸克魯維酵母)、R^:酵母屬(例如多形^L3b酵母)或畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母)的菌抹(參見Gleeson等，遺傳微生物學雜誌1321986，pp.34593465;US4，882，279)。其它真菌細胞的例子是絲狀真菌的細胞，例如"/7e/^/7/m,3/d.《〃a/51.菌株的保藏號CBS645.78分類位置子嚢菌門，屍/re"o邁yce"s，肉座菌目，肉座菌科尖嫌抱/735^//7(9/"re/io/n/cefes,肉座菌目，肉座菌科菌抹的保藏保藏號CBS279.96分類位置子囊菌門，/，re"6w/ce"s,肉座菌目，小赤殼科菌抹的保藏號CBS400.58分類位置子嚢菌門，/^/"e/o/77ycWd^,肉座菌目，(科未分類)大孢糞殼爿we"fra/(y物種的保藏號ATCC60255分類位置子嚢菌門，/^re/70/77/cer^，糞殼目，糞殼科糞生糞殼"。6e/^e乂Ces"/ef"e〃0/^r/s物種的保藏號ATCC52644分離自H.Dissing的糞，ISP，OJ,丹麥分類位置子嚢菌門，/yre/70/Z7yce"^糞殼目，糞殼利:灰腐質黴7Vaee"物種的保藏號ATCC22726來源HatfieldPolytechnic分類位置子嚢菌門，/y/"e/o/^c"",糞殼目，(考+未分類)黑腐質黴6to"尤菌抹的保藏號CBS819.73分類位置子嚢菌門，/yre/70/z^ce/1^,糞殼目，(科未分類)菌抹的保藏號ATCC28085分類位置子囊菌門，/y/"e/70/z^ce"s,糞殼目，(科未分類)一菌抹的保藏號CBS174.70，IM1145.136分類位置子囊菌門，Z^/"e/KM/cW"，糞殼目，毛殼科分離自蘑菇堆肥菌抹的保藏號NRRL8126分類位置子囊菌門，/^re/7^^cw"，糞殼目，毛殼科物種的保藏號ATCC62373分類位置子囊菌門，戶yre/70邁/c""，糞殼目，4J^殼科分離自牙買加ii4^斯山Selandinsp(Corapositaceae，Asterales)的葉片菌抹的保藏號NKBC1515(曰本大學，profeTubaki保藏中心)分類位置子嚢菌門，/yre/K/277cefes，糞殼目，Ce/^"o鵬&ceae管毛殼/^"cire/菌抹的保藏號CBS799.83分類位置子嚢菌門，/^re/o歷yce"s，糞殼目，毛殼科巴西毛殼5a〃s"ef屍o&a/菌抹的保藏號CBS122.65分類位置子嚢菌門，/yre/70/z^ce/1(^，糞殼目，毛殼科牆毛殼0r^菌抹的保藏號CBS163.52分類位置子囊菌門，/y/"e/7咖/c""，糞殼目，毛殼科菌抹的保藏號CBS547.75分類位置子囊菌門，屍/re/70/77/ce/^，糞殼目，毛殼科菌抹的保藏保藏號CBS117.65分類位置子囊菌門，/yre/7o/z^ceres，糞殼目，毛殼利-菌抹的保藏保藏號CBS272.96分離自在牙買加Christiana中生長的ArtocarpusaUUis的葉片，Moraceae，Urticales分類位置子囊菌1'，，/yre/7cvz7ycefes,7V7c/70577力ae/"/a/es,(孝+未分類)分離自雲南昆明植物園的Pinusyuannanensis的葉片分類位置子囊菌門，屍/re/cw/cefes，假"4^殼目，/^/e&ceae，菌抹的保藏保藏號CBS278.96分類位置子嚢菌門，/yr，町ce/^,"/，"力a/es,黑腐皮殼科葫,科刺盤孢(Passerini)EllisetHalsted別名圍小叢殼orbiculare變種JenkinsetWinstead物種的保藏號ATCC52609分類位置子嚢菌門，/^/"e/7卿7",M，黑痣菌目黑膠耳菌抹的保藏保藏號CBS277.96分類位置擔子菌門，層菌綱，木耳目，黑耳科菌抹的保藏號CBS280.96分類位置擔子菌門，層菌綱，蘑菇目網^&褶菇(屍rj67//.菌抹的保藏號CBS275.47分類位置擔子菌門，層菌綱，蘑菇目，鬼MM層孔菌"J屍r.菌抹的保藏保藏號CBS276.96分類位置擔子菌門，層菌綱，非褶菌目，Fo肌7aceaei^o/^/pe/Z/s1印.'菌抹的保藏保藏號CBS283.96分類位置擔子菌門，層菌綱，非褶菌目，煙管菌科(由18S序列和同源性分類學鑑別和相聯繫)血^:菌(Y.K/ojW別名血紅多孔菌；血紅密孔菌(厶,乂菌抹的保藏號AKli5062(京都大學培#^保藏中心)分類位置擔子菌門，非褶菌目，多孔菌科物種的保藏號ATCC38548分類位置擔子菌門，非褶菌目，裂褶菌科菌抹的保藏號CBS282.96分類位置壺菌門，壺菌綱，5^/ze〃ofl^cefa/es，/zo邁wco/"/ws/y/i^U/'/^d^c/j/p/Jer另寸名徵小毛霧菌抹的保藏號IF04578物種的保藏號ATCC46883分類位置接合菌門，接合菌綱，毛黴目，毛黴科閃光多貞審"w/ze,Ke以上所述所產生的PCR產物25徵升等分試樣在0.8。M敏凝溫度瓊脂糖(SeaPiaqueGTG，FIC)凝皎上進行電泳，從凝皎上切下相關的片段。通過添加0.1體積10x瓊脂糖酶緩衝液(NewEngUndBiotabs)和2單位八OO徵升熔化的瓊脂糖到樣品中，接著在""C溫育1.5小時，經瓊脂糖酶處理回收。用酚和三氯甲^提樣品，經添加2體積96%EtOH和0.1體積3MNaAc(pH5.2)沉澱經離心回收PCR片段，在70%EtOH中洗滌，乾燥和再懸浮於20徵升限制蘇緩衝液(10mMTris-HC1,lOraMMgCL,50mMNaCl，1mMDTT)中。以HindIII和Xbal消4匕片段，用S^三氯甲^:取，經2體積、96%EtOH和2體積、NaAc(pH5.2)沉澱回收，並亞克J^〃//2cUiI/J^2l-切割的pYES2.0栽體中。篩選cDNA文庫和陽性克隆的特徵確定。以相應的隨機引導的(Feinberg和Vogelste'tn)"P-標i己的(〉lx10cpra/徵克)PCR產物作為探4十，經菌落雜交(Sambrook，1989)篩選按以下所說構建的哞酒糖酵母和大腸桿菌的cDNA文庫。於65t:在2xSSC(Sambrook，1989)、5xDenhardt's溶液(Sambrook,1989)、0.5%(w/v)SDS、100jig/rai變性給睛DNA中進行雜交20小時，接著於25t:在5xSSC(2x15分鐘)中、於65t:在2xSSC、0.5%SDS(30分鐘)中、於65X:在O.2xSSC、0.5。/。SDS(30分鐘)，^J&於25"C在5xSSC(2x15分鐘)中洗滌，採用以下方法確定陽性cDNA克隆的特徵，所述方法是用pYES2,0多接頭引物(Invitrogen，USA)測序cDNA插入物的末端，用雙M^鏈終止法(Sanger等)採用螢光標記的終止劑測定兩條鏈的最長cDNA的核苷酸序列。按照製造商的說明，採用應用生物系統373A自動測序儀，用Taq脫氧末端循環測序試劑貪(PerkinElraerUSA)和[3YES2.0多接頭引物(InvUrogen，USA)或合成寡核苷酸引物測序Qiagen純化的質粒DNA(QiagenUSA).按照t)evereux等描迷的方法進行序列數據分才斤-用硫氰^ii行總RNA的抽提，接著經5-7MCsCl墊層超離心法，採用W094/14953中描述的方法經寡(dT)-纖維素親合色譜法進行poly(A)HNA的分離。cDNA合成採用RNaseH方法(Gubler和Hoffman(1983)基因25:263-269，Sambrook等(1989)分子克J^:實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY)用F.S.Hagen(pers.comm.)開發的髮夾j務飾從5微克poly(A)'RNA合成雙鏈cDNA在預i^/(匕的無核糖核酸蘇的Eppendorph試管中於70t:加熱poly(A廣RNA(在5pi1DEPC處理的水中的5ng)8分鐘，在冰上驟冷，添加逆轉錄酶緩衝液至終體積50微升，所述逆轉^al:緩衝液(50mMTris-Cl(pH8.3)、75mMiCCl、3raMMgCL，lOraMDTT，Bethesda研究實驗室)包含lmMdATP、dGTP和dTTP;0.5raM5'-甲基-dCTP(Pharmacia);40單位人類胎盤核糖核酸醉抑制劑(RNasin，P謂ega);1.45徵克oligo(dT),廣NotI引物(Pharmacia)以及1000單位S叩erScript11核糖核酸酶H逆轉錄餘(Bethesda研究實驗室).通it^45C溫育反應混合物1小時合成第一鏈cDNA'在合成之後，將mRNA:cDNA雜交混合物按照製造者的i先明經MicroSpinS-40.0HR(Pharmacia)旋轉柱凝膠過濾。在凝膠過濾之後，將雜交體用第二鏈緩衝液稀釋，所述緩衝液(20raMTris—HC1(pH7.4)、90raMKC1、4.6raMMgCl!、lOraM(NH山SO"0.16mM(NAD+)包含200nM各種dNTP、60單位大腸桿菌DNA聚合酶l(Pharmacia)、5.25單位核糖核酸酶H(Proraega)和15單位大腸桿菌DNA連接酶(Boehringer曼海if)。通it^16t:下溫育反應試管2小時和在25X:下溫育15分鐘進行第二鏈cDNA合成。由添加乙二胺四乙酸至最終濃度20mM終止反應，其後用e^三氯甲;^^提。Mung大豆核酸酶處理通過於-20X:下添加2體積的96%EtOH、0.2體積的10MNHMc沉澱雙鏈cDNA12小時，離心回收，用70%EtOH洗滌，乾燥並再懸浮於30徵升Mung大豆核酸酶緩衝液中，該緩衝液(30mMNaAc(pH4.6)、300raMNaCl,lraMZnSO,，0.35raMDTT，2%甘油)包含25單位Mung大豆核酸酶(Pharmacia).通過在30X:溫育反應物30分鐘，接著添加70徵升lOmMTris-HCl(pH7.5)、LmM乙二胺四乙酸，笨酚抽提以及在水上用2體積96%乙醇和0.1體積3MNaAc(pH5.2)沉澱來剪切單^C夾DNA。用T4DNA聚合Sl4t化末端離心回收雙鏈cDNA，在30徵升含0.5mM各種dNTP禾口5單位T4DNA聚合酵(NewEnglandBiolabs)的T4DNA聚合酶緩衝液中16C溫育1小時，使末端鈍化。加入EDTA至終濃度20mM，然後用笨fid^氯仿提取，加入2體積96%EtOH和0.1體積3MNaAc(pH5.2)於-20。C沉澱12小時。銜接子連接，Not1消化和大小選#:在填充反應完成後，經離心回收cDNA,用70%EtOH洗滌並乾燥。將cDNA沉澱重懸於25徵升連接緩衝液中，所述緩衝液(30raMTris-HCl(pH7.8)、lOmMMgCl!、10raMDTT、0.5mMATP)包含2.5微克非回文BstXI銜接子(lnvitrogen)和30單位T4連接酶(Proraega)，在16C溫育12小時。通過在65"C加熱20分鐘然後在水上冷卻終止反應。連接的cDNA用NotI限制酶消化，其是通過添加20徵升水，5徵升10xNotI限制絳緩衝液(NewEnglandBioiabs)和50單位NotI(NewEnglandBioUbs)，接著在371C溫育2.5小時進行的.65C加熱10分鐘終止反應。經凝皎電泳在1xTBE中的0.8%SeaPlaqueGTP4氐溶化溫度瓊脂糖凝膠(FMC)上大小分級分離cDNA，以分離未連接的銜接子和小的cDNA。按照製造者的"i兌明，由切下0.7kb並用P-瓊脂糖酶(NewEnglandBiolabs)從^&^:援出，並且於-20C添加2體積96%EtOH和0.1體積3MNaAc(pH5.2)沉澱12小時^i^阡cDNA的大小i^擇。文庫的構建通過離心回收定向的、選擇了大小的cDNA，在70%EtOH中洗滌，千燥並懸浮在30nl的lOraMTris-HCl(pH7.5)，lraMEDTA中。按照製造廠商的說明通過MicroSpinS-300HR(Pharmacia)旋轉;^行剿險過濾使cDNA脫鹽'在10^1包含5^1雙鏈cDNA(反應試管#1和#2)、15單位的T4連接酶(Proraega)以及30ng(試管im、40ng(試管並2)和40ng(試管#3，栽體背景對照)的BstXI-Notl裂解的pYES2.0栽體的連接緩衝液(30mMTris-HCl(pH7.8)、lOmMMgCL、L0raMDTT、0.5raMATP)中進行三種試驗連接'通ii^ti6x:下溫育i2小時、在70x:下加熱20分鐘、然後向每個試管添加10^U的水進行連接反應。如上所迷把的每種連接混合物電穿孔進40^x1電感受態的(electrocompeteiU)大腸桿菌DH10B細胞(Bethesda研究實驗室)中(S認brook等，(1989)分子免隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY).使用最優條件在包含庫的大腸桿菌中建立文庫。各庫通過在LB+氨千青黴屬素瓊脂平板塗布轉化的大腸桿菌並在37C下培養24小時產生15000-300G0克隆/平板製作'把^tnlLB+氨苄青審素添加到平板上並懸浮細胞。使細胞懸浮液於37匸下在50ml試管中振蕩1小時。使用QIAGEN質粒試劑盒按照按照製造廠商的說明從細胞分離質粒DNA並在-20"C下保存。把得自各個庫的純化質粒DNA(100ng/nl)的等分試樣通過電穿孔轉4說啤酒糖酵母W3124中(Becker和Guarante(1991)蘇學方法，194:182-187)，把轉化體平板接種於包含2%葡萄糖的SC瓊脂上並在30i:下培養。陽性菌落的筌別在生長3-5天之後，把瓊脂平板複製接種於一組包含0.1%AZCLHE纖維素的SC+半乳l尿嘧啶瓊脂平板上。將這些平板在30C下培養3-7天。內切葡聚糖酶陽性菌落妄定為藍環圍繞的菌落。為了在瓊脂上分離單個菌落，塗布得自fi^"陽性菌落的細胞，為了筌別產生內切葡聚糖酶的菌落，選擇產生酶的單個菌落。陽性克隆的鑑定陽性克隆作為單個菌落獲得，使用生物素化的多接頭引物直接從酵母菌落擴增cDNA插入片段，通過磁性小珠(DynabeadM-280，Dynal)系統純化，並通過使用鏈-末端方法(Sanger等(1977)美國科學院學報，74:5463-5467)和Sequenase系統(美國生物化學)測定每個cDNA克隆的5'-末端序列單個地確定其特徵。使用螢光標記的終止子通過雙脫氧鏈終止方法(Sanger等)測定得自兩務逸的最長cDNA的核苷酸序列.通過如下所述轉4^大腸桿菌救援(rescue)質粒DNA。<吏用AppliedBiosystems3"A自動測序儀按照製造廠商的i兌明用Taq/K^末端循環測序試劑盒(PerkinElraer，US)和pYES2.0多接頭引物(Invitrogen，USA)或合成的寡核苷酸引物測定Qiagen純4匕的質粒DNA(Qiagen，USA)的序列'序列數據的分析按照Devereux等進4f。在麴黴中表達的cDNA基因的分離把產生內切葡聚糖酶的酵母菌M種於在50ml玻璃試管中的20ralYPD培養液中.試管在30t:下振蕩2天。通過在3000rpm下離心10分鐘收穫細胞。按照WO94/14953分離DNA並將其溶解在5(Hil水中。通過標準方法把DNA轉4I^4大腸桿菌。^f吏用標準方法從大腸桿菌分離質粒DNA並通過限制酶分析進行分析。使用適當的限制酶切除cDNA插入片段並連接進麴黴表達栽體中。米麴黴或黑麴黴的轉化如WO95/02043的16頁，214亍-17頁，124亍(本文一併參考)所述製備原生質體。把100pl的原生質體懸浮'液和5-25ng在10pLSTC(l.2M山梨醇，10mMTris-HC1，pH=7.5，lOmMCaCL)中的適當DNA混合將原生質體與p3SR2(攜帶A.nidulansamdS基因的質粒)混合'混合物在室溫下放置25分鐘。添加O.2ml60%PEG4000(BDH29576)、lOraMCaCl"10mMTris-HCl(pH7.5)並小心地混合(兩次)，^J&添加0.85mL的相同溶液並小心地混合。混合物在室溫下放置25分鐘，在2500g下旋轉15分鐘，把沉澱懸浮在2ml的1.2M山梨醇中。在再次沉澱之後把原生質體塗布在最小的包含l.OM蔗糖(pH7.0)',lOmM乙St^ft為氮源以及20mMCsCl以抑制背景生長的平板上(Cove,生物化學學報，113(1966)5卜56)。於37C下培養4-7天之後，選擇孢子並塗布以形成單個菌落。重複該過程，保存第二次再分離之後的單個菌落的孢子作為所定義的轉化體。米麴黴轉化體的試驗把每個轉化,種在10ml的YPM中並繁殖。在於37n下接種2-5天之後，除去lOral的上清液。如上所述通過AZCLHE纖維素筌別內切葡聚糖酶活性。用於評價本發明的DNA構建體的性質ii)的雜交條件測定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間的雜交的^it務陣包括在5xSSC(標準檸檬酸鹽)中預浸漬包含待雜交DNA片段或RNA的濾膜10分鐘，濾膜在5xSSC(Sambrook等1989)、5xDenhardt's溶液(Sambrook等1989)、0.5。/。SDS和100ng/ml變性的聲處理的給睛DNA(Sambrook等1989)中預雜交，然後在包含隨機引物的(Feinberg，A.P.和Vogelstein,B.(1983)生物化學年評，132:6-13)、32P-dCTP-標記的(比活>1x10Vpm/Kig)的探針的相同溶液中於約45t:下雜交12小時u然後濾膜在2xSSC、0.5%SDS中洗滌兩次30分鐘，溫度優選地不高於50X:，更優選地不高於55C，更優i^是不高於60t:,更優il^是不高於70X:，尤其是不高於75r。用於雜交的核苷酸探針是對應於分別在SEQ1DN0:1、4、6、8，、10、12或16中所示的DNA序列和/或分別可以從在,酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大腸桿菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的質粒獲得的DNA序列的內切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列。免疫交M應用於測定免疫交H應的抗體可以通過^t用純化的纖維素酶製備。更具體地說，抗本發明的纖維素酶的抗血清可通過按照N.Axelsen在"定量免疫電泳手冊"，Blackwel1科學出版社，1973，23章中或A.Johnstone和R-Thorpe，實踐免疫化學，BLackweU科學出版社，1982(更具體地說在27-31頁)中描述的方法製備.純化的免疫球蛋白可從抗血清獲得，如通過鹽沉澱((NHO!S(K)並進行滲析和離子交換色譜(如在DEAE-Sephadex上)。蛋白質的免疫化學定性可通過Outcherlony雙擴散分鬥斤(O.Ouchteriony:試驗免疫學手冊(D.M.Weir,Ed.),BlackweU科學出版^土，1967,655-706頁)、交叉免疫電泳(N.Axelsen等，同上，第3和4章)或火箭免疫電泳(N.Axetsen等，第2章)完成。培養基YPD:10g酵母提取物，20g蛋白腖，加H2O至900ml。高壓滅菌，添加100rai20%的葡萄糖(無菌過濾的)。YPD:10g酵母提取物，20g蛋白腖，加H'0至900ral。高壓滅菌，添加100ml20%的麥芽糖糊精(無菌過濾的)。10x鹼鹽(baselsalt):75g酵母^^(nitrogenbase),113g琥銷酸，68gNaOH，加H20至1000ml，無菌過濾。SC-URA:100ral10x鹼鹽，28ml無維生素的20%^"^^酸，10ml1%的色氨酸，加HzO至900ml，高壓滅菌，添加3.6ml5X蘇氨酸以及100ml20%葡萄糖或20%半孔糖。SC-URA瓊脂SC-URA,添加20g/l瓊脂.PD瓊脂39g馬鈴薯右旋糖瓊脂，DIFCO0013;添加去離子水至1000ml;高壓滅菌(121C下15-20分鐘)。PC瓊脂馬鈴薯和胡蘿蔔(研磨，每種20g)，添加水至1000ml，煮沸1小時；瓊脂(20g/1Merck1614);高壓滅菌(121t:下20分鐘)。PC液態培養l如PC瓊脂，但沒有瓊脂。PD液態培養^:24g馬鈐薯右旋糖培養液，Difco0549,添加去離子水至1000ml;高壓滅菌(121t:下15-20分鐘)。具有纖維素的PC和PD液態培養l每1000ml添加30gSolcafloc(Dicacel^r從Dicalite—Europe—Nord，9000Gent，t匕矛'J時獲得)。