確定草藥品質的新穎方法
2023-05-08 04:44:01 1
專利名稱：確定草藥品質的新穎方法
技術領域：
本發明涉及一種確定草藥品質的方法。特別是，本發明是利用生物晶片的技術檢測出存在於草藥中所需的生物活性成份。
背景技術：
許多年來，草藥(整株植物)已應用於醫療上。通常是以熬煮液或茶的方式服用草藥，或以糊漿的方式外用糊覆草藥。然而，實際經驗顯示，相同品種的草藥的個體，當以相同的方式處理時，可存有醫療功效上顯著的差異。
草藥的成份通常是許多化合物的混合物，其中某些化合物可能具有生物活性且可能對人體和動物具有治療功效。草藥的成份中化合物種類和/或其相對含量可能會改變，該改變取決於草藥個體的遺傳信息及該草藥生長時的天然條件，諸如栽種的地理位置，土壤組成，水質，氣候(包括溫度和溼度)，陽光照射強度及生長時間。
草藥對人體和動物的醫療功效取決於該草藥所含有的數種活性化合物及其相對含量。草藥個體所含有的活性化合物量愈高，該草藥個體顯示愈高的治療功效。科學上對檢測草藥所含有的所需活性成份及其相對含量並無指引，甚至當該草藥已知具有特定的治療功效時也是這樣。判斷已知對人體和動物具有治療功效的草藥個體的品質，通常基於熟悉草藥人士的經驗，其系藉由觀察草藥的體型、外觀及顏色、嗅聞草藥的氣味、和/或咀嚼草藥的組織。對人體和動物具有治療功效的草藥，現有技術並未教示或暗示可藉由科學的方法能確定該草藥的品質(即，存在所需的活性成份和/或其相對含量)。
美國專利號6,156,291揭示一種可重複萃取植物的化學成份的藥理活性混合物的方法，其中該方法可改進該藥理活性成份的混合物的品質控制。
為確定具有特定醫療用途的草藥個體的品質，本領域首先需要發展出一種科學性方法，其能夠檢測出並確定草藥個體含有所需的醫療活性成份，使得該含有所需的醫療活性成份及治療功效的草藥個體能夠被篩選得到，而其它不含有該醫療活性成份的草藥個體，甚至包括相同物種的其它草藥個體，可被排除而不予使用。
發明簡述本發明的一個方面涉及一種確定草藥品質的方法，其是通過利用生物晶片的技術以檢測出存在於草藥中所需的生物活性成份。
本發明的另一個方面涉及一種確定在不同地區所栽種的人參的品質的方法，它是通過利用生物晶片的技術以檢測出存在於人參中能夠與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)專一性結合的生物活性成份。
附圖簡述
圖1A顯示韓國所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer；稱為高麗參)的粗幹根的粉末的甲醇萃取液的高效液相層析(HPLC)的輪廓圖，及該HPLC分級液的螢光圖像。
圖1B顯示中國吉林地區所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer稱為吉林參)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級液的螢光圖像。
圖1C顯示韓國所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer稱為白高麗參)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級液的螢光圖像。
圖1D顯示中國長白山地區所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer稱為東洋參)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級液的螢光圖像。
圖1E顯示美國Wisconsin州所栽種的人參(Pana ginseng C.A.Meyer稱為西洋參)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級液的螢光圖像。
圖2A顯示中國西南地區所栽種的三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的切片的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級液的螢光圖像。
圖2B顯示中國西南地區所栽種的三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的粗幹根(稱為三七粒)的粉末的甲醇萃取液的HPLC輪廓圖，及該HPLC分級液的螢光圖像。
發明詳述本發明提供一種確定草藥品質的方法，它是通過利用生物晶片的技術以檢測出存在於草藥中所需的生物活性成份。
本發明的方法包括下述的步驟利用HPLC分級草藥萃取液以得到草藥萃取液的分級樣品，將該草藥萃取液的分級樣品以微陣列的方式加載至已經預先處理過的塗覆塑料載片上，及進行雜交反應及信號檢測。
