多肽鏈多亞基蛋白質的複合表達的製作方法
2023-05-08 18:47:36
專利名稱：多肽鏈多亞基蛋白質的複合表達的製作方法
技術領域：
這項發明是一項有關應用重組DNA技術生產蛋白質的過程工藝以及相關的結構和系統。這項發明應用宿主細胞分別而又同時複合表達出目標蛋白的兩個及兩個以上的多肽鏈，亞基或其他的類似物，譬如人胰島素，通過單一的重組載體進行表達。經過篩選的宿主細胞正如設計所要求地分泌出具有活性的蛋白質。這項發明具有多方面應用的先進性，尤其在大規模藥物工業化生產方面。
背景技術：
生產蛋白質藥物，把優化基於基因重組技術基礎上的生物製藥過程看作是有效控制成本的關鍵。歸根結底，生產的步驟和原料的製備過程越少越好。現存的生物技術產業的生產過程通常為以下問題所困擾首先是在獲得終產物之前的中間步驟太多；其次是生產中用到的生物所產生的中間體或終產物的生命周期不易控制，所以導致了產率的降低；第三，這種中間體或是終產物總是需要昂貴的並且多次的純化步驟。
近來，一種工業生產多肽鏈或多亞基蛋白質的方法是將它們分別生產，然後純化，修飾並且在體外合成終產物。在終產物中的多肽鏈或多亞基在體外合成時必須按照一定的比例和正確的形態組裝，才能形成天然的具有生物活性的結構。這種正確的形態包括在多肽鏈或亞基的胺基酸殘基上的正確的氧化還原狀態以便形成交聯所需的並使蛋白質得以穩定的二硫鍵。在這種條件下多肽鏈或亞基之間的不正確的比例導致了終產物的不溶或失活，以及產率和質量的嚴重下跌。
另一種方法是將在多肽鏈或亞基如同一條線狀多肽製造出來，無論它有沒有二硫鍵。這種方法的好處是解決了上面所說的多肽鏈或亞基之間的不正確的比例的問題；但是在多肽鏈或亞基能夠正確地合成終產物之前必須增加一個斷鏈的步驟。這種化學的或酶解的斷鏈的步驟，以及後續的修飾步驟同樣是費時費錢。
以胰島素為例，一個穩定的具有生物活性的胰島素分子是由兩條稱為A鏈和B鏈的多肽組成的。以人的胰島素為代表的胰島素分子具有一個21個胺基酸的A鏈和一個30個胺基酸的B鏈。它們彼此通過兩個二硫鍵連接，另有第三個二硫鍵在A鏈內部(G.Bell，etal.1979Nature 282525-527)。自然狀態下的胰島素分子的兩條鏈是由一條單鏈mRNA編碼，並翻譯為一條多肽。然後再酶解斷鏈成為兩條多肽鏈。因此胰島素分子的A，B鏈與其它的某些大分子的亞基不同，它原本是一條線狀多肽，只是在翻譯後才經過斷鏈而分開的。下面在有關胰島素的製造工藝上對上述的兩種方法還要作進一步的描述。
另一個與胰島素這類多肽鏈不同的具有亞基的多肽的例子是白介素-12(IL-12)。白介素-12是由兩個多肽亞基組成的(p35和p40)，但是這兩個亞基分別代表著兩個完全不同而且不相關的基因，3p12-3q13.2(p35)和5q31-q33(p40)的表達產物，而且分別由多個二硫鍵連接(Gubler U.et al.1991Co-Expression Of Two DistinctGenes Is Required To Generate Secreted Bioactive CatatonicLymphocyte Maturation Factor.Proc.Natl.Acad.Sec.USA，884143-47). 作為具有多肽鏈或亞基的藥用多肽在其大規模生產時也總是面臨以上問題。因此迫切需要發展一種簡單而又高效的生產工藝用以明顯地減少表達後修飾，純化，酶切，與此同時達到高產率高質量的產品，無論它的多肽和亞基的構成如何。胰島素產業就是一個很好的例子。
眾所周知，胰島素是由胰腺的朗格罕小體中的beta細胞分泌的，唯一具有降糖功能的天然激素，治療糖尿病的特效藥。糖尿病導致一系列嚴重的併發症。在美國有一千八百二十萬患者，佔人口6.3％。在中國有三千萬患者。由於胰島素的絕對或相對缺失所造成的葡萄糖使用度低下，使得患者並發高血壓，高血糖，嚴重的動脈粥樣硬化，及神經系統，腎臟和微循環疾病。是美國第七位致死的疾病。它也是20-74歲人群中導致失明和腎衰的首要病因。不僅如此，糖尿病患者還面臨著壞疽截肢，心血管疾病，和休克的高發風險。
糖尿病分為I型和II型。I型糖尿病是由於beta細胞退化導致人體自身不能製造足夠的胰島素。這類患者必須依靠外源性胰島素存活。II型糖尿病患者的beta細胞分泌胰島素的功能正常，但是體細胞對胰島素卻不能正常反應。胰島素治療對於II型糖尿病患者克服胰島素抗性也許同樣是必要的。在所有被診斷為糖尿病的患者中大約30％需要每天通過注射，胰島素泵或其他途徑攝入胰島素。糖尿病是一種慢性疾病，目前還沒有根治的辦法。
豬和牛的胰島素早已用來治療糖尿病。但是長期使用動物胰島素將導致明顯的弊端糖尿病的患者體內將產生抗動物胰島素的抗體，從而導致不僅動物胰島素的療效下降，而且注射部位的炎症反應。另外動物胰島素的生產也無法滿足全世界持續增長的需求。
1982年獲準上市的基因工程人胰島素具有許多優點。它沒有動物胰島素的副作用，易於控制質量，原料來源豐富。近來通過改變天然胰島素的一些胺基酸設計了胰島素類似物。其中某些類似物的生物活性甚至超過天然胰島素。並且由於它不容易聚合，所以在臨床應用上可能有更大的優勢。
在天然產物中，人胰島素基因首先表達為前胰島素原。它可以表示為前胰島素原-B-C-A。前胰島素原的信號肽有24個胺基酸，具有起始信號序列的功能。C肽是位於A鏈和B鏈之間的31個胺基酸的連接肽。由於受其在胞質中內質網上的信號肽受體的吸引而引導新生的肽鏈穿過內質網膜進入內質網腔，在內質網腔內有一種與膜結合的蛋白酶將信號肽切除。剩餘的部分稱為胰島素原，在途經高爾基體時在一系列類似於胰蛋白酶/羧肽酶B的作用下在連續兩個鹼性胺基酸序列處切去C肽。A鏈和B鏈正確地盤曲，並最終合成成熟的胰島素分子。這些天然胰島素產生的生化過程早已有許多文獻記載，例如Steiner的文章(Steiner et al.Clin.Invest.Med.9328-36.(1986).)。
目前，在製藥業界主要有兩種方法生產胰島素。第一種方法是人胰島素基因的A鏈與B鏈分別表達於宿主細菌，如大腸桿菌(Escherichia coli)。經過純化以後的宿主細菌表達的兩種多肽經由氧化反應，化學形成A鏈與B鏈間的二硫鍵，體外合成人胰島素。這種方法存在很多缺點。其中最主要的問題是由於A鏈與B鏈間的二硫鍵是隨機形成的。因此產生的分子往往具有不正確的三維結構。這種隨機形成的分子是如此之多，以致於造成具有生物活性的正常的人胰島素產率下降，以及生產成本顯著增加。不僅如此，由於大腸桿菌太小，難以順利接受諸如人胰島素這樣的相對較大的基因，造成了作為宿主細胞的大腸桿菌潛在的產率受到限制。
第二種方法，胰島素原基因在細菌中克隆，並且表達為一條含有A鏈與B鏈，以及為C肽連接的單鏈多肽(B-C-A)。這種方法是基於對天然胰島素合成的過程中C肽所扮演的角色它使得A鏈與B鏈上的半胱胺酸成為空間結構上最適於形成正確的二硫鍵(Bell et al.，Nature 28426-32(1980))。經過表達和分泌之後的C肽在體外被酶切掉，從而使A鏈與B鏈分離。儘管已有各種各樣的方法尋求縮短C肽，但是這種表達後的酶切仍然是這種方法必不可少的步驟。這是一個費時而又耗費成本的工藝過程。上述方法的細節可參閱N.Annibali的美國專利20030104607。總之，至今遺傳工程藥物，諸如胰島素及其衍生物的生產仍在尋求一種簡單而又經濟的新方法。
發明內容
此項發明既涉及方法也涉及一個單一的包括至少兩個表達盒的重組遺傳結構和系統。每個表達盒為目標蛋白的一個肽鏈或亞基編碼。每個表達盒具有自己的5』調控區，無論它編碼的肽鏈或亞基的DNA序列是相同或不同。