PB-9液態培養^:把12gRofec(Roquette10卜0441)和24g葡萄糖添加至1000nU水中；把pH值調整到5.5;每1000ml添加5ml礦物油和5gCaC(L。高壓滅菌(121X:下40分鐘)。YPG液態培養基4g酵母提取物(Dirco0127)，lgK隨恭rck4873)，0.5gMgSOr7H20Merck5886，15g右旋糖，Roquette101-0441,0.1mlPluronic(101—3088);添加去離子水至1000ml;高壓滅菌(121x:下20分鐘)稀釋鹽溶液(DS):製備兩種母液P—母液13.61gKH惡;13.21g(NHO2P(^,17.42g添加去離子水至100ml。Ca/Mg母液7.35gCaCh.2H20，10.17gMgClr6訪，添加去離子水至100ml;把pH值調整至7.0;高壓滅菌(121t:;20分鐘)把0..5raiP-母液和0.imlCa/Mg母液混合添加去離子水至1000mlAZCLHE纖維素(Megazyrae，澳大利亞)。用途在洗滌和穿著過程中，染色的織物或衣物的染料通常滲色，從而使衣物看起來已褪色和穿舊。從織物表面除去纖維將部分地恢復織物初始的顏色和外》見。本文所使用的術語"顏色澄清"是指通過多次洗滌循環織物或衣物的初始顏色部分地恢復術語"除去丸狀物"指從織物表面除去丸狀物。術語"浸泡液體"指這樣的一種含水的液體，要洗的衣物在進行常規洗滌過程前要浸泡在其中。浸泡液體可包含一種或多種通常用於洗滌或洗滌方法的糹且分。術語"洗液"指這樣的一種含水的液體，在其中要洗的衣物進行洗滌過程，即通常是一種手工或在洗;^L中的化學或機械結合的作用。通常，洗^A粉劑或液體洗滌劑組合物的水溶液。術語"衝洗液體"指這樣的一種含水的液體，為了衝洗要洗的衣物，即實質上從要洗的衣物中除去洗滌劑溶液，在其中浸泡並處理要洗的衣物，通常是在洗滌過程之後立即進行-衝洗液體可包含織物條理或軟化組合物按照本發明的方法要洗的衣物可以是常規的可洗的衣物。優i4A，要洗的衣物的主要部分是縫合或未縫合的織物，包括從棉製造的編織物(knits)、編織物(wovens)、斜⑩棉布、紗線和毛巾、棉混紡物或天然或人造纖維素(如制自包含木聚糖的纖維素織物，如制自木漿)或其混合物。混合物的例子是具有一種或多種輔助材料的棉或人造纖維/纖維膠(如羊毛、合成纖維(如聚耽胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙蜂纖維、聚偏二氯乙烯纖維、聚氨甲酸乙酯纖維、M纖維、aramid纖維)以及包含纖維素的纖維(如人造纖維/纖維膠、薴氛亞麻/亞麻布、黃氣乙酸纖維素纖維、LyoceU)。洗滌劑組^y按照本發明的一個方面，本發明的內切葡聚糖酶可典型地是洗滌劑組合物的組分。同樣地，它們可以以非塵狀粒劑、穩定液體或受保護的酶形式包括在洗、滌劑組合物中。非塵狀粒劑可按照，如在US4,106,991和^"l，"2所(二者都屬於NovoIndustriA/S)/>開的方法產生並可有可無地按照^域的方法包禮蠟狀的表面蓋覆劑的例子是平均分子量為1000至20000的聚(環氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG);具有16至50個環氧乙烷單位的乙M^匕的壬勤^;乙M化的脂肪醇(其中醇包含12至20個^J^、子，具有15至80個環氧乙烷單位)；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的甘油單、雙和三酸酯。在專利GBM83591中給出了通過流化>^技術製成的適於應用的形成薄片的表面蓋覆劑的例子。如液態鰷製劑可按照已制定的方法通過添加多羥基化合物(如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼紀穩定。其它酶德定劑在本領域中是已知的。受保護的酶按照在EP238，216中公開的方法製備本發明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，如粉劑、粒劑、糊劑或液體。液體洗滌劑可是水溶液，典型地包含多達70%的水和0-30%的有^劑，或非水溶液。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，每種活化劑可以是陰離子、非離子、陽離子或兩性離子的，洗滌劑通常包含0-50%陰離子表面活性劑，如線性^^笨嗜酸鹽(LAS)、a-烯烴橫酸鹽(A0S)、)^統酸鹽(脂肪醇闢^酸酯)(AS)、脂肪醇乙M"^i酸鹽(AEOS或AES)、仲坑烴碌酸鹽(SAS)、a-疏代脂肪酸甲基酯、；^或烯^4^珀酸或皂。它可以包含0-40%的非離子表面活寸生劑，如脂肪醇乙l基化物(AEO或AE)、羧化的脂肪醇乙M^匕物、壬基酚乙M化物、H聚苷、歉基二甲胺氧化物、乙氡基化的脂肪酸單乙醇跣胺、脂肪酸單乙醇耽胺或聚羥烷脂肪酸^Jfe(如如在WO92/06154中所描述的)。洗滌劑組合物還可包含一種或多種其它酶，如澱粉酶、脂酶、角質酶、蛋白酶，過氧化物酶和氧化酶，如^l"。洗滌劑可包含1-65%洗滌劑助洗劑或配位劑，如滯石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯、檸檬酸鹽、次^^^乙酸(NTA)、乙二氨四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTMPA)、^&或烯基琥珀酸、可溶'liii酸鹽或層珪酸鹽(如得自Hoechst的SKS-6)。洗;M^也可無助洗劑，即實質上不含洗滌劑助洗劑。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。例子是羧甲基纖維素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、馬來^/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月^^酯/丙烯酸共聚物。洗塗劑可包含漂白系統，該系統包含H晶源，如與形成過酸的漂白活化劑(如四乙基乙二胺(TAED)或壬耽氧苯磺酸鹽(NOBS))結合的過鄰酸鹽或過碳酸鹽.另外，漂白系統可包^it酸，如耽胺、醯亞胺或鞏型。本發明的洗條劑組合物的酶可以使用常規的穩定劑穩定，如多羥基化合物(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如芳族硼酸酷，組合物可按照在如WO92/19708和WO92/19709中所述製成製劑。洗滌劑也可包含其它常規的洗滌劑組份，如織物調理劑，包括粘土、泡,助劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、汙物懸浮劑、抗汙物再沉積劑、染料、殺菌劑、螢光增白劑或香料。pH(於使用濃度下在水溶液中測量)通常是中性或威t生的，如在7-11的範圍內。在本發明的範圍之內洗滌劑組合物的具體形式包括tableseeoriginaldocumentpage732)—種製成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含tableseeoriginaldocumentpage74tableseeoriginaldocumentpage75tableseeoriginaldocumentpage767)—種製成粒劑的具有至少600g/1的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含tableseeoriginaldocumentpage76tableseeoriginaldocumentpage77tableseeoriginaldocumentpage78tableseeoriginaldocumentpage79tableseeoriginaldocumentpage80complextableseeoriginaldocumentpage810-3%16)如在1)-15)中所述的洗滌劑製劑，該製劑包含作為另外的組分或作為已經指出的漂白系統的替代物的穩定或膠囊化的過酸。17)如在l)、3)、7)、9)和12)中所述的去垢組合物，其中所:說的過硼酸鹽被過碳酸鹽替代。18)如在l)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的去垢組合物，該組合物還包含錳催化劑.猛催化劑可以是，例如在"用於低溫漂白的有效的猛催化劑"，自然369，1994,637-639中所描述的一種化合物。19)製成非水溶液洗滌劑液體的去垢組合物，該組合物包含液態非離子表面活性劑如線性的烷M化伯醇、助洗劑系統(如磷酸鹽)、酶和鹼。洗滌劑也可以包含陰離子表面活性劑和/或漂白系統。內切葡聚糖酶可以以通常用於洗滌劑的濃度摻入。它包含在本發明的洗衣組合物中，纖維素酶可以以對應於每升洗液中0.0001-10mg(以純4匕的酶蛋白質計算)的纖維素酶添加。按照本發明的另一個方面，內切葡聚糖酶可典型地是織物調節劑或軟化組合物的組分。通常的軟化組合物的例子在例如EP0233910中公開。坊織中的應用在另一個實施方案中，本發明涉M發明的內切葡聚糖酶在生物拋光過程的用途。生物拋光是紗表面的特異'汰處理，這種處理改進了織物的手感和外觀的質量，而不失去織物可溼性。生物拋光最重要的作用可通過糹艮少起毛和形成丸狀物、增加光彩/光澤、改進的織物手感、增加的耐用軟度以及改變的吸水能力表徵。生物拋光通常發生在4f織和編織的織物製造的溼處理之中。溼處理包含如下步騄脫漿、衝洗、漂白、洗滌、染色/印花和塗飾。在每個這樣的步驟期間，織物或多或少地進行機械作用。通常，在針織和編織織物之後，織物進行到脫裝階段，其後為衝洗階段等。脫裝是從織物除去漿糊的作用。在機械織機上編織之前，為了增加彎曲的紗線的抗張強度，常常用漿糊澱粉或澱粉衍生物包被。在編織之後，裝糊包被物在進一步處理織物之前必須除去以確保均勻和防洗效果。已知為了達到生物拋光的效果，需要溶纖和機械作用的組合。還已知當用纖維素酶處理和用軟化劑的常規處理結合時可達到"超軟化"。可以設想本發明的內切葡聚糖酶用於纖維素織物的生物拋光是有優勢的，如可達到更徹底的拋光。生物拋光可通過應用例如在W093/20278中所描迷的方法獲得。石洗褲以提供所需的織物顏色的局部發亮或通過餘&處理織物(具體來說是用"石洗的"外觀(局部顏色磨損)。可以單獨(如在US4，832，864中所公開的)或與比在傳統的方法較少量的浮石一起或與珍珠巖一起(如在W095/09225中公開的)進行本發明的內切葡聚糖酶的處理.紙漿和紙上的應用在ii^紙漿工業中，本發明的內切葡聚糖酶有利地應用到如下方面-用於剝樹皮^^W^轉筒中剝樹皮之前，用內切葡聚糖酶的預處理可降解形成層，從而有利於節能。-用於脫纖維因為纖維素酵對內部纖維表面的水解作用，在精製或打漿之前用內切葡聚糖酶處理含纖維素纖維的材料可導致能量消耗的減少。使用內切葡聚糖酶與使用已知的酶相比可導致改進的節能，因為人們相信本發明的酶組合物具有更高的穿透纖維壁的能力。-用於纖維改性，即纖維性質的改進，其中需要^跨纖維壁的部分水解，這需要更深的穿透酶(如為了使扭險的纖維更柔韌).迄今為止，纖維的深度處理對高產量的紙漿(如機械紙漿或再循環紙漿的混*)是不可能的'這歸結於纖維壁結構的性質(因為纖維壁的孔基質的物理限制，該性質阻止S^子的通過).設想本發明的內切葡聚糖酶能滲入纖維壁。-排水改t造紙紙漿的排水能力可通過用水解酶(如纖維素酶)處理紙裝得到改進.木素纖維素紙漿的處理可按照例如在WO91/M819、WO91/14822、WO92/18688和WO92/17573中的描iti^行'植物材料的降解在另一個實施方案中，本發明涉及按照本發明的內切葡聚糖酶和/或酶製劑用於植物材料(如細胞壁)降解的用途。本發明涉及為了增加產量在酒、水果或蔬菜汁中應用本發明新內切葡聚糖酶和/或酶製劑。按照本發明的內切葡聚糖務&可用於各種植物細自生的材料或廢材料的齊&水解，如農業殘餘物，如麥秸杆、玉米穗軸、整抹玉米植物、核果殼、草、蔬菜殼、豆殼、穀殼、甜菜漿等。為了改進不同種類的加工、M其它組分的純化或提^取(如從穀物中純化P-葡聚糖或e-葡聚糖4氐聚物)、改進食物價值、減少水結合量、在廢水植物中提高降解、提高(:jjcn^草保藏法的草和穀類的)轉化等，可以降解植物材料。下列實施例i兌明本發明。實施例1通*達克隆檢測了4種真菌的溶纖酶，這4種真菌屬於子嚢菌綱的兩個目之內的3個科；測定了相應的DNA序列；異源表i^通過液體發酵產生的酶在顏色澄清測定中進行特徵分析，表明其具有良好的性能。4吏分離物CBS117.65、CBS478.94、NRRL8126和ATCC10523在振蕩燒瓶培養器中在富含纖維素的馬鈴薯右旋糖培養液中生長，在26x:下培養5天(振蕩M,150rpm)。ferre"r/s和Ko/wfe//aco〃"o/z7由/^y的內切葡聚糖膝的克J^fo表達分另,1分離f力e/wo/7力/7a、/fcre/z/o//w歷,7^/e/ai^/aferre"r/s和"//"ofr/c/jo/o^的mRNA，這些生物體生長在含有纖維素的發酵培養基(振蕩培養基以確保充分換氣)中。在生長3-5^J^收穫菌絲，立即把菌絲在液氮中冷凍，並且儲存在-80X:下。在所描述的大腸桿菌中利用1%的栽體背景分別構建外"//0/7/"0/"3.fA"/^/^/"義cre邁o//"邁印.，7^/e/a"aferre"r/s和Ko/wteZ/a00//^0"/(^0/&;5的文庫，每個il^中含有大約106個單個克隆.把每一個文庫的一些集合的質粒DNA轉化到酵母中，從每一個集合中得到了含有250-400個酵母菌落的50-100個平板'利用AZCLHE纖維素測定法在SC-瓊脂平板上答別和分離內切葡聚糖酶-陽性菌落.從酵母菌落直接擴增cDNA插入物，並且利用以上材料和方法部分中描迷的方法進4亍4生質分析。S印IDNO:1顯示了編碼/^^//^/^力0,3Z力e/7770/)/7//3的內切葡聚糖膝的cDNA的DNA序列，SEQIDN0:1也顯示了相應^J^^^列.從DSM9770的質粒中可以獲得此cDNA。編碼/lc,e麵/咖m.的內切葡聚糖酶的c隱的,序列列於seqidno:4中，相應^J^復宇列列於SEQIDNO:5中。從DSM10082的質粒中可以獲得此c眼。編碼77/>/a^3f"reW/7s的內切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列列於SEQiDNO:8中，相應^J^酸序列列於SEQIDNO:9中。從DSM10081的質粒中可以獲得此cDNA。編碼K。/wfe"aco"e/o"ic/o油s的內切葡聚糖醉的c眼的■序列列於SEQ.IDNO:16中，相應#^酸序列列於SEQIDNO:17中。從DSM10571的質粒中可以獲得該cDNA。從酵母菌落分離出總DNA，並且通過轉化以上所述的大腸桿菌救援質粒DNA。為了在束麴黴屬中表達內切葡聚糖酶，用適當的限制性內切酶消化DNA,在凝膠上進行片斷分級分離，分別純化與#yce//op/^/7orac6>//"o"/c/o/Ve;內切葡聚糖酶基因相應的片段，其後把基因連接到用適當的限制性內切酶消化的pHD414中，分別形成了質粒pA2C357、pA2C193、pA2C385和pA2C488在大腸桿菌中擴增DNA之後，把質粒轉化到以上所述的米麴黴中。米麴黴轉化體試驗如上所迷試驗爭個轉化體的內切葡聚糖酶的活性。一些轉化體比米麴黴背景具有更大的內切葡聚糖酶活性。*明了在米麴黴中內切葡聚糖酶的有"達'利用YPM培養基在500ral銜阮中選#^接種了具有最高的內切葡聚糖酶活性的轉化體.在發酵(為確保良好的通氣進行充分的,)3-5天後，把培養'液以2000g離心10分鐘，並且回收上清液.B.內切葡聚糖酶活性的測定可以測定內切葡聚糖酶相當於分析標準物的溶纖活性，並且以單位S-CEVU表示。溶纖酶水解CMC,因此減少了培養混合物的粘度。可以通過振動粘度計(例如法國Sofraser，MIVI3000)測定產生的粘度減弱。可以按照AF301.1分析方法進行以S-CEVU測量的溶纖活性的測定，這種方法可以向本申請人索取。通過測量樣品的減少羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力，S-CEVU測定方法量化了樣品中的催化活性。測定在糹OX:、pH7.5的條件下進行，同時利用了降4氐CMC底物粘度的相關的酶標準物。利用磷酸飽和纖維素(PASC)以SAVI單位測定內切葡聚糖酶活性的'測定方法定義1SAVI-U是形成一定量的還原碳水化合物(相當於每分鐘lnmol的葡萄糖)的酶量。測定條件酶溶液0.5ml0.1M緩衝'液中的4g/PASC:2.0ml20分鐘，40匸敏感性最大0.1SAVIli/raH大約1S-CEVU/ral(CMC粘^D最小0.01SAVIU/ral-大約0.1S-CEVli/ml還原糖形成的測定按照Lever,M.比色法測定碳水化合物的一種新反應(生物化學年報1972.vol47(273-279))進行還原基團的測定。通過把1.5克對羥笨甲酸氫酸(PHBILH)和5克酒石酸鈉在100ml的2%氫氧化鈉中混合製備試劑混合物。底物利用水凍丙酮和砩酸按照下面的方式製備PASC貯液。把5克纖維素(Avicel)用水溼潤，加入150ml85°/。的冰凍正磷酸把混合物放置在冰浴中，緩'度撹拌l小時。然後加入IOOml水凍丙酮並且攪拌。把漿液轉移到帶有燒結的3號pyrex盤的Buchner過濾器中，並且用;水凍丙鮦洗滌三次，每次洗滌之後儘可能吸乾。^J&把濾餅用500ml水洗滌兩次，每次洗滌之後儘可能吸千把PASC與去離子水混合，使總體積達到300ml，均勻混合(使用超Turrax均化器)，並且保存在冰箱中(達一個月)。用緩衝液平衡底物20克碑酸飽和的纖維素PASC貯液以5000rpm.離心20分鐘，倒出上清液；沉澱在30ml緩衝液中再懸浮並在5000rpm.下離心20分鐘。倒出上清液，將總共60克的沉澱以5克纖維素/升的濃度懸浮在緩衝液中。pH8.5的測定緩衝液0.1M巴比妥。p'HIO的測定緩衝液0.1M甘氨酸。方法1.S^樣品的^^釋將酶溶液在與底物相同的緩衝液中稀釋。2.酶反應將緩衝溶液中的底物在42X:下預熱5分鐘(2ml)。然後加入0.5rol酶溶液(稀釋至0.2-1S-CEVU/ml)，混合5秒鐘。通it^酶溶液中添加終止試劑獲得酶空白。40^:下培養20分鐘。通過加入0.5ml2%NaOH溶液並混合5秒鐘終止反應。將樣品以5000rpm.離心20分鐘。將1ml上清液與0.5mlPHBAH試劑混合，並且煮淬10分鐘。試管在水水浴中冷卻。3.還原末端基團的確定使用分光光度計在410nm測量吸收率。通過在加入酶溶液之前加入氫氧化鈉製備空白。利用在相同緩衝液中的5，10,和25mg/1濃度的葡萄糖和在煮沸之前加入PHBAH試劑獲得葡萄糖標準曲線。利用標準曲線計算釋放的還原葡萄糖當量。4.催化活性的計算測量410nm的吸收率1)標準曲線(葡萄糖)-(H，O)對葡萄糖的濃度2)酶樣品(樣品)-(空白)按照標準曲線計算葡萄糖濃度活寸生(SAVLLI/ml):X(mg葡萄糖/1)*稀幹液_180.16(葡萄糖的分子量)*20(分鐘)C./e/77o/7力/的內切葡聚糖酶的純化和性質分析將pA2C193轉化的米麴黴在YPM培養基上培養4天。然後將液體離心並無菌過濾。利用20kD閾值的DOW膜GR61PP通過在AMIC0N室中的超濾作用濃縮樣品。分析超濾濃縮物的S-CEVU/ml和SaviU/ral，得到下列結果tableseeoriginaldocumentpage87純化把2毫升UF-濃縮物稀釋5倍，以降低其離子強度，並通過0.22nm圓板過濾器過濾。將樣品加入到用50raMTris/HCl緩衝液(pH7.5)平衡的MonoQHR/5Pharmacia柱上，流速為1毫升/分鐘。在用緩沖液A洗MJiJ基線時，用含有lMNaCl(緩沖液B)的Tris/HCl緩衝液(pH7.5)，梯度洗脫是在1小時之內緩衝液B從0-50%變化。36分鐘後，出現高峰複合物，收集每份lml的流份，將最初的10個流份在羧甲基纖維素/瓊脂糖/剛果紅的平板上顯示纖維素酶活性。合併這些流份，並利用20kD閾值的D0W膜GR61PP通it^AMIC0N室中的超濾作用濃縮至3毫升將樣品加入到用100raMTris/HCl緩衝液(pH6.35)平衡的HiLoad2660Superdex75TMprep梯度Pharmacia^LL,;線為1毫升/分鐘。82分鐘後，出現高峰，每份lml收集流份，最初的10個流份在羧甲基纖維素/瓊脂糖/剛果紅的平板上顯示纖維素酶活性合併這些流份，得到的結果如下Aw=0.15A'ro/Am=1.62Mw(SDS)-22kDpl=3.5-5SDS-PAGE上的純度=100%S-CEVUM=28.5S-CEVU/mg=436消光係數=54880(計算的)Mw(計算的)-22kD消光係數是以由所附的SEQIDNO:1(^J^^列)的序列計算的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的含量為基礎。