草藥系首先經研磨成微細粉末並利用溶劑進行萃取。可用於本發明的溶劑包括水、C1-6醇、C1-6醚，及其組合。隨後，離心該草藥萃取液，並濃縮所得到的上清液。利用HPLC分級該濃縮的上清液，同時監控該分級液的吸光度。收集所得到的分級液。
塑料載片的材料可為同聚物或共聚物，其是由一種或多種單體的聚合所製備，該單體系選自乙烯、滷化乙烯、丙烯、滷化丙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丁二烯、丙烯腈、降冰片烯或苯乙烯，其中苯乙烯的聚合物是優選的。該塑料載片的材料亦可為聚碳酸酯。該塑料載片的大小相當於微陣列器或雷射掃描儀所常用的載片大小。本發明的方法所使用的塑料載片的優點在於可使用各種不同的化學藥劑以處理該塑料載片的表面，使得不僅是大分子(諸如蛋白質和DNA)，亦包括小分子(諸如草藥的代謝物)可固定於該塑料載片的表面上。此優點若對照常用的玻璃載片僅能用於固定大分子(諸如蛋白質和DNA)的事實尤顯得重要。再者，塑料材料可易於模製成所需的形狀，且亦具有成本低的優異性。於本發明的優選體系中，該塑料載片具有2個凹槽。得自於草藥的分級液的樣品可欄格化地點樣於該凹槽的表面上，且隨後可將含有探針的溶液加到該凹槽上以進行雜交反應。該2個凹槽的深度可為相同或不同，且介於低於0.03毫米至高達0.5毫米的範圍內。進一步，經模製後，每1個凹槽的相對2邊可分別含有欄杆以用於支撐蓋玻片，其中該蓋玻片用於防止蒸發或損失該加載至該凹槽上的含有探針的溶液。
該塑料載片的預先處理可利用多官能團醛及隨後浸沒於提供NH2基團的前體溶液中，以使得所生成的塑料載片在其表面上含有活性胺基。該提供NH2基團的前體可以是有機物或無機物，且可選自NH4OH、伯胺，仲胺或叔胺，其中該伯胺，仲胺及叔胺的脂族和/或芳香族部份可用於充作額外的間隔子。對於該提供NH2基團的前體，能直接提供自由NH2基團的NH4OH是優選的。
在本發明中，該塑料載片上的塗層可由多官能團分子(例如，多官能團環氧化物)所構成，它起到間隔子的作用。該多官能團環氧化物的作用將草藥所含的成份連接到該經先期處理的塑料載片上。該多官能團環氧化物的一端的活性環氧基與該經先期處理的塑料載片的表面上的胺基反應，而該多官能團環氧化物的另一端的活性環氧基吸附草藥所含的成份或與草藥所含的成份反應。具體說，草藥成份中含有自由羥基、巰基和/或胺基的化合物能與該多官能團環氧化物的另一端的活性環氧基形成共價鍵，因而該化合物能夠連接至該經塗覆的塑料載片上。該多官能團環氧化物優選含有6-24個碳原子長的化學鏈，使得草藥所含的成份不會直接地結合或吸附到該經先期處理的塑料載片上。在本發明中，每1個點樣樣品對經塗覆的塑料載片的結合是牢固的，甚至經嚴謹的脫離衝洗後亦然。重要的是在本發明中，不僅是大分子(諸如蛋白質和DNA)，亦包括小分子(諸如代謝物)都可以以均一相或非均一相的方式固定於該經塗覆的塑料載片的表面上。
在本發明的方法中，對將草藥萃取液的分級樣品以微陣列的方式加載至該經塗覆的塑料載片上的步驟，該草藥萃取液的分級樣品系藉由應用高密度欄格技術並利用微陣列器以微陣列的方式點樣且固定於該經塗覆的塑料載片的欄格面積上，其中每1個樣品點可含有呈均一相或非均一相的草藥成份。在本發明的方法中，可使用整合性微小化技術(integrating miniaturizationtechnology)以增加該經塗覆的塑料載片上欄格樣品的密度。
在本發明的方法中，檢測草藥中存在所需的生物活性成份以確定該草藥的品質是基於標的物導向的方式，其包括將含有標記探針的溶液加載至該經塗覆的塑料載片的凹槽上以進行雜交反應(其中可利用玻璃片蓋住每一個凹槽以防止該含有標記探針的溶液的蒸發)，及利用儀器(例如，雷射掃描儀)以顯像並鑑定出能與該標記探針結合或反應的樣品點樣點。本發明的方法所使用的探針是基於已確定的分子機制且呈均一相或非均一相的已知標的物，其可為，例如，拮抗諸如選擇的細胞、受體、肽或蛋白質類的小分子化合物，競爭性配體、或抗體。該連接探針的標記物可為染料或放射性物質。
本發明的優選方面是提供一種確定在不同地區所栽種的人參的品質的方法，其是利用生物晶片的技術檢測出存在於人參中能夠與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)專一性結合的生物活性成份。具體的，經生物素標記的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和經Cy3標記的鏈黴親和素(strepavidin)作為探針進行雜交反應。在本發明的方法中，若觀察到顯示經處理的塑料載片上樣品點樣點中的成份與經生物素標記的TNF-α結合的信號，其顯示該樣品點樣點的成份中存有至少1種候選化合物，其具有類似於拮抗TNF-α的生物活性。這些候選化合物可用於治療自身免疫疾病，諸如類風溼性關節炎。
在功效上，本發明的方法可用簡單的方式迅速地檢測出存在於草藥中所需的生物活性成份並進一步確定該草藥的品質。
