用於治療診斷的生物標誌物的製作方法

2023-05-12 00:01:46

專利名稱：用於治療診斷的生物標誌物的製作方法
用於治療診斷的生物標誌物
背景技術：
用於諸如癌症這樣的狀況和疾病的生物標誌物包括生物分子，諸如蛋白質、肽、月旨質、RNA、DNA及它們的變體和修飾。特異性生物標誌物(例如DNA、RNA和蛋白質)的鑑定可以提供用於狀況或疾病的診斷、預後或治療診斷(theranosis)的生物印記。生物標誌物可在體液中檢測，包括循環DNA、RNA、蛋白質和囊泡(vesicle)。循環生物標誌物包括蛋白質(諸如PSA和CA125)以及核酸(諸如SEPT9DNA和PCA3信使RNA(mRNA))。循環生物標誌物還包括循環囊泡。囊泡是從細胞上脫落的由膜包封的結構，並且其可見於多種體液中，包括血液、血漿、血清、乳汁、腹水、支氣管肺泡灌洗液和尿液。囊泡還可作為蛋白質、RNA、DNA、病毒和朊病毒的運送媒介而參與細胞之間的通訊。微RNA是調控信使RNA轉錄和降解的短RNA。已經在體液中發現了微RNA並且已經觀察到其是從腫瘤細胞上脫落的囊泡內的組分。與疾病相關的循環生物標誌物(包括囊泡和/或微RNA)的分析可有助於檢測疾病或其嚴重程度、確定對疾病的易感性以及進行治療決策。生物樣品中存在的囊泡提供了生物標誌物的來源，例如，所述生物標誌物存在於囊泡內(囊泡有效負載)或存在 於囊泡表面上。囊泡的特徵(例如尺寸、表面抗原、細胞源的確定、有效負載)還可提供診斷、預後或治療診斷的信息。仍然存在著對可用於檢測和治療疾病的生物標誌物進行鑑定的需求。與囊泡相關的微RNA和其它生物標誌物以及囊泡的特徵可用於診斷、預後或治療診斷。本發明提供了用於通過檢測生物標誌物而表徵表型的方法和系統，所述生物標誌物是疾病或疾病進程的指示。所述生物標誌物可以是循環生物標誌物，包括囊泡和微RNA。發明概述本文公開了用於通過分析囊泡(諸如存在於來自受試者細胞的生物樣品中的囊泡)來表徵表型的方法和組合物。表徵受試者或個體的表型可以包括但不限於診斷疾病或狀況，預後疾病或狀況，確定疾病階段或狀況階段、藥物的效力、生理狀況、器官危境(organdistress)或器官排斥反應、疾病或狀況的進展、與疾病或狀況的治療相關性關聯或者特定的生理或生物學狀態。在一個方面，本發明提供了在需要的受試者中治療診斷疾病或失調的方法，其包括:在來自所述受試者的樣品中鑑定囊泡群體的生物印記，其中所述生物印記包括一種或多種細胞特異性生物標誌物的存在或水平和/或一種或多種疾病特異性生物標誌物的存在或水平，以及一種或多種一般囊泡生物標誌物的存在和水平；以及將所述生物印記與參照進行比較，其中所述比較是所述受試者對於治療劑是響應者或非響應者的指示，由此而治療診斷所述疾病或失調。在一些實施方案中，所述受試者此前尚未暴露於所述治療劑。在其它實施方案中，所述治療診斷包括測定治療的效力。本文提供的方法可在體外進行，其中在體外環境中評估所述生物標誌物。在一些實施方案中，所述受試者當前並未受到對所述疾病或失調的治療。在其它的實施方案中，所述受試者正處於對所述疾病或失調的現行治療中。所述方法可進一步包括對所述受試者施用所述治療劑。可在單一分析中實施鑑定生物印記的方法。例如，可使用多重方法評估多種生物標誌物。在一些實施方案中，在多重分析中評估所述生物印記中的所有標誌物。在其它實施方案中，所述生物標誌物中的一些在單一分析中評估並且在不同的分析中評估一種或多種其它生物標誌物，所述不同的分析也可以是多重分析。例如，可在第一多重分析中評估多種囊泡表面生物標誌物，並且可在第二多重分析中評估多種微RNA。可將所述第一和第二多重分析的結果相結合以鑑定包含囊泡表面生物標誌物和微RNA的生物印記。在一些實施方案中，受到評估的樣品包括體液。所述體液可包括任意適合的體液，包括但不限於外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper』 s fluid)或預射精液、女性射出液、汗液、排洩物、毛髮、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、膽汁、間質液、經血、膿液、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、稀便(stoolwater)、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管肺抽吸液、囊胚腔液(blastocylcavity fluid)或臍帶血。在一些實施方案中，所述體液包括血清或血漿。所述囊泡群體包括囊泡的任何可用的群體。在一些實施方案中，所述囊泡群體具有20nm至1500nm的直徑。在其它實施方案中，所述囊泡群體包含直徑20nm至800nm的囊泡。在其它實施方案中，所述囊泡群體包含直徑20nm至200nm的囊泡。可對所述囊泡群體進行尺寸排阻色譜、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、親和捕獲、免疫分析、微流體分離或它們的組合。可在所述樣品上實施這些方法以分離或捕獲所需的囊泡。還可在事先不實施分離或捕獲所述囊泡群體的技術的情況下評估所述囊泡群體。所述一種或多種細胞特異性生物標誌物、一種或多種疾病特異性生物標誌物以及一種或多種一般囊泡生 物標誌物可包括蛋白質。所述蛋白質可以是囊泡表面抗原和/或囊泡有效負載。在一些實施方案中，所述一種或多種疾病特異性生物標誌物包括EpCAM、B7H3、⑶24、組織因子或其組合。在一些實施方案中，所述一種或多種一般囊泡生物標誌物包括CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab_5b、MFG-E8、膜聯蛋白 V 或其組合。可使用結合劑鑑定本發明的生物印記。在一些實施方案中，鑑定生物印記包括將所述樣品與對於兩種不同的分析物特異性的至少兩種結合劑接觸。例如，鑑定生物印記可包括將所述樣品與對於三種不同的分析物特異性的至少三種結合劑接觸。所述結合劑可以是可結合於目標生物標誌物的任何有用的實體。用於本發明的結合劑包括但不限於抗原、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、凝集素、肽、枝狀物、膜蛋白標記劑或化學化合物。鑑定本發明的生物印記可包括對一種或多種核酸的評估。鑑定本發明的生物印記還可包括對一種或多種核酸、肽、蛋白質、脂質、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖的評估。所述一種或多種核酸可以是，但不限於，DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA或shRNA。在一些實施方案中，所述核酸包括一種或多種微RNA。所述微RNA可以是循環生物標誌物或可與囊泡結合，例如作為囊泡有效負載。所述一種或多種核酸可以是 miR-21、miR-205、miR-92、miR-147、miR-141 或 miR-574 中的一種或多種。所述一種或多種核酸可以是圖3-6、19-24、26-30、32、33、36、40-42、47、51、53-57和/或60中列出的一種或多種微RNA。所述一種或多種核酸可以是選自miR-21、miR-205、miR-92、miR-147或miR-574中的一種或多種微RNA。可以使用統計判別分析和歸類方法鑑定所述受試者是響應者還是非響應者。本文所使用的響應者包括預計對候選治療有反應的受試者，無論所述治療此後是否有效。響應者還包括對當前治療具有部分反應的受試者。在一些實施方案中，將受試者鑑定為對於所述治療劑的非響應者或響應者包括將所述受試者的生物印記針對來自此前鑑定的對於治療劑的響應者和非響應者的一組生物印記進行關聯。如果所述受試者的生物印記與來自此前鑑定的響應者的生物印記組的關聯比其與來自此前鑑定的非響應者的生物印記組的關聯更為緊密，則可將所述受試者鑑定為響應者。如果所述受試者的生物印記與來自此前鑑定的非響應者的生物印記組的關聯比其與來自此前鑑定的響應者的生物印記組的關聯更為緊密，則可將所述受試者鑑定為非響應者。在一些實施方案中，將所述受試者鑑定為對於所述治療劑的非響應者或響應者包括使用使用此前鑑定的響應者和非響應者進行訓練的分類器對所述受試者的生物印記進行分類。本發明的方法可用於癌症的治療診斷。例如，所述癌症可以是前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌或黑色素瘤。本發明的方法可用於治療診斷前列腺癌。在一個實施方案中，所述疾病或失調包括前列腺癌並且所述生物印記包括=PCSA和PSMA中的一種或多種以及B7H3和EpCam中的一種或多種。在另一個實施方案中，所述疾病或失調包括前列腺癌並且所述生物印記包括PCSA。本發明的方法可用於治療診斷結腸直腸癌。在一個實施方案中，所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括:DR3、STEAP, Epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TR0P2和TETS中的一種或多種。在另一個實施方案中，所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括:CD9、EGFR、CD63、MUC1、TGM2、CD81、HMP、EPHA2、丁]\^]\1211、^093六、00666、0024、鐵蛋白4 0六釐、如六1^、6 1 30、？53、]\^(:17、從^釐和 B7H3 中的一種或多種。在又另一個實施方案中，所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括:CD9、EPHA2、EGFR·、CD63、MUCl、TGM2、CD81、 ΜΡ1、GPRl10、MMP9、TMEM211、UNC93、CD66e、CD24、Ngal、EpCAM、GPR30、0PN、MUC17、p53、MUC2、Ncam 和 TSGlOl 中的一種或多種。在實施方案中，所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括:TMEM211和⑶24。在其它實施方案中，所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括=EpCam和⑶66。在一個實施方案中，所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括:EGFR、EPHA2、p53和KRAS中的一種或多種。本發明的方法可用於治療診斷乳腺癌。在一個實施方案中，所述疾病或失調包括乳腺癌並且所述生物印記包括:CD9、HSP70、Gal3、MIS、EGFR、ER、ICB3、CD63、B7H4、MUCl、DLL4、CD81、ERB3、VEGF、BCA225、BRCA、CA125、CD174、CD24、ERB2、NGAL、GPR30、CYFRA21、⑶31、cMET、MUC2和ERB4中的一種或多種。在另一個實施方案中，所述疾病或失調包括乳腺癌並且所述生物印記包括:CD9、EphA2、EGFR、B7H3、PSMA, PCSA, CD63、STEAP、CD81、B7H3、STEAPl、ICAMl (CD54)、A33、DR3、CD66e、MFG_e8、H印sin、TMEM211、TR0P-2、EGFR、乳腺珠蛋白、！fepsin、NPGP/NPFF2、PSCA、5T4、NGAL、NK-2、EpCam、NK_1R、5T4、PA1-1 和 CD45 中的一種或多種。在又另外的實施方案中，所述疾病或失調包括乳腺癌並且所述生物印記包括:BRCA、cMET、DLL4、EphA2、EGFR、ER、ERB2、ERB3、ERB4 和 VEGF 中的一種或多種。本發明的方法還可用於治療診斷肺癌。在本發明的實施方案中，所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括:SPB、SPC、TFF3、PGP9.5、CD9、MS4A1、NDUFB7、Cal3、iC3b、CD63、MUCl、TGM2、CD81、B7H3、DR3、MACCl、TrkB、組織因子(TF)、TIMPU GPCR(GPRllO)、MMP9、MMP7、TMEM211、TWEAK、CDADCl、UNC93、APC、A33、CD66e、CD24、ErbB2、CD10、BDNF、鐵蛋白、S印rase、NGAL、EpCam、ErbB2、骨橋蛋白(OPN)、LDH、HSP70、MUC2、NCAM、CXCL12、結合珠蛋白(HAP)、CRP和Gro-α中的一種或多種。在其它實施方案中，所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括:ΕΡΗΑ2、⑶24、EGFR和CEA中的一種或多種。在又另外的實施方案中，所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括:SPB、SPC、NSE、PGP9.5、⑶9、P2RX7、NDUFB7、NSE、Gal3、骨橋蛋白、CHI3L1、EGFR、B7H3、iC3b、MUCl、間皮素、SPA、TPA、PCSA, CD63、AQP5、DLL4、CD81、DR3、PSMA, GPCR 110 (GPRllO)、EPHA2、CEACAM、PTP、CABYR、TMEM211、ADAM28、UNC93a、A33、CD24、CD10、NGAL、EpCam、MUC17、TR0P2 和 MUC2 中的一種或多種。在一個實施方案中，所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括:SPB、SPC、PSP9.5、NDUFB7、Gal3、iC3b、MUC1、GPCR 110、CABYR 和 MUC17 中的一種或多種。在另一個實施方案中，所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括:⑶9、⑶63、⑶81、B7H3、PROGRP,CYTO 18、FTH1、TGM2、CENPH、膜聯蛋白 1、膜聯蛋白V、ERB2、EGFR、CRP、VEGF、CYT0 19、CCL2、骨橋蛋白(0ST19)、骨橋蛋白(0ST22)、BTUB, CD45、TIMP, NACCl、MMP9、BRCAl、P27、NSE、M2PK、HCG, MUCl、CEA、CEACAM、CYT07、EPCAM、MS4A1、MUC1、MUC2、PGP9、SPA、SPA、SPD,P53、GPCR(GPR110)、SFTPC、UNCR2、NSE、INGA3、INTG b4、MMPl、PNT、RACKl、NAP2、HLA、BMP2、PTH1R、PANADH、NCAM、CD151、CKS1、FSHR、HIF、KRAS、LAMP2、SNAIL、TRM29、TSPAN1、TWIST1、ASPH和AURKB中的一種或多種。