此項發明的重組遺傳結構在宿主細胞中表達產生了至少兩條肽鏈或亞基。在重組遺傳結構中的每個表達盒都有一個引導序列，它將各自的翻譯的多肽，即作為所翻譯的多肽鏈的一部分的這種目標蛋白的各個肽鏈或亞基，通過預定的路徑在細胞內加工並分泌至胞外。
作為一個具體實例，這裡選擇的宿主細胞具有將目標蛋白的多個肽鏈或亞基進行表達後修飾的能力。這樣產生的多肽以一種具有生物活性的形式由宿主細胞分泌出來。這也許需要將多肽鏈摺疊成正確的三維結構，例如在正確的位置形成二硫鍵。這也許需要目標蛋白在由宿主細胞內分泌到細胞外液之前進行降解過程及糖基化。
作為另一個具體實例，此發明提供了一個簡單而有效的途徑生產一種具有至少兩條多肽鏈的目標蛋白。這種目標蛋白在天然狀態下是通過表達後的酶解反應形成的。此發明則按照目標蛋白中所包含的肽鏈或亞基的數量，用同樣數量的表達盒來構建一個載體。此項發明證實了這些同時表達出來的，各自不同的肽鏈或亞基，按照正確比例經過細胞加工機制產生所要的目標蛋白。總之，此項發明導致從根本上去掉了用以保持肽鏈之間的正確空間結構的任何連接肽。從而也就避免了翻譯後斷開各個肽鏈的酶切反應，以及相關的多次純化，修飾步驟。總之，以胰島素的生產為例，此項發明顯著簡化了生產工序，提高了產率。
應用此項發明不僅適用於那些在天然狀態下經過翻譯後酶切反應才能產生成熟的蛋白質，而且也適用於那些具有多亞基的，通常是分別表達的蛋白質。以白介素12為例，此項發明可以採用二個表達盒構建的載體編碼白介素12的各個亞基。
因此，一方面，此項發明導致了一種重組遺傳結構用以表達含有兩個以上的肽鏈的目標蛋白，取代了翻譯後酶切生成天然產物的方法。這種重組遺傳結構包括至少兩個表達盒。每個表達盒含有一個序列專門為目標蛋白的一個肽鏈編碼。通過這種重組遺傳結構翻譯表達的目標蛋白避免了天然的產物必需的翻譯後的酶切反應。就天然的哺乳動物的目標蛋白而言，此項發明的重組遺傳結構是由DNA或RNA構成。
另一方面，此項發明導致了基於這種重組遺傳結構的一種蛋白質翻譯表達的新方法。
另外，此項發明涉及由上述重組遺傳結構轉化的一種細胞。這種細胞能夠表達具有生物活性的目標蛋白，譬如它的天然摺疊特性，又如它不需要像天然產物那樣進行翻譯後酶切反應。在一個具體實例中，當目標蛋白分泌出來時至少一個二硫鍵已存在於重組表達的肽鏈之間。在另一個具體實例中，當目標蛋白分泌出來時己糖基化了。
又另一方面，此項發明導致了生產具有生物活性的目標蛋白的新方法。這種新方法包括提供上述由重組遺傳結構轉化的一種細胞，以及通過在這種細胞中的表達的目標蛋白具有生物活性，但是無需像天然產物那樣進行翻譯後酶切反應。
再另一方面，此項發明涉及一個包含以下序列的重組DNA片段 Pm1-Ld1-Pt1-Y1-Tm1-Pm2-Ld2-Pt2-Y2-Tm2， 上面所列的每一元件可操作地連接於相鄰的元件。Pm是酵母啟動子序列。Ld是酵母引導序列。Pt是蛋白酶識別序列。Tm是酵母終止序列。在一個具體實例中，Y1和Y2是為人胰島素的B鏈和A鏈編碼的DNA序列。在另一個具體實例中，Y1和Y2分別是為白介素12的兩個亞基蛋白編碼的DNA序列。
另外，此項發明涉及通過以下方式生產的重組人胰島素分子提供帶有重組遺傳結構的一種真核細胞；這種重組遺傳結構包括含有為人胰島素分子中A鏈編碼的DNA序列的第一表達盒，以及為人胰島素分子中B鏈編碼的DNA序列的第二表達盒；它還涉及這種用於表達的真核細胞，這種重組遺傳結構，重組人胰島素分子及其分泌表達到外周培養液，直至從外周培養液中收穫重組人胰島素分子的全部過程。在一個具體實例中分泌表達的重組人胰島素分子是具有生物活性的。具體實例中列舉的真核細胞是酵母細胞。
前面所述，此發明其它的特點和先進性以及發明本身將在下面的描述和附圖中得以進一步的全面的理解。
圖1是逐一圖示天然人胰島素前體B-C-A的DNA序列(SEQ IDNo1)(上行)與酵母偏好的人胰島素前體的編碼序列(SEQ ID No2)(下行)的比較，以不同顏色的下劃線加以區分。在加粗的5』和3』區域是分別為人胰島素原的B鏈和A鏈編碼的DNA序列。在未加粗的中間區域，是為C鏈編碼的DNA序列。
圖2是圖示多核苷酸「5』-USAp」(上)和「3』-USAp」(下)用於實例1中因具有互補性而相互結合的核酸。在PCR時預期將向兩端延伸的部分以虛線標示。
圖3是圖示實例1的第一步，PCR產物的分子量的瓊脂糖凝膠圖象。PCR的標準標記物顯示了分別位於1K，0.75K，0.5K，0.3K，0.15K和50bp的條帶。第一和第二條帶是由PCR合成的人胰島素前體B-C』-A的DNA序列的樣品。第三和第五條帶是多核苷酸「5』-USAp」的樣品。第四和第六條帶是多核苷酸「3』-USAp」的樣品。
圖4是圖示說明一種基於酵母的穿梭載體pPIC9K的結構和表達胰島素前體B-C』-A的DNA序列。這種描繪的表達載體pPIC9K(B-C』-A)是一種中間結構。
為下一步的載體構建做準備。
圖5是圖示描繪了一種用於實例1的策略用中間質粒pPIC9K(B-C』-A)構建載體pPIC9K(+B+A)。
圖6是一幅中間質粒pPIC9K(+B)用以表達人胰島素B鏈的限制性酶切圖(標記為「B」)。
圖7是一幅中間質粒pPIC9K(+A)用以表達人胰島素A鏈的限制性酶切圖(標記為「A」)。
圖8是一幅最終表達質粒pPIC9K(+B+A)用以表達人胰島素B鏈和A鏈的限制性酶切圖。
圖9是Dot Blot照片。
最左方的IN1，IN3，IN5代表三種濃度遞增的標準人胰島素。其餘的是代表用質粒pPIC9K(+B+A)轉化的細胞外液的樣品。每一行分別代表經篩選出的陽性重子轉化菌株的同一克隆於不同發酵時間0小時，24小時，48小時，72小時，96小時，120小時收集的細胞外液樣品。最下一行9K代表用質粒pPIC9K轉化的細胞外液樣品。
圖10是Westurn Blot照片。
最左方的IN顯示標準人胰島素。條帶1，2，3，4分別代表別代表經篩選出的陽性重子轉化菌株發酵24，48，72及96小時的細胞外液的樣品。
圖11包括三幅高壓液相色譜(HPLC)分析圖 上圖標記為2的樣品代表經篩選出的陽性重組子轉化菌株發酵96小時的細胞外液洗脫曲線。
中圖標記為2+IN代表上述樣品2加上標準人胰島素樣品IN的洗脫曲線。
下圖標記為IN代表標準人胰島素樣品洗脫曲線。
具體實施方式
除非另外註明，本發明這裡所用的全部名詞與以往其它專利中的常規經典名詞的含義相同。尤其是參照了以下參考書的定義和解釋Sambrook et al.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual(Second Edition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.and Ausubel FM et al.(1989)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.。可以理解，本發明所用的定義和解釋並不限於特定的方法，實驗程序和試劑。
這裡所說的「多肽」或「肽鏈」或「亞基」是涉及肽鍵連接的由單鏈胺基酸構成的化合物。這裡所說的「蛋白質」由「多肽」或兩個以上的「多肽」組成。這裡所說的「亞基」是蛋白質的一部分。它是由專一的天然mRNA產生的。與此不同的是這裡所說的「肽鏈」雖然也是蛋白質的一部分，也是由同樣的天然mRNA產生的，但是天然的「肽鏈」對人胰島素而言需要翻譯後的酶切反應。
這裡所說的「生物活性」是表示一個重組子或與它的天然產物相對應合成的蛋白質或多肽所具有的結構的，調控的，生化和生理的功能。