在NOVEXPre-Cast疑歐4-20%Tris-甘氨酸^JH1.0raraxlO孔上進行SDS-Page。在PharmacUPAG板(pH3.5-9.5)上進行IEF，由羧甲基纖維素-剛果紅覆蓋顯現出活性。"和K:。"的測定在pH8-5和底物濃度多達8克/毫升的情況下，以與測定SAVI單,同的方式測定L和IU,。得到下列結果L為38/每秒，L為5g/1，磷酸飽和纖維素，pH8.5。在pH7.5時對羧甲基纖維素的比活性每毫克蛋白質436S-CEVU。D.Mf/er邁op//7a的內切葡聚糖酶的pH和溫度分布圖的確定在下列條件下測定pH的分布圖通過把0.1MTri-碑酸鈉與0.1M檸檬酸混合製備pH值在2.5-10.0之間的緩衝液。稀釋純化的內切葡聚糖酶以便確保測tl應在測定的線性範圍內。底物是O.4%AZCL-HE-纖維素(MegaZyme)的懸液，其以1:1和檸檬酸/磷酸鹽緩衝液混合，使最終的底物濃度為0.2%AZCL-HE-纖維素。向Eppendorf⑧1.5ml聚丙蜂管中的1ral底物加入10^1酵溶液，並在Eppendorf⑧控溫熱混合儀(Thermomixer)中培養15分鐘，然後將蘇在另一熱混合儀中95X:下熱滅活20分鐘離心，並將200^1的各上清液轉移到96孔微量滴定板的各個孔中，通過ELISA讀數—儀(LabsysterasMulUskanMCC/340)在620nra測量0D。最適pH的培養溫度是30t:.對於每個pK值，三個管中都加入了餘並在熱滅活之前培養，而一個管(空白)加入酶並立即熱滅活。計算了三個培^#品的平均值，並減去空白值。測定了下列pH下分布:tableseeoriginaldocumentpage89可以看出內切葡聚糖Slr在pH4.0和8.0之間有60%以上的活性，最佳活'棘pH5.0-6.0溫度分布在pH5.5下以相同的方式確定最佳溫度。溫度範圍從30x:到sox:。對於每種溫度，進行三個培養，並計算平均值。通過酶的即刻熱滅活產生三個空白，並從培養的樣品值減去空白的平均值。可以看出內切葡聚糖酶在50-7ox:時具有最佳活性。tableseeoriginaldocumentpage90E.以毀絲黴屬纖維素酶(SEQIDNO.1)除去表面纖絲和從含有纖維素纖維的織物中突出的纖維為指標測量其對顏色的淨化儀器Terg-0-tometer液體體積100ml樣伴150次/分鐘的垂直攪拌器衝洗時間自來水5分鐘洗滌溫度40X:洗滌液體0.05M褲酸鹽緩衝液pH:7.0洗滌時間30分鐘重複2次酶毀絲黴屬SEQIDNO.IB劑量500和2500S-CEVU/1織物2塊舊的黑色100%棉布樣品，5x6cm(0.9克)乾燥滾動千燥評價由DatacolorE1repho反射分光光度計測量it^射(Remission)。將反射值計算威AL(Hanter實驗室值)當纖維素酶除去表面纖絲和從紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑，並得到更低的L值。將所說的樣品和對照樣品(即沒有酶洗塗的樣品)比較沒有纖維素酶500ECU/12500ECU/10.00-1.41-1.91△L值和對照樣品比較.所得的數據顯示在試驗的條件下，沒有CBD的毀絲黴屬纖維素酶給出很好的顏色澄清作用.F.yl(FCe//0/7/7f/70r，30秒鐘，50C;1分鐘，72X:)，並以72C4分鐘結束。反應C以(2分鐘，94t:;1分鐘，52X:;和2分鐘，72X:)開始，之後是15個循環(30秒鐘，94TC;30秒鐘，52r;90秒鐘，72t:)，並以72'C4分鐘結束。如上面所述，將這兩個構建體轉化到米麴黴中。G.克隆的帶有纖維素結合域的纖維素酶的純化和性質分析發酵後，從生產菌的胞外液分離回收克隆產物。然後，在含pH7.5的卩0raM碑酸鈉的漿液中使用150克的微晶纖維素，通過親合層析高度純化大約1克的纖維素酶。將所i兌的微晶纖維素與M約1克纖維素酶的粗發酵液混合。在4t:下混合20分鐘後，將所說的徵晶纖維素酶^大小為50x200讓的總體積將柱用200ral緩衝液洗滌，然後在相同的緩衝液中以0.5MNaCl洗滌直到不再有蛋白質洗脫液。然後以500mt20咖的Tris(pH8.5)洗滌.最後以r/。三乙胺(pH11.8)漠脫純化的全長酶。將;5Ufe下來的蘇溶液調至pH8，並利用帶有膜D0WGR61PP(閾值為20kD的聚丙烯)的Amicon室濃縮至每毫升含有5rag以上的蛋白質。純化的纖維素膝t生質分析如下tableseeoriginaldocumentpage93通過SDS-PAGE分析纖維素酶的分子量，並利用Pharmacia的標準LMW蛋白質標記試劑盒計算纖維素酶的分子量。分子量明顯高於編碼胺基酸的組成的分子量，這是因為接頭區是0-糖基化的，結果導致高分子量。使用Pharmacia兩性電解質PAG板(pHl5至9.5)並再使用帶有已知PI的蛋白質的Pharmacia試劑盒確定PI。利用已知吸收率的色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸以胺基酸組成為基礎計算摩爾消光係數。利用羧甲基纖維素作為底物，以0.5pH為間隔在40t:下培養20分鐘並計算還原糖的形成而獲得pH活性分布圖。計算了不同pH下的相對活性，表中包含有超過50%相對活性的間隔點。利用應用生物系統模型W3A測序儀確定了純化的纖維素酶的N-末端。按照製造商的說明操作此蛋白質測序儀.兩個纖維素酶被封阻，這是因為形成致熱穀氨酸鹽的N-末端穀氨酖胺，無法檢測致熱穀氨酸鹽，並且其阻斷了進一步的測序。利用MicroCalc公司的具有連續掃描速率的MC熱量計(calorimeter),並將溫度以每小時90t:的速率從20t:升至90x:,在中性ph(7.o)下進行DSC差示掃描量熱法。產生抗體。利用毀絲黴屬、頂孢黴屬和梭孢殼屬的纖維素酶在兔中產生抗體。將0.1毫克純化的溶解在0.9%NaCl溶液中的纖維素酶在注射前與弗氏佐劑混合。以一周間隔將兔免疫10次通過好^酸銨沉澱(25%飽和>純化免疫球蛋白G組分(IgG)。在水中溶解沉澱，然後對乙酸鈉緩衝液(pH5.0，50mM)(隨去離子水的改變而改變)進4亍徹底透片斤。過濾後，IgG組分由疊氮化鈉(O.01%)穩定。利用瓊脂平板中的免疫擴散，三個纖維素酶都和其同源的抗血清形成單一的免疫沉澱物，在3個克隆的纖維素酶和抗其它兩種纖維素酶產生的抗血清之間沒有見到沉澱。在緩衝液中測量構建體l內切葡聚糖酶(SEQIDNo.2)除去表面纖絲和除去含纖維素纖維的織物中突出的纖維的性能儀器Terg-0-toraeter液體體積100ml攪拌150次/分鐘(rpm)衝^b時間自來水5分鐘、洗滌溫度40匸水^Jl:1raMCaCL洗條液體0.05M磷酸鹽緩衝液pH:7.0洗滌時間30分鐘重複2次織物2塊舊黑色100%棉布樣品，5x6cm乾燥滾動乾燥評價由MacbethColorEye7000反射分光光度計測量光的反射。將反射值計算成AL(Hanter實驗室值)。當由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更亮，並得到更低的L值。結果tableseeoriginaldocumentpage95所得的數據顯示在試驗的條件下，本發明的酶給出很好的顏色澄清度。H-III.在緩衝'液中測定^/"fe/hco7/er/"/c/w/^s的內切葡聚糖酶(SEQIDNo.n)除去表面纖絲和除去含有纖維素纖維的織物中突出的纖維的性能儀器Terg-0-tometer液體體積100ml攪幹150次/分鐘，垂直撹拌衝洗時間自來水5分鐘洗滌溫度40匸洗滌液體Q.05M磷酸鹽緩衝液pH:7.0洗滌時間30分鐘重複2次劑量2.5S-CEVU/ml織物2塊舊黑色100%棉布樣品，5x6cm(0.9克)乾燥滾動乾燥評價由t)atacolorElrepho反射分光光度計測量光的反射。將反射值計算成AL(Hanter實驗室值).當由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑，並得到更低的L值。將此樣品和對照樣品(即沒有酶洗滌的樣品)比較沒有纖維素酶有纖維素酶0.00-0.57.和對照樣品比較的AL反射值。所得的數據顯示在試驗條件下，纖維素酶給出很好的顏色澄清度.H-IV.在高pH高栽洗滌劑中測量克隆的7Z/e/aWa/er/"e^/7s和//"ew卯/"邁m.cbs478.94的纖維素蘇除去表面纖絲和除去含有纖維素纖維的織物中突出的纖維的'汰能儀器rTerg-O-tometer液體體積150ral150次/分鐘，垂直,衝洗時間自來水10分鐘洗滌溫度35r洗滌液體1.Og/l的US型HDG(沸石/蘇打助劑，陰離子/非離子重量比〉2.5)pH:10.0i^A:1.0mMCaCh0.34mMMgCl洗滌時間12分鐘重複6次織物2塊舊黑色棉布樣品，5x6ctn(約150g/m')2塊深色4十織棉布樣品，5x6cm(約600g/m2)乾燥滾動乾燥評徐由DatacolorElrepho反射分光光度計測量光的反射'將反射值計算成AL(Hanter實驗室銜'當由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑和更好，並得到更低的L值。分別試驗了777/e/a"srer薦"/:(SEQIDNO:9)和/fc簡謝.鵬s/.CBS478.94(SEQIDNO:5)的克隆纖維素酶的不同劑量(分別稱為A和B)。結果:tableseeoriginaldocumentpage97所得的數據顯示在試驗條件下，兩種纖維素酶都給出很好的顏色澄清度。H-V.測量從77/.e/a"a"/ve"r/:和"/e細/w/BCBS478.94以及構建體1(SEQIDNo.2)克隆的纖維素酶除去表面纖絲和除去含纖維素纖維的織物中突出的纖維的性能儀器Terg-O-toraeter液體體積150ml挽拌15Q次/分鐘，垂直,衝洗時間自來水10分鐘洗滌溫度35Ci^A:1.0mMCaCL0.34mMMgCl洗滌液體2.Og/1的HDL(中性，檸檬酸助劑HDL,非離子/陰離子重量比>0.5)pH:7.0洗滌時間30分鐘重複2次織物2塊舊黑色棉布樣品，5x6cm(約150g/m2)2塊深色4f織棉布樣品，4x7cra(約600g/m2)乾燥滾動乾燥評價由DatacolorElrepho反射分光光度計測量光的反射。將反射值計算成AL(CIE實驗室值)。當由纖維素酶除去表面纖絲和除去紗中突出的纖維時，黑色織物的表面看起來更黑和更好，並得到更低的L值。分別試驗了7T/e/ar/afe/"/"e^f/7s(SEQIDNO:9)和Jcre/70/2/i//77CBS478.94(SEQIDNO:5)及構建體1(SEQIDNO:2)的克隆纖維素酶的不同劑量(分別稱為A和B及C)。結果tableseeoriginaldocumentpage98所得的數據顯示在試驗條件下，所有的纖維素酶都給出很好的顏色澄清度L.應用T7/e/ay/aferresfr/s和/lcre/wo/7/〃/T7s/.及構建體1(SEQiDNO.2)的內切葡聚糖酶對斜紋粗棉布修整實驗儀器洗滌機WascatorFL120液體體積2Q升織物1.1kg在+汰粗棉布織物，14.50Z100%棉布脫漿10分鐘，55X:，pH750mlAquazyme120L2.5g/l磷酸鹽緩衝液磨蝕2小時；pH和溫度根據下表變化:tableseeoriginaldocumentpage99滅活15分鐘，80匸lg/1碳酸鈉衝洗在冷的自來水中，三個衝洗循環，各5分鐘評價利用Texflash2000作為磨蝕水平的測量手段，在420nm下測定織物的反射。用本發明的不同內切葡聚糖酶處理斜^棉布織物，結果列於下表:tableseeoriginaldocumentpage99tableseeoriginaldocumentpage100在斜紋粗棉布實驗中，所有試驗纖維素酶都顯示極好的性能，儘管每一種酶有其自身的作用方式。當在斜紋粗棉布實驗中應用SEQIDNO:2的酶時，可能達到較高的磨蝕水平，同時強度損失很小。當使用SEQLDNO:9的酶處理斜紋粗棉布時，可以達到非常高的洗褪故果，幾乎使織物達到漂白的外觀。當使用SEQIDNO:5的酶進行斜紋粗棉布實驗時，在較低的最佳溫度下，能達到很高的磨蝕水平，這^1得可能減少加熱並節約能源J./4cre/776>/7/〃/77禾口777/e/<3K/莫，利用Wascator完成測定。處理時間是wascator中55r，60分鐘；LOM中60-90分鐘。緩沖液為2g/l的乙酸鈉(用醋酸調整pH至5)。織物和液體的比率是l:10,但是在Uunder-0-meter中，4吏用了20個直徑Mrara的鋼球(每個11克)，以獲得足夠的;W^蝕效果。生物拋光後，立即在2g/1的碳酸鈉中80t:下進行滅活15分鐘，之後用冷水衝洗。利用從1到5的絨毛分值評價所得的結果，其中1代^始材料的纖絲的外觀，5禮表高質量的外觀，其表面上沒有可見的纖維。既然內切纖維素酶是特別針對表面處理的，重量的損失低於2%，因此此項不包括在評價的指標中。評價了兩種纖維素蘇/^廠eww7/卿m.(seq[DNO.5)和7T/e/a^3M廠廠es"",IDNO.9)的克隆纖維素酶.兩種纖維素餘對Tencel及Tencel混合的織物都能去纖絲。利用本發明的內切葡聚糖酶，除去的只是很小的纖絲，而當利用木黴屬的酸'〖生纖維素酶混合物時，除去的是整個纖維。因此，利用本發明的內切葡聚糖酶時，被處理織物的強度損失保持在最小水平。下列劑量給出了良好的去纖絲作用，即絨毛分值為4或者以上每克織物15s-cevu的/^/"e歷朋/〃/t7m.纖維素醉(seqldN0:5);和每克織物10S-CEVU的77e/a〃a纖維素酶(SEQIDNO:9)。實施例2通過表達克隆以及通過PCR克隆檢測由植物病原體產生的新的溶纖臶，這種植物病原體從大豆種子中分離出來，並鑑定為船c/y/7力oy7/z7a產生供PCR的生物量和表達克隆的方法使CBS281.96的分離物在振蕩燒瓶培養器中在富含纖維素馬鈴薯右旋糖培養液中生長，，在26X:下培養5天(振蕩條件150rpm)。A.船cro//7cw/'/7ap/ase<9///a的內切葡聚糖絳的克^r^表達從船cro/j/cw/朋；/aseo〃/7a分離mRtU,這種病原體生長在包含纖維素的發酵培養基中，挽拌以確保通氣良好。在生長3-5天之後收穫菌絲，立即在液氮中冷凍，並保存在-80C。按所述方法，用1%的載體背景在大腸桿菌中構建約cr"力o/w/朋/7/m化o7/朋的含有大約10'單個克隆的文庫。用一些庫的質粒DNA轉化酵母，並從每一個庫中獲得包含250-400個酵母菌落的50-100個平板。鑑定內切葡聚糖酶陽')"生菌落，並通過AZCLHE纖維素測定方法在SC瓊脂平板上分離.從酵母菌落上直接擴增cDNA插入物，並如上面的材料和方法部分的描iiii行其性質分析。SEQIDNO:10中顯示了編碼內切葡聚糖蘇的cDNA的DNA序列，SEQIDNO:11中顯示了相應的^^酸序列。從DSM10512質粒中能夠獲得該cDNA。從酵母菌落分離總DM，並通過轉化如上述的大腸桿菌救援質粒DNA。為了在麴黴屬中表達所說的內切葡聚糖酶，用適當的限制酶消化所說的DNA，在M上對各個片斷進行分級分離，將相應於內切葡聚糖酶基因的片段純化。將得到的基因連接到用適當的限制酶消化的pHD414上，結果形成質粒pA2C477。在大腸桿菌中進行DNA擴增之後，用所說的質粒轉化上述的米麴黴.通過雜交篩選cDNA文庫和陽性克隆的特徵分析利用隨機引物標記的/^<3杧0//加的PCR產物作為雜交探針篩選大腸軒菌中的/Vacn/7々o/77/"a/7/aseo//〃3cl)NA文庫的大糹勺6000克l^^成單位(c.f.u.)。如材料和方法部分中的描述產生PCR產物通過對cDNA4垂入物末端進行測序和通過確定兩條鏈中最長的cDNA的核芬^f列而確定陽性cDNA克隆。SEQIDNO:10顯示了編碼內切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO:11顯示了相應的^^^列，B./^c/7/7A0/n/;2ap/73seo/z'加的內切葡聚糖酵和〃w/w/co/a//2s0/e"s的43kD內切葡聚糖酶基因融M的構建製備一種構建體的目的是製造尨^<3"0//朋的內切葡聚糖酶的+汴生物，這種衍生物具有〃./ywo7e/:(在W091/17243中公開)的43kD內切葡聚糖餘的接頭和CBD。"/^"eo//^的天然內切葡聚糖蘇沒有接頭和/或纖維素結合域CBD。此構建體由/7/<^//加的內切葡聚糖蘇(223個胺基酸)和〃./"so/e/^的43kD內切葡聚糖酶的72個C-末端^^酸組成。將〃.//7M/e/^的43ld)內切葡聚糖酶的cDNA以此內切葡聚糖酶基因從Taka-啟動子轉錄的方式克隆到pHD414中形成的質粒命名為pCaHj418。將編碼#-p力3化o〃朋的內切葡聚糖酶的cDNA作為BstXI/NotI片段克隆到pYES2.0中，形成的質粒命名為pClC477。引物引物1:5'-GGTCGCCCGGACTGGCTGTTCCCGTACCCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGG-3'引物2:5'-CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGGGTACGGGAACAGCCAGTCCGGGCGACC-3'pYES2.0F.HT引物5'—CGGACTACTAGCAGCTGTAATACG-3'AMG-term.引物5'-CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3'通過如Higuchi等(1988)描述的PCR重疊延伸方法構建內切葡聚糖酶融合體。反應A:利用聚合SI^反應(PCR)擴增引物1和AMG-term.引物之間的pCaHj418的片段(〃.//7M/e^的43kD內切葡聚糖酶的接頭與CBD部分)。反應B:pYES2.0F.HT引物和引物2之間的pClC477的片段(#./7力3"0//朋的內切葡聚糖酶基因)的？01(擴增。反應C:在整個側翼區引物(即pYES2.0F.HT引物和AMG-term.引物)存在的情況下，在第三個PCR中利用前面的兩個純化的片段。純化反應C中擴增的片段，以限制酶XbaI和BamHI消化。將純化的消化片段連接在以限制酶XbaI和BaraHI消化的pHD414上。用連接的質粒轉化大腸桿菌菌抹DH5aF'(新英格蘭生物實驗室)的感受態細胞，並分離包含基因融合本的菌落.通過DNA測序驗伍克隆部分的序列'在如Perkin-Elraer推薦的標準^H^下進行聚合Sl^^應。反應A和B以94X:2分鐘開始，之後是20個循環(30秒鐘,94TC;30秒鐘，52C;1分鐘，72X:)，並以72X:4分鐘結束。反應C以(2分鐘，94X:;l分鐘，52X:;和2分鐘，72C)開始，之後是20個循環(30秒鐘，94X:;30秒鐘，，52C;90秒鐘，72X:),並以72r4分鐘結束。如上面所述，將#建體轉化到米麴黴中。實施例3//"e銜//咖和糞生糞殼的內切葡聚糖酶的克l^表達。表達克隆的生物量的產生方法使CBS478.94的分離物和ATCC52644分別在振蕩燒瓶培養器中在富含纖維素的馬鈴薯右旋糖培養液中生長，在26X:下培養5天(振蕩條件150rpm).分別從/fc/"e/ffo/2/wzw.CBS478.94和糞生糞殼ATCC52644中分離mRNA，這兩種生物體生長在包含纖維素的發酵培養基中,挽拌以確保通氣良好.在生長3-5天之後收穫菌絲，立即在液氮中冷凍，並保存在-80"C。如上所述，用1%的栽體背景在大腸桿菌中分別構建/(C/"e/^/7/z7/T7m.cbs478.94和糞生糞殼ATCC52644(每個含有大約106單個克隆)的文庫。用每一個文庫中一些集合質粒DNA轉化酵母，並從每一個集合中獲得包含250-400個酵母菌落的50-100個平板。鑑定內切葡聚糖酶陽性菌落，並通過AZCLHE纖維素測定方法在SC瓊脂平板上分離。從酵母菌落上直接擴增cDNA插入物，並如上面的材料和方法部分的描述進行其性質分析。SEQIDN0:6中顯示了編碼//cre/ra/7/〃/z7的內切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO:7中顯示了相應的^^l亭列。從DSM10080的質粒中能夠獲得此cDNA。