核重編程序方法

2023-05-10 03:33:46

專利名稱:核重編程序方法
技術領域：
本發明涉及使體細胞重編程序且產生誘導的多潛能幹細胞的方法。
技術背景
由人或小鼠早期胚胎確立，胚胎幹細胞(ES細胞)能夠長期培養，同時維持其分化 成在活生物中發現的所有類型細胞的潛力。具有這個特徵，人ES細胞預期充當用於許多疾 病的細胞移植療法，包括帕金森氏病、青少年糖尿病和白血病。然而，ES細胞移植造成與器 官移植一樣引起排斥的問題。此外，從倫理觀點來看，不少人反對由破壞人胚胎確立的ES 細胞的使用。
如果誘導患者的體細胞分化以確立具有類似於ES細胞那些的多潛能性和增殖能 力的細胞(此處，這些細胞稱為「誘導的多潛能幹細胞」(iPS細胞)，並且有時稱為「胚胎 幹細胞樣細胞」或「ES樣細胞」)，那麼確立的細胞將用作不造成排斥問題和倫理問題的理 想多潛能細胞。近年來，已報告iPS細胞可以由小鼠和人分化的細胞產生，從而引起極大 關注(國際專利申請公開號 W02007/69666 ；Cell，126，第 663-676 頁，2006 ；Cell，131，第 861-872 頁，2007 ；Science，318，第 1917-1920 頁，2007 ；Nature，451，第 141-146 頁，2008)。
所有這些方法包括將多種特定核重編程序因子(例如，在Cell，126，第1-14頁， 2006中，使用4種因子:0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)引入體細胞內以達到重編程序的步 驟，所述步驟涉及使用逆轉錄病毒或慢病毒用於將基因有效引入體細胞內的目的，所述基 因編碼核重編程序因子。然而，因為使用病毒載體的基因遞送涉及安全問題，所以需要開發 無需使用病毒載體產生iPS細胞的方法。

發明內容
技術問題
本發明的目的是提供無需使用病毒載體例如逆轉錄病毒通過使體細胞重編程序 產生iPS細胞的方法。
解決問題的技術方案
本發明人廣泛研究以解決上文描述的問題，並且發現通過藉助於非病毒表達載體 例如質粒載體將編碼重編程序因子的基因引入體細胞內可以產生iPS細胞，並且通過該方 法可以由體細胞獲得安全的iPS細胞。本發明已基於這些發現而發展。
因此，本發明提供了產生誘導的多潛能幹細胞的方法，其包括將至少一種非病毒 表達載體引入體細胞內的步驟，所述非病毒表達載體整合了編碼重編程序因子的至少一種 基因。
在優選實施方案中，本發明提供了其中載體是在染色體外自主可複製的非病毒表 達載體的上述方法；和其中載體是質粒載體的上述方法。
在另一個優選實施方案中，本發明提供了其中編碼重編程序因子的基因是通過W0 2005/80598中描述的篩選核重編程序因子的方法選擇的基因之一或多種此種基因的組合的上述方法；和其中編碼重編程序因子的基因是選自下述的一種或多種基因、優選2種基 因的組合、更優選3種基因的組合、特別優選4種或更多種基因的組合的上述方法0ct家 族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因和Nanog基因。
更優選的組合是(a)由Oct家族基因和Sox家族基因組成的2種基因的組合；(b) 由Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因組成的3種基因的組合；(c)由Oct家族基 因、Klf家族基因、Sox家族基因和Myc家族基因組成的4種基因的組合；(d)由Oct家族基 因、Sox家族基因、Lin家族基因和Nanog基因組成的4種基因的組合；(e)由Oct家族基 因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因和Nanog基因組成的6種基 因的組合；等等。此外，還優選在組合中包括TERT基因和/或SV40 Large T抗原基因。視 情況而定，優選排除Klf家族基因。
其特別優選的組合是由0ct3/4和Sox2組成的2種基因的組合；由0ct3/4、Klf4 和Sox2組成的3種基因的組合；由0ct3/4、Klf4、SoX2和c-Myc組成的4種基因的組合；由 0ct3/4、Sox2、Lin28 和 Nanog 組成的 4 種基因的組合；以及由 0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc, Lin28和Nanog組成的6種基因的組合。還優選在這些組合中包括TERT基因和/或SV40 Large T抗原基因。視情況而定，優選排除Klf4。