所述疾病可以是肺癌並且所述生物印記可包括:ASPH、BRCAl、EGFR、EPHA2、ErbB2、HIF、KRAS、MS4A1、P27、P53、ADH、PGP9、PGP9.5、VEGF 中的一種或多種。本發明還可用於通過鑑定包含藥物相關生物標誌物的生物印記而治療診斷癌症。在實施方案中，所述疾病或失調包括癌症並且所述生物印記包括:ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCA1、β III 微管蛋白、BIRC5、B_RAF、BRCAl、BRCA2、CA2、小窩蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDKN2A、CDKN1A、CDKN1B、CDK2、CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c-KIT、c_Met、c_Myc、C0X-2、細胞周期蛋白 DU DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、E-鈣粘蛋白、ECGF1、EGFR、EML4-ALK 融合蛋白、EPHA2、表皮調節素、ER、ERBR2、ERCC1、ERCC3、EREG、ESRl、FLT1、葉酸受體、FOLRl、F0LR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART, GNRHl、GNRHRl、GSTPl、HCK、HDACl、hENT-1、Her2/Neu、HGF, HIF1A、HIGl、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IGF-1R、IGFRBP,IGFRBP3、IGFRBP4、IGFRBP5、IL13RA1、IL2RA、KDR、Ki67、KIT、K-RAS、LCK,LTB、淋巴毒素 β 受體、LYN、MET、MGMT、MLHl、MMR、MRP1、MS4A1、MSH2、MSH5、Myc、NFKBl、NFKB2、NFKBIA、ODCl、OGFR、pl6、p21、p27、p53、p95、PARP-U PDGFC、PDGFR、PDGFRA,PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA,POLAl、PPARG,PPARGC1、PR、PTEN、PTGS2、RAFl、RARA,RRMl、RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活素、TK1、TLE3、TNF, TOP1、T0P2A、T0P2B、TS、TXN、TXNRDl、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA, VEGFC, VHL,YESl和ZAP70中的一種或多種；以及一種或多種一般囊泡生物標誌物。將所述一種或多種標誌物與參照相比較的 過表達、表達不足或突變用於選擇所述治療劑。所述一種或多種標誌物可包括KRAS。與野生型參照相比KRAS的突變可用於選擇所述治療劑。在實施方案中，通過對KRAS mRNA測序而確定KRAS的突變。進行評估的KRAS mRNA可以是囊泡群體中的有效負載。用於評估所述囊泡群體的一種或多種一般囊泡生物標誌物包括目標囊泡中常見的囊泡標誌物。例如，所述一種或多種一般囊泡生物標誌物可以是一種或多種四跨膜蛋白質，諸如⑶9、⑶63和/或⑶81。所述一種或多種一般囊泡生物標誌物可以是⑶63、⑶9、⑶81、⑶82、⑶37、⑶53、Rab_5b、MFG-E8和膜聯蛋白V中的一種或多種。所述一種或多種一般囊泡生物標誌物還可以是列於表3中的一種或多種標誌物。本發明的方法可用於任意疾病或失調的治療診斷，所述疾病或失調可通過生物標誌物分析進行評估，例如對循環生物標誌物和/或囊泡的生物標誌物分析。所述疾病或失調包括但不限於癌症、惡變前狀況、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或失調、心血管疾病或失調、神經疾病或失調、感染性疾病或者疼痛。在一些實施方案中，所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、結腸癌、增生性息肉、腺瘤、結腸直腸癌、高度異型增生、低度異型增生、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、腦癌、成膠質細胞瘤、肝細胞癌、宮頸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、食管癌、胃腸道間質瘤(GIST)、腎細胞癌(RCC)、胃癌、結腸直腸癌(CRC)、CRC Dukes B、CRCDukesC-D、血液惡性腫瘤、B細胞慢性淋巴細胞性白血病、B細胞淋巴瘤_DLBCL、B細胞淋巴瘤-DLBCL-生發中心樣、B細胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細胞樣或伯基特氏淋巴瘤(Burkitt 』 slymphoma)。 所述癌症還可包括急性淋巴細胞性白血病；急性髓性白血病；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎樣瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明癌；類癌瘤；原發部位不明癌瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎樣瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；嗅神經母細胞瘤；尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma);盧頁外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌瘤 』胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST);妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌症；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤 』腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症(Langerhans cell histiocytosis);喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維性組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰癌；乳頭狀瘤；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤；胸膜肺的母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌；Sezary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；夕卜陰癌；Waldenstr6m巨球蛋白血症或腎母細胞瘤。所述惡變前狀況可以是但不限於，光化性角化病、萎縮性胃炎、白斑病、增殖性紅斑、淋巴瘤樣肉芽腫病、白血病前期、纖維症、宮頸非典型增生、子宮頸非典型增生、著色性幹皮病、巴雷特食管(Barrett' s Esophagus)、結腸直腸息肉、轉化型病毒感染、HIV、HPV或其它具有成為惡變風險的生長或病灶。在一些實施方案中，所述自身免疫疾病包括炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、盆腔炎、脈管炎、銀屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多發性硬化症、重症肌無力、I型糖尿病、類風溼性關節炎、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡(SLE)、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、強直性脊柱炎Sjogrens病、CREST症候群、硬皮病、風溼病、器官排斥反應、原發性硬化性膽管炎或膿毒症。 在一些實施方案中，所述心血管疾病包括動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、易損斑塊、中風、局部缺血、高血壓、狹窄、血管阻塞或血栓形成事件。本方法所治療診斷的神經疾病包括但不限於多發性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、精神分裂症、雙相型障礙、抑鬱症、孤獨症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷頓病(HD)、唐氏症候群、腦血管疾病、Rasmussen腦炎、病毒性腦膜炎、神經精神性系統性紅斑狼瘡(NPSLE)、肌萎縮性脊髓側索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、傳染性海綿狀腦病、缺血再灌注損傷(例如中風)、腦外傷、微生物感染或慢性疲勞症候群。在一些實施方案中，所述疼痛包括纖維肌痛、慢性神經病理性疼痛或周圍神經病理性疼痛。在其它實施方案中，所述感染性疾病包括細菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠普爾氏病(Whipple' s Disease)、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、腦膜炎、瘧疾、結核、流行性感冒。在另一方面，本發明提供了在需要的受試者中治療診斷疾病或失調的方法，其包括:在來自所述受試者的樣品中鑑定囊泡群體的生物印記，其中所述生物印記包括KRAS、BRAF, PIK3CA和/或c-kit的突變；以及與參照的生物印記進行比較以鑑定所述KRAS、BRAF, PIK3CA和/或c_kit的突變的存在，由此而治療診斷所述疾病或失調。可在分離自所述囊泡群體的mRNA中檢測所述突變。在一些實施方案中，所述生物印記包括KRAS的突變。KRAS的突變可用於確定是否使用EGFR抑制劑(其包括但不限於帕尼單抗和西妥昔單抗)治療所述受試者。KRAS的突變可顯示對EGFR抑制劑治療的抗性。在另一方面，本發明提供了用於實施本發明的任意方法的試劑的用途。所述試劑可用於治療診斷疾病或失調。在相關的方面，本發明還提供了包含用於實施本發明的任意方法的試劑的試劑盒。通過引用併入
本說明書中提及的所有公開、專利和專利申請均以引用方式併入本文，其程度如同各公開、專利或專利申請均特別地和單獨地表明以引用的方式併入一樣。附圖簡述圖l(a)_(g)示出了表格，其按照譜系、細胞/組織的分組比較、特定疾病狀態列出了示例性癌症，以及列出了對這些癌症、分組細胞/組織比較和特定疾病狀態特異性的抗原。此外，所述的抗原可以為生物標誌物。所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，經過突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖2 (a) - (f)示出了表格，其按照譜系、細胞/組織的分組比較、特定的疾病狀態列出了示例性的癌症，以及列出了對這些癌症、分組細胞/組織比較和特定疾病狀態特異性的結合劑。圖3(a)_(b)是列出了示例性乳腺癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對乳腺癌具有特異性的囊泡得到和進行分析，以產生乳腺癌特異性囊泡生物印記。此外，一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖4(a)_(b)是列出了示例性卵巢癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對卵巢癌具有特異性的囊泡得到和進行分析，以產生卵巢癌特異性的生物印記。此夕卜，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖5是列出了示例性肺癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對肺癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生肺癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不 足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖6 (a)-(d)是列出了示例性結腸癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對結腸癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生結腸癌特異性生物印記。此夕卜，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖7是列出了相對於增生性息肉對腺瘤具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於增生性息肉對腺瘤具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾)。圖8是列出了相對於正常組織對炎性腸病(IBD)具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於正常組織對炎性腸病具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾)。圖9(a)_(c)是列出了相對於結腸直腸癌(CRC)對腺瘤具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述生物標誌物可以由相對於結腸直腸癌對腺瘤具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。