SEQIDNO:19中顯示了編碼糞生糞殼的內切葡聚糖酶之cDNA的部分DNA序列(cDNA的5'末端的核普^列)，SEQIDNO:20顯示了相應的胺基酸序列.從DSM10576的質粒中能夠獲得此cDNA.從酵母菌落分離總DNA，並通過轉化如上述的大腸桿菌^L援質粒DNAu為了在麴黴屬中表達所說的內切葡聚糖酶，用適當的限制酶消化所說的dna,在^M上對各個片斷進行分級分離，將分別相應於^cre/z70/7/鵬和糞生糞殼的內切葡聚糖酴基因的片段純化。將得到的基因連接到用適當的限制酶消化的pHD414上，結果分別形成質粒pA2C371和pA2C502。在大腸桿菌中進行DNA擴增之後，用所i兌的質粒轉化上述的米麴黴。實施例4a.由pcr克隆^//3/戶6//"sca6e//aCBS280.96的內切葡聚糖酶使CBS280.96的分離物在靜態的燒瓶培養器中含小^J良的培養基(每燒瓶300g小M添加"0ml的鹽溶紀上生長，其中，在26C下培養6天。培養後，以蒸鎦水抽提小:^(每燒瓶300ni1)，並在l。/。瓊脂糖(LUex瓊脂糖Medinova)中檢驗提取物的內切葡聚糖酶活性(0.rMza-HE-纖維素(megazyrae))。在pH為3.0,7.0和9.5的平板上現察活性。從如上所述生長的CW"//^///中分離mRNA。在生長3-5天之後收穫菌絲，立即在液氮中冷凍，並保存在-80t:。如上所述，用l%栽體背景，在大腸桿菌中構建&//7//^///1"4^//3(每個含有大約106單個克隆)的文庫，利用隨機引物"P-標記的C.sca/e/A3的PCR產物作為雜交探針，篩選大腸扦菌中的6V/V2//7e〃/ssca6e//3cDNA文庫的大約10000克隆形成單位(c.f.u.)。如材料和方法部分中的描述產生PCR產物.通過對cDNA插入物末端進行測序和通過確定兩務逸中最長的cDNA的核芬l宇列而確定陽性cDNA克隆。SEQIDN0:12顯示了編碼內切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDN0:13顯示了相應的M^列。可以從DSM10511中的質粒獲得此cDNA。從酵母菌落分離總DNA,並通過轉化如上述的大腸桿菌救援質粒DNA。為了在麴黴屬中表達所說的內切葡聚糖酶，用適當的限制皭消化所說的DNA，在g上對各個片段進行分級分離，將分別相應於所說的內切葡聚糖酶基因的片段純化。接下來將得到的基因連接到用適當的限制酶消化的pHD414上，結果形成質粒pA2C475。在大腸桿菌中進行DNA擴增之後，用所說的質粒轉化上述的米麴黴。Cr//7//7e///ssca6e//3的內切葡聚糖酵和〃w/27/co/a//75ro/e/JS/'/7so/e/2s的43kDa的內切葡聚糖酶的接頭/CBD區的基因融^的構建Cr//7/pe//"sc^e/"的天然內切葡聚糖酶既沒有接頭也沒有纖維素結合域(CBD)。此外，全長cDNA在編碼內切葡聚糖酶的開放讀框(ORF)的上遊包含ATG起始密碼子，這可能導玫基於異源cDNA表達的混雜翻譯的起始，如在酵母(哞酒酵母)和絲狀真菌(米麴黴)中。這樣，利用通過重疊延伸的剪接(S0E)已經構建了Cr/7/'/7e//2、sc^e/h的內切葡聚糖酶和〃咖/co/a//m/e/w的43kD的內切葡聚糖蘇的接頭/CBD區(在WO91/17243中公開)的兩個基因融合體(Horton等，1989)。構建體1由編碼C"<3&//<3的內切葡聚糖酶的226個殘基的cDNA組成，此cDNA通過PCR與〃.//^o/e/7S的編碼位於〃.//jso/e/^43kD內切葡聚糖酶的COOH-末端的接頭和CBD區(72個#^紛的cDNA的3'-末端連接。第二個雜交構建體和前迷的基因構建體相同，只是通過PCR缺失了推定的信號肽的前5'個殘l結果使信號肽變短，此信號M第二個框內起始密碼子開始。質粒枸建體質粒pClC475包含C"a6e//3的全長cDNA，將其克隆到BstXI/NoU-切口酵母表達栽體pYES2.0中；質粒pClC144包含〃.//w/e/^的全長cDNA,將其克隆到pYES2.O的BstXi位點上。經重疊延伸的剪接利用50-100ng的pClC475為衝莫板，各300-350pmol的正向引物(正向引物l:5'-CCCCAAGCTTGACTTGGAACCAATGGTCCATCC-3';正向引物2:5'二CCCCAAGCTTCCATCCAAACATGCTTAAAACGCTCG-3')，250pmol的反向引物DNA熱循環儀(Landgraf，德國)和2.5單位的Taq聚合每(Perkin-Eimer，Cetus，USA)，在PCR緩沖液(IOmMTris-HC1，pH8.3;50mMKC1;1.5mMMgCL;0.01%明膠；包含每種dNTP200pM)中產生編碼C"We//<3的內切葡聚糖酶的核心區的兩個PCR片段。利用循環方式(94匸變性l分鐘；55匸退火2分鐘；72t:延伸3分鐘)進行三十個PCR循環。利用100ng的pClC144作為模板，250praol的正向引物(5'-CACTAATATCTCGGGC-TGTGTTCGTAAACCCTCCAGCAGCACCA-GCTCTCCGGTC-3'),250pmol的pYES2.0反向引物(5'-GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATA-3')，DNA熱循環儀(Landgraf，德國)和2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，USA)，在PCR緩衝液(10mMTris—HC1，pH8.3;50raMKC1;1.5mMMgCL;0.01%明膠；包含每種dNTP200(nM)中產生編碼〃.//wo/e/w的內切葡聚糖酶的接頭和CBD的PCR片段。如上文進行三十個PCR循環。將PCR產物在O.7%低膠凝溫度的瓊脂糖凝皎(SeaPlaque，FMC)中進行電泳，從凝皎中切割目的片段，並按照製造商的說明通過瓊脂糖酶(新英格蘭生物實驗室，美國)處理，之後是笨酚抽提和在-20n下通itira入2體積的96%EtOH和0.1體積的3MNaAc乙醇沉澱12小時回收目的片段。通it^兩種組合的PCR緩衝液(10niMTris-HCl，pH8.3;50raMKC1;1.5mMMgCL;0.01%明膠；包含每種dNTP200nM)中組合上述的重疊PCR片段(每個模板約50ng)產生6W/7/'/e〃""a6e〃a的內切葡聚糖酶和〃〃/z//"/a//wo/ey的43kD的內切葡聚糖酶的接頭/CBD區的重組雜合基因。利用DNA熱循環儀(Landgraf,德國)和2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，USA)進行SOE反應。利用循環方式(94C變性l分鐘；55C退火2分鐘；72。C延伸3分鐘)進行二個PCR循環，終止反應，向反應混合物中加入各末端引物(正向引物l:5'-CCCCAAGCTTGACTTGGAACCAATGGTCCATCC-3';正向引物2:5'-CCCCAAGCTTCCATCCAAACATGCTTAAAACGCTCG-3';反向引物5'-GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATA-3')，利用循環方式(94X:變寸生1分鐘；55匸退火2分鐘；72t:延伸3分鐘)進行另外三十個PCR循環。用於米麴黴中異源表達的表達盒的構建將PCR產生的重組片段在0.7。/。低膠凝溫度的瓊脂糖^m(SeaPlaque，FMC)中進行電泳，從凝膠中切割目的片段，並按照製造商的說明通過瓊脂糖酶(新英格蘭生物實驗室，美國)處理，之後是笨酚抽提和在-20C下乙醇沉澱12小時回收目的片段。以HindIII和XbaI進行DNA片段消化，將DNA片段連接在^'/7^n//^/-切割的pHD414栽體上，之後按照製造商的說明將構建體電穿孔到大腸桿菌DH10B細胞(生命技術，美國)中。如材料和方法部分所描述的，從兩務逸測定形成的基因融合體的核苷酸序列，SEQIDN0:14A和15A。如所描述的，這些構建體可以轉4匕米麴黴。實施例5從46個絲狀真菌和單軸真菌(raonocentricfungi)中用PCR;J^測所il的溶纖酶類型，這些真菌代表23個科的32個屬，屬於7個綱的15個目，總而言之包括真菌的所有4個組子嚢真菌、擔子真菌、壺真菌和M真菌5.1材料1.棉色二孢菌抹的保藏，保藏號CBS274.962.〃/05770,a(b//^r3/z//(Hawksw等)Hawksw等菌抹的保藏號NKBC1444，4.AscobolusstictoideusSpeg.菌抹的保藏號Q026(NovoNordisk保藏中心)分離自鵝糞，Svalbard，挪威5.5"acco辦o/ws^///t^e//:^f,〃cDi^cc.菌抹的保藏保藏號CBS275.966.爽孢青黴,e//w7e/物種的保藏號ATCC623967.產黃青黴r/KW菌抹的保藏號ATCC94808.77e廠/77cwycesve/"/"wcc^w5"Pugh等菌抹的保藏保藏號CBS285.969.鹿角團炭角菌厶e"/w/7/e菌抹的保藏保藏號CBS284.9610.點孔座殼exZJF/.參見A.Munk:丹麥/yre"卿'c"es，DanskBotaniskArkiw，Vo117，1195711.AWw//s/orw/7sp分離自在中國雲南省昆明植物園中生長的山茶的葉片(茶科,Guttiferales)分離自海上樣品，Bahamas13.蛇形鐮孢57er6a^/r菌抹的保藏號IFO446714.早熟禾鐮孢recUlTr.物種的保藏號ATCC6088315.腐皮鐮孢^3".,&cc.S/i/f/《〃a/s.菌抹的保藏號IMI107.51116.番茄尖鐮孢"3cC5V7/d.《〃a/7s.菌抹的保藏號CBS645.7817.尖銀抱A35"5V7V0/^菌抹的保藏號CBS744.7918.鏈孢粘帚黴C/7/啦/》J^w〃菌抹的保藏號ATCC1052319./VeC/a/7//e<2Z//7g/e/菌株的保藏，保藏號CBS279.9620.大孢糞殼勿e"附/f/物種的保藏號AT(X6025521.灰腐質黴TVaee/物種的保藏號ATCC2272622.黑腐質黴o/T/r/l菌抹的保藏號CBS819.73菌抹的保藏號ATCC2808524.777/e/ai//s//7e廠/770/7力//3,e/"^AS157/7^e/7(另寸名6'0/777ascw菌抹的保藏號CBS174.70，IMI145.13625.67<30^/"/"力//7〃/77廠oecw/K//51517/77〃/7/5"acca/YZoef/f/a廠C力3/物種的保藏號ATCC6237326.5y^/7as/^/W3^/7/'/e/75751菌抹的保藏號NKBC1515(曰本大學，profeTubaki保藏中心)27.管毛殼/^"e/菌株的保藏號CBS799.8328.巴西毛殼勘〃^ae/1屍o"a/菌抹的保藏號CBS122.6529.牆毛殼Co油菌抹的保藏號CBS163.5230.C力aefo/77/."/77F/rescey^M^gafra菌抹的保藏號CBS547.7531.A7^n57ora577菌抹的保藏保藏號CBS272.9632./V/^rc^/7ora57分離自33.Z/a/70"/esy"ge/7es/a菌抹的保藏保藏號CBS278.9634.葫蘆科刺盤孢^3wer/'/7/^7〃sW〃a/We^另'j名圍小叢殼Ksr0/"6/c〃/a/"e/e/h'/751efff7/7sfead物種的保藏號ATCC5260935.黑膠耳Fr.菌抹的保藏保藏號CBS277.9636.;KJ峰層孔菌"J/7/".菌株的保藏保藏CBS276.9637.綿皮孔菌屬(？)菌抹的保藏號CBS283.9638.糹沐囊壼菌WeSs/y》粉/^/^、c/e/"菌抹的保藏保藏號CBS282.9639.Z力/zcv77wcor/^y/7/w51(X//7flr/"y)5Ic///jioer別名微小毛黴菌抹的保藏號IFO457840.閃光須黴"朋zeM/77Ye《力e/z7》厶e船/w/e/"菌抹的保藏號IFO481441弗雷生刺枝黴,77e*/77《AeM緒'er菌抹的保藏號NRRL230542.粉紅單端孢菌抹的保藏號IFO537243.6b/]/of/ec/咖^nctop力/fe分離自中國雲南省昆明的鮮恭法物的葉片44.菌抹的保藏物保藏號CBS271.96Coelomycete，分離自牙買加Christiana的ArtocarpusaltUis的葉片(桑科，lirticales)45.菌抹的保藏物保藏號CBS273.96Coeloraycete，分離自牙買加ii4i斯山的Pimentadioica(杉^|^良考+，Myrtales)的葉片46.菌抹的保藏號CBS270.96Coeloraycete,分離自生長在牙買加達拉斯山的Pseudocaly咖aal1iaceura(Bignoniaceae，Solanaies)的葉片5.2方法菌抹的保持和生物量的產生將菌抹保持在培養i(9cra)中的瓊脂或斜面上(參見培養基表PCA和PDA)。在以下生長條件之下在樣瓶中培養44種菌沐如PC、PD和PB9或YPG的普通培養基(參見培養基表)；培養時間3至9天；溫度26t:;rpm在175-150之間。使14號菌抹(,.聲5e)在小麥麩上生長15天(26X:;靜態)。使38號菌抹在加有1cm'高壓滅菌濾紙片的稀釋的鹽溶液(DS/2)中生長。活性試驗在由"/o瓊月旨糖(HSB，Litex瓊月旨糖，Medinova)製成的0.1。MZCL-HE-纖維素(Megazyrae)平板(14cm培養皿)上試驗活性。所有試驗均以3份進行，即將AZCL-HE-纖維素溶解在三種緩衝液中，調節至pH3,7或9.5(使用各種比例的以下兩種組分一水檸檬酸單水合物，Merck產品號100244(21.0g)，溶解在水中，使總體積為1000亳升；0.1Mdodecabrohydrate三鈉，Merck產品號6578(38g)，溶解在水中，{吏總體積為1000毫升。在臨用前混合。收穫生物量通過過濾(根據真菌的生長調節濾器網眼，最細的用於具有高度孢子形成菌絲體的真菌，例如/^^/7咖j/^.)收穫生物量。將在濾器上的生物量刮至無菌塑膠袋中，並立即冷凍(掩沒到液氮中)。5.3結果I.使用材料和方法中描述的PCR篩選與擴增技術，獲得了下列部分cDNA序列Acco6o/wsG^7"e〃M的cD&cc.CBS275.96:SEQIDNO:21(和在SEQIDNO:22中的推定的M^列)；T7e，/Z7,c"rer藩歸sCBS285.96:SEQIDNO:23(和在SEQIDNO:24中的推定的#^#列)；鹿角團炭角菌CBS284,96:S印IDNO:25(和在SEQIDNO:26中的推定的a^列)；番茄尖鐮孢CBS645.78:SEQIDNO:27(和在SEQIDNO:28中的推定的M睃字列)；〃ec"/'aCBS279.96:SEQIDNO:29(和在SEQIDNO:30中的推定的^*列)；灰腐質黴ATCC22726:SEQIDNO:31(和在SEQIDNO:32中的推定黑腐質黴CBS819.73:SEQIDNO:33(和在SEQIDNO:34中的推定C/a^/o/vV7//〃y77廠oecw/7o7ss/'/7〃/77ATCC62373:SEQIDNO:35(和在SEQmNO:36中的推定的M^宇列)；S"/7a^c^/7orato/7i."e/w/jNKBC1515:SEQIDNO:37(和在SEQIDNO:38中的推定的#^酸序列)；/V/>rosporasp.CBS272.96:SEQIDNO:39(和在SEQIDNO:40中的推定的g^列)；弗雷生刺枝黴SEQIDNO:41(和在SEQIDNO:42中的推定的^tJ^黑膠耳CBS277.96:SEQIDNO:43(和在SEQIDNO:44中的推定Co/7/oMec/"/z7:SEQIDNO:45(和在SEQIDNO:46中的推定的絲餅列)；保藏物CBS271.96:SEQIDNO:47(和在SEQIDNO:48中的推定的狄耕列)；保藏物CBS270.96:SEQIDNO:49(和在SEQIDNO:50中的推定的棉色二孢CBS274.96:SEQIDNO:51(和在SEQIDNO:52中的推"7g環/7訓C1444:SEQIDNO:53(和在SEQIDNO:54中的推定的Ml亭列)；疾孢青黴ATCC62396:S印IDNO:55(和在SBQIDNO:56中的推點孔座殼SEQIDNO:57(和在SEQIDNO:58中的推定的^J^^列)；蛇形鐮孢，IFO4467:SEQIDNO:59(和在SEQIDNO:60中的推定77/e/3r/a/77e/77W//7/7aCBS174.70:SEQIDNO:61(和在S印IDNO:62中的推定的^^f列)；管毛殼CBS799.83:SEQIDNO:63(和在SEQIDNO:64中的推定f/ae/o/7/〃/7K/7"esce/s:SEQIDNO:65(和在SEQIDNO:66中的j扭葫蘆孝+刺盤"fe:SEQIDNO:67(和在SEQIDNO:68中的推定的^^餅列)；閃光須黴SEQIDNO:69(和在SEQIDNO:70中的推定的#^*列)；和粉紅單端孢SEQIDNO:71(和在SEQIDNO:72中的推定的4J^酸序列)。II.《吏用材料和方法中描迷的PCR篩選與擴增技術，獲得了部分編碼本發明的酶的部分cDNA序列，按照布達佩斯條約保藏了質粒大腸桿菌，DSM10583，保藏日1996年3月13日；來源於粉紅單端孢的cDNA;大腸桿菌，DSM10584，保藏曰1996年3月13曰；來^f、於S/s/Msfc^para//7e/7〃/、的cDNA;大腸桿菌，DSM10585，保藏日1996年3月13日；來源於(7力ea"/77/〃/z7/wmrw/z7的cDNA;大腸桿菌，DSM10587，保藏日1996年3月13日；來源於糞生糞殼的cDNA;大腸桿菌，DSM10588，保藏日1996年3月13曰；來源於未筌別的菌抹CBS273.96的cDNA;大腸桿菌，DSM10586，保藏曰1996年3月13曰；來源於5"po/^7pe"/ss/7的c隨。粗上清液的顏色澄清作用在正常的洗滌期間，織物常常褪色。然而，如果織物用<^色澄清的纖維素酶洗滌，則織物的外觀得到改善，原來的顏色得到更好地保持或保留.—t、^T4*沾志A沐Mirr沐W清作用,裝置液體體積梭拌衝洗時間洗滌溫度洗滌液pH洗滌時間重複酶劑量織物乾燥Terg-o-toraeter100毫升用垂直攪拌器150次/分鐘在自來水中5分鐘40x:0.05M蜂酸鹽緩衝液7.030分鐘2次以下所示菌抹的粗上清液200,500,1000或2500S-CEVU/1的兩種劑量2塊舊黑100%棉布，5x6cm(O.9克)滾動乾燥評價經DatacotorElrepho反射分光光度測量v^射。以AL(Hunter實驗值)計算反射。當從紗突出的表面纖絲和纖維被纖維素酶除去時，黑色的織物的表面顯得更黑，獲得更低的L值。將樣品與一種對照樣品(即不用酶洗滌)比較。以下顯示了與對照樣品比較的ALR反射值'ECU/1菌抹2005002,250Q13.蛇形鐮孢n.t.-O.71n.t.-l.2815.腐皮鐮孢n.t.-0.96n.t.-l.3724.7"力/</3廠/<3/"/e/77(9/7力//<-O.30n.t.-1.25n.t.25.n.t-l.79n.t.-2.1837.SpongipeLiisn.t.一l.Oln.t.-1.6339.///zo則corn丄-1.90n丄-2.6641.弗雷生刺枝黴n.t.-0.17n.t.-1.3345.保藏號CBS273.96n.t.-1.31n.t.-1.20數據表明，在試驗條件下，所有菌株都給出良好的澄清作用(n.t.=在這一劑量下未試驗)。序列表(l)一般信息(n申請人(A)姓名NovoNordiskA/S(B)街il:NovaAUe(C)城巿DK-2880Bagsvaerd(E)國家.'