這裡在核酸的陳述中所說的「異源性」是表示這種核酸不是細胞內源性的或基因組的成分。這種核酸一般是由轉化，顯微注射，電轉移等方法導入細胞的。一般這種核酸都有至少一個編碼序列，但是這個編碼序列未必都表達。
這裡所說的「遺傳結構」是表示任何結構或序列涉及遺傳基因序列，例如任何數量的RNA或DNA形式的多核苷酸，以及mRNA，cDNA，人工合成的RNA和DNA，cDNA，天然基因組DNA，和RNAs以及其他反義RNA和DNA衍生物。這種遺傳結構可以是雙鏈或是單鏈，如果是單鏈，它可以是編碼鏈，也可以是非編碼鏈(反義，互補鏈)。這種遺傳結構也可以是全部或是部分表達載體。
這裡所說的「表達載體」是指具有進入並在宿主細胞內表達外源核苷酸能力的載體。
「表達盒」是指一種轉錄單位。這裡所說的表達盒是表達載體的一個單位。它包含一段為通常是外源性的蛋白質或蛋白質組分編碼的核苷酸序列。它通常是可調控的序列，能夠影響這種外源性的蛋白質或蛋白質組分在宿主細胞的表達。一般說來，真核細胞的調控序列包含轉錄啟動子及合適的轉錄mRNA的核糖體結合位點和和轉錄終止序列。
「可操作地連接」或「可操作地聯合」的核苷酸區域是指功能相關的核苷酸區域。例如一個啟動子的核苷酸序列就是與轉錄調控相關的核苷酸序列相關聯；同樣的，一個核糖體的結合位點則與一段編碼蛋白質翻譯相關聯。一般而言，可操作地連接是指鄰接或接近的，在引導區域不光彼此相連而且在閱讀區也是連接的。當然，可操作地連接的諸元件也可以是有間隔的。
這裡所說的「C肽」是指胰島素前體單鏈線狀分子的B-C-A多肽中的連接部分。C肽分別與B鏈的第30位胺基酸和A鏈的第1位胺基酸相連接。
此項發明提供了一個高產簡便的，使用創新性基因表達技術改進的細胞基礎的製藥新工藝。特點之一，構建的表達載體含有多表達盒。每個表達盒為目標蛋白的不同組分編碼。所選擇的宿主細胞具有表達各個組分，並且使其通過加工成為具有生物活性形式的細胞學機能。從而省略了許多現行的工業生產步驟，諸如多次純化，修飾和酶切步驟等。
表達載體 為了採用基因重組方法生產含有多個多肽鏈組分的目標蛋白，此項發明尋求並提供或仿照了天然形態的目標蛋白，同步地，按照正確比率表達各個組分(多肽鏈或亞基)。以前試圖採用單一啟動子控制多組分蛋白質的複合表達的嘗試遇到很多困難。從一開始產率就令人失望。這可能是由於單一啟動子控制的外源性的DNA序列受到了內部的表達效率的限制。不僅如此，單一的啟動子或表達盒所表達的單一的多肽鏈(如胰島素)外源性蛋白質必須經過複雜的酶切步驟使得這種線狀的單一的多肽鏈變成若干肽鏈或亞基並去掉任何連接肽。
因此，本項發明構建了一種含有兩個以上表達盒的表達載體。每一表達盒分別表達目標蛋白的一個多肽鏈或亞基序列。由於每一肽鏈或亞基分別為一個獨立的啟動子所控制，所以無論它的啟動子相同與否，其表達效率均可顯著地改進。在載體中上述表達盒可以是間隔的，也可以是相鄰的。在一個具體例子中，多個表達盒含有相同的啟動子。故而各個表達盒表達每個多肽鏈或亞基的效率相同。
最終載體編碼部分或全部的目標蛋白。譬如，一個成熟的目標蛋白分子有三個不同的組分(多肽鏈或亞基)A，B，和C。一個表達載體含有兩個表達盒，分別編碼組分A和B，即三分之二的目標蛋白。同例中如果表達載體含有三個表達盒，分別編碼組分A，B，和C，則表達載體表達全部蛋白。在本項發明的具體例子中，表達盒的構建與目標蛋白的多肽鏈組分數量一致。如果在成熟目標蛋白中組分A是組分B的兩倍，則在本項發明的表達載體內將含有兩個表達盒編碼組分A，一個表達盒編碼組分B。
每一個表達盒應包括各種表達的調控成分。表達盒由5』調控區域起始並影響著下遊序列的表達。一般而言，真核細胞調控區域含有轉錄啟動子及核糖體結合序列。而表達盒也可以由一段控制轉錄終止的序列(終止子)結束。在本項發明的理想狀態下編碼所要求的多肽組分是與5』調控區域和3』終止序列關聯性。同時，每個表達盒可以包含一個或多個增強序列以增強編碼序列的表達。許多增強序列可以單獨存在。它可存在於表達盒之外的表達載體上下遊的其它位置。部分或全部調控成分，如全部5』調控區域，啟動子，引導序列，終止序列和任選性增強序列等要素在多表達盒中可以是相同也可以是不同的。在特定實例中的5』調控區域，啟動子和mRNA核糖體結合位點在每一個表達盒都是相同的。對多肽各個組分編碼的轉錄和翻譯的控制也都是相同的。這也就是說步調一致的複合表達是最理想的。
宿主細胞通過表達載體所進行的多肽的表達，其中每個表達盒可以包含一個引導序列作為它的一部分。這個引導序列翻譯為信號肽，從而促使外源性的多肽組分進入所要求的細胞內加工途徑。例如將翻譯的多肽轉移至內質網，然後進入高爾基體並最終分泌出體外。在理想狀況下，一旦信號肽被宿主細胞識別和加工，這個多肽就作為目標蛋白分泌到體外的培養基。信號肽在這過程中或之後不久被酶解。為確保無誤，表達盒可以編碼一個序列，使得一種蛋白酶可以識別並切掉它。一種蛋白酶識別序列是賴胺酸-精氨酸，可以被內切酶Kex2識別並在精氨酸和相鄰的下遊胺基酸之間酶解。這個信號肽-編碼引導序列，以及本項發明中遺傳結構的任何其它成分相對於產生蛋白質的宿主微生物既可以是同源性的也可以是異源性的。
一旦獲得適當的目標蛋白克隆的多肽組分(肽鏈或亞基)，無論它是源於cDNA或基因組，採用通用的重組表達技術，將其序列插入表達盒。最好是讓這些克隆的編碼與宿主細胞匹配。在一個具體例子中，所有表達盒的組分除了外源性多肽組分的序列之外都是相同的。這就造成了目標蛋白的各個多肽組分的表達條件達到最大限度的同步化與同質化，以便達到同時，等量地進行複合表達。
按照本項發明的方向，具體實例的遺傳結構含有多表達盒。每個表達盒有以下序列 Pmn-Ldn-Ptn-Yn-Tmn Pm代表啟動子序列，Ld代表引導序列，Pt代表蛋白酶識別序列，Y代表目標蛋白的各個肽鏈或亞基的編碼序列，Tm代表終止序列，n代表指數符號。所列的每一組分都是首尾相連的。很明顯，公式中各組分之間可能有也可能沒有外加的序列。一個組分可能與相鄰的組分重疊。譬如，蛋白酶識別序列(Pt)可能是引導序列(Ld)的一部分。
如果一個蛋白質有兩個或兩個以上不同的多肽鏈或亞基，則此發明的表達盒(兩個)中的具體含義是 Pm1-Ld1-Pt1-Y1-Tm1-Pm2-Ld2-Pt2-Y2-Tm2， 其中Y1和Y2代表著各自蛋白質的肽鏈或亞基。
任一個合適的表達載體均可以承擔此發明中用以表達遺傳重組結構的任務。許多原核或真核生物的表達載體已被商業化。用以試圖構建一個遺傳結構起點表達載體選擇的知識含在本發明的知識範圍之內。一般而言，用以實施本發明的公用載體是質粒，病毒(包括噬菌體)，可以整合的DNA片斷(即可用遺傳重組方式整合進入宿主的片斷)。或者可說，此表達盒可以有一或多個拷貝穩定地插入到宿主細胞的特殊位點，它也可能整合至額外染色體或小的染色體元件上。
大多數質粒均包含有各種調控元件。例如，優秀的酵母載體均具有由原始的內源的2微米的酵母質粒或是ARS使此質粒以高拷貝數在酵母細胞中增殖。著絲粒(CEN)序列則限制了質粒在酵母細胞中複製、拷貝數量增殖的能力。還應注意有它的終止序列。
這些載體可以獨位於宿主全面複製，作為質粒，它也可以整合到染色體上，正如整合的DNA片斷一樣。最好的條件下，其載體含有複製及調控序列，而這些序列則來源於所希望的表達宿主。例如，在宿主細胞中可行使啟動子的是一段可結合該宿主細胞的RNA聚合酶的一段序列，它還可以用作該宿主細胞核糖體結合的序列。
首選的表達質粒還要具有一個或多個選擇標記基因。由此，可以提供轉化的型態的選擇，它們可以是真核生物的二氫葉酸還原酶或新黴素的抗性特性；也可以是原核生物E.coli的四環素或氰黴素的抗性特徵。插入構建的表達盒到表達質粒上是已知的重組表達的重要技術，它會在以後的例子中詳細說明。合適的用於原核及真核生物宿主克隆及表達載體也可見於Sambrook等的介紹中。