圖10是列出了相對於CRC對IBD具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於CRC對IBD具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖11 (a) - (b)是列出了相對於Dukes C-D對CRC Dukes B具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於Dukes C-D對CRC Dukes B具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖12(a)_(d)是列出了相對於具有高度異型增生的腺瘤對具有低度異型增生的腺瘤具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於具有高度異型增生的腺瘤對具有低度異型增生的腺瘤具有特異性的囊泡得到且進行分析。此夕卜，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖13 (a)-(b)是列出了相對於克羅恩氏病(CD)對潰瘍性結腸炎(UC)具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於CD對UC具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖14是列出了相對於正常組織對增生性息肉具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於正常組織對增生性息肉具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾 )。圖15是列出了相對於正常組織對低度異型增生的腺瘤具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於正常組織對低度異型增生的腺瘤具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖16是列出了相對於正常組織對腺瘤具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於正常組織對腺瘤具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖17是列出了相對於正常組織對CRC具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由相對於正常組織對CRC具有特異性的囊泡得到且進行分析。此夕卜，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖18是列出了對良性前列腺增生具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對良性前列腺增生具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖19(a)_(c)是列出了示例性的前列腺癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對前列腺癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生前列腺癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖20(a)_(c)是列出了示例性的黑色素瘤生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對黑色素瘤具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生黑色素瘤特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖21 (a)-(b)是列出了示例性胰腺癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對胰腺癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生胰腺癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖22是列出了對腦癌具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對腦癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生腦癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後 修飾)。圖23(a)_(b)是列出了示例性銀屑病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對銀屑病具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生了銀屑病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾的(外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖24(a)_(c)是列出了示例性心血管疾病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對心血管疾病具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生心血管疾病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖25是列出了對血液惡性腫瘤具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對血液惡性腫瘤具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生血液惡性腫瘤的特異性生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖26 (a)-(b)是列出了對B細胞慢性淋巴細胞性白血病具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對B細胞慢性淋巴細胞性白血病具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生B細胞慢性淋巴細胞性白血病的特異性生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖27是列出了對B細胞淋巴瘤及B細胞淋巴瘤DLBCL具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對B細胞淋巴瘤及B細胞淋巴瘤DLBCL具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖28是列出了對B細胞淋巴瘤DLBCL生發中心樣、B細胞淋巴瘤DLBCL活化B細胞樣和B細胞淋巴瘤DLBCL具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對生發中心樣B細胞淋巴瘤DLBCLdSK B細胞樣B細胞淋巴瘤DLBCL和B細胞淋巴瘤-DLBCL具有特異性的囊泡得到且分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。
圖29是列出了示例性的伯基特氏淋巴瘤生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對伯基特氏淋巴瘤具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生伯基特氏淋巴瘤特異性生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，進行突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖30(a)_(b)是列出了示例性肝細胞癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對肝細胞癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生肝細胞癌的特異性生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖31是列出了示例性宮頸癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對宮頸癌具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖32是列出了示例性子宮內膜癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對子宮內膜癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生子宮內膜癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖33(a)_(b)是列出了示例性頭頸癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對頭頸癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生頭頸癌的特異性生物印記。此夕卜，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖34是列出了示例性炎性腸病(IBD)生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對IBD具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生IBD特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖35是列出 了示例性糖尿病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對糖尿病具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生了糖尿病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖36是列出了示例性的巴雷特食管生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對巴雷特食管具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生巴雷特食管特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖37是列出了示例性纖維肌痛生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對纖維肌痛具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖38是列出了示例性中風生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對中風具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生中風特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖39是列出了示例性多發性硬化症(MS)生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對MS具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生了 MS的特異性生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖40(a)_(b)是列出了示例性帕金森氏病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對帕金森氏病具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生帕金森氏病的特異性生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖41是列出了示例性風溼病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對風溼病具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生風溼病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖42(a)_(b)是列出了示例性阿爾茲海默氏病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對阿爾茲海默氏病具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生阿爾茲海默氏病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖43是列出了示例性朊病毒病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對朊病毒病具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生了朊病毒病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖44是列出了示例性膿毒症生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對膿毒症具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生膿毒症特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖45是列出了示例性慢性神經病理性疼痛生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對慢性神經病理性疼痛具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖46是列出了示例性周圍神經病理性疼痛生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對周圍神經病理性疼痛具有特異性的囊泡得到且進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖47是列出了示例性精神分裂症生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對精神分裂症具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生精神分裂症特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖48是列出了示例性雙相型障礙或疾病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對雙相型障礙具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生雙相型障礙特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。