下述的實施例僅用於進一步舉例說明本發明的方法，但本發明的範圍不應以下述的實施例為限。
實施例實施例1利用高效液相層析(HPLC)分級人參萃取液將栽種於不同地區所得到的乾燥人參(參閱表1)研磨成微細粉末，隨後於真空下進行包裝以利長期貯存。室溫下，對每一種人參的研磨粉末(50克)，利用甲醇(500毫升，HPLC等級)藉由勻漿機(OMNI)進行連續摻合5分鐘以完成萃取。在4℃和8000rpm下，離心所生成的萃取液達30分鐘，隨後以上述相同的方法，對該殘餘物(片狀沉澱)進行再次萃取和離心(重複2次)。收集所得到的澄清上清液，隨後利用旋轉式蒸發器(Laborota 4000，HEIDOLPH)將該上清液濃縮為最終體積30毫升。將由50％水和50％乙醇所組成的混合物加入到該濃縮的上清液中，使其體積為50毫升，隨後利用磁性攪拌棒進行混合20分鐘。在4℃和8000rpm下，離心所生成的溶液30分鐘。在室溫和12000rpm下，離心所得到的澄清上清液10分鐘，隨後分析所生成的澄清上清液。
利用HPLC進行分析。將上述所生成的澄清上清液(0.1毫升)加載TSK凝膠ODS-80TM管柱(4.6毫米×15釐米，5微米填料，TOSOH，先前已用水平衡)中，隨後以0-100％乙醇的二次蒸餾水梯度溶液進行洗脫(流速0.75毫升/分鐘)96分鐘。在波長205納米下，持續監控洗脫液的吸光度。該吸光度的結果顯示於圖中，其中圖1E(關於栽種於美國Wisconsin州的人參)所顯示的輪廓圖系不同於圖1A、1B、1C和1D所顯示的輪廓圖，此結果顯示該HPLC輪廓圖的差異是由於栽種人參的地理區域的不同。在該0到96分鐘期間，以0.75毫升/分鐘/分級液的方式收集洗脫液，其中每一個分級液(含有人參的成份)的0.225毫升是由利用自動化液體處理系統(MultiProbe II，PACKARD)轉移到一式三份的每一個96孔圓底微量滴定板上。所生成的含有乾燥的人參成份的微量滴定板可立即進行活性分析或可加以貯存以便於以後使用。
實施例2預先處理塑料載片及製備經塗覆的塑料載片利用苯乙烯的聚合物製備模製的塑料載片，它含有2個凹槽。該模製塑料載片的大小相當於微陣列器或雷射掃描儀所使用的常用玻璃載片，其中該凹槽的深度是0.05毫米。
首先，在室溫下將該模製塑料載片浸沒於0.4％戊二醛溶液(pH5.0)中達4小時，隨後經水衝洗並在60℃下浸漬於3M NH4OH(pH11.0)的溶液中達4小時。在37℃下，利用100mM 1，4-丁二醇二醛水甘油醚(pH11.0)過夜處理所生成的塑料載片。最終，利用0.1M NaHCO3溶液(pH8.0)衝洗該塑料載片，並令其乾燥。
實施例3利用微陣列方式加載樣品至經塗覆的塑料載片上利用微陣列器(BioGrid II，BIOROBOTIC)將樣品點樣至實施例2所製備的經塗覆的塑料載片上。令上述實施例1的微量滴定板所含有的乾燥人參成份溶解在30％ DMSO/0.1M碳酸鈉緩衝液(pH9.5)中以形成最終體積為16微升/孔。利用4號針(內徑0.4毫米)管件，將該人參成份樣品自該96孔微量滴定板加到該經塗覆的塑料載片的凹槽表面上。將生物素肼(biotin hydrazide)溶液(20微克/毫升)點樣於該經塗覆的塑料載片的凹槽表面上，作為對照組。在該經塗覆的塑料載片的凹槽表面上的斑點經乾燥後，將所生成的塑料載片在37℃下浸沒於1M乙醇胺溶液(pH8.0)中達2小時。
實施例4雜交反應及信號檢測利用生物素化的腫瘤壞死因子-α(B-TNF-α)和經Cy3標記的鏈黴親和素(strepavidin)作為進行雜交反應的探針。對實施例3的每一個經處理的塑料載片的2個凹槽分別覆蓋玻璃片(22毫米×22毫米)，隨後將20微升B-TNF-α的TBST緩衝液(0.5微克/毫升，含有50mM Tris-HCl，pH7.3，0.15M NaCl和0.05％Tween 20)加到該經處理的塑料載片的凹槽上，並於37℃下進行培育2小時。利用該TBST緩衝液衝洗經處理的塑料載片4次，隨後在37℃下乾燥，並覆蓋如上所述的玻璃片。對每一個凹槽加載經Cy3標記的鏈黴親和素(20微升)。隨後令該塑料載片於37℃下靜置2小時，進而利用該TBST緩衝液衝洗4次，並利用二次蒸餾水輕洗4次。令經處理的塑料載片於37℃下乾燥，並利用雷射掃描儀(GenePix4000，AXON)進行掃描。該掃描的圖像如圖所示。
圖像上的綠色螢光斑點顯示在該人參樣品中存有至少一種活性成份，它能與B-TNFα結合。自圖像上所顯示的人參(Pana ginseng C.A.Meyer)樣品的顯影結果可知，僅有源自於圖1A的分級液60-72(其得自於韓國所栽種的人參粗幹根的萃取液)的樣品顯示與B-TNFα結合的活性。該存在於上述的分級液60-72中具有與B-TNFα結合的活性的活性成份可能系一種人參皂苷(ginsenoside)，因為人參皂苷是人參主要的具生物活性的化合物，且已顯示於鼠或人體的巨噬細胞中作為TNFα拮抗劑(參閱文獻Planta Med.2001 67213-218)。另外，源自於圖2B的分級液3-16(其系得自於三七(Pana notoginseng(Burk)Chen)的粗幹根的萃取液)的樣品，亦顯示能與B-TNFα結合的活性。