在此發明的具體技術描述中重點說明的是一種酵母載體。任一種在酵母系統中行使功能的啟動子都可能被使。酵母載體中有用的促進序列包括下面啟動子，它們是金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶，或者是其它的糖分解酶，如烯醇甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構酶，3-磷酸甘油酸酯變位酶，丙酮酸激酶，3磷酸異構酶，磷酸葡萄糖異構酶，這些終止序列與異質3』-端相連接，以便提供Poly(A)和促使mRNA的終止。在製備本發明的良好的表達載體時，翻譯的起始位置可以參照大多數酵母細胞中給於有效表達的核酸序列(見Cigan，M.andDonanne，T.F.，Cene，591-18(1987)中有關優秀的翻譯起始位點的描述)。
宿主細胞 本發明適當地採用了真核表達系統。因為原核系統沒有翻譯之後的修飾及摺疊的細胞機制，在已知的修飾內容方面，其中有的已被述及，但不限於這些。它們是乙醯化，乙醯化作用，醯胺化，ADP-核糖化(ribosylation)，糖基化，GPI-錨狀物形成，酯數及酯衍生物的共價結合，甲基化，myristlyation，pegylation，異戊烯化，磷酸化，ubiguitination或任意其它相似的過程。
在具體實踐中，該表達載體被引入真核細胞，其上所攜帶之為各種表達盒所編碼的蛋白鏈或亞基在此細胞中通過其自身存在的分泌途徑，分泌正確摺疊的成熟蛋白質，其中之一，使用的就是以酵母為宿主的細胞。
酵母具有分泌機制，它的這種分泌機制與哺乳動物的分泌系統是一致的，其中包括它的摺疊能力，蛋白水解過程，糖基化等與哺乳動物方式一致。當使用適當的載體，酵母則可以遞送表達的蛋白於細胞外，回收和純化這些在培養液中蛋白質所使用的程序也與哺乳動物相似，甚至其收率比從哺乳動物中回收和純化它們更高。另外，該分泌系統還提供了適合所獲蛋白二硫鍵形成的環境(Smith等，schenee 2291219(1985)) 在各種酵母中啤酒酵母已被用於生產許多種蛋白質。一般情況下，啤酒酵母利用它的成熟因子(α-因子)作蛋白表達，該成熟因子由信號肽(pre)和其後的前序列組成。信號肽序列由19個胺基酸組成，而前序列則由66個胺基酸組成，其中包括N-糖側基及具兩個鹼性胺基酸的Kex2內切酶的酶作用位點(waters等，JBC，2636209-14(1988))。然而，現行的利用啤酒酵母的方法經常面臨由於較弱能力的啟動子和過早蛋白酶作用的問題。
作為甲醇酵母的Pichia pasteris，在此發明中顯示出獨特的優點，這些單細胞的有機體具有大量生產外源蛋白質的能力。它們可以在缺少葡萄糖的情況下利用甲醇作唯一碳源而生長，而且在大容量的發酵罐中保持高密度生長，依不同的蛋白質，在此表達系統中可以獲得比其他系高10-100倍產量的結果。例如，Pichia pasteris細胞可以生長到高密度，利用它的乙醇脫氫酶啟動子AOXI，這個啟動受甲醇的嚴格控制。結果，在不影響其生長的情況下異源蛋白由於甲醇的誘導獲得高表達。另外，甲醇酵母具有產生許多高等生物細胞進行翻譯後修飾的能力，這些修包括蛋白酶水解，蛋白質摺疊，二硫橋的形成及糖基化，這就使得此系統成為工業化生產的理想的表達系統。
Pichia Pastoris是12個種4個屬中可以利用甲醇的一種酵母(CreggJ.等，Biol Technology 11905-910(1993))。其分泌機制，P.Pasteris和啤酒酵母是相同的(Wang，Y.等，BiotechnologylBioengineering 7374-79(2001))。另一個可有效利用甲醇的酵母表達系統是Hansenula polymorpha，該4個可利用甲醇的酵母屬是Pichia，Candida，Hansenula和Torulopsis。請注意，除上述甲醇酵母外，其它種的酵母是啤酒酵母和Kluyvoromyces lactis，它們也可以被使用於本發明中。
當一個細胞系被選作為表達系統或宿主，或多個攜帶有本發明所構建的重組遺傳結構的載體單位引入宿主細胞時，這也意味著本發明中所用宿主細胞也為本發明的經遺傳技術構建的載體所改造，並能產生為重組技術構建的蛋白質或多肽。宿主細胞也被遺傳改造(即轉導，轉化，轉染)。較好的情況是，該表達載體會有1個或多個可選擇的標誌基因，因此經遺傳工程改造的宿主細胞可以以容易的方式選擇。
經遺傳工程改造過的宿主細胞可以在傳統的營養培養基中生長，這種營養基已被改造以適合於激活啟動子，選擇轉化子或擴增異質序列編碼的基因。培養條件中如溫度，pH類似於以前選作表達的宿主細胞培養的條件，它們將作為本發明的內容。收集和鑑定這些表達的蛋白質或多肽的技術，包括分離，純化，修飾和裝配等也屬本發明的常規技術。
本發明由下面實驗驗證，但不限於這些實驗。
實驗1 為了獲得具生物活性的人胰島素，在一種酵母宿主中引入通過由具A、B鏈分別表達的質粒，這種酵母，細菌的穿梭質粒為pPIC9K，其中可用如下公式表示 Pm-Ld-Pt-Y1-Tm-Pm-Ld-Pt-Y2-Tm 這裡，Y1是編碼A鏈的DNA序列，而Y2則為編碼B鏈的DNA序列，由於所用宿主為甲醇酵母P.Pasporis，所以Y1和Y2為酵母偏好密碼子，而其它元件如下述公式 Aox1Pm-YeastLd(s)-Kex2位點-Y1-Aox1Tm- Axo1Pm-YeastLd(s)-Kex2位點-Y2-Aox1Tm， 這裡，Yeast Ld序列翻譯為信號(肽)(前)序列，而後為原序列。其羧端是一個「Lys-Arg」的短序列，它是Kex2的酶切位點。
1.載體的構建 載體構建的策略簡述如 第一步以酵母偏好編碼的人胰島素原B-C』-A類似序列的5』及3』端分別含有內切酶SnaB1和Notl位點由PCR合成。其中「C』」是人胰島素天然「C」鏈的類似物，利用它們的SnaBI和NotI位點，此B-C』-A編碼序列可以插入到特定的表達盒上，這個表達盒位於pPIC9K質粒的Aox1啟動子之後，得到表達質粒pPIC9K(B-C』-A)。
第二步以pPlC9k(B-C』-A)為模板，以兩端分別有XhoI和EcoRI識別位點的產物的PCR合成B片段，經酶處理後插入到pPIC9K，獲得表達B鍊表達盒的質粒，稱為pPIC9K(+B)。
第三步第二步中的「B」為「A」代替所得質粒各為pPIC9K(+A) 第四步以pPIC9K(+A)為模板，以兩端均為Aat II識別位點為末端的兩條產物，PCR合成帶完整A鍊表達盒的片段。
第五步把由第四步及第二步合成的片段及質粒用Aat II處理並連接、轉化、篩選質粒得pPIC9K(+B+A)，其中含有兩個分子的表達盒，一個表達B鏈，另一個表達A鏈。
此文中某些步驟以不同的順序進行，但本實例所採用的是標準的分子生物學程序，見Ausnbel，F.M.，等所編「分子克隆實驗指南」第二版(1992)，具體程序如下 <第一步中間體質粒pPIC9K(B-C』-A)的構建。
見圖1SEQ ID NO1是天然的胰島原(B-C-A)來源於NCB1網上的資料庫的DNA序列，SEQ ID NO2是酵母偏愛序列，其兩者不同的以下橫線標出。
圖1中5』和3』端實線部分分別標明為B及A鏈序列，各中間細線部分則為C鏈序列。
為了簡化程序，其C鏈以「C』」標明，本發明以兩個胺基酸密碼子代之，即「AAAAGA」，當然，C鏈還可以是不同長度或不同的胺基酸編碼序列。相應的，兩條單鏈寡聚核苷酸，SEQ ID NO3和4，分別是B和A鏈的編碼序列，其中包括有C』序列。其結果，此成對的寡聚核苷酸可互作為模板和引物以PCR形式合成目的B-C』-A鏈。其兩條寡聚核苷酸分別為 5』-USAp(100nt)(SEQ ID NO3) 5』-
TTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACT-3』， 3』-USAp(100nt)(SEQ ID NO4) 5』-ATAT
TTAGTTACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAAGAACAAATAGAAGTACAACATTGTTCAACAATACCTCTTTTAGTCTTTGGAGTGTAGAAGA-3』 上述二個寡聚體的最後3』端20個核苷酸彼此互補的(下橫線是)，這些互補部分在PCR中被此作為引物。其結果是獲得B-C』-A的前胰島素類似物。5』-USAp的5』端有內切酶snaB1位點，以雙下橫線標系。而3』-USAp的5』-端則有酶NotI的酶切位點，也是雙下橫線示出。
上述二條多核苷酸5』-USAp和3』-USAp由Integrated DNATechaologies Iac(Coralville，IA USA)合成。(B-C』-A)的PCR合成在預冷於冰浴的0.5ml的微型離心管中按以下順序加入5ul 10倍濃度的緩衝液，8.5ul每種含1.25mM濃度的dNTP，10ul的5』USAp(50-100ng)，10ul的3』USAp(50-100ng)，0.5ul Taq DNA聚合酶(5u/ul)，加ddH20至50ul。反應在自動控溫PCR儀中進行94℃4分鐘，55℃2分鐘，72℃3分鐘。如此5個周期。產物用0.7％的瓊脂糖凝膠鑑定(圖2)。證明獲得了預期的184bp片斷。
酵母穿酸質粒pPIC9K購自美國Invitrogen，圖4中有Kanamyin抗性基因、氰黴素抗性基因及組氨酸標誌。因此，無論在細菌或酵母中轉化細胞時，均可被選擇並在組氨酸缺陷型中選擇出具高抗性的個體。pPIC9K中的表達盒，即先頭含有5』-AOX1的啟動子及末尾含3』-AOX1終止(TT)的部分，也包括有指導基因表達產物分泌的引導序列(「S」)和蛋白質內切酶Kex2位點以及由質粒PBR322來的E.coli的複製位點。
膠純化上述B-C』-A片斷及質粒pPIC9K以內切酶SnaBI和NotI酶切，然後彼此連接。其連接產物轉化TOP10F』(E.coli)細胞。轉化子由酶切應證。
轉化子進一步由TakaRa Biotechology(Dalion)公司序列分析確定。其結果如下(SEQ ID NO5) 5』-GCATTACGTATTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACT
GGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGTTCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAAGCGGCCGCATAT-3』 其中，5』-及3』-兩端是SnaBI和NotI，以單下橫線標示，C』-肽則以雙下橫線標示。同源性由DNAMAN軟體分析，與PCR B-C』-A序列完全一致。圖5表明了pPIC9K(B-C』-A)與pPIC9K(+B+A)兩者之間的對比結果。以上所作，以下第二至第五步中有較詳細的說明。
下面兩條寡聚核苷酸是TaKaRa Biotechnology公司合成的，用它們作為引物，以pPIC9K(B-C』-A)作模板， 5』-引物(36nt)(SEQ ID NO6) 5』-ATCTCTCGAGAAAAGATTCGTTAACCAAC ACTTGTG-3』 3』-引物(36Nt)(SEQ ID NO7) 5』-ATCTGAATTCATCTTAAGTCTTTGGAGTGTAGAAGA-3』 它們的5』端有XhoI識別位點，而3』端有EcoRI識別位點，以下單橫線標明。
按上述PCR條件經30個循環合成出B鏈的122bp長度的DNA鏈(如下)，其兩端分別含有XhoI和EcoRI酶切位點，以下單橫線標出。
5』-ATCTCTCGAGAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACTTAAGATGAATTCAGAT-3』 PCR產品用XhoI和EcoRI消化並純化。插入也用XhoI和EcoRI消化的質粒pPIC9K，然後一起形成另一個如圖6所示的中間的載體pPIC9K(+B)。通過限制性酶分析選擇和鑑定陽性重組體。
下列寡聚核苷酸由TakaRa Biotechnology公司合成，以pPIC9K(B-C』-A)作為模板 5』-引物(36nt)(SEQ ID NO9) 5』-ATCTCTCGAGAAAAGAGGTATTGTTGAACAATGTTG-3』 3』-引物(36Nt)(SEQ ID NO10) 5』-ATCTGAATTCATCTAGTTACAGTTAGTTTTCCAATT-3』 XhoI和EcoRI切點以下單橫線標示。
按前述PCR條件，經30個循環後，合成出95bp的片斷如下其5』-及3』-端各含有XhoI及EcoRI酶切位點，由下單線示之 5』-ATCTCTCGAGAAAAGAGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGTTCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAGATGAATTCAGAT-3』 上述PCR產物用Xhol及EcoR1雙酶切，與也用上述二酶酶切後的pPIC9K連接得另一個中間體質粒，即pPIC9K(+A)。如圖7，其正重組子用酶切確證。
下述二寡核苷酸由Takaka Biochnology公司合成，以pPIC9K(+A)為模板。
5』-引物(30Nt)(SEQ ID NO12) 5』-ATCTGACGTCAGATCTAACATCCAAAGACC-3』 3』-引物(30Nt)(SEQ ID NO13) 5』-ATCTGACGTCAAGCTTGCACAAACGAACTT-3』 其5』-端及3』-端均分別含有AatII酶切位點，以下橫線示之。
採用上述PCR條件，30個合成周期，其PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳確認。膠回收法獲得長1697bp片斷，其結構以下式表示 AatII-5』AOX1啟動子-S-插入序列A-3』AOX1(TT)-AatII 上述含1697bp5』-AOX1啟動子-S-插入序列A-3』-AOX1(TT)的片斷與pPIC9K(B)均經AatII酶切，連接，轉化，選擇，其最終表達質粒pPIC9K(+B+A)，經酶譜分析而獲得(見圖8)。
2.宿主細胞的培養，轉化與重組子的特徵鑑定 宿主細胞的培養，轉化與轉化子的鑑定等均按David R.Higgins等(Pichia Protocols，edited by D.Higgins and J.Cregg，Humana Press(1998))推薦的方法進行，大致過程包括GS115的培養，轉化，重組子的選擇，表現型(-his+葡萄糖1-his以及+甲醇)確定。Mut表現型的選擇及表達試驗搖瓶或發酵罐中高表達株的選擇等。