圖49是列出了示例性抑鬱症生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對抑鬱症具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生抑鬱症特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖50是列出了示例性胃腸道間質瘤(GIST)生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對GIST具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生GIST特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖51(a)_(b)是列出了示例性腎細胞癌(RCC)生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對RCC具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生RCC特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖52是列出了示例性肝硬化生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對肝硬化具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生肝硬化特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖53是列出了示例性食管癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對食管癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生食管癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖54是列出了示例性胃癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對胃癌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生胃癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖55是列出了示例性孤獨症生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對孤獨症具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生孤獨症特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖56是列出了示例性器官排斥反應生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對器官排斥反應具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生器官排斥反應特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖57是列出了示例性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生耐甲氧西林金黃色葡萄球菌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖58 是列出了示例性易損斑塊生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以由對易損斑塊具有特異性的囊泡得到且進行分析，以產生易損斑塊特異性的生物印記。此夕卜，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾(例如外遺傳修飾或翻譯後修飾)。圖59(a)_(i)是列出了示例性基因融合體的表格，其中所述的基因融合體可以由囊泡得到或分析。所述的基因融合體可以為生物標誌物，並且可以存在或不存在，表達不足或過表達，或修飾，例如外遺傳修飾或翻譯後修飾。圖60 (a)-(b)為基因及其相關性miRNA的表格，其中所述的基因(例如該基因的mRNA)、其相關miRNA或者它們的任意組合可以用作可由囊泡分析的一種或多種生物標誌物。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾。圖61A描述了鑑定包含核酸的生物印記以表徵表型的方法。圖61B描述了鑑定囊泡或囊泡群體的生物印記以表徵表型的方法。圖62圖示了可以在本發明的某些示例性實施方案中使用的計算機系統。圖63圖示了對囊泡上的蛋白質進行篩選獲得的結果，所述蛋白質可用作所述囊泡的生物標誌物。所述蛋白質的抗體可用作結合劑。經鑑定為囊泡的生物標誌物的蛋白質的實例包括Bcl-XL、ERCC1、角蛋白15、⑶81/TAPA-1、⑶9、上皮特異性抗原(ESA)和肥大細胞糜蛋白酶。所述生物標誌物在囊泡中或囊泡上可以存在或不存在，表達不足或過表達，突變或修飾，並且可用於表徵狀況。圖64詳細描述了通過評估囊泡生物印記而表徵表型的方法。圖64A為塗敷有捕獲抗體的平面基底的示意圖，所述的捕獲抗體捕獲表達該蛋白質的囊泡。所述的捕獲抗體是針對囊泡蛋白質的，其對衍生自病變細胞的囊泡(「疾病囊泡」)具有或不具有特異性。所述檢測抗體與捕獲的囊泡結合併提供螢光信號。所述檢測抗體可檢測通常與囊泡相關的抗原，或檢測與細胞源或疾病(如癌症)相關的抗原。圖64B為塗敷有捕獲抗體的珠的示意圖，所述的捕獲抗體捕獲表達該蛋白質的囊泡。所述的捕獲抗體是針對囊泡蛋白質的，其對衍生自病變細胞的囊泡(「疾病囊泡」)具有或不具有特異性。所述檢測抗體與捕獲的囊泡結合併提供螢光信號。所述檢測抗體可檢測通常與囊泡相關的抗原，或檢測與細胞源或疾病(如癌症)相關的抗原。圖64C為篩選方案的實例，其可以使用如圖64B中所示的珠以多重方式實施。圖64D示出了捕獲或檢測囊泡以表徵表型的說明性示意圖。圖64E示出了評估囊泡有效負載以表徵表型的說明性示意圖。圖65描繪了與EpCam偶聯的珠的掃描電子顯微照片(SEM)，其中所述的珠已經與VcaP囊泡孵育。(A)將載玻片塗敷聚-L-賴氨酸並與珠溶液孵育。在連接後,依次使用戊二醛和四氧化鋨固定所述珠(i)，每個固定步驟為30分鐘，並在兩個固定步驟之間稍加洗滌；(ii)在丙酮中逐漸脫水，20%的增量，每個步驟大約5-7分鐘；(iii)臨界點乾燥；以及(iv)用金噴濺塗敷。(B)左:描述了在如(A)中所示的EpCam塗敷的珠上的較高放大倍數的囊泡。右:描述了通過超速離心分離的囊泡，其附著在聚-L-賴氨酸塗敷的載玻片上，並按照(A)中所述固定並染色。圖66為蛋白質表達譜的示意圖。通常，不同的蛋白質並非平均或均一地分布於囊泡外殼上。囊泡特異性蛋白質通常更為常見，而癌症特異性的蛋白質是較少見的。使用更常見的較低癌症特異性的蛋白質可以更容易地完成囊泡的捕獲，並且癌症特異性的蛋白質可以用於檢測階段。圖67圖示了描述使用檢測來自受試 者的囊泡的基於珠的方法而產生的結果的方法。(A)對於單個患者而言，使用在圖64B中所描述的篩選方案的珠計數和信號強度的圖，其中為 100個捕獲珠用於每個患者的各捕獲/檢測組合分析。對於給定的患者而言，輸出結果顯示了相對信號強度的所檢測的珠的數量。在給定強度下捕獲的珠的數量為在該強度下囊泡以怎樣的頻率表達檢測蛋白質的指示。對於給定的珠而言，信號的強度越強，則檢測蛋白質的表達越多。(B)為通過將正常患者合併為一條曲線而將癌症患者合併為另一條曲線，並使用生物統計分析區分所述曲線而得到的歸一化的圖。對來自各個個體的數據歸一化以考慮通過檢測機器所讀取的珠數量的差異，將這些數據加在一起，然後再次歸一化以考慮各群體中不同的樣品數目。圖68圖示了前列腺癌的生物印記。㈧為由使用微球平臺的多重試驗而收集的強度值的柱狀圖，其中珠被CD63抗體功能化，與由患者血漿純化的囊泡孵育，然後用藻紅蛋白(PE)偶聯的EpCam抗體標記。較深的陰影的柱(藍)表示12名正常受試者的群體，而較淺的陰影的柱(綠)得自7名3期前列腺癌患者。(B)是根據圖67所述對(A)中所示出的各柱狀圖進行歸一化的圖。對於前列腺癌患者樣品和正常樣品兩者，分布為對來自(A)的微球結果的強度值的高斯擬合。(C)為(B)中示出的前列腺癌生物印記之一的實例，即，⑶63對⑶63生物印記(上方的圖)，其中⑶63用作檢測劑及捕獲抗體。下方的3個圖示出了在3種前列腺癌細胞系(VCaP、Lncap和22RV1)上的流式細胞分析的結果。水平線上方的點表示捕獲了具有⑶63的囊泡(包含B7H3)的珠。垂直線右側的珠表示捕獲了具有⑶63的囊泡(具有PSMA)的珠。在線上方和線右側的這些珠具有所有的3種抗原。⑶63是與囊泡相關的表面蛋白質，PSMA是與前列腺細胞相關的表面蛋白質，而B7H3是與侵襲性癌症(具體而言為前列腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌)相關的表面蛋白質。所有這3種抗原結合在一起鑑定出來自癌症前列腺細胞的囊泡。大部分表達CD63的前列腺癌囊泡還具有前列腺特異性膜抗原PSMA和B7H3 (參與調節腫瘤細胞遷移和入侵，並且為侵襲性癌症及臨床結果的指示)。(D)為前列腺癌囊泡的形態。上方的圖示出了使用CD63、CD9和CD81以多種組合進行捕獲和標記的結果。幾乎所有的點都位於右上象限，表明這3種標誌物是高度偶合的。下一列描述了使用B7H3捕獲並使用⑶63和PSMA標記細胞系囊泡的結果。VCaP和22RV1都表明 ，使用B7H3捕獲的大多數囊泡還具有⑶63，並且存在兩種群體，即，具有PSMA的群體和不具有PSMA的群體。由於LNcap不具有大量的包含B7H3的囊泡(不存在大量具有CD63的點)，B7H3的存在可以是癌症侵襲性程度的指示。LnCap為早期前列腺癌類似細胞系。圖69:說明了結腸癌的生物印記。(A)描述了由使用了微球平臺的各種多重試驗而收集的強度值的柱狀圖，其中使用捕獲抗體對珠功能化，將其與從患者血漿純化的囊泡一起孵育，然後用檢測抗體標記。較深的陰影柱(藍)表示來自正常的群體，而較淺的陰影柱(綠)來自結腸癌患者。(B)示出了(A)中所示各柱狀圖的歸一化圖。(C)描述了由多重試驗收集的強度值的柱狀圖，其中被⑶66抗體(捕獲抗體)功能化的珠與由患者血漿純化的囊泡一起孵育，然後用與PE偶聯的EpCam抗體(檢測抗體)標記。紅色的群體來自6名正常的受試者，而綠色群體來自21名結腸癌患者。將由各個體得到的數據歸一化以考慮所檢測的珠數目的差異，將這些數據加在一起，然後再次歸一化以考慮各群體中不同的樣品數目。圖70顯示多重檢測劑可以增大信號。(A)當囊泡標記有多種與前列腺特異性PE偶聯的抗體時，中位強度值被繪製為來自VCaP細胞系的純化濃度的函數。各圖的右側列出了以EpCam(左側的圖)或PCSA(右側的圖)捕獲的囊泡以及通過檢測抗體所檢測的多種蛋白質。在這兩種情況下，CD9與CD63的組合均得到了超出背景的最佳信號增加(底部圖描繪增加百分率)。CD9與CD63的組合得到超出背景的大約200%的百分增加。(B)進一步顯示前列腺癌/前列腺囊泡特異性標誌物的復用改善了前列腺癌細胞源的囊泡的檢測。當使用多種前列腺特異性PE偶聯的抗體進行標記時，中位強度值被繪製為來自VCaP細胞系的純化濃度的函數。描繪了以PCSA(左側的圖)和EpCam(右側的圖)捕獲的囊泡。在這兩種情況下，B7H3與PSMA的組合均得到了超出背景的最佳信號增加。圖71說明了使用⑶63檢測劑和⑶63捕獲按階段對於結腸癌的結腸癌生物印記。強度柱狀圖得自使用CD63塗敷的珠捕獲的並使用CD63偶聯PE標記的囊泡。在對照組中有6位患者(A)，I期中有4位患者(B)，II期中有5位患者(C)，III期中有8位患者(D)，和IV期中有4位患者(E)。由各個個體得到的數據經歸一化以考慮所檢測的珠數量的變化，將這些數據加在一起，然後再次歸一化以考慮各群體中的不同樣品數(F)。圖72:說明了使用EpCam檢測劑和CD9捕獲對於按階段的結腸癌的結腸癌生物印記。強度柱狀圖得自使用CD9塗敷的珠捕獲的並使用EPCam標記的囊泡。其中，在對照組㈧、I期(B)、11期(C)、111期⑶和VI期(E)中都有患者。由各個個體得到的數據以歸一化以考慮所檢測的珠數量的變化，將這些數據加在一起，然後再次歸一化以考慮各群體中的不同樣品數(F)。圖73:說明了(A)使用針對所列蛋白質的抗體(列出作為檢測和捕獲抗體)檢測前列腺癌的靈敏度、特異性以及置信度水平。⑶63、⑶9和⑶81為一般標誌物，並且EpCam為癌症標誌物。單個結果描繪於(B)中，對於EpCam對⑶63而言，以99%的置信度，100%(η = 8)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，並且以99%的置信度，77% (η = 10)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(C)對於⑶81對⑶63而言，以99%的置信度，90% (η =5)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77% (η = 10)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(D)對於⑶63對⑶63而言，以99%的置信度，60% (η = 5)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，80% (η =10)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(E)對於⑶9對⑶63而言，以99%的置信度，90% (η = 5)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77% (η= 10)的正常患者樣品不同於廣義正態分布。