丹麥(F)郵區代碼(ZIP):DK-2880(G)電話+4544448888Ol)傳真+4544493256(ii)發明名稱新的內切葡聚糖酶(iii)序列數72(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算杌[BM-PC兼g^JL(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.0,IJ(EPO)(2)SEQIDNO:1A的4言息(i)序列特徵(A)長度891個g對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(vi)原始來源(A)生物體哞酒糖酵母(B)菌椒瞎9770(xi)序列描迷:SEQIDNO:1A:AAAGAAAGGCTCTCTGCTGTCGTCGCTCTCGTCGCTCTCGTCGGCATCCTCCATCCGTCC60GCCTTTGATAACCCGCTCCCCGACTCAGTCAAGACGACGCATACTTGGCACCATGCATCT120CTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGGACCAGCTCTCGGGCAT180CGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTCJCAlAGCCGAGCTGCGCCTGGCCCGGCAAGGG240CCCCTCGTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGACGGCGGCTC300CACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAGAGCCCCTG360GGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGCAGCTCCGA420GTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTCGCGGGCAA480GAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCACTTTGACCT540GGCCATCCCC-GGTGGCGGTGTCGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTACGGCGCTCC600CCCGAACGGCTGGGGCGMICGCTACGGCGGCATCCATTCCAAGGAAGAGTGCGAATCCTT660CCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCAAAACGCCGACAA720CCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTG780CTCCCGTTAAGAGGGAAGAGAGGGGGCTGGAAGGACCGAAAGATTCAACCTCTGCTCCTG840CTGGGGAAGCTCGGGCGCGAGTGTGAAACTGGTGTAAATATTGTGGCACACACAAGCTAC900TACAGTCCGTCTCGCCGTCCGGCTAACTAGCCTTGCTGCGGATCTGTCCAAAAAAAAAAA960(2)SEQIDNO:IB的信息(U序列特徵(A)長度225個氛基酸(B)類型g酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(iU分子類型蛋白質(xi)序列描迷SEQIDNO:IB:MetHi_8LeuSerALaThrThrGlyPheLeuALaLeuProValLeuAla151015LeuAspGinLeuSerGlylieGlyGinThrThrArgTyrTrpAspCys202530CysLysProSerCysAlaTrpProClyLysGlyProSerSerProVal354045GinAlaCysAspLysAsnABpAsnProLeuAsnAspGlyGlySerThr505560AxgSerGlyCysAspAlaGlyGlySerAlaTyrMetCysSerSerGLn65707580SerProTrpAlaValSerAspGluLeuSet:TyrGlyTrpAlaALaVaL859095LysLeuAlaGlySerSerGluSerGinTrpCysCysAlaCysTyrGlu10010511〇LeuThrPheThrSerGlyProValAlaGlyLysLysMetlieValGin115125AlaThrAsnThrGlyGlyAspLeuGlyAspAsnHiePheAspLeuAla13013S140lieProGiyGlyGlyVal5lyliePheAsnALaCysThrAspGinTyr145150155160GlyA"ProProAenGLyTrpGlyAspArgTyrGlyGlyIHisSer16517017SLysGluGluCysGluSerPheProGluAlaLeuLysProGlyCysAsn180185190TrpArgPheAspTrpPheGinAenAlaAspAanProSerVaLThrPhe195200205GinGluValAlaCyBproSerGluLeuThrSerLysSerGlyCysSer210215220225(2)SEQIDNO:2A的孑言息(n序列特徵(A)長度894個g對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體"構建體1"(xi)序列描述SEQIDNO:2A:ATGCATCTCTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGCACCAGCTC60-TCGCGCATCGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTGCAAGCCGAGCTCCGCCTGGCCC120GOCAAGGGCCCCTCG丁CTCCGGTGCAGGCCTGCCACAAGAACCACKACCCGCTCAACGAC180GGCGGCTCCACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGCCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAG240AGCCCCTGGGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGC300AGCTCCGAGTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTC360GCGGGCAAGAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCAC420TTTGACCTGGCCATCCCCGGTGGCGGTGTCGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTAC480GGCGCTCCCCCGAACGGCTGGGGCGACCGCTACGGCGGCATCCATTCCAAGGAAGAGTGC540GAATCCTTCCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCAAAAC600GCCGACAACCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAG660AGCGGCTGCTCCCGTCCCTCCAGCAGCACCTAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACC720AGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGC780TGCACTGCTGACAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGCCTGGAGCGGCTGCACCACCTGC840GTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGTAG894(2)SEQIDNO:2B的信息:(i)序列特徵(A)長度297個M酸(B)類型氣l酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線'汰(ii)分子類型蛋白質(x)序列描述SEQIDNO:2B:MetHisLeuSerALaThrThrGLyPheLeuftAaLeuProVaLLeuMa151015LeuAspGinLeuSerGlylieGlyGinThrThrArgTyrTrpAspCys202530CysLysProSerCyaAlaTrpProGlyLysGlyProSerSerProVal354045GinAlaCyaAapLyaAanAspAanProLeuAsnAspGlyGlySerThr5055-60ArgSerGlyCysAspALaGlyGlySerAlaTyrMet:CysSerSerGin65707S80SerProTrpA"V"SerAspGluLeuSerTyrGLyTrp"aAlaV"LyeLeuALa8SGlySerSerGlu100Ser90GinTrp105CysCysAla95CysTyrGlu110LeuThrPheThrSerGlyProVaiAlaGlyLys乙ysMetlieValGLrUS120125AlaThrAsnThrGlyGlyAspLeuGlyAspAenHisPheAspLeuAla130135140lieProGlyGlyGlyValGlyliePheAsnALaCysThrAspGLnTyr145150155160GiyAlaProProAsnGlyTrpGlyAspArgTyrGlyGly工leHisSer16517017SLysGluGluCysGluSerPheProGiuAlaLeu乙ysProGlyCysAsn180185190TrpArgPheABpTrpPheGinAsnAlaAspAsnProSerValThrPhe200205GinGluVal_AlaCyBProSerGl_uLeuThrSer乙ysSerGlyCysSer21021S220ArgProSerSerSerThrSerSerProVaLAsnGinPro丁hrSerThr22523023S240SerThrThrSerThrSerThrThrSerSerProProValGinProThr2"250255ThrProSerGlyCysThrAlaGLuArgTrpAlaGinCysGlyGiyAsn260265270GlyTrpSerGiyCyBThrThrCysV""aGlySerThrCysThrLys2752B0285lieAanAspTrpTyrHi_aGinCyaLeu290295(2)SEQ[DNO:3A的4言息:(i)序列特徵927個威基對核酸單鏈(A)長度(B)類型(C)鏈型(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(A)生物體"構建體2"(xi)序列描述:SEQIDNO:3A:ATGCATCTCTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGGACCAGCTC60TCCCGCATCGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTGCAAGCCGAGCTGCGCCTGGCCC120CCCAAGGCCCCCTCCTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGAC180GGCGGCTCCACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCOGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAG240AGCCCCTGCGCCG丁CAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGC300AGCTCCGAGTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTC360GCGGGCAAGAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCAC420TTTGACCTGGCCATCCCCGGTGGCGGTG丁CGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTAC480GGCGCTCCCCCGAACGGCTGGGGCGACCGCTACGGCGGCATCCATTCC^AGGAAGAGTGCGAATCCTTCCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCPJVAAC600GCCGACAACCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAG660AGCGGCTGCTCCCGTAACGACGACGGCAA(f，TCCCTGCCGTCCAGATCCCCTCCAGCAGC720ACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCG780AGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGCTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGC840GGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGAT丁900AATGACTGGTKCCATCAGTGCCTGTAG927(2)SEQIDNO:3B的信息(i)序列特徵(A)長度:(B)類型(C)鏈型308個H酸絲酸單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO:3B:MetHisLeuSerAlaThrThrGlyPheLeuAlaLeuProValLeuAli151015LeuABpGinLeuSerGlylieGiyGLnThrThrArgTyrTrpAspCy￡202530CysLysProSerCysAlaTrpProGlyLysGlyProSerSerProVaL354045GinAlaCysAspLysAsnAspAsnProLeuAsnAspGlyGlySerThr505560ArgSerGlyCysAspAlaGlyGlySerALaTyrMetCysSerSerGin65707580SerProTrpALaValSer:ABpGluLeuSerTyrGlyTrpAlaAlaVal859095Ly曰LeuAlaGlySerSerGluSerGinTrpCysCysAlaCysTyrG1l100105110LeuThrPheThrSerGlyProValAlaGlyLysLysMetlieValGlr115120125AlaThrAsnThrGlyGlyAspLeuGLyAspAsnHi^sPheAspLeuALa130135140lieProGLyGlyGLyVaLGLyILePheAsnAiaCysThrAspGin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sAsnAsnGinSerProTrp70"8085GCCGTCAA個GACTTGATCAAT144AlaValAsnAspLeulieAsn90100GGTGGCAAT153GlyGlyAsnGTGTCGTATGGCTTCGCCGCCACAGCGValSerTyrGlyPheAlaAlaThrAla95U)SEQIDNO:44的信息G)序列特徵(A)長度51個氛基酸(B)類型H酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描迷SBQIDNO:44:Ser15GluGlyLysAsnAspAsnProLeuAlaAspPheSerThrLys10CysProGluTrpSerGlyGlySerAlaTyrThrCysAsnAsnGinSer202530AlalieValAsnAsrTAspLeuValSerTyrGlyPheAlaAlaThrAla354045GlyGlyAsn50(2)SEQIDNO:45的信息G)序列特扭(A)長度17i個^fct(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線'汰(H)分子型cDNA(vO原始來源(A)生物體乙b/7/ofAec/w/7(ix)特徵:(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1...171(xi)序列描述:SEQIDNO:45:AGCCGCCCCGTCGGAACCTGCAAGAGGA^ACGACAACCCCCTCTCCGAC48SerArgProValGlyThrCysLysArgAsnAspAsnProLeuSerAsp556065CCCGATGCCAAGTCCGGC'TGCGACGGCGGCGGCGCCTTCATGTGCTCC96ProAspAlaLysSerGlyCysAspGlyGlyGlyAlaPheMetCysSer707580ACCCAGCAGCCGTGGGCCGTCTTCGCC144ThrGinGinProTrpAlaValPheAla8590GCCACGGCCATCAGCGGCGGC171AlaThrAlalieSerGlyGly100105AACGACAATCTGGCATATGGCAsnAspAsnLeuAlaTyrGly95AACGAGAsnGlu(2)SEQIDNO:46的信息(i)序列特徵(A)長度57個胺基酸(B)類型H酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描迷SEQIDNO:46:SerArgSerAsp1ProAspCysSerThrGinPheAlaProValGlyThrCysLysArgAsnAspAsnProLeu510AlaLysSerGlyCysAspGlyGlyGlyAlaPheMet202530GinProTrpAlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGly354045AlaThrAlalieSerGlyGlyAsnGlu5055(2)SEQIDNO:47的信息:(i)序列特徵(A)長度:(B)類型(C)鏈型159個^J^對核酸單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源:(B)菌抹CBS271.96(")特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1...159(xi)序列描述SEQIDNO:47:ACTTGCAACAAGAACGACGGGCCCCTGTCCAGCCCCGATGCCGCCTCC48ThrCysAsnLysAsnAspGlyProLeuSerSerProAspAlaAlaSer606570GGCTGTGATGGCGGCGAAGCCTTTGCCTGTTCTAATACCTCGCCTTGG96GlyCysAspGlyGlyGluAlaPheAlaCysSerAsnThrSerProTrp758085GCCGTCAGCGACCAGCTCGCGTACGGATACCTCGCCACGTCCATCTCC1"AlaValSerAspGinLeuAlaTyrGiyTyrLeuAlaThrSerlieSer9095100105GGCGGCACCGAGTCG159GlyGlyThrGluSer110(2)SEQIDNO:48的信息:(U序列特扭(A)長度個氛l酸(B)類型氬基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(H)分子類型蛋白質(xU序列描迷S印tDNO:48:ThrCysAsnLysAsnAspGlyProLeuSerSerProAspAlaAlaSer151015GlyCysAspGlyGlyGluAlaPheAlaCysSerAsnThrSerProTrp202530AlaValSerAspGinLeuAlaTyrGlyTyrLeuAlaThrSerlieSer354045GlyGlyThrGluSer50.(2)SEQIDNO:49的4言息(i)序列特徵(A)長度84個威基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(n)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌抹CBS270.