轉化及其選擇阻性重組子的程序如下GS115感受態細胞製備；pPIC9K(+B+A)DNA以酶SalI線性化後加入細胞，混勻後加到0.2轉化管中；其電擊條件為1.5KV， 2.5μF，200ohm，電擊後T1和T2在4-5之間為好；用1.0ml 1.0M的山梨醇洗出；塗布於MD/-HIS平板上，30℃24小時後檢查酵母斑；挑單個菌落分別塗布於葡萄糖選擇培養皿(MD)或甲醇選擇培養皿(MM)上，在MM平板上生長迅速的是Mut+，其它的是Muts(甲醇緩慢利用型)；重新接種到含G418不同濃度的平板上，篩選抗性最大(即插入拷貝數量最高)的菌落，保存備用。
為表達載體pPIC9K(+B+A)成功轉化的菌株GSGT1註冊並保存於中國武漢，武漢大學中國典型培養物保護中心。
3.人胰島素的表達 先置高拷貝轉化子於25ml的MGY培養基中30℃，300rpm培養過夜(OD600＝4左右)，轉入1升的MGY培養基中30℃300rpm培養至生長對數期(OD600＝4.0左右)，2500xg室溫下離心5分鐘，沉澱物重新懸浮於BMMY培養基中(OD600＝1.0)，30℃，300rpm繼續培養，每天補加100％的甲醇至培養液中，含0.5％的甲醇以誘導胰島素B和.A鏈的表達，每4小時以氣相色譜法監測甲醇含量。如此培養90小時左右。2500xg室溫下離心5分鐘，上清液於-80℃下保存備用，宿主細胞可加入新鮮培養基繼續培養，從上述離心上清液中分離人胰島素。
上清中的表達產物沉澱濃縮之後，至少經微孔過濾，疏水反應層析或離子交換層析等純化程序。表達的上述胰島素通過反向HPLC純化。
4.產品質量鑑定 上述上清產品通過沉澱濃縮，並通過免疫Blot和Western Blot確認。圖9是免疫Blot實驗結果的圖解。以標準免疫Blot方式進行，使用的是鼠抗人胰島素的抗體。(Code No2D11-45.Santa CrnzBiotechnology，lnc.，Santa Craz.Colifornia.USA)。最左邊的是依次增加人胰島素濃度的陽性對照(1N1至1N5)。其它為不同經重組載體pPIC9K(+B+A)轉化過的單菌落在不同生長時段所收集的上清產品。「9k」為經pPIC9轉化的宿主細胞在不同生長時期收集的培養上清，以它作為空白對照。正如圖9所示，三株轉化子菌株B36、C320和D138人胰島素的表達量均以發酵時間的增長而增加。
圖10是Western Blot結果的照片。按標準的Western Blot方法進行，所用的是老鼠的抗胰島素的克隆抗體(Code N0ID11-H5)。最右邊的標以「1N」的是標準的人胰島素。其它的則為用重組質粒pPIC9K(+B+A)轉化的不同菌株的培養液。1-4分別為發酵24，48，72和96小時的發酵液。圖10中一條可見的為72小時發酵獲得的蛋白帶與標準的人胰島素相一致。圖9與圖10共同說明人胰島素來B和A鏈分別在轉化的Pichia Pastoris細胞中得到了表達並裝備分泌成人胰島素。
圖11，為HPLC檢測胰島素表達水平的洗脫曲線。三個圖均有一個共同的洗脫峰，即24.5分鐘，內部標準胰島素洗脫位置表明完全與表達產生的胰島素相同。與標準胰島素相比，在該系統中表達的胰島素約為400mgle，洗脫峰進一步份SDS-PAGE分析(結果專列出)及Western Blot分析(見圖10) 有多種方法可以用以測試所表達的胰島素的生物活性。例如，分別給40個健康，正常的老鼠腹腔內注射0.2ml的經純化的表達產物。20分鐘之後，從它們中取血。將它們作為試驗組。3小時之後，當這些老鼠的血糖恢復到正常狀態，再用人胰島素再給上述40支老鼠腹腔注射0.2ml，之後又20分鐘，從上述注射的老鼠中取血作為陽性對照組，前面以表達的產物和商業的胰島素在正常情況下注射所收集樣品作為負對照組，此之組中的血糖水平進行及生物學分析。如果試驗顯示出血糖水平的降低，則證明有生物活性。其所試產品的i.u(國際單位活性)可由與已知正陽性組比較計算出來。
實驗2 這裡介紹另一種構建重組表達載體pPIC9K(+B+A)的程序，其中主要特徵是省掉了實驗1中中間體pPIC9K(B-C』-A)的構建。下面介紹兩者之間的主要不同點，相同的則於以省略。
根據圖1中所用的酵母系統好的編碼子，如下法獲取人胰島素B鏈的DNA片斷，兩條3』-端尾部相互補的寡聚核苷酸是 5』-Oligo(71Nt)(SEQ ID NO14) 5』-GCTA
AAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTT-3』 3』-Oligo(70Nt)(SEQ ID NO15) 5』-TAGC
TTAAGTCTTTGGAGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACCACAAACCAAGTACAAAGCTTCA-3』 上述二寡聚體3』-端20個核苷酸SEQ ID NOS14和15彼此互補，如同圖2中的寡聚核苷酸，它們互補並彼此作為引物於PCR中彼此延伸(虛線部分)。結果獲得了雙鏈的B鏈。在SEQ ID NO14的5』-端有Xho1酶切位點，以雙下橫線標明。在SEQ ID NO15的5』-端則有Notl酶切位點，也以下雙橫線標明。
照PCR按實驗1的程序進行，5個循環，獲得121bp長度的DNA片斷。該片斷並被插入pPIC9K便組建出中間載體pPIC9K(+B)。其作法是上述膠純化的B片斷以酶XhoI和Notl酶切，而質粒pPIC9K先以Notl完全酶切，而後再以XhoI部分酶切，從酶切混合物膠中回收大片斷，並與已酶切過的B片斷連接，連接產物轉化TOP10F』E.coli細胞，並由轉化細胞中製備中間體質粒pPIC9K(+B)DNA。
選擇陽性重組子，並以限制性內切酶和電泳法鑑定。插入的B片斷作進一步的序列分析，與已知序列對比，確認為(SEQ ID NO16) 5』-TTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACT-3』 與上述實驗1相同，下面二條寡聚體也採用圖1中酵母偏愛密碼子，由人胰島素前體合成其A片斷 5』-Oligo(90Nt)(SEQ ID NO17) 5』-GCTA
AAAAGAGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGTTCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAAGCGGCCGCGCTA-3』 3』-Oligo(90Nt)(SEQ ID NO18) 5』-TAGC
TTACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAAGAACAAATAGAAGTACAACATTGTTCAACAATACCTCTTTTCTCGAGTAGC-3』 為SEQ ID NO175』-端的XhoI識別位點和SEQ ID NO18 5』-端NotI識別位點分別以下雙橫線標明。
以實驗第一步的方法進行PCR反應，獲得所需91bp的片斷，此片斷及pPIC9K同樣以XhoI及NotI酶切，連接。轉化TOP10F』細胞後，其插入片斷以上述同樣方法進行鑑定。
<第三步A鍊表達盒以實驗1中第4步的方法製備。
<第四步最後表達質粒pPIC9K(+B+A)按實驗1中的第五步進行。
實驗3 按實驗1和2中介紹的方法，可以推廣應用於構建兩個分子表達盒於同一表達載體上，於體內表達和裝備兩個異源二聚體的蛋白分子。如白介素12。其中一個用於表達白介素12的P35，另一個則用於表達白介素12的P40的編碼序列。
相同的載體和宿主也可以用作白介素12的生產。即改變實驗1和2用於表達人胰島素的B鏈可以用來表達白介素12的P35，而用於表達人胰島素A鍊表達盒可以用來表達白介素12的P40鏈。其改變的細節可見於具體實驗中。