圖74說明了㈧使用針對所列蛋白質的抗體(列出作為檢測和捕獲抗體)檢測結腸癌的靈敏度和置信度水平。⑶63和⑶9為一般標誌物，EpCam為癌症標誌物，並且⑶66為結腸標誌物。單個結果描繪於(B)中，對於EpCam對⑶63而言，以99%的置信度，95%(η = 20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，100% (η = 6)正常患者樣品不同於廣義正態分布；(C)對於EpCam對⑶9而言，以99%的置信度，90% (η = 20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77% (η = 6)正常患者樣品不同於廣義正態分布；(D)對於⑶63對⑶63而言，以99%的置信度，60% (η = 20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，80% (η = 6)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(E)對於⑶9對⑶63而言，以99%的置信度，90% (η = 20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99% 的置信度，77% (η = 6)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(F)對於⑶66對⑶9而言，以99%的置信度，90% (η = 20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77% (η = 6)的正常患者樣品不同於廣義正態分布。圖75說明了通過評估TMPRSS2-ERG表達使用EpCam對來自血漿的前列腺癌細胞源囊泡的捕獲。(A)將漸變量的VCAP純化囊泡摻入正常血漿中。使用具有EPCAM抗體或其同種型對照的Dynal珠分離囊泡。分離來自囊泡的RNA，並使用qRT-PCR測量TMPRSS2:ERG融合轉錄物的表達。(B)將VcaP純化的囊泡摻入到正常血漿中，然後與塗敷有EpCam或同種型對照抗體的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分離RNA。使用來自各樣品的等體積RNA來進行RT-PCR以及隨後的Taqman分析。(C)在使用EpCam和IgG2同種型陰性對照珠捕獲的22RV1囊泡之間SPINKl和GAPDH轉錄物的循環閾值(CT)差異。CT值越高表明轉錄物的表達越低。圖76:說明了在VCaP前列腺癌細胞源囊泡與正常血漿囊泡之間的前10種差異表達的微RNA。通過超速離心、接著通過RNA分離得到VCAP細胞系囊泡和來自正常血漿的囊泡。使用qRT-PCR分析得到微RNA譜。前列腺癌細胞系源囊泡具有較高水平(較低CT值)的所示微RNA，如在柱狀圖(A)和表(B)中所描述的。圖77描述了使用⑶9珠捕獲的miR-21表達的柱狀圖。將來自前列腺癌患者的Iml血漿、250ng/ml的LNCaP或者正常的純化囊泡與⑶9塗敷的Dynal珠一起孵育。RNA與所述的珠和珠上清液分離。一個樣品(#6)未進行捕獲以用於比較。使用qRT-PCR測量miR-21表達，並比較各樣品的平均CT值。⑶9捕獲改善了前列腺癌樣品中miR-21的檢測。圖78描述了使 用⑶9珠捕獲的miR-141表達的柱狀圖。本實驗按照圖77所述的方法實施，其中使用qRT-PCR測量miR-141的表達而非miR-21的表達。圖79描繪了不同前列腺印記的靈敏度和特異性的表。「外來體」列出了囊泡水平的閾值或參照值，「前列腺」列出了用於前列腺囊泡的閾值或參照值，「癌症-1」、「癌症-2」和「癌症-3」列出了前列腺癌的3種不同生物印記的閾值或參照值，「QC-1」和「QC-2」列則列出了對於定性對照的閾值或參照值、或者可靠性，並且最後的4列列出了良性前列腺增生(BPH)的特異性和靈敏度。圖80詳細說明了結腸直腸癌(CRC)細胞系相對正常囊泡的TaqMan低密度陣列(TLDA)miRNA卡比較。所述CRC細胞系在該圖右側標出。Y軸顯示了 CRC細胞系與正常對照相比表達上的倍數變化。觀測的miRNA在X軸上標出，並且從左至右為miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a 和 miR_200b。對於各個 miR，從左至右的柱形對應於細胞系L0V0、HT29、SW260、C0L0205、HCT116和RK0。這些miRNA在正常或黑色素瘤細胞中未過表達。圖81是使用基於柱的過濾方法從血漿中分離囊泡的示意圖，其中隨後使用微球平臺評估所分離的囊泡。圖82是囊泡膜由於諸如超離心這樣的高速離心而壓縮的示意圖。這種高速離心可去除微弱地錨定於所述膜的蛋白質靶，這與更為牢固地錨定於所述膜內的四跨膜蛋白相反。非受理論的束縛，因此超離心可減少囊泡中的細胞特異性靶，並因此在隨後對所述囊泡的生物印記的分析中檢測不到。圖83是顯示了生物標誌物⑶9、⑶63和⑶81的檢測的圖，其使用了捕獲劑A)⑶9、B)PCSA、OPSMA和D)EpCam。囊泡分離自對照樣品(健康樣品)和前列腺癌樣品，II期前列腺癌(PCa)樣品。與囊泡的超離心分離相比，通過使用基於柱的過濾分離方法改善了 PCa和對照之間的分離。圖84描述了分離自患者樣品(#126)的囊泡的各種生物標誌物的檢測水平在使用超離心與基於過濾器的方法之間的比較，所述基於過濾器的方法使用了具有IOOkDa分子量截止值(MWCO)的500μ1柱(Millipore，Billerica, MA)。所述圖描述了 A)超離心純化的樣品；B)Microcon樣品；C)超離心純化樣品和IOug Vcap以及D)具有IOug Vcap的Microcon樣品。所使用的捕獲劑是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA, B7H3和EpCam，並且檢測到了 CD9、CD81 和 CD63。圖85描述了分離自患者樣品(#342)的囊泡的各種生物標誌物的檢測水平在使用超離心與基於過濾器的方法之間的比較，所述基於過濾器的方法使用了具有IOOkDaMWCO的500μ I柱(Millipore，Billerica, MA)。所述圖描述了 A)超離心純化的樣品；B)Microcon樣品；C)超離心純化樣品和IOug Vcap以及D)具有IOug Vcap的Microcon樣品。所使用的捕獲劑是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam，並且檢測到了 CD9、CD81和CD63。圖86 提供了標準曲線，其用於 CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3 和 EpCam 的捕獲劑以及對囊泡的生物標誌物CD9、CD81和CD63 (A、B)或B7H3和EpCam (B、D)的檢測。圖87是示出了使用對CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA, B7H3和EpCam的捕獲劑對從樣品(#126)分離的囊泡檢測生物標誌物CD9、CD81和CD63 (A-D)或B7H3和EpCam(E-H)的圖，所述囊泡使用具有 IOOkDa MWCO 的 500 μ I 柱(Millipore，Billerica, MA) (A、E)、具有 150kDa MWCO 的 7ml 柱(Pierce , Rockford, IL) (B、F)、具有 IOOkDa MWCO 的 15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (C、G)或具有 150kDa MWCO 的 20ml 柱(Pierce ，Rockford,IL) (D、H)分尚。

圖88是示出了使用對CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕獲劑對從樣品(#342)分離的囊泡的生物標誌物CD9、CD81和CD63(A-D)或B7H3和EpCam (E-H)進行檢測的圖，所述囊泡使用具有 IOOkDa MWCO 的 500 μ I 柱(Millipore, Billerica, MA) (A、E)、具有 150kDa MWCO 的 7ml 柱(Pierce ，Rockford，IL) (B、F)、具有 IOOkDa MWCO 的 15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (C、G)或具有 150kDa MWCO 的 20ml 柱(Pierce , Rockford，IL) (D、H)分尚。圖89是示出了在一種樣品(#126) (A-C)相對另一種樣品(#117) (D-F)的對比中使用對CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕獲劑對囊泡的生物標誌物CD9、CD81和CD63或B7H3和EpCam進行檢測的圖，其使用了具有150kDa MWCO的7ml柱(Pierce ,Rockford, IL) (A、D)、具有 IOOkDa MWCO 的 15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (B、E)或150kDa MWCO 的 20ml 柱(Pierce , Rockford, IL) (C、F)。圖90說明了囊泡生物印記區分正常前列腺和PCa樣品的能力。癌症標誌物包括EpCam和B7H3。一般囊泡標誌物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特異性標誌物包括PCSA。據發現所述測試對於PCa對比正常樣品具有96%的靈敏度和95%的特異性。圖91說明了本發明的囊泡分析對比傳統PCa測試的改善的靈敏度。圖92說明了本發明的囊泡分析對比傳統PCa測試的改善的特異性。圖93說明了使用⑶63對對BPH樣品與正常和PCa樣品的區分。圖94說明了囊泡生物印記區分正常前列腺和PCa樣品的能力。癌症標誌物包括EpCam和B7H3。一般囊泡標誌物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特異性標誌物包括PCSA。據發現所述測試對於PCa對比正常和BPH樣品具有98%的靈敏度和84%的特異性。圖95說明了用於PCa的本發明囊泡分析對比傳統測試的改善特異性，即使在包括BPH樣品的情況下。圖96說明了本發明的囊泡分析對比傳統PCa測試的ROC曲線。圖97示出了一般囊泡(如囊泡「MV」 )水平、前列腺特異性MV和具有癌症標誌物的MV的水平之間的相關性。圖98A說明了在PCa和正常樣品之間顯著不同的囊泡標誌物。圖98B-D說明了使用單一捕獲劑和單一檢測劑評估來自正常和癌症受試者的囊泡。所述捕獲劑是EpCam的抗體並且所述檢測劑檢測B) CD81、OEpCam或D) CD9。圖99是A)囊泡前列腺癌分析的示意圖，其產生了決策樹B)、C)、D)以用於確定樣品對於前列腺癌是否為陽性。圖100A-C說明了用於捕獲區分結腸直腸癌(CRC)與正常樣品的囊泡的各種不同捕獲抗體的能力。圖100A說明了 CRC囊泡樣品相對正常樣品的捕獲抗體抗原(X軸)的倍數變化(Y軸)，其根據抗體陣列測定。圖100B與之類似，不同之處在於根據圖例所示，Y軸是CRC和正常樣品中的中位螢光強度。圖100C類似於圖100B，其在另外的樣品組上實施。圖101說明了結腸直腸癌(CRC)細胞系和患者樣品中的KRAS測序。樣品包含獲自細胞系(B)或從來自所述患者的組織樣品(D)獲得的基因組DNA，或獲自從所述細胞系(A)脫落的或來自所述患者(C)的血漿樣品中囊泡中的RNA有效負載的cDNA。圖102A示出了描述在乳腺癌患者樣品(η= 10)或正常對照(即，無乳腺癌)中檢測到的生物標誌物的超出正常值的倍數變化。使用系留於珠上的所標示抗原的抗體捕獲血漿樣品中的囊泡。使用針對四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的標記抗體檢測所捕獲的囊泡。Y軸上的倍數變化是在所述乳腺癌樣品中檢測到的囊泡與正常樣品相比較的中位螢光強度(MFI)的倍數變化。圖103Α說明了來自肺癌樣品的膜囊泡中的各種不同生物標誌物與正常樣品相比較的倍數變化，其使用針對所標出的囊泡抗原的抗體進行檢測。黑色柱是肺癌樣品與正常樣品的比率。白色柱是非肺癌樣品與正常樣品的比率。下劃線標出的數據在圖103Β中示出。圖103Β說明了使用針對所標示的囊泡抗原的抗體檢測的膜囊泡螢光水平。螢光水平是來自以下樣品的平均值:正常(白色)、非肺癌樣品(灰色)以及分期肺癌樣品(黑色)。圖103C示出了使用EPHA2(i)、CD24(ii)、EGFR(iii)和CEA(iV)在來自肺癌患者和正常對照的樣品中進行的囊泡檢測的中位螢光強度(MFI)。圖103D和圖103E在Y軸上給出了在來自肺癌和正常(非肺癌)受試者的樣品中檢測到的囊泡的平均螢光強度(MFI)。捕獲抗體沿X軸標出。圖104說明了對在來自正常(非癌症)血漿樣品、乳腺癌(BCa)血漿樣品和前列腺癌(PCa)血漿樣品的囊泡內的組織因子(TF)的檢測。使用系留於微球上的抗組織因子抗體捕獲血漿樣品中的囊泡。使用針對四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的標記抗體檢測所捕獲的囊泡。發明詳述本發明公開了 用於表徵生物樣品(如，來自細胞培養物、生物體或受試者的樣品)的表型的方法和系統。可通過評估一種或多種生物標誌物表徵所述表型。所述生物標誌物可與囊泡或囊泡群體相關，其為存在的囊泡表面抗原或囊泡有效負載。本文所使用的，囊泡有效負載包含封裝於囊泡之內的實體。囊泡相關的生物標誌物可包含膜結合的和可溶的生物標誌物。所述生物標誌物還可以是循環生物標誌物，諸如在體液中被評估的微RNA或蛋白質。除非另行說明，否則本文中提及囊泡或生物標誌物組分而使用的術語「純化的」或「分離的」指的是這些組分從細胞或生物體部分或完全純化和分離。此外，除非另行說明，提及使用結合劑進行的囊泡分離包括將囊泡結合於所述結合劑，無論該結合是否導致所述囊泡與起始材料中的其它生物實體的完全分離。通過分析循環生物標誌物(如核酸生物標誌物)而表徵表型的方法描述於圖61A的方案6100A中，其為非限制說明性實例。在第一步驟6101中獲得生物樣品，如體液、組織樣品或細胞培養物。從所述樣品分離核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA，如微RNA。對這些核酸的評估可為表型提供生物印記。