在另一個優選實施方案中，本發明提供了其中引入體細胞內的非病毒表達載體的 種類數目是1、2、3或4的上述方法；其中編碼重編程序因子的基因是由Oct家族基因、Klf 家族基因和Sox家族基因組成的3種基因的組合，並且將這些基因整合入一種非病毒表達 載體中的上述方法；其中編碼核重編程序因子的基因是由Oct家族基因、Klf家族基因、Sox 家族基因和Myc家族基因組成的4種基因的組合，並且將Oct家族基因、Klf家族基因和 Sox家族基因整合入一種非病毒表達載體中的上述方法；其中Oct家族基因、Klf家族基因 和Sox家族基因以這種順序以從5'到3'末端方向整合入一種非病毒表達載體的上述方 法；以及其中Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因與使得能夠進行多順反子表達的 間插序列一起整合入一種非病毒表達載體中的上述方法。
在另一個優選實施方案中，本發明提供了其中2種或更多種上述非病毒表達載體 同時引入體細胞內的上述方法；其中編碼重編程序因子的基因是由Oct家族基因、Klf家族 基因、Sox家族基因和Myc家族基因組成的4種基因的組合，並且將第一種非病毒表達載體 和第二種非病毒表達載體同時引入體細胞內的上述方法，所述第一種非病毒表達載體整合 了選自4種基因的3種或更少種基因，且所述第二種非病毒表達載體整合了 4種基因中的 剩餘一種或多種基因；其中3種或更少種基因是Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基 因，並且剩餘基因是Myc家族基因的上述方法；其中3種或更少種基因是0ct3/4、Klf4和 Sox2，並且剩餘基因是c-Myc的上述方法；和其中非病毒表達載體引入體細胞內重複執行2 次或更多次的上述方法。
在特別優選的實施方案中，本發明提供了其中將具有0ct3/4、Klf4和Sox2的第一 種非病毒表達載體以及具有c-Myc的第二種非病毒表達載體引入體細胞內的上述方法；其 中將第一種非病毒表達載體和具有c-Myc的第二種非病毒表達載體引入體細胞內的上述 方法，所述第一種非病毒表達載體具有以這種順序以從5'到3'末端方向的0ct3/4、Klf4 和Sox2 ；其中0ct3/4、Klf4和Sox2以這種順序以從5'到3'末端方向與使得能夠進行多 順反子表達的間插序列連接，並且插入第一種非病毒表達載體內的上述方法；其中第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體同時引入體細胞內的上述方法；以及其中引入重 復執行2次或更多次的上述方法。還提供的是其中引入的至少一種非病毒表達載體的全部 或部分基本上不整合到染色體中的上述方法。
在另一個優選實施方案中，本發明提供了其中體細胞是哺乳動物包括人的體細 胞、優選人或小鼠體細胞、特別優選人體細胞的上述方法；其中體細胞是胎兒人細胞或得自 成年人的體細胞的上述方法；和其中體細胞是從患者收集的體細胞的上述方法。
在另一個方面，本發明提供了可以通過上述方法獲得的誘導的多潛能幹細胞。在 優選實施方案中，本發明還提供了誘導的多潛能幹細胞，其中引入的至少一種非病毒表達 載體的全部或一些基本上不整合到染色體中。
還提供的是上述誘導的多潛能幹細胞，其中體細胞是哺乳動物包括人的體細胞、 優選人或小鼠體細胞、特別優選人體細胞；其中體細胞是胎兒人細胞或得自成年人的體細 胞的上述誘導的多潛能幹細胞；和其中體細胞是從患者收集的體細胞的上述誘導的多潛能 幹細胞。
本發明還提供了用於在產生誘導的多潛能幹細胞的上述方法中使用，整合了編碼 重編程序因子的至少一種基因的非病毒表達載體，優選質粒載體。
本發明還提供了由上述誘導的多潛能幹細胞誘導和分化的體細胞。
本發明還提供了幹細胞療法，其包括給患者移植通過誘導的多潛能幹細胞的分化 誘導獲得的體細胞，所述誘導的多潛能幹細胞使用從患者分離的體細胞通過上述方法獲 得。
本發明進一步提供了使用各種細胞評估化合物、藥物、有毒物質等的生理活性和 毒性的方法，所述各種細胞通過經由上述方法獲得的誘導的多潛能幹細胞的分化誘導獲得。
發明的有益效果
無需使用整合到染色體內的載體例如逆轉錄病毒產生，由本發明提供的誘導的多 潛能幹細胞是有利的，因為腫瘤發生和其他問題在通過使誘導的多潛能幹細胞分化獲得的 體細胞和組織中不出現。在本發明的優選實施方案中，在通過本發明的方法產生的誘導的 多潛能幹細胞中，引入的至少一種非病毒表達載體的全部或一些附加型地存在，基本上不 整合到染色體中。因此，本發明的方法使得可能由例如患者的體細胞製備高度安全的誘導 的多潛能幹細胞，並且通過使這種細胞分化獲得的細胞(例如，心肌細胞、胰島素生產細胞 或神經細胞等)可以安全地用於幹細胞移植療法，以用於廣泛多樣的疾病，包括心力衰竭、 胰島素依賴性糖尿病、帕金森氏病和脊髓損傷。


圖1顯示根據本發明方法使用質粒用於由0ct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc轉染體 細胞(MEF)的時間過程規程，7次獨立測試的結果(左側照片，432A-1至432A-7 細胞密 度lxlO6細胞/100mm皿)和另一次測試的結果(右側照片，432B-1 細胞密度2xl05細胞 /100mm皿)。中央最下面的圖片顯示對照結果(無轉染)。在圖1中，相列顯示相差圖像， 並且GFP列顯示GFP陽性集落。