%(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1...84(xi)序列描述SEQIDNO:49:CCAGTTTTCTCCTGTGACAAGTACGACAACCCTCTACCTGACGCCAAT48ProValPheSerCysAspLysTyrAspAsnProLeuProAspAlaAsn556065GCTGTGTCCGGGTGTGACCCCGGAGGTACTGCCTTC84AlaValSerGlyCysAspProGlyGlyThrAlaPhe707580(2)SEQLDNO:50的信息(i)序列特徵(A)長度28個胺基酸(B)類型氛基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO:50:ProValPheSerCysAspLysTyrAspAsnProLeuProAspAlaAsn151015AlaValSerGlyCysAspProGlyGlyThrAlaPhe2025(2)SEQIDNO:51的信息(i)序列特徵(A)長度147個^^Jtt(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(U)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌沐棉色二孢，CBS274.96(xi)序列描迷SEQIDNO:51:ACCTGCGACGCCTGCGACAGCCCCCTCAGCGACTACGACGCCAAGTCCGGCTGCGACGGC60GGTAGCGCAT-ACACCTGCACCTACTCTACCCCCTGGGCCGTCGACGACAACCTCTCCTAC120GGTTTCGCCGCCGCCAAGCTGAGCGGA147(2)SEQIDNO:52的信息(i)序列特徵(A)長度49個g酸(B)類型:氛基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(H)分子類型肽(xi)序列描述S印IDNO:52:ThrCysAspAlaCysAspSerProLeuSerAspTyrAspAlaLysSer151015GlyCysAspGlyGlySerAlaTyrThrCysThrTyrSerThrProTrp202530AlaValAspAspAsnLeuSerTyrGlyPheAlaAlaAlaLysL<euSer354045Gly(2)SEQIDNO:53的4言息(i)序列特徵(A)長度135個g對(B)類型核酸(C)鏈型，單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌沐〃/M/wra辦/^ra/z//，NKBC1444(xi)序列描述SEQIDNO:53:CCACTAGCAGATTTCACCGGTGGAACCGGCTGTAATGGCGGTTCGACATTCTCATGCTCA60AACCAACAACCATGGGCGGTCAACGACACATTCTCGTACGGCTTTGCGGGCATCTTTATC120ACAGGCCATGTCGAG135(2)SEQIDNO:54的4言息(i)序列特徵(A)長度45個M酸(B)類型M酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO:54:ProLeuAlaAspPheThrGlyGlyThrGlyCysAsnGlyGlySerThr151015PheSerCysSerAsnGinGinProTrpAlaValAsnAspThrPheSer202530TyrGlyPheAlaGlyliePhelieThrGlyHisValGlu354045(2)SEQIDNO:55的信息(i)序列特徵(A)長度IM個M對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性Ui)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌沐疣孢青黴，ATCC62396(xi)序列描迷SEQIDNO:55:GCCAAATCTGGATGTGATGCTGGTGGAGGTCAAGCCTACATGTGCTCCAACCAACAACCT60TGGGTAGTCAACGACAACCTCGCCTACGGTTTCGCCGCAGTCAACATTGCCGGC1"(2)SEQIDNO:56的信息(n序列特徵(A)長度38個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描迷SEQIDNO:56:AlaLysSerGlyCysAspAlaGlyGlyGlyGinAlaTyrMetCysSer151015AsnGinGinProTrpValValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAla202530AlaValAsnlieAlaGly35(2)SEQIDNO:57的4言息(i)序列特徵(A)長度113個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌抹點孔座殼(xi)序列描述SEQIDNO:57:TTCGACGTCCGGGTGCGACAATGGCGGCAGCGCCTTCATGTGCTCTAACCAAAGCCCCTG60GGCCGTCAACGACGATCTGGCCTACGGCTGGGCCGCCGTCTCAATCGCGGGCC113(2)SEQIDNO:58的信息(i)序列特徵(A)長度37個氛基酸(B)類型g酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO:58:SerThrSerGlyCysAspAsnGlyGlySerAlaPheMetCysSerAsn151015GinSerProTrpAlaValAsnAspAspLeuAlaTyrGlyTrpAlaAla202530ValSerlieAlaGly35(2)SEQIDNO:59的葉言息(i)序列特徵(A)長度177個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌抹蛇形鐮孢，IFO4467(xi)序列描述SEQIDNO:59:TCAACACCGGTGCAGACGTGCGACCGCAACGACAACCCGCTCTACGACGGCGGGTCGACG60CGGTCCGGCTGCGACGCCGGCGGCGGCGCCTACATGTGCTCGTCGCACAGCCCGTGGGCC120GTCAGCGACAGCCTCTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCCGCATCGCCGGCCAGTCCGAG177(2)SEQIDNO:60的信息(i)序列特徵(A)長度59個胺基酸(B)類型H酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線')i(H)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO:60:SerThrProValGinThrCysAspArgAsnAspAsnProLeuTyrAsp151015GlyGlySerThrArgSerGlyCysAspAlaGlyGlyGlyAlaTyrMet202530CysSerSerHisSerProTrpAlaValSerAspSerLeuSerTyrGly354045TrpAlaAlaValArglieAlaGlyGinSerGlu-55(2)SEQIDNO:61的信息(i)序列特徵(A)長度150個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌抹r力/eA3"'aMe/wo//〃a,CBS174.70(xi)序列描述SEQIDNO:61:AACGACAACCCCATCTCCAACACCAACGCTGTCAACGG丁TGTGAGGGTGGTGGTTCTGCT60TACGCTTGCTCCAACTACTCTCCCTGGGCTGTCAACGATGACCTTGCCTACGGTTTCGCT120GTTACCAAGATCTCCGGTGGCTCCGAGGCC150(2)SEQIDNO:62的信息(i)序列特徵(A)長度50個胺基酸(B)類型氛基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(n)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO:62:AsnAspAsnProlieSerAsnThrAsnAlaValAsnGlyCysGluGly151015GlyGlySerAlaTyrAlaCysSerAsnTyrSerProTrpAlaValAsn202530AspAspLeuAlaTyrGlyPheAlaValThrLysGlyGlySer3540.eSer45(2)SEQIDNO:63的信息(i)序列特徵(A)長度180個#對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(H)分子型cDNA(vi)原始來源:(A)生物體:管毛殼，CBS799.83(xi)序列描述SEQIDNO:63:GTCAATCAGCCCATCCGAACGTGTAGTGCCAACGACTCGCCCTTGTCCGACCCAAATACC60CCAAGTGGCTGTGACGGTGGTAGCGCCTTCACTTGTTCCAACAACTCCCCGTGGGCAGTC120GATGACCAGACAGCTTATGGCTTTGCGGCAACAGCCATCAGTGGCCAGTCCGAGAGCAGC180(2)SEQIDNO:64的信息:(i)序列特徵(A)長度60個a酸(B)類型H酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述:SEQIDNO:64:ValAsnGinProlieArgThrCysSerAlaAsnAspSerProL^euSer151015AspProAsnThrProSerGlyCysAspGlyGlySerAlaPheThrCys202530SerAsnAsnSerProTrpAlaValAspAspGinThrAlaTyrGlyPhe354045AlaAlaThrAlalieSerGlyGinSerGluSerSer505560(2)SEQIDNO:65的4言息(i)序列特徵(A)長度159個i^t(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源C/w"頻'鵬Wre鮮/w，CBS547.75(xi)序列描述SEQIDNO:65:ACCTGCGACAAGAAGGACAACCCCATCTCTGATGCCAACGCCAAGAGCGGCTGTGATGGC60GGTTCTGCTTTCGCCTGCACCAACTACTCTCCCTTCGCCGTCAACGACAACCTCGCCTAC120GGTTTCGCTGCCACCAAGCTTGCTGGAGGCTCCGAGGCT159(2)SEQIDNO:66的j言息(i)序列特徵(A)長度53個胺基酸(B)類型M酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(i0分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO:66:ThirCysAspLysLysAspAsnProlieSerAspAlaAsnAlaLysSer15GlyCysAspGlyGlySerAlaPheAlaCysThrAsnTyrSerProPhe202530AlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThrLysLeuA-la"40"GlyGlyGluAla50(2)SEQIDNO:67的4言息(i)序列特徵(A)長度81個g對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌沐葫蘆科刺盤孢(xi)序列描述SEQIDNO:67:ACCTGCTACGCCAATGACCAGCGCATCGCCGACCGCAGCACCAAGTCCGGCTGCGACGGC60GGCTCGGCCTACTCCTGTTCT81(2)SEQIDNO:68的4言息(i)序列特徵(A)長度27個#^酸(B)類型'.g酸(C)鏈型單鏈，(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO:68:ThrCysTyrAlaAsnAspGinArglieAlaAspArgSerThrLysSer151015GlyCysAspGlyGlySerAlaTyrSerCysSer2025(2)SEQIDNO:69的信息(n序列特徵(A)長度160個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(W拓樸結構線性(H)分子型cDNA(vi)原始來源(B)菌沐閃光須黴(xi)序列描述SEQIDNO:69:ACCTGTGACAAGAAGGACAACCCCATCTCA^ACTTGAACGCTGTCAACGGTTGTGAGGGT60GGTGGTTCTGCCTTCGCCTGCACCAACTACTCTCCTTGGGCGGTCAATGACAACCTTGCC'120TACGGCTTCGCTGCAACCAAGCTTGCCGGT_GGCTCCGAGG160(2)SEQIDNO:70的信息(i)序列特徵(A)長度53個胺基酸(B)類型氣基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO:70:ThrCysAspLysLysAspAsnProlieSerAsnLeuAsnAlaValAsn151015GlyCysGluGlyGLyGlySerAlaPheAlaCysThrAsnTyrSerPro202530TrpAlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThrLysLeu354045AlaGlyGlySerGlu50(2)SEQIDNO:71的4言息(i)序列特徵(A)長度165個^fct(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子型cDNA(vi)原始來源粉紅單端孢，IFO5372(xi)序列描述SEQIDNO:71:CCAGTAGGCACCTGCGACGCCGGCAACAGCCCCCTCGGCGACCCCCTGGCCAAGTCTGGC60TGCGAGGGCGGCCCGTCGTACACGTGCGCCAACTACCAGCCGTGGGCGGTCAACGACCAG120CTGGCCTACGGCTTCGCGGCCACGGCCATCAACGGCGGCACCGAG165(2)SEQIDNO:72的信息(n序列特徵(A)長度55個胺基酸(B)類型l基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(n)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO:72:ProValGlyThrCysAspAlaGlyAsnSerProLeuGlyAspProLeu151015AlaLysSerGlyCysGluGlyGlyProSerTyrThrCysAlaAsnTyr202530GinProTrpAlaValAsnAspGinLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThr354045AlalieAsnGlyGlyThrGlu5055參考文獻本發明的背景GB-A-1368599EP-A-0307564EP-A-0435876W091/17243WO91/10732WO91/17244WO95/24471WO95/26398酶學方法，1988，Vol.160，p.200-391(Wood,W.A.和Kellogg,S.T.編).Beguin，P.，"纖維素降解的分子生物學"，徵生物學年評(1990)，Vol.44，pp.219-248.Henrissat，B.，"纖維素酶和它們與纖維素的相互作用"，纖維素(1994)，Vol.1，pp.169—196.T.-M.Enveri，"微生物纖維素酶"，W.M.Fogarty,徵生物膝和生物技術，應用考牛學出版4土，183-224(1983).BSguin，P.和Aubert，J-P.,"纖維素的生物降解"，FEMS徵生物學回顧13(1994)25-58.Sheppard，P.O.等，"保守纖維素酶家族特異性序列在克隆Fusariumoxysporum纖維素酶同系物cDNA上的用途，基因，(1994)，Vol.15,pp.163-167.Saloheimo，A.等，"經在酵母中表達分離的7Wc力o&廠鵬reese/的新的小內切葡聚糖酶基因，eg/i1',分子生物學(1994)，Vol.13(2)，pp.219-228.■Arsdeli，J.N.等，(1987)Trichode簡reesei內切葡聚糖酵[在啤酒糖酵母中的克隆、特徵確定和表達，生物/技術5:60-64.PenttUU，M.等，(1986)Trichoderraareesei纖維素酶基因之間的同源性內切葡聚糖酶I基因的完整的核苷^f列，基因15:253-263.Saloheimo，M.等，(1988)EG111，一種新的Trichodermareesei內切葡聚糖酶基因和酶兩者的特機基因63:11-21.Gonz"es，R.等，"Trichodermalongibrachiatumeg〃基因的克隆、序列分析和在酵母中的克隆"，應用徵生物生物學(1992),VoL38，pp.370-375.Ooi，T等"棘孢麴黴的纖維素蘇(FI-CMCase)cDNA的克隆和序列分析"Curr.Genet.(1990),voL.18，pp.217-222.Ooi，T等，"編碼AspergiUusacuieatus纖維素酶(F卜CMCase)的基因的完整的核苷絲列"核酸研究(1990),vol.18,No.19,P.5884.Xu，G.等，"多種厭氧rumen真菌Neocalliraastixpatriciarum纖維素酵cDNA在大腸桿菌中的克隆和表達"，遺傳微生物學雜誌(1992)，vol,138，pp.1413-1420.Xu，G.等，"新的編碼具有高的內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和木聚糖酶活寸生的三>^多功能催4匕區的NeocalUraasUxpatriciarum多糖類水解酶c隨(ce/f,遺傳微生物學(1992)，voL138，pp.2397-2403.Zhou，L.等，"厭氧真菌Neocallimastixpatriciarum的無內含子ce/"編碼模式家族內切葡聚糖酶"，生物化學雜誌(1994),voL.297，pp.359-364.Dalb小ge，H.和Heldt-Hansen，H.P.，"用於真菌酶基因有效表達克隆的新方、法"，Mol.Gen.Genet.(1994)，vol.243，pp.253—260.AU，B.R.S等，"厭氧真菌Piromyces的纖維素酶和半纖維素酶構成多蛋白纖維素-結合複合物和被多基因家族編碼"，FEMS徵生物學通訊(1995)，vot.125，No.1，pp.15-21.日本DNA資料庫(DDBJ).Wang,H.Y.和Jones，R.W."phytopathogenic真菌他c/7/7/咖/'朋/7力"eo///73內切葡聚糖Sl^編碼基因的克隆、特徵確定和功能性表達"，基因，158:125128,1995.Wang，H.Y.和Jones,R.W.:"從phytopathogenic真菌船crop力咖//73/j/a"oh'/a克隆的單一內切葡聚糖5^"編碼基因"，應用和環境徵生物學，61:20042006，1995.Henrissat:生物化學雜誌，280:309316，1991.Schauwecker,F.L.S.F.,Warmer,G.，Kahmann，R.:"dimorphic真菌Ustilagomaydis中纖維素酶基因的fiL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.