通過對與目標表型(如疾病對健康、治療前和治療後)相關的核酸取樣，可測定作為表型的指示的一種或多種核酸標誌物。本發明的各個方面涉及通過評估在所述樣品中存在的一種或多種核酸分子(如微RNA)而確定生物印記6105，其中所述生物印記對應於預定的表型6107。圖61B說明了使用囊泡分離核酸分子的方案6100B。在一個實施例中，獲得生物樣品6102，並且從所述樣品分離一種或多種囊泡6104，如，來自特定細胞源的囊泡和/或與特定疾病狀態相關的囊泡。通過鑑定與所述囊泡相關的表面抗原和/或測定存在於所述囊泡中的組分(「有效負載」)的存在或水平而分析所述囊泡6106。除非另行說明，本發明所使用的術語「抗原」通常指的是可被結合劑結合的生物標誌物，無論所述結合劑是抗體、適體、凝集素或用於所述生物標誌物的其它結合齊U，並且無論這種生物標誌物是否在宿主中引發免疫應答。囊泡有效負載可以是包括肽和多肽的蛋白質和/或核酸，諸如DNA和RNA。RNA有效負載包括信使RNA (mRNA)和微RNA (本文中亦稱為miRNA或miR)。根據所述囊泡的生物印記表徵表型6108。在本發明的另一個說明性方法中，方案6100A和6100B共同實施以表徵表型。在該方案中評估了囊泡和核酸(如微RNA)，從而表徵所述表型。在一個相關的 方面，本文提供了用於發現生物標誌物的方法，其包括評估在一個樣品中的囊泡表面標誌物或有效負載標誌物以及將所述標誌物與另一樣品進行比較。在樣品之間明顯不同的標誌物可用作本發明的生物標誌物。這類樣品可以來自受試者或受試者組。例如，所述組可以是，例如，對於給定疾病或失調的給定治療的已知響應者和非響應者。經發現區分已知響應者和非響應者的生物標誌物提供了關於受試者是否可能對治療(諸如治療劑，如藥物或生物製品)有所反應的生物印記。表型本文公開了通過分析囊泡(諸如膜囊泡)來表徵個體的表型的產品和方法。表型可以為受試者的任何可觀察的特徵或性狀，例如疾病或狀況、疾病階段或狀況階段、疾病或狀況的易感性、疾病階段或狀況的預後、生理狀態或對治療的反應。表型可以由受試者的基因表達及環境因素的影響以及這二者之間的相互作用引起，以及由對核酸序列的外遺傳修飾引起。受試者中的表型可以通過從受試者獲得生物樣品並分析所述樣品中的一種或多種囊泡來表徵。例如，表徵受試者或個體的表型可以包括檢測疾病或狀況(包括症狀前的早期階段檢測)，確定疾病或狀況的預後、診斷或治療診斷，或者確定疾病或狀況的階段或進程。表徵表型還可以包括鑑定針對特定疾病、狀況、疾病階段或狀況階段的適當治療或治療效力、疾病進展的預測和可能性分析，特別是疾病復發、轉移擴散或疾病惡化。表型還可以為狀況或疾病(例如癌症或腫瘤)的臨床上獨特的類型或亞型。表型的確定還可以為生理狀況的確定、器官危境或器官排斥(例如移植後)的評估。本文所述的產品和方法可以在個體的基礎上評估受試者，其可以提供在治療中的更有效和更經濟的決策的益處。在一個方面，本發明涉及囊泡分析以提供預測受試者是否可能對疾病或失調的治療有反應的生物印記。表徵表型包括預測所述受試者的響應者/非響應者狀態，其中響應者對疾病的治療有反應而非響應者對所述治療無反應。可在所述受試者中分析囊泡並與已知對治療有反應或沒有反應的先前受試者的囊泡分析進行比較。如果所述受試者中的囊泡生物印記與已知對所述治療有反應的先前受試者更為接近，則所述受試者可表徵或預測為所述治療的響應者。類似地，如果所述受試者中的囊泡生物印記與已知對所述治療無反應的此前受試者更為接近，則所述受試者可表徵或預測為所述治療的非響應者。所述治療可以針對任意適當的疾病、失調或其它狀況。在與響應者/非響應者狀態相關的囊泡生物印記已知的情況下，所述方法可用於任意疾病情況中。本發明所使用的術語「表型」可以指貢獻於囊泡生物印記的任何性狀或特徵，該生物印記使用本發明的方法而鑑定。例如，表型可以是受試者可能對治療有反應的標識，或更廣義地其可為治療診斷基於針對獲自受試者的樣品鑑定的生物印記的診斷、預後或治療診斷確定。在一些實施方案中，所述的表型包括疾病或狀況如表I中所列的那些。例如，所述的表型可包括腫瘤、贅生物或癌症的存在或發生腫瘤、贅生物或癌症的可能性。通過本文所述的產品或方法檢測或評估的癌症包括但不限於乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、增生性息肉、腺瘤、結腸直腸癌、高度異型增生(high grade dysplasia)、低度異型增生(low gradedysplasia)、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、腦癌(例如成膠質細胞瘤)、血液惡性腫瘤、肝細胞癌、宮頸 癌、子宮內膜癌、頭頸癌、食管癌、胃腸道間質瘤(GIST)、腎細胞癌(RCC)或胃癌。所述的結腸直腸癌可以為CRC Dukes B或CRC DukesC-D。所述的血液惡性腫瘤可以為B細胞慢性淋巴細胞性白血病、B細胞淋巴瘤-DLBCUB細胞淋巴瘤-DLBCL-生發中心樣、B細胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細胞樣以及伯基特氏淋巴瘤。所述表型可以是惡變前狀況，諸如光化性角化病、萎縮性胃炎、白斑病、增殖性紅斑、淋巴瘤樣肉芽腫病、白血病前期、纖維症、宮頸非典型增生、子宮頸非典型增生、著色性幹皮病、巴雷特食管、結腸直腸息肉或有可能發展成為惡性腫瘤的其它異常組織生長或病灶。諸如HIV和HPV的轉化型病毒感染也提供了可根據本發明進行評估的表型。通過本發明的方法表徵的癌症可包括但不限於，癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖細胞瘤、胚細胞瘤或其它癌症。癌瘤包括但不限於，上皮腫瘤、鱗狀細胞腫瘤鱗狀細胞癌、基底細胞腫瘤基底細胞癌、移行細胞乳頭狀瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺體)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰島瘤(linitis plastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性腸肽瘤、膽管癌、肝細胞癌、囊性腺樣癌、闌尾類癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒細胞瘤、許特萊氏細胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、腎細胞癌、格拉維茨瘤(grawitz tumor)、多發性內分泌腺瘤、子宮內膜腺瘤、附件和皮膚附件腫瘤、粘液表皮樣腫瘤、囊性、粘液性和漿液性腫瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、導管、小葉和髓質腫瘤、腺泡細胞腫瘤、複合上皮腫瘤、沃辛腫瘤(warthin' s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺腫瘤、性索間質瘤、泡膜細胞瘤、粒膜細胞瘤、卵巢含睪丸母細胞瘤、支持細胞睪丸間質細胞瘤、血管球瘤、副神經節瘤、嗜鉻細胞瘤、血管神經肌瘤、痣與黑色素瘤、黑素細胞痣、惡性黑色素瘤、黑色素瘤、結節性黑色素瘤、發育不良痣、惡性痣性黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤以及惡性肢端著色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限於，Askin腫瘤、葡萄狀肉瘤(botryodies)、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性血管內皮細胞瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤,其包括:腺泡狀軟組織肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促結締組織增生性小圓形細胞瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、卡波濟氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、神經纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限於，慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞幼淋巴細胞性白血病、淋巴眾細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)(諸如WaldenstrGm巨球蛋白血症)、脾邊緣區淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、單克隆免疫球蛋白沉積病、重鏈病、亦稱為malt淋巴瘤的結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤(nmz I)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T細胞幼淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病、侵襲性NK細胞白血病、成人T細胞性白血病/淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤，鼻型、腸病型T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、母細胞性NK細胞淋巴瘤、蕈樣黴菌病/塞澤裡症候群(sezary syndrome)、原發性皮膚⑶30陽性T細胞淋巴組織增生性疾病、原發性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、非指定、間變性大細胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(結節性硬化、混·合細胞性、富淋巴細胞、淋巴細胞耗盡或非耗盡)以及結節性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤。生殖細胞腫瘤包括但不限於，生殖細胞瘤、無性細胞瘤、精原細胞瘤、非生殖細胞瘤性生殖細胞瘤、胚胎癌、內胚竇腫瘤、絨毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺細胞瘤。胚細胞瘤包括但不限於，腎母細胞瘤、成神經管細胞瘤和視網膜母細胞瘤。其它癌症包括但不限於，唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲狀腺癌(延髓和乳頭狀甲狀腺癌)、腎癌、腎實質癌、子宮頸癌、子宮體癌、子宮內膜癌、絨毛膜癌、睪丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、腦腫瘤(如膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、髓母細胞瘤和外周神經外胚層腫瘤)、膽囊癌、支氣管癌、多發性骨髓瘤、基底細胞癌、畸胎瘤、視網膜母細胞瘤、脈絡膜黑色素瘤、精原細胞瘤、橫紋肌肉瘤、盧頁咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、尤文氏肉瘤和漿細胞瘤。在進一步的實施方案中，進行分析的癌症可以是肺癌，其包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌(包括小細胞癌(燕麥細胞癌)、小細胞/大細胞混合癌以及複合性小細胞癌)、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質細胞瘤、膠質母細胞瘤、肝細胞癌、乳頭狀癌腎癌、頭頸部鱗狀細胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或實體腫瘤。在實施方案中，所述癌症包括急性成淋巴細胞性白血病；急性骨髓性白血病；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎樣瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明癌；類癌瘤；原發部位不明腫瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜母細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經細胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；頡外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST)；妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性的轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤病；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌衝度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤；胸膜肺母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌 症；S6zary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr6m巨球蛋白血症或腎母細胞瘤。本發明的方法可用於表徵這些及其它癌症。因此，對表型的表徵可提供本文公開的癌症之一的診斷、預後和治療診斷。所述的表型還可以為炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，所述的疾病可以為炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(⑶)、潰瘍性結腸炎(UC)、盆腔炎症、脈管炎、銀屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多發性硬化症、重症肌無力、I型糖尿病、類風溼性關節炎、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡(SLE)、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、強直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST症候群、硬皮病、風溼病、器官排斥反應、原發性硬化性膽管炎或膿毒症。