本文上面公開的專利文獻和科學出版物引入本文以供參考。
本發明已用一定的具體實施方式
描述以便使其各個方面可以更充分地理解，不是為了將本發明限制於這些個別具體的實施方式。相反，是為了覆蓋所有的可能包括在本發明附帶的權利要求中限定的範圍內的替換物、修飾和等價物。
序列表
基諾藥業(Genoteins Pharmaceutical Inc.)
多重蛋白鏈或亞單位的共表達
P12988MXD
CN 200410061039.0
2004-11-03
18
PatentIn version 3.3
1
261
DNA
Homo sapiens
1
tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct actgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcctggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaacta g261
2
261
DNA
酵母
2
ttcgttaacc aacacttgtg tggttctcac ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60
gaaagaggtt tcttctacac tccaaagact agaagagaag ctgaagactt gcaagttggt 120
caagttcaat tgggtggtgg tccaggtcct ggttctttgc aaccattggc tttggaaggt 180
tctttggaaa agagaggtat tgttgaacaa tgttgtactt ctatttgttc tttgtaccaa 240
ttggaaaact actgtaacta a261
3
100
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
3
gcattacgta ttcgttaacc aacacttgtg tggttctcac ttggttgaag ctttgtactt 60
ggtttgtggt gaaagaggtt tcttctacac tccaaagact100
4
104
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
4
atatgcggcc gcttagttac agtagttttc caattggtac aaagaacaaa tagaagtaca 60
acattgttca acaatacctc ttttagtctt tggagtgtag aaga 104
5
184
DNA
Artificial
PCR產物
5
gcattacgta ttcgttaacc aacacttgtg tggttctcac ttggttgaag ctttgtactt 60
ggtttgtggt gaaagaggtt tcttctacac tccaaagact aaaagaggta ttgttgaaca 120
atgttgtact tctatttgtt ctttgtacca attggaaaac tactgtaact aagcggccgc 180
atat 184
6
36
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
6
atctctcgag aaaagattcg ttaaccaaca cttgtg36
7
36
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
7
atctgaattc atcttaagtc tttggagtgt agaaga 36
8
122
DNA
Artificial
PCR產物
8
atctctcgag aaaagattcg ttaaccaaca cttgtgtggt tctcacttgg ttgaagcttt 60
gtacttggtt tgtggtgaaa gaggtttctt ctacactcca aagacttaag atgaattcag 120
at 122
9
36
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
9
atctctcgag aaaagaggta ttgttgaaca atgttg36
10
36
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
10
atctgaattc atctagttac agttagtttt ccaatt 36
11
94
DNA
Artificial
PCR產物
11
atctctcgag aaaagaggta ttgttgaaca atgttgtact tctatttgtt ctttgtacca60
attggaaaac tactgtaact agatgaattc agat94
12
30
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
12
atctgacgtc agatctaaca tccaaagacc 30
13
30
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
13
atctgacgtc aagcttgcac aaacgaactt 30
14
71
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
14
gctactcgag aaaagattcg ttaaccaaca cttgtgtggt tctcacttgg ttgaagcttt 60
gtacttggtt t 71
15
70
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
15
tagcgcggcc gcttaagtct ttggagtgta gaagaaacct ctttcaccac aaaccaagta60
caaagcttca 70
16
90
DNA
Artificial
PCR產物
16
ttcgttaacc aacacttgtg tggttctcac ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt60
gaaagaggtt tcttctacac tccaaagact 90
17
90
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
17
gctactcgag aaaagaggta ttgttgaaca atgttgtact tctatttgtt ctttgtacca60
attggaaaac tactgtaagc ggccgcgcta 90
18
90
DNA
Artificial
合成的寡核苷酸
18
tagcgcggcc gcttacagta gttttccaat tggtacaaag aacaaataga agtacaacat60
tgttcaacaa tacctctttt ctcgagtagc 90
PCT/RO/134表
涉及微生物或其他生物材料保藏的證明
(PCT條約13bis)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重新列印)
權利要求