—種酶製劑，該S^製劑實質上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以vM^於壼菌門(CAK"/ff/o邁yco&)的菌^J^得的，這種酶包^4t自以下序列的MM列XaaThrArgXaaPheAsp5Caa1234567,'XaaThrArgXaaTyrAspXaa123'456■7和)XaaThrArgXaaTrp.AspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7號位置上，Xaa是20個天然#^*基中的>^一個。19.按照權利要求18的酶製劑，其中在7號位置上的#^^基是半J!^酸(Cys)。20.按照權利要求18的Sl^J劑，其中在1號位置上的^4^M自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。21.按照權利要求18_20之任一的酶製劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個aM基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5個a^基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345中，第一序列的3號位置上，^J^^Trp、Tyr或Phe;第一序列的4號位置上，^酸是Trp、Tyr或Phe;第一序列的8號位置上，g酸是Arg、Lys或His;第一序列9、10和12號的各位置上，在第二序列的4號位置上，酸是20個天然#^#基中的任何一個。22.按照權利要求18-21^:任一的g^"〗劑，其中所i兌的酶是可以A^於壺菌綱(C4rmV/湖j^"e》的菌^lt得的，優^^是可以>^於由以下目的菌^l^得的壺菌目(07"^^'a/")、5Wze/io邁yce"/es、肋壺菌目他，c/^r/a/es)和芽枝黴目(》/a"oc/ad/a/e力。23.按照權利要求22的酶製劑，其中所說的酶是可以從屬於i^/zeZ/oa^cefaceae科的菌抹獲得的，優選的是可以從屬於嚢壺菌屬0力/加;力/j^〃力的菌抹獲得的，更優選的是可以從屬於紅根嚢壺菌(^ko;/i7c〃s/wea)的菌抹獲得的，尤其是可以從紅根嚢壺菌CBS282.96獲得的。24.—種酶製劑，該酶製劑實質上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以M於^^菌門U^咖yco")的菌^t得的，這種酶包含選自以下序列的#^^列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567.;XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234-567J和"XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7號位置上，Xaa是20個天然J^^基中的任何一個。25.按照權利要求24的酶製劑，其中在7號位置上的a^基是半其在在在在絲酸(Cys)。26.按照權利要求24的酶製劑，其中在1號位置上的a^基選自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。27.按照權利要求24-26之任一的酶製劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個M^基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCy$.-XaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213■和具有以下序列的由5個M^基組成的第二欣TrpCysCysXaaCys12345中，第一序列的3號位置上，M酸是Trp、Tyr或Phe;第一序列的4號位置上，Trp、Tyr或Phe;第一序列的8號位置上，#J^^AArg、Lys或His;第一序列9、10和12號的#置上，在第二序列的4號位置上，M^20個天然#^^基中的*時一個'28.按照權利要求24-27^^任一的酶製劑，其中所，說的酶是可以A^於接合菌綱(々^z^c^e》的菌抹獲得的，優選的是可以從屬於毛黴目鋒c/es)的菌#^得的。29.按照權利要求28的SH^J劑，其中所說的酶是可以城於由毛黴科(J/〃coracea)和枝黴科(rA3咖2V/aceae)的菌^J^得的，優選的是可以A^於由根毛黴屬W力/zo/zw/cor)、須黴屬(？Arco邁/ces)和刺枝黴屬(C力a"ay,77"邊)的菌#1^得的。30.按照權利要求29的酶製劑，其中所i兌的酶是可以從屬於由y力/zo邁wcor;^/〃^、閃光須黴CP力7c0邁yces/7"e/s)、弗雷生刺枝黴(Oa"os"0^"邁/>6"/7//)的菌^_得的，優i^是可以Mj^於由以下菌抹的菌梯J^得的A^/zcrawcor/ws/〃usIF04578、閃光須黴IF04814和弗雷生刺枝黴NRRL2305。31.—種酶製劑，該酶製劑實質上由具有溶纖活'逸的SI組成，所述酶是可以從屬於由Jrc力ae^co邁7ce^、盤菌綱.(i/sc0邁7c"e力、其在在在在/fer巡/a5^o/ffji^es、腔菌綱(丄ocw/o3sco邁7ee^)和不整嚢菌綱CP/ec&邁j^We》的菌;^^得的，這〕種酶包^4自以下序列的^^^列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567,.XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567,*和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7號位置上，Xaa是20個天然a^基中的任何一個。32.按照權利要求31的S^"劑，其中在7號位置上的a絲基是半縫酸(Cys)。33.按照權利要求31的酶製劑，其中在1號位置上的g^基選自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。34.按照權利要求31-33之任一的酶製劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個g自基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp1234567891011—1213和具有以下序列的由5個a^基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第'一序列的3號位置上，^酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4號位置上，a^Trp、Tyr或Phe;在第一序列的8號位置上，Arg、Lys或His;在第一序列9、10和12號的#置上，在第二序列的4號位置上，酸是20個天然M酸殘基中的任何一個'35、按照權利要求31-M之任一的SH"劑，其中所說的酶是可以M於由以下目的菌抹Jl得的盤菌目(戶ez/za7es)、戶/y^/s邁a^ies、座嚢菌目36.按照權利要求35的酶製劑，其中所說的酶是可以從屬於由以下科的菌抹獲得的葫蘆黴科(CtfCuW/"r/aceae)、斑痣盤菌科(^Fr/s鵬&ceae)、糞盤菌科C^co&o/3cese)和發菌科(7Wc力oc咖ace3e);優選地是由屬於由以下屬的菌抹產生的色二孢屬(歷》/6^/a)、Wemy/^erojw/s、〃/os/70,a、殼球^&>^(船croj9力咖2'加)、糞盤菌屬(J5w6o/〃s)、5^cco6o/ws、青黴屬CPe刀/ci7//—和37.按照權利要求36的酶製劑，其中所說的酶是可以從屬於由以下種的菌抹獲得的棉色二孢(/^》/o"iagoss7p/加)、Wcmsr/^e,,^<s/7.、Wc^ora6//^t譜//、胞cro/7力咖/加、^co6o7w51、5^cco6W^力./WeZ/iAy、疾抱青黴(戶e"/ci7/Z咖mm/ci7/c^z/忠)、產黃青黴(/te//c/"/鵬c力rj^SY^e/咖)和7&orao/z^"pwtwco^stw;優選地是可以從屬於由以下菌抹的菌抹獲得的棉色二孢CBS274.96、〃Awpora6//^r諸//NKBC1444、胞"o/;力咖/加pAa<yeo///wCBS281.96、A"o6o/m^///We//wCBS275.96、疾孢青黴ATCC62396、產黃青黴ATCC9480和77ei7270邊/cesKerrwcos^CBS285.96。38.—種酶製劑，該酶製劑實質上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以從屬於由間座殼目("/a;wr"/e力、岌角菌目Ur/ar/s/e》、7y/c/ca/j/aer/a和黑症-菌目C^//"cAw/"ia)、^油7/，r咖和孑L座殼屬(屍aro/7/a)。43.按照權利要求42的酶，其中所i兌的酶是可以M於由以下種的菌抹獲得的"/，rf力es/，/ze".a、葫蘆科刺盤孢(6W/efofr/由邁/age/7sr/wzz)、A7^ro印ora、鹿角團炭角菌U>/a/7a力j770A7/0/2)、yVb^/zy/y^/^r^z/和,j、孑L座殼(屍oro//a/w/CaA3)，優選地是可以M^於由以下菌抹的菌^t得的"/a/7or^e;^/^e/e5"/aCBS278.96、葫聲科刺盤孢ATCC52609、A7^rosporaCBS272.96和鹿角團炭角菌CBS284.96。44.一種酶製劑，該酶製劑實質上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶是可以y^y萬於由小赤殼科(Afec"/aceae),糞殼科GSbiY/ar/aceae),毛殼科菌抹和屬於頂孢黴屬(Jcrezffo/7/咖)，粘帚黴屬(67/oc/W/"邁)，i"c7^3//"/w範，柱^1^(6^///^ro(^r;7朋)和周刺座黴屬(&/""//<3)的菌抹獲得的，il種酶包^^自以下序列的m^酸亭列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567,.XaaThrArgXaaTyrAspXaa12345.67和XaaThrArg'XaaTipAspXaa123.4567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7號位置上，Xaa是20個天然M^基中的任何一個。45.按照權利要求44的酶製劑，其中在7號位置上的g^基是半il^酸(Cys)。46.按照權利要求44的酶製劑，其中在1號位置上的M^M自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。47.按照權利要求44-46之任一的酶製劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個a^基組成的第一肽Tl;rArgXaaXaaAspCysCys.XaaXaaXaaCysXaaTrp12■345678910111213和具有以下序列的由5個a^基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys2345中，第一序列的3號位置上，Trp、Tyr或Phe;第一序列的4號位置上，^酸是Trp、Tyr或Phe;第一序列的8號位置上，Arg、Lys或His;其在在在在第一序列9、10和12號的Ki置上，在第二序列的4號位置上，酸是20個天然^J^i^基中的任何一個。48.按照權利要求44-47之任一的酶製劑，其中所說的酶是可以從屬於由以下屬的菌抹獲得的柱孢屬(6W//2^Ycar^/7)、叢赤殼屬(#e"r/3)、周刺座黴屬(&/〃"//3)、糞殼屬(5or&r/a)、梭孢殼屬(r力/e/37ia)、Sypastospora、毛殼屬(6^ef咖/wz)、毀絲黴屬旨ce7/》/力fMra)、5^F"/W咖、"acforr力/iJ咖、粘帚黴屬(C7ioc/ad/咖)、頂孢黴屬(Jcre咖//咖)。49.按照權利要求48的酶製劑，其中所說的酶是可以從屬於由以下種的菌抹獲得的Wy"^"ocar;70i7s/7.、Afe"r/a"/"ea、PWu,e"a、糞生糞殼(5brc^Wa/7肌？o/a)、大孢糞殼Cforfl^r/a分,5^o^/7orato/7/"e/57s、67s由iT力ii2咖/"oecw/^/7^/邁咖、牆毛殼f力er卿/7力//3、鏈孢祐帚黴(67/o^d/z//zc"e"w/""/z)、Scj^Z/^/mMei7zw/7力i73和J^re邊朋/w/z優i^fc是可以/M^於由以下菌抹的菌抹獲得的鏈孢粘帚黴ATCC10523和CBS227.48、^"r/a//"eaCBS279.96、F<x/"fe//<2co7/"orr/c/w/ctesCBS400.58、糞生糞殼ATCC52644、大孢糞殼ATCC60255、r力/eh"'a^rre"r"NRRL8126、77/e/ar2."/e/YBo/;A//aCBS174.70、牆毛殼CBS163.52、C/ae飾/咖FimycmyCBS547-75、C力a"湖/〃邁6ra"7/e""、CBS122.65、C力a"咖/鵬cu/72'co/or咖CBS799.83、to/ne/"細C1515、^7adorr力/y3咖/becw/7C^s/邁鵬ATCC62373、妙ce/一/^力oraf力er邁0p力/7aCBS117-65、^cj^3/7^/2'咖f力er巡o/7力//4ATCC28085和Jore/zk/iw邁早CBS478.94^自以下序列的#^^列:xaaThrArgXaaPheAspXaa1234567XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567,..和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4號位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7號位置上，Xaa是20個天然M^基中的任何一個。51.按照權利要求50的酶製劑，其中在7號位置上的M^基是半J^酸(Cys)。52.按照權利要求50的S^^劑，其中在1號位置上的M^M自天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。53.按照權利要求50-52之任一的酶製劑，其中所述的酶包含具有以下序列的由13個^tJ^^基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp123456789■101112i3和具有以下序列的由5個U^基組成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3號位置上，a酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4號位置上，#J^lTrp、Tyr或Phe;在第一序列的8號位置上，^J^是Arg、Lys或His;在第一序列9、10和12號的#置上，在第二序列的4號位置上，酸是20個天然M^基中的任何一個。54.按照權利要求53^L任一的酶製劑，其中所說的酶是可以從屬於由以下菌林的菌抹獲得的番痴尖錄抱(屍"sar/咖0je75^0r咖7/co/ers/"')CBS645.78、尖^^孢pa^277oraCBS744.79、腐皮鐮孢IMI107.511、蛇形鐮孢IFO4467、早熟禾鐮孢ATCC60883、黑腐質黴CBS819.73和灰腐質黴ATCC22726。55.按照權利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41—43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第一序列的9號位置上的狄絲絲自脯氨酸、蘇氨酸、幾氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半;i^酸、天冬《、穀氨SfcJ疾、酪氨酸、絲氨酸、甲磁裒酸和色氨酸，優選地選自脯氨酸和蘇氨酸。56.按照權利要求14-17、21—23、27-30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第一序列的10號位置上的gg基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬耽胺、穀氨醯胺、酪氨酸、絲氨酸、甲磁氨酸和色氨酸，優M是絲氨酸。57.按照權利要求14-17、21-23、27—30、34-37、41—43、47-49、53和54^^任一的酶，其中在第一序列的12號位置上的a^^M自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半a酸、天冬酖胺、穀氨跣胺、酪氨酸、絲氨酸、甲磁氨酸和色氨酸，優i^i也選自丙氨酸^"氣酸。58.按照權利要求14-17、2卜23、27—30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第二序列的4號位置上的a^基選自脯氨酸、蘇氨酸、縵氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半皿酸、天冬跣胺、穀氨StJ疾、酪氨酸、絲氨酸、甲磁袁酸、色氨酸、穀氨酸和天冬氨酸，選自丙氨酸、甘氨酸和穀氨^Jfe'59.按照權利要求14-17、21-23、27-30、34—37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在笫一序列的第3號位置上的M^基是酪氨酸；或在第4號位置上的#^^基是色氨乾或在第8號位置上的氨基絲基是賴氨酸。60.—種DM構建化該構建體編碼按照權利要求11-59之任一的酶。61.按照權利要求14-17、21-23、27—30、34-37、41-43、47—49、和54之任一的酶製劑，其中所i兌的第一序列包M自以下序列的a絲列ThrArgTyxTrpAspCysCysLysProSerCysi^tlaTrp123456789101112137ThrArgTyrTrpAspCysCysLysThrSerCysAlaTrp12345678910111213,.—ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysGlyTrp1234567891011121362.—種提供微生物菌抹的方法，所述菌抹包含編碼存在於按照權利要求1-9、11-59和61之任一酶製劑中的酶的基因，該方法包括在標準條件下與圖1所示的任何保守區的寡核苷酸雜交(例如PCR擴增)。63.按照權利要求62的方法，其中所說的寡核苷酸包含編碼包含在選自以下序列的肽中的至少五肽的核苷酸亭列a.ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa12,34'5678'91011121314在3或4在號位置上的#^酸是Trp、Tyr或Phe;在8號位置上的^^酸是Arg、Lys或His;在9、10、12和14號位置上的^^酸分別是20個天然M^基中的任何一個；和b.TrpCysCysXaaCysTyr123456在4號位置上的M酸是20個天然^^^基中的^T一個；和c.XaaProGlyGlyGlyXaaGlyXaaPhe1234567891號位置上的g酸是Met或lie;6和8號位置上的M酸分別是Leu、Ile或Val;和d.GlycysXaaXaaArgXaaAspTrp^(aa"123456789在3號位置上的M^l20個天然^^g基中的^K一個-，在4和6號位置上的g酸分別是Trp、Tyr或Phe;並且在9號位置上的^J^^I:Phe或Met。64.按照權利要求62的方法，其中所說的寡核苷酸包含互補於權利要求63的序列的核普M^列。65.按照權利要求63的方法，其中所說的暮法苷酸相應於選自以下PCR引物的PCR引物有義，5'-CCCCAAGCTTACIA/cGITAC/tTGGGAC/tT'gC/tTGC/tAAA/gA/cC-S'反義l，5,-CTAGTCTAGATAVoCiAIGCVoCAVoCAcC-3';反義2,5,-CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/0ICCICCICCIGG_3',.