所述的表型還可以包括心血管疾病，例如動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、易損斑塊、中風或局部缺血。所述的心血管疾病或狀況可以為高血壓、狹窄症、血管阻塞或血栓形成事件。所述的表型還可以包括神經疾病，例如多發性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、精神分裂症、雙相型障礙、抑鬱症、孤獨症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷頓病(HD)、唐氏症候群、腦血管疾病、Rasmussen腦炎、病毒性腦膜炎、神經精神性系統性紅斑狼瘡(NPSLE)、肌萎縮性脊髓側索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、傳染性海綿狀腦病、缺血再灌注損傷(例如中風)、腦外傷、微生物感染或慢性疲勞症候群。所述的表型還可以為諸如纖維肌痛、慢性神經病理性疼痛或周圍神經病理性疼痛的狀況。所述的表型還可以包括感染性疾病，例如細菌、病毒或酵母菌感染。例如，所述的疾病或狀況可以為惠普爾氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、腦膜炎、瘧疾、結核病或流行性感冒。可以評估囊泡中的病毒蛋白質(例如HIV或HCV樣顆粒)從而表徵病毒狀況。所述的表型還可以包括圍產期或妊娠相關的狀況(例如先兆性子癇或早產)、代謝疾病或狀況(例如與鐵代謝有關的代謝疾病或狀況)。例如，可以測定在囊泡中的鐵調素(hepcidin)從而表徵鐵缺乏。所述的代謝疾病或狀況還可以為糖尿病、炎症或圍產期狀況。本發明的方法可用於表徵這些疾病或失調以及可通過生物標誌物評估的其它疾病或失調。因此，對表型的表徵可提供對本文公開的疾病或失調之一的診斷、預後和治療診斷。受試者可通過分析從受試者獲得的生物樣品中的一種或多種囊泡(如多種囊泡)來確定受試者的一種或多種表型。受試者或患者可以包括但不限於哺乳動物，例如牛、鳥、犬、馬、貓、綿羊、豬或靈長動物(包括人及非人靈長動物)。受試者還可以包括:由於瀕危而變得重要的哺乳動物，例如西伯利亞虎；或者具有經濟意義的動物(例如用於人消費的農場飼養動物)，或對人類而言具有社會意義的動物(例如作為寵物或在動物園中飼養的動物)。此類動物的實例包括但不限於:食肉動物，例如貓和狗；豬，包括畜養豬、食用豬和野豬；反芻動物或有蹄類動物，例如牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛、駱駝或馬。此外，還包括瀕危的或在動物園中飼養的鳥；以及禽類，更特別的是家養的禽類，即，家禽，例如火雞和雞、鴨、鵝、珍珠雞。還包括家養的豬和馬(包括賽馬)。此外，與商業活動有關的任何動物種類也都被包括在內，例如與農業、水產業和其它活動有關的動物，所述行業中為了經濟生產率和/或食物鏈的安全，疾病監測、診斷和療法的選擇是常規措施。所述的受試 者可以患有此前存在的疾病或狀況，例如癌症。或者，所述的受試者可以並未患任何已知的此前存在的狀況。所述的受試者還可以對現有或過去的治療是非反應性的，例如對癌症的治療是非反應性的。樣品得自所述受試者的生物樣品可以為任何體液。例如，所述的生物樣品可以為外周血、血清、血漿、腹水、尿、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或預射精液、女性射出液、汗液、排洩物、毛髮、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、膽汁、間質液、經血、膿液、皮月旨、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管肺抽吸液或其它灌洗液。生物樣品還可以包括囊胚腔、臍帶血或母體循環血(其可以為胎兒來源或母體來源的)。所述的生物樣品還可以為組織樣品或活體組織，從中可獲得囊泡和其它循環生物標誌物。例如，可以培養得自樣品的細胞，並且從所述培養物中分離囊泡(例如參見實施例1)。在各個實施方案中，可由這些生物樣品直接評估本發明公開的生物標誌物或更特別地生物印記(如，對核酸或多肽生物標誌物或其功能性片段的存在或水平的鑑定)，其使用各種方法，諸如，從血液、血漿、血清或任意前述生物樣品中提取核酸分子，使用蛋白質或抗體陣列鑑定多肽(或功能性片段)生物標誌物，以及本領域中已知用於鑑定與評估核酸和多肽分子的其它陣列、測序、PCR和蛋白質組技術。表I列出了疾病、狀況或生物學狀態的說明性實例，以及可以對其中的囊泡進行分析的生物樣品的相應列表。表1:對於各種疾病、狀況或生物學狀態，用於囊泡分析的生物樣品的實例
說明性的疾病、狀況或生物學狀態 I說明性的生物樣品·
權利要求
1.一種在需要的受試者中治療診斷疾病或失調的方法，其包括 (a)在來自所述受試者的樣品中鑑定囊泡群體的生物印記，其中所述生物印記包括一種或多種細胞特異性生物標誌物的存在或水平和/或一種或多種疾病特異性生物標誌物的存在或水平，以及一種或多種一般囊泡生物標誌物的存在或水平；以及 (b)將所述生物印記與參照進行比較，其中所述比較指示了所述受試者對於治療劑是響應者還是非響應者，由此而治療診斷所述疾病或失調。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述受試者此前尚未暴露於所述治療劑。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述治療診斷包括確定療效。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述鑑定在單一分析中進行。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述樣品包括體液。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述體液包括外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或預射精液、女性射出液、汗液、排洩物、毛髮、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、膽汁、間質液、經血、膿液、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管肺抽吸液、囊胚腔液或臍帶血。
7.根據權利要求5所述的方法，其中所述體液包括血清或血漿。
8.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述囊泡群體包含具有20nm至800nm的直徑的囊泡。
9.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述囊泡群體包含具有20nm至200nm的直徑的囊泡。
10.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述囊泡群體進行尺寸排阻色譜、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、親和捕獲、免疫分析、微流體分離或它們的組合。
11.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述一種或多種細胞特異性生物標誌物、一種或多種疾病特異性生物標誌物以及一種或多種一般囊泡生物標誌物包括蛋白質。
12.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述一種或多種疾病特異性生物標誌物包括EpCAM、B7H3、⑶24、組織因子或其組合。
13.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述一種或多種一般囊泡生物標誌物包括 CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab_5b、MFG-E8、膜聯蛋白 V 或其組合。
14.根據權利要求I所述的方法，其中所述生物印記包括使用結合劑進行的分析。
15.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中鑑定所述生物印記包括將所述樣品與對於三種不同分析物特異性的至少三種結合劑接觸。
16.根據權利要求I或15所述的方法，其中所述結合劑包括抗原、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PM)、鎖核酸(LNA)、凝集素、肽、枝狀物、膜蛋白標記劑或化學化合物。
17.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中鑑定所述生物印記包括對一種或多種核酸的評估。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述一種或多種核酸包括DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、si RNA、hnRNA 或 shRNA。
19.根據權利要求17所述的方法，其中所述一種或多種核酸包括miR-21、miR-205、miR-92、miR-147、miR-141 或 miR-574 的一種或多種。
20.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中鑑定所述生物印記包括對一種或多種核酸、肽、蛋白質、脂質、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖的評估。
21.根據權利要求17所述的方法，其中所述一種或多種核酸包括圖3-6、19-24、26-30、32、33、36、40-42、47、51、53-57 和 / 或 60 中的一種或多種微 RNA0
22.根據權利要求17所述的方法，其中所述一種或多種核酸包括選自miR-21、miR-205、miR-92、miR-147 或 miR-574 的一種或多種微 RNA。
23.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述受試者當前並未針對所述疾病或失調接受治療。
24.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述受試者正處於針對所述疾病或失調的治療中。
25.根據權利要求2所述的方法，其進一步包括對所述受試者施用所述治療劑。
26.根據權利要求2所述的方法，其中鑑定所述受試者為對於所述治療劑的非響應者或響應者包括將所述受試者的囊泡生物印記針對來自此前鑑定的對於所述治療劑的響應者和非響應者的一組囊泡生物印記進行關聯。
27.根據權利要求26所述的方法，其中在所述受試者的囊泡生物印記與來自此前鑑定的響應者的囊泡生物印記組的關聯比其與來自此前鑑定的非響應者的囊泡生物印記組的關聯更為緊密的情況下，將所述受試者鑑定為響應者。
28.根據權利要求26所述的方法，其中在所述受試者的囊泡生物印記與來自此前鑑定的非響應者的囊泡生物印記組的關聯比其與來自此前鑑定的響應者的囊泡生物印記組的關聯更為緊密的情況下，將所述受試者鑑定為非響應者。
29.根據權利要求2所述的方法，其中鑑定所述受試者為對於所述治療劑的非響應者或響應者包括針對使用此前鑑定的響應者和非響應者進行訓練的分類器對所述受試者的囊泡生物印記進行分類。
30.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述疾病或失調包括前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌或黑色素瘤。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括前列腺癌並且所述生物印記包括PCSA和PSMA中的一種或多種以及B7H3和EpCam中的一種或多種。
32.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括前列腺癌並且所述生物印記包括PCSA。
33.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括 DR3、STEAP, Epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL, EpCam、MUC17、TR0P2 和TETS中的一種或多種。
34.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括 CD9、EGFR、CD63、MUC1、TGM2、CD81、 ΜΡ、EPHA2、TMEM211、UNC93A、CD66e、CD24、鐵蛋白、EpCAM, NGAL, GPR30、p53、MUC17、NCAM 和 B7H3 中的一種或多種。
35.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括 CD9、EPHA2、EGFR、CD63、MUCl、TGM2、CD81、 ΜΡ I、GPRl 10、ΜΜΡ9、ΤΜΕΜ211、UNC93、CD66e、CD24、Ngal、EpCAM、GPR30、OPN、MUC17、p53、MUC2、Ncam 和 TSGlOl 中的一種或多種。
36.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括TMEM211和⑶24。
37.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括EpCam和CD66。
38.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括結腸直腸癌並且所述生物印記包括EGFR、EPHA2、p53和KRAS中的一種或多種。
39.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括乳腺癌並且所述生物印記包括 CD9、HSP70、Gal3、MIS、EGFR、ER、ICB3、CD63、B7H4、MUC1、DLL4、CD81、ERB3、VEGF、BCA225、BRCA, CA125、CD174、CD24、ERB2、NGAL, GPR30、CYFRA21、CD31、cMET、MUC2 和 ERB4中的一種或多種。