1.一種重組遺傳結構，用於表達具有在天然生產中通過翻譯後形成的至少兩條鏈的目標蛋白，所述重組遺傳結構包括至少兩個表達盒，每一個表達盒包括對應於所述目標蛋白一條鏈的序列，其中，所述重組遺傳結構的翻譯在不需要如天然生產一樣的翻譯後酶切的情況下表達所述目標蛋白。
2.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，其中所述目標蛋白是哺乳動物蛋白質。
3.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，其中所述目標蛋白包括胰島素分子。
4.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，其中所述至少兩個表達盒是緊密相鄰的。
5.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，其中所述至少兩個表達盒都包含相同的5』端調控區。
6.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，其中所述至少兩個表達盒都包含彼此相同的5』端調控區，以及彼此不相同的目標蛋白亞基的DNA序列。
7.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，其中所述至少兩個表達盒都有相同的引導序列。
8.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，其中第一個表達盒包含可操作地連接於第一引導序列的編碼目標蛋白的第一條鏈的序列，第二個表達盒包含可操作地連接於第二引導序列的編碼目標蛋白的第二條鏈的序列，這兩個引導序列則能夠誘導各自的表達盒所表達的產物進入自然的分泌途徑。
9.根據權利要求8所述的重組遺傳結構，其中所述第一條鏈與所述第二條鏈是不同的。
10.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，包含如下序列
Pm1-Ld1-Pt1-Y1-Tm1-Pm2-Ld2-Pt2-Y2-Tm2
其中每個列出元件可操作地連接於相鄰的元件，Pm代表啟動子序列；Ld代表引導序列；Pt代表蛋白酶識別序列；Y1和Y2則分別代表目標蛋白的不同的鏈各自的序列；Tm則代表終止序列。
11.根據權利要求10所述的重組遺傳結構，其中Pm1和Pm2基本上是相同的，Ld1和Ld2基本上是相同的，Pt1和Pt2基本上是相同的，Pt1和Pt2基本上是相同的，Tm1和Tm2基本上是相同的。
12.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，包括DNA。
13.根據權利要求1所述的重組遺傳結構，包括RNA。
14.由權利要求1所述的重組遺傳結構表達的是蛋白質。
15.一種細胞包括用於表達在自然生產中具有通過翻譯後剪切形成的至少兩條鏈的目標蛋白，一種重組遺傳結構包括至少兩個表達盒，其中每一個表達盒基本上與所述目標蛋白的一條肽鏈相對應，並且所述細胞通過所述重組遺傳結構在沒有所述目標蛋白的天然生產過程中所需的翻譯後剪切的情況下能夠表達具有生物活性的目標蛋白質。
16.根據權利要求15所述的細胞，其中所述細胞是一種真核細胞。
17.根據權利要求15所述的細胞，其中所述細胞是一種酵母細胞。
18.根據權利要求15所述的細胞是選自pichia，Hansenula、Candida和Toralopsis等酵母菌株。
19.根據權利要求15所述的細胞，其中所述重組遺傳結構包含如下序列
Pm1-Ld1-Pt1-Y1-Tm1-Pm2-Ld2-Pt2-Y2-Tm2
其中每個所列元件可操作地連接於相鄰的元件，Pm代表啟動子序列、Ld代表引導序列、Pt代表一種蛋白酶識別序列、Y1和Y2分別代表目標蛋白質的不同的鏈的序列，Tm代表終止序列。
20.根據權利要求19所述的細胞，其中Pm1和Pm2是相同的，Ld1和Ld2是相同的，Pt1和Pt2是相同的，Tm1和Tm2是相同的。
21.根據權利要求19所述的細胞，其中所述蛋白酶識別序列編碼Kex2作用位點。
22.根據權利要求19所述的細胞，其中所述引導序列編碼一種信號肽，該信號肽引導由所述重組遺傳結構表達的多肽通過所述細胞的分泌途徑。
23.根據權利要求22所述的細胞，其中所述目標蛋白質以其天然的摺疊構象被分泌。
24.根據權利要求22所述的細胞，其中在至少兩條不同的鏈之間形成至少一個二硫鏈，以形成分泌時的目標蛋白。
25.根據權利要求22所述細胞，其中所述目標蛋白質在分泌過程中被糖基化。
26.根據權利要求15所述的細胞，其中所述目標蛋白質包含胰島素。
27.根據權利要求15所述的細胞，其中所述重組遺傳結構包含DNA。
28.目標蛋白質是由權利要求15所述的細胞表達。
29.一種用於生產生物活性目標蛋白的方法，所述目標蛋白具有在自然生產情況下通過翻譯後剪切形成的至少兩條鏈，所述方法包括以下步驟
(a)提供一種具重組遺傳結構的細胞，其中所述重組遺傳結構包含至少兩個表達盒，每一個表達盒包含基本上相應於目標蛋白質的一條鏈的序列；以及
(b)在無需自然情況下要求的翻譯後剪切的情況下通過所述細胞表達所述生物活性的目標蛋白質。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述目標蛋白質包含具有兩條鏈的胰島素，並且所述重組遺傳結構包含兩個表達盒。
31.根據權利要求29所述的方法，其中所述細胞是酵母細胞。
32.重組DNA，由如下序列組成
Pm1-Ld1-Pt1-Y1-Tm1-Pm2-Ld2-Pt2-Y2-Tm2
其中每一個所列元件是可操作地彼此相鄰連接的，Pm代表酵母啟動子序列，Ld代表酵母引導序列，Pt代表蛋白酶識別序列，Tm代表酵母終止序列。
33.根據權利要求32所述的重組DNA，其中，所述酵母是PichiaPastoris。
34.根據權利要求32所述的重組DNA，Pt1和Pt2中的至少一個包括賴氨酸密碼子，而後跟一個精氨酸密碼子。
35.根據權利要求32所述的重組DNA，其中Y1和Y2分別代表人胰島素的B鏈和A鏈的DNA序列。
36.根據權利要求32所述的重組DNA，其中Y1和Y2分別代表一種細胞因子的兩個亞單位。
37.根據權利要求36所述的重組DNA，其中所述細胞因子是白介素12。
38.一種重組人胰島素分子，通過如下步驟生產
(a)提供一種真核細胞，其包含由第一個表達盒和第二個表達盒組成的重組遺傳結構，其中所述第一個表達盒包含對應於人胰島素分子A鏈的序列，所述第二個表達盒包含對應於人胰島素分子B鏈的序列；
(b)誘導所述細胞以通過所述細胞內的重組遺傳結構來表達所述重組人胰島素分子，並將所述表達的重組人胰島素分子分泌到周圍培養基中；和
(c)從所述周圍培養基中收集所述分泌的人胰島素分子。
39.根據權利要求38所述的重組人胰島素分子，其中在步驟(b)中分泌的所述重組人胰島素分子是有生物活性的。
40.根據權利要求38所述的重組人胰島素分子，其中所述真核細胞是酵母細胞。
全文摘要
提供了一種重組遺傳結構，其包括至少兩個表達盒。每一個表達盒編碼目標蛋白的一個鏈或亞基。該遺傳結構趨向於將表達的蛋白質引向宿主細胞的分泌路徑。本發明的一項實際應用就是在同一個甲醇營養型酵母表達載體上，分別通過兩個獨立的表達盒表達人胰島素的兩個鏈。成熟且具生物活性的人胰島素分子無需任何翻譯後酶切而得以分泌。
文檔編號C12N15/16GK101120092SQ200580045813
公開日2008年2月6日 申請日期2005年10月11日 優先權日2004年11月3日
發明者馬延高, 馬向東 申請人:基諾藥業有限公司