和','反義3，5，-CTAGTCTAGAIAACCAA/0TCAA/0A/TAIC0/TCC-3'.66.—神DM構建體，該構建體包^^編碼顯示溶纖活性^L^的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO:1中所示的DNA序列和/或可以>^哞酒糖酵母DSM9770中的質粒獲得的DM序列，或者b)SEQIDNO:1中所示的DM序列的類似物或可以從哞酒糖酵母DSM9770中的質粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源於，優選地至少70y。同源於SEQIDNO:1中所示的DM序列和/或可以從譁酒糖酵母DSM9770中的質棒獲得的DM序列，ii)在本文所描述的條-件下與SEQIDNO:1中所示的DM序列和/或可以A^哞酒糖酵母DSM9770中的質粒獲得的DM序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源於，優逸地至少65y。同源於由一種DNA序列編碼的多肷，所述DM序列包含SEQIDNO:1中所示的DNA序列和/或可以從哞酒糖酵母DSM9770中的質^H得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體免疫學>^應性的，所述內切葡聚^^酶由SEQIDNO:1中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM9770中的質粒獲得的DNA序列編碼.67.按照權利要求66的DM構建來其中所述的DM序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎產生的，所述DNA文庫是屬於毛殼科的菌椒優M是屬於毀絲黴屬的菌歉特別是屬於脫""邁0"力//3的菌朱尤其是^f力er邁op力i7aCBS117.65的文庫。68.—種DNA構建體，該構建體包含編碼顯示內切葡聚糖酶活性:^的DM序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO:4中所示的DNA序列和/或可以從哞酒糖酵母DSM10082中的質粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO:4中所示的DNA序列的類似物或可以從哞酒糖酵母DSM10082中的質粒獲得的DNA序列的類^f以物，該類似物i)同源於，優選地至少70。/。同源於SEQIDNO:4中所示的DM序列和/或可以從哞酒糖酵母DSM10082中的質粒H得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO:4中所示的DM序列和/或可以從啤酒糖酵母DSM10082中的質M得的DNA序列的相同核苷酸^:針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源於，優選地至少60y。同源於由一種DNA序列編碼的多ftt所述DNA序列包含SEQIDNO:4中所示的DM序列和/或可以從哞酒糖酵母DSM10082中的質粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多狀，該多肽是與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體免疫學反應性的，所述內切葡聚糖酶由SEQIDNO:4中所示的DM序列或可以從啤酒糖酵母DSM10082中的質粒獲得的DNA序列編碼-69.按照權利要求68的DNA構建朱其中所述的DNA序列是v^—種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎產生的，所述DNAib^是屬於肉座菌科(Ay/70creaceae)的菌抹，優選地是屬於頂孢黴屬的菌抹，特別是Jc酒o刀/t;邁印.CBS478.94的il^。70.—種DNA構建^s該構建體包含編碼顯示內切葡聚糖酶活性之酶的DM序列，所述DM序列包括a)SEQIDNO:6中所示的DM序列或可以從啤酒糖酵母DSM10080中的質粒獲得的DNA序列，或者的DNA序列的類似物或可以^J年酒糖酵母DSM10080中的質粒獲得的DM序列的類似物，該類似物i)同源於，優逸也至少65。/。同源於SEQIDNO:6中所示的DNA序列或可以從哞酒糖酵母DSM10080中的質粒獲得的DNA序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO:6中所示的DM序列或可以從哞酒糖酵母DSM10080中的質粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源於，優選地至少70。/。同源於由一種DNA序列編碼的多欣，所述DNA序列包含SEQIDNO:6中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10080中的質粒H得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內切葡聚糖鰷的抗體免疫學A^應性的，所述內切葡聚糖酶由SEQIDNO:6中所示的DNA序列或可以從哞酒糖酵母DSM10080中的質粒獲得的DNA序列編碼。71.按照權利要求70的DNA構建化其中所述的DNA序列是從一種DM文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎產生的，所述DNA文庫是屬於fi^"o/z/ceae科的菌沐優i^是屬於頂孢^v^的菌沐特別是力cre邁o//咖CBS478.94的M。72.—種DNA構建朱該構建體包含編碼顯示內切葡聚糖酶活性^J^的DNA序列，所述DM序列包括a)SEQIDNO:8中所示的DM序列或可以v^，年酒糖酵母DSM10081中的質粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO:8中所示的DNA序列的鮝似物或可以從哞酒糖酵母DSM10081中的質粒lt得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源於，優選fe至少75y。同源於SEQIDNO:8中所示的DNA序列或可以從啤酒糖酵母DSM10081中的質粒獲得的DM序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO:8中所示的DNA序列或可以從哞酒糖酵母DSM10081中的質粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源於，優逸地至少70y。同源於由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO:8中所示的DNA序列或可以從譁酒糖酵母DSM10081中的質粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多欣，該多版是與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體免疫學　;^應'li的，所迷內切葡聚糖酶由SEQIDNO:8中所示的DM序列或可以從啤酒糖酵母DSM10081中的質粒獲得的DNA序列編碼。73.按照權利要求72的DNA構建體，其中所述的DNA序列是從一種DM文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎產生的，所述DNAi^是屬於毛殼科的菌歉優i4^;^屬於r力2'e/a^a^rrestr/s的菌朱特別是7T/e/ar/afe/Te""腿L8126的iL^。74.—種DNA構建化該構建體包含編碼顯示內切葡聚糖酶活性^JI的DNA序列，廬斤述DNA序列包括a)SEQIDNO:10中所示的DNA序列或可以從;tJ^桿菌DSM10512中的質粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO:10中所示的DNA序列的類似物或可以從大腸桿菌DSM10512中的質粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源於，優逸地至少65X同源於SEQIDNO:IO中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10512中的質粒獲得的DM序列，ii)在本文所描述的條件下與SEQIDNO:10中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10512中的質粒獲得的DNA序列的相同核普酸探針雜交，iii)編碼一種多狀，該多狀同源於，優i^fc至少55X同源於由一種DM序列編碼的多肽，所述DM序列包含SEQIDM):IO中所示的DM序列或可以從:^桿菌DSM10512中的質粒獲得的DM序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化的內切葡聚糖酶的抗體免疫學反_應'法的，所迷內切葡聚糖酵由SEQIDNO:10中所示的DM序列或可以從:U^桿菌DSM10512中的質粒獲得的DNA序列編碼。75.按照權利要求74的DNA構建朱其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎產生的，所迷DMiL^是屬於斑痣盤菌科的菌歉優M是屬於殼球孢屬的菌歉特別是屬於胞cr叩力tMi加//，o//"s的菌昧尤其是乂CBS281.96的^>^。76.—種DNA構建朱該構建體包含編碼顯示內切葡聚糖酶活性^#的隨序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO:12中所示的DM序列或可以從:桿菌DSM10511中的　質粒獲得的DM序列，或者b)SEQIDNO:12中所示的DM序列的類合又物或可以從大腸桿菌DSM10511中的質粒lt得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源於，優^ifc至少60。/n同源於SEQIDNO:12中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10511中的質粒獲得的DNA序列，H)在本文所描迷的條件下與SEQIDNO:12中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10511中的質粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多Jlt該多肽同源於，優選fe至少60y。同源於由一種DM序列編碼的多At所述DM序列包含SEQIDNO:12中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10511中的質粒獲得的DM序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體免疫學反應性的，所述內切葡聚糖酶由SEQIDNO:12中所示的DM序列或可以從:^桿菌DSM10511中的質粒^l得的DM序列編碼。77.按照權利要求76的DNA構建A其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎產生的，所述DNA文庫是屬於口蘑科的菌抹，優選地是屬於毛皮傘屬的菌抹，特別是屬於CW/2/》e//"的菌狐尤其是C.sca6e//aCBS280.96的iL^。78.—種DNA構建體，該構建體包含編碼顯示內切葡聚糖酶洽汰:^的DNA序列，所迷DNA序列包括a)SEQIDNO:16中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10571中的質粒獲得的DM序列，或者b)SEQIDNO:16中所示的DM序列的類似物或可以從大腸桿菌DSM10571中的質粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源於，優逸地至少70。/。同源於SEQIDNO:16中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10571中的質粒獲得的DM序列，ii)在本文所描述的條件下與S印IDNO:16中所示的DM序列或可以從大腸桿菌DSM10571中的質粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多狀同源於，優選地至少60y。同源於由一種DM序列編碼的多欣，所述DNA序列包含SEQIDNO:16中所示的DM序列或可以從雄桿菌DSM10571中的質粒獲得的DM序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體免疫學>^應性的，所述內切葡聚糖酶由SEQIDNO:16中所示的DM序列或可以從:^桿菌DSM10571中的質粒獲得的DNA序列編碼。79.按照權利要求78的DNA構建體，其中所述的DM序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DM文庫為基礎產生的，所述DNA文庫是屬於周刺座黴屬的菌朱優i^fc是屬於ro/We/hcoy/e/^/Lr/Woicfes的菌朱特另'Jco""o"oc力o^/esCBS權.58的文庫。80.—種DNA構建化該構建體包含編碼顯示內切葡聚糖酶活性^JI"的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO:19中所示的DNA序列或可以從大腸桿菌DSM10576中的質粒獲得的DNA序列，或者b)SEQIDNO:19中所示的DNA序列的類似物或可以從大腸桿菌DSM10576中的質粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源於SEQIDNO:19中所示的DM序列或可以從大腸桿菌DSM10576中的質^lt得的DNA序列，U)在本文所描述的條件下與SEQIDNO:19中所示的DNA序列或可以從;^桿菌DSM10576中的質粒獲得的DM序列的相同核香酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源於由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO:19中所示的DM序列或可以從大腸軒菌DSM10576中的質^t得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體免疫學反應性的，所迷內切葡聚糖酶由SEQIDNO:19中所示的DM序列或可以從JU^桿菌DSM10576中的質粒獲得的DNA序列編碼'81.按照權利要求80的DM構建體，其中所述的DNA序列是從一種DNA文庫分離的或者是以該DNA文庫為基礎產生的，所述DNAi^M於糞殼科的菌^優狄是屬於糞殼屬的菌朱特別屬於糞生糞殼的菌椒尤其是糞生糞殼ATCC52644的i^。82.按照權利要求66-81之任一的DM構建化該構建體還_包含編碼纖維素-結^^域的DNA序列。83.權利要求82的DM構建氛該構建體還包含編碼纖維素-結合域(CBD)的DNA序列，所述纖維素-結^、域和由所述DM構建體之DNA序列編碼的酶的酶核心(催化活',是可絲連接的。84.—種重組表達載朱該載體包^^按照權利要求62-83之任一的DNA構建體。85.—種細胞，該細胞包含按照權利要求66-83之任一的的DM構建體或按照權利要求84的重組表達載體。86.按照權利要求85的細胞，該細胞是真核細胞，特別真菌細胞，如酵母細胞或絲狀真菌細胞，或所逸基因所來源的內源性細胞。87.按照細胞權利要求86的細胞，其中所i兌的細胞屬於麴黴屬(^perw'"u;)、(屍"wr/w邊)或木黴屬(7Wc/Oflter鵬)的菌抹，特別是禾^^#:孢(,wsariwyz^razw'T/esr^zd、，累麴黴C^/7er^77/ws"/ger)或米曲88.—種產生顯示內切葡聚糖酶活性的酶的方法，該方法包括在可以產生所迷酶的務陣下，培養按照權利要求85-87之任一的細胞，並從培*中回收所述的酵。89.—種顯示內切葡聚糖酶活性的酶，該酶a)由按照權利要求66-83之任一的DNA構建體編碼，b)由按照權利要求88的方法產生，或c)是與一種抗純化內切葡聚糖酶的抗體免疫學反應性的，所述內切葡聚糖酶由序列表SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16、19^_任一所示的DNA序列編碼。90.—種使要洗的衣物顏色澄清的方法，該方法包括用包^^按照權利要求1-9、11-61和89之任一的酶製劑的浸泡、洗滌或衝洗液體處理要洗的衣物。91.按照權利要求90的方法，其中所說的要洗的衣物用洗;^L處理.92.按照權利要求90或91的方法，其中所說的內切葡聚糖酶^器循環使用條件下，以每升液體1到1000S-CEVU,優i^fc是5到200S-CEVU的有效量存在於浸泡、洗滌或衝洗液體中。93.按照權利要求90-92:^任一的方法，其中所說的浸泡、洗滌或衝洗液體的最適pH在4和11之間，優i^fe在6和10.5之間。94.按照權利要求90-93之任一的方法，其中溫度在15"和60t:之間。95.按照權利要求90-94之任一的方法，其中所，說的浸泡、洗滌或衝洗液體還包含一種或多種選自蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、澱粉酶、脂酶、過氧化物酶和^S^的酶。96.—種洗^J且合物，該組合物包含:接照權利要求1-9、11-61和89之任一的酶製劑，以及選自表面活性劑、助洗劑化合物和織物軟化劑的化絲。97.按照權利要96的洗衣組合物，該組合物還包含一種或多種選自蛋白酶、澱粉酶、脂酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化物酶和*的酶。98.按照權利要求97的組合物，其中所說的表面活性劑是非離子、陰離子、陽離子、兩性離子、兩，Ml兼性表面活性劑。99.按照權利要求98的組合物，其中所說的織物軟化劑是陽離子或非離子^t化劑，優M是季^f匕合物，並且其可以進一步包含或不包含一種或多種選自表面活性劑、電解質、緩衝液、抗氧劑和液態載體的化合物。100.按照權利要求l-9、11-61和89之任一的酶在降解或修飾植物材料(例如細胞壁)上的用途。101.按照權利要求l-9、U-61和89之任一的酶在處理織物原料或織物，優M是在防止背染、生物拋光或"石洗"纖維素織物中的用途。102按照權利要求1-9、1卜61和89之任一的酵在處理紙漿，優選地是在剝樹皮、脫纖維、纖維改性、S^^墨或改善排水中的用途。103.—種酶製劑，該製劑富含按照權利要求l-9、11-61和89的顯示溶纖活性的酶。104.按照權利要求103的^l劑，該製劑還包含一種或多種選自半乳聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果膠乙醯酷酶、聚豐乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖搭酸酶、果,解酶、M酸鹽裂解酶、內切葡聚糖酶、果膠甲酯酶、蛋白酶、脂酶、澱粉酶、角質酶、過氧化物酶、漆酶、纖維二糖水解酶和轉穀氨,酶的酶。全文摘要一種在洗滌劑，洗滌，紡織和造紙紙漿應用中性能良好的酶製劑，該製劑實質上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶包含具有序列ThrArgX3X4AspCysCysX8X9X10CysX12TrpX14(其中X3和X4各自分別是Trp、Tyr或Phe；X8是Arg、Lys或His；X9、X10、X12和X13各自是20個天然胺基酸殘基中的任何一個)的14個殘基的第一胺基酸序列和具有序列TrpCysCysXX4Cys(其中XX4是20個天然胺基酸殘基中的任何一個)的5個殘基的第二胺基酸序列，其條件是在第一胺基酸序列中，(i)當X12是Ser時，X14不是Ser，和(ii)當X12是Gly時，X14不是Ala。文檔編號C12N9/42GK101173263SQ20071018163公開日2008年5月7日申請日期1996年3月18日優先權日1995年3月17日發明者L·N·安德森,L·朗厄,M·S·考皮寧,M·伊哈拉,M·肖萊恩,R·I·尼爾森,S·F·拉森,S·塔卡基申請人:諾沃奇梅茲有限公司