40.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括乳腺癌並且所述生物印記包括 CD9、EphA2、EGFR、B7H3、PSMA, PCSA, CD63、STEAP, CD81、B7H3、STEAPl、ICAMl (CD54)、A33、DR3、CD66e、MFG_e8、!fepsin、TMEM211、TROP-2、EGFR、乳腺珠蛋白、!fepsin、NPGP/NPFF2、PSCA、5T4、NGAL、NK-2、EpCam、NK-lR、5T4、PAI-I 和 CD45 中的一種或多種。
41.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括乳腺癌並且所述生物印記包括 BRCA、cMET、DLL4、EphA2、EGFR、ER、ERB2、ERB3、ERB4 和 VEGF 中的一種或多種。
42.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括 SPB、SPC、TFF3、PGP9. 5、CD9、MS4A1、NDUFB7、Cal3、iC3b、CD63、MUCl、TGM2、CD81、B7H3、DR3、MACCl、TrkB、組織因子(TF) ,TIMPUGPCR(GPRllO)、MMP9、MMP7、TMEM211、TWEAK、CDADCl、UNC93、APC, A33、CD66e、CD24、ErbB2、CD10、BDNF、鐵蛋白、S印rase、NGAL, EpCam、ErbB2、骨橋蛋白(OPN)、LDH、HSP70、MUC2、NCAM、CXCL12、結合珠蛋白(HAP)、CRP 和 Gro- α中的一種或多種。
43.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括ΕΡΗΑ2、CD24、EGFR和CEA中的一種或多種。
44.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括 SPB、SPC、NSE、PGP9. 5、CD9、P2RX7、NDUFB7、NSE、Gal3、骨橋蛋白、CHI3L1、EGFR、B7H3、iC3b、MUCI、間皮素、SPA、TPA、PCSA、CD63、AQP5、DLL4、CD81、DR3、PSMA、GPCR 110 (GPR110)、EPHA2、CEACAM、PTP、CABYR、TMEM211、ADAM28、UNC93a、A33、CD24、CD10、NGAL、EpCam、MUC17、TR0P2和MUC2中的一種或多種。
45.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括 SPB、SPC、PSP9. 5、NDUFB7、Gal3、iC3b、MUCl、GPCRl 10、CABYR 和 MUC17 中的一種或多種。
46.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括 CD9、CD63、CD81、B7H3、PRO GRP、CYTO 18、FTHl、TGM2、CENPH、膜聯蛋白 I、膜聯蛋白 V、ERB2、EGFR、CRP、VEGF、CYTO 19、CCL2、骨橋蛋白(0ST19)、骨橋蛋白(0ST22)、BTUB、CD45、TIMP, NACCl、MMP9、BRCAl、P27、NSE、M2PK、HCG, MUCl、CEA、CEACAM、CYTO 7、EPCAM、MS4A1、MUC1、MUC2、PGP9、SPA、SPA、SPD, P53、GPCR (GPRllO)、SFTPC, UNCR2、NSE、INGA3、INTG b4、MMPUPNT,RACKl、NAP2、HLA,BMP2、PTH1R、PAN ADH、NCAM、CD151、CKSl、FSHR、HIF、KRAS、LAMP2、SNAIL、TRIM29, TSPANl、TWISTl、ASPH 和 AURKB 中的一種或多種。
47.根據權利要求30所述的方法，其中所述疾病或失調包括肺癌並且所述生物印記包括 ASPH、BRCAl、EGFR、EPHA2、ErbB2、HIF、KRAS、MS4A1、P27、P53、ADH、PGP9、PGP9. 5 和 VEGF中的一種或多種。
48.根據權利要求2所述的方法，其中所述疾病或失調包括癌症並且所述生物印記包括ABCCl、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCAl、 βIII微管蛋白、BIRC5、B-RAF、BRCA1、BRCA2、CA2、小窩蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDKN2A、CDKN1A、CDKN1B、CDK2、CDW52、CES2、CK 14,CK 17,CK 5/6、c-KIT、c-Met、c-Myc、COX_2、細胞周期蛋白 Dl、DCK、DHFR、DNMTl、DNMT3A、DNMT3B、E-鈣粘蛋白、ECGFl、EGFR、EML4-ALK 融合體、EPHA2、表皮調節素、ER、ERBR2、ERCCl、ERCC3、EREG、ESRl、FLTI、葉酸受體、FOLRl、F0LR2、FSHB, FSHPRHU FSHR, FYN、GART, GNRHl、GNRHRl、GSTPl、HCK、HDACl、hENT-1、Her2/Neu、HGF, HIF1A、HIGl、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IGF-1R、IGFRBP, IGFRBP3、IGFRBP4、IGFRBP5、IL13RA1、IL2RA、KDR、Ki67、KIT、K-RAS、LCK, LTB、淋巴毒素 β 受體、LYN、MET、MGMT、MLH1、MMR、MRP1、MS4A1、MSH2、MSH5、Myc、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、ODCU OGFR, pl6、p21、p27、p53、p95、PARP-I、PDGFC、PDGFR、PDGFRA,PDGFRB, PGP、PGR、PI3K、POLA,POLAUPPARG,PPARGCUPR、PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RRMl、RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活素、TK1、TLE3、TNF, TOPI、T0P2A、T0P2B、TS、TXN, TXNRDU TYMS,VDR、VEGF、VEGFA, VEGFC, VHL, YESl 和 ZAP70 中的一種或多種。
49.根據權利要求48所述的方法，其中與參照相比較(a)中的一種或多種標誌物的過表達、表達不足或突變用於選擇所述治療劑。
50.根據權利要求48所述的方法，其中(a)中的一種或多種標誌物包括KRAS並且與野生型參照相比KRAS的突變用於選擇所述治療劑。
51.根據權利要求50所述的方法，其中所述KRAS的突變通過對KRASmRNA測序而確定。
52.根據權利要求51所述的方法，其中所述KRASmRNA是所述囊泡群體中的有效負載。
53.根據權利要求1-3中任一項或權利要求31-52中任一項所述的方法,其中所述一種或多種一般囊泡生物標誌物包括一種或多種四跨膜蛋白。
54.根據權利要求1-3中任一項或權利要求31-52中任一項所述的方法,其中所述一種或多種一般囊泡生物標誌物包括⑶9、⑶63和⑶81中的一種或多種。
55.根據權利要求1-3中任一項或權利要求31-52中任一項所述的方法,其中所述一種或多種一般囊泡生物標誌物包括⑶63、⑶9、⑶81、⑶82、⑶37、⑶53、Rab_5b、MFG-E8和膜聯蛋白V中的一種或多種。
56.根據權利要求1-3中任一項或權利要求31-52中任一項所述的方法,其中所述一種或多種一般囊泡生物標誌物包含表3中所列的一種或多種標誌物。
57.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述疾病或失調包知癌症、惡變前狀況、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或失調、心血管疾病或失調、神經疾病或失調、感染性疾病或者疼痛。
58.根據權利要求57所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、結腸癌、增生性息肉、腺瘤、結腸直腸癌、高度異型增生、低度異型增生、前列腺增生、前列腺 癌、黑色素瘤、胰腺癌、腦癌、成膠質細胞瘤、肝細胞癌、宮頸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、食管癌、胃腸道間質瘤(GIST)、腎細胞癌(RCC)、胃癌、結腸直腸癌(CRC)、CRCDukes B、CRC Dukes C-D、血液惡性腫瘤、B細胞慢性淋巴細胞性白血病、B細胞淋巴瘤-DLBCUB細胞淋巴瘤-DLBCL-生發中心樣、B細胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細胞樣或伯基特氏淋巴瘤。
59.根據權利要求57所述的方法，其中所述癌症包括急性淋巴細胞性白血病；急性髓性白血病；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎樣瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明癌；類癌瘤；原發部位不明癌瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎樣瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；嗅神經母細胞瘤；尤文氏肉瘤；顱外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌瘤；胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST);妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌症；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維性組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤；胸膜肺的母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌；S6zary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstrom巨球蛋白血症或腎母細胞瘤。
60.根據權利要求57所述的方法，其中所述惡變前狀況包括光化性角化病、萎縮性胃炎、白斑病、增殖性紅斑、淋巴瘤樣肉芽腫病、白血病前期、纖維症、宮頸非典型增生、子宮頸非典型增生、著色性幹皮病、巴雷特食管、結腸直腸息肉、轉化型病毒感染、HIV或HPV。
61.根據權利要求57所述的方法，其中所述自身免疫疾病包括炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎(UC)、盆腔炎、脈管炎、銀屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多發性硬化症、重症肌無力、I型糖尿病、類風溼性關節炎、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡(SLE)、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、強直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST症候群、硬皮病、風溼病、器官排斥反應、原發性硬化性膽管炎或膿毒症。
62.根據權利要求57所述的方法，其中所述心血管疾病包括動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、易損斑塊、中風、局部缺血、高血壓、狹窄、血管阻塞或血栓形成事件。
63.根據權利要求57所述的方法，其中所述神經疾病包括多發性硬化症(MS)、帕金森氏病(ro)、阿爾茲海默氏病(AD)、精神分裂症、雙相型障礙、抑鬱症、孤獨症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷頓病(HD)、唐氏症候群、腦血管疾病、Rasmussen腦炎、病毒性腦膜炎、神經精神性系統性紅斑狼瘡(NPSLE)、肌萎縮性脊髓側索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、傳染性海綿狀腦病、缺血再灌注損傷(例如中風)、腦外傷、微生物感染或慢性疲勞症候群。
64.根據權利要求57所述的方法，其中所述疼痛包括纖維肌痛、慢性神經病理性疼痛或周圍神經病理性疼痛。
65.根據權利要求57所述的方法，其中所述感染性疾病包括細菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠普爾氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、腦膜炎、瘧疾、結核或流行性感冒。
66.一種在需要的受試者中治療診斷疾病或失調的方法，其包括 (a)在來自所述受試者的樣品中鑑定囊泡群體的生物印記，其中所述生物印記包括KRAS, BRAF, PIK3CA 和 / 或 c_kit 的突變；以及 (b)將所述生物印記與參照進行比較以鑑定KRAS、BRAF,PIK3CA和/或c_kit的突變的存在，由此而治療診斷所述疾病或失調。
67.根據權利要求66所述的方法，其中所述突變在分離自所述囊泡群體的mRNA中檢測。
68.根據權利要求66或67所述的方法，其中所述生物印記包括KRAS的突變。
69.根據前述任意權利要求所述的方法，其中所述方法在體外進行。
70.試劑在實施根據前述任意權利要求中任一項所述方法的用途。
71.—種試劑盒，其包含用於實施根據權利要求1-69中任一項所述方法的試劑。
全文摘要
對可用於診斷、治療相關或預後方法的生物標誌物進行評估以表徵表型(如狀況或疾病)或者疾病的階段或進程。來自體液的循環生物標誌物可用於確定生理狀態譜或確定表型。這些生物標誌物包括核酸、蛋白質以及循環結構，如囊泡。生物標誌物可用於治療診斷目的以選擇針對疾病、狀況、疾病階段以及狀況階段的候選治療方案，並且還可用於確定療效。所述生物標誌物可以是循環生物標誌物，包括囊泡和微RNA。
文檔編號G01N33/53GK103237901SQ201180022248
公開日2013年8月7日 申請日期2011年3月1日 優先權日2010年3月1日
發明者D·D·哈爾伯特, C·庫斯裡奇, G·波斯特, M·克拉斯, D·斯佩茲勒, T·帕夫洛夫斯基, A·塔西納託, D·霍爾特曼 申請人:卡裡斯生命科學盧森堡控股有限責任公司