表1
權利要求
1.一種確定草藥品質的方法，其特徵在於，該方法包括步驟利用高效液相層析(HPLC)分級草藥萃取液，得到草藥萃取液之分級樣品；將該草藥萃取液的分級樣品以微陣列方式加到已經預先處理的塗層塑料載片上；和進行雜交反應及信號檢測以檢測出存在於該草藥中所需的生物活性成份。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在該方法中首先利用溶劑萃取所述草藥，所述溶劑選自水、C1-6醇、C1-6醚，或其組合。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過HPLC所得到的草藥分級液呈均一相或非均一相。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述草藥分級液含有所述草藥的二級代謝物。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該塑料載片具有2個凹槽且該分級樣品固定於該凹槽表面。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該塑料載片的材料是聚碳酸酯、或由1種或多種單體所製備的同聚物或共聚物，所述單體選自乙烯、滷化乙烯、丙烯、滷化丙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丁二烯、丙烯腈、降冰片烯或苯乙烯。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，該塑料載片的材料是苯乙烯的聚合物。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在塗覆所述塑料載片前，利用多官能團醛和隨後浸沒於提供NH2基團的前體溶液中以預先處理該塑料載片。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述多官能團醛是戊二醛。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述提供NH2基團的前體是NH4OH。
11.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述塗層是由多官能團分子所構成的。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述多官能團分子是在每1個末端含有至少1個環氧基的多官能團環氧化物。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，在該多官能團環氧化物的一端的環氧基與該經預先處理的塑料載片的表面上的胺基反應。
14.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，在該多官能團環氧化物另一端的環氧基與草藥成份的自由羥基、巰基或胺基反應。
15.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，該多官能團環氧化物含有6-24個碳原子長的化學鏈。
16.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該草藥是人參。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，該人參栽種在不同的地區。
18.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，該人參所含的所需的生物活性成份能夠與腫瘤壞死因子-α專一性結合。
19.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該方法利用含有標記探針的溶液進行雜交反應。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，該含有標記探針的溶液呈均一相或非均一相。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，該標記是染料或放射性物質。
全文摘要
本發明涉及一種確定草藥品質的新穎方法，它包括利用生物晶片技術檢測出存在於草藥中所需的生物活性成份。
文檔編號G01N33/543GK1459631SQ0212005
公開日2003年12月3日 申請日期2002年5月14日 優先權日2002年5月14日
發明者徐立偉, 張素真 申請人:先進基因股份有限公司