圖2顯示用於iPS細胞產生的表達質粒。編碼0ct3/4、Klf4和Sox2的3種cDNAs
6以這種順序與編碼2A肽作為間插序列的序列連接，並且插入pCX質粒(pCX-2A-m0KS)內。 此外，將c-Myc的cDNA插入pCX內(pCX-c_Myc)。粗(bald)線顯示在PCR分析中使用的擴 增區，其用於檢測基因組中的質粒整合(圖6)。
圖3顯示使用質粒用於iPS細胞誘導的時間表。實線剪標指示各自質粒的轉染時 間點。
圖4顯示確立的非病毒介導的iPS細胞的形態學。上圖顯示相差圖像，並且下圖 顯示GFP陽性集落(刻度條=200 u m)。
圖5顯示用於ES細胞標記的基因表達的PCR分析結果，其使用從ES細胞、使用逆 轉錄病毒誘導的iPS細胞(克隆20D-17 :Nature，448，第313-317頁，2007)、使用質粒誘導 的iPS細胞(克隆440A-3、4、7、8、10和11 ；克隆432A-1)、和MEF細胞中分離的總RNAs獲得。
圖6顯示通過PCR檢測質粒整合。從C57BL/6小鼠、使用逆轉錄病毒誘導的iPS細 胞(克隆20D-17)、用質粒誘導的iPS細胞(克隆432A-1 ；克隆440A-1至11)和MEF細胞 中提取基因組DNAs，並且通過PCR使用圖2、13和14中顯示的引物進行分析。在關於0_1、 K和M的PCR中，得自內源基因的條帶由輪廓線(outlined)箭頭指示，且得自整合質粒的條 帶由實心箭頭指示。對於Fbxl5報導分子，下部條帶指示野生型等位基因，並且上部條帶指 示敲入等位基因。
圖7顯示畸胎瘤形成結果。將無質粒整合的iPS細胞(克隆440A-3、_4和_8)皮 下移植給裸鼠。4周後，切除腫瘤並且用蘇木精和伊紅染色。自上顯示的是分別關於腸樣上 皮組織、表皮組織、橫紋肌和神經組織的結果(刻度條=50 y m)。
圖8顯示得自無整合的iPS細胞(克隆440A-3和-8)的嵌合小鼠。
圖9顯示通過PCR檢測質粒整合。從ICR小鼠、iPS細胞(克隆432A-1)、和得自 使用質粒誘導的iPS細胞(克隆432A-1 ；克隆440A-3，8)的嵌合小鼠中提取基因組DNAs， 並且通過PCR擴增圖2中顯示的0-1、K和M區。得自內源基因的條帶由輪廓線箭頭指示， 且得自整合質粒的條帶由實心箭頭指示。Nanog報導分子和Fbxl5報導分子的存在也通過 PCR進行檢測。
圖10顯示在DNA印跡分析中使用的探針和限制性內切核酸酶識別位點的位置。E 指示EcoRI，並且B指示BamHI。
圖11顯示DNA印跡分析結果。從RF8ES細胞和iPS細胞(克隆440A_3、4、7、8、10 和11 ；克隆432A-1)中提取基因組DNAs (6 u g),並且用BamHI和EcoRI切割。pCX-2A_m0KS 和pCX-c-Myc質粒(各20pg)的混合物充當對照。輪廓線箭頭指示得自內源基因的條帶， 並且實心箭頭指示得自染色體3上的0ct3/4假基因(估計大小2049bp)的條帶。箭標指 示得自轉基因的條帶。儘管在克隆432A-1中觀察到的許多條帶的特性不明，但這可能暗示 多重轉基因的整合。GFP探針用於檢測Nanog報導等位基因。
圖12顯示SSLP分析結果。對來自C57BL/6小鼠、RF8ES細胞、無整合的iPS細胞 (克隆440A-3至11)和MEF細胞的基因組DNAs (各50ng)，執行SSLP分析。這些iPS細胞 得自5個MEF細胞克隆(克隆1、2、3、5和6)的混合物。
圖13和14顯示在實施例1至3中用於PCR的引物。
圖15顯示根據本發明方法使用質粒用於由0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc, Lin28、
7Nanog和SV40Large T抗原轉染人牙髓幹細胞的時間過程規程，和16個獨立的iPS細胞集落。
圖16和17顯示在轉染後第31天時(圖16)和在第二代傳代培養物中(圖17) 由胎兒HDF確立的iPS細胞(5個克隆203A-1至203A-5，其中挑選203A-4作為陰性對照) 的照片。
圖18顯示5個iPS細胞克隆(203A-1至203A-5)的基因組PCR分析結果。
圖19和20顯示在轉染後第35天時(圖19)和在第二代傳代培養物中(圖20) 由人牙髓幹細胞確立的iPS細胞(5個克隆217A-1至-4和-6)的照片。
圖21顯示5個iPS細胞克隆(217A-1至_4和-6)的基因組PCR分析結果。
圖22和23顯示在第一次電穿孔後第35天時(圖22)由年輕女性HDF確立的iPS 細胞(2個克隆279A-1和-2)和在傳代培養後的克隆279A-2(圖23 ；右圖是在左圖中的加 框區域的特寫圖片)的照片。
圖24顯示iPS細胞克隆279A-2的基因組PCR分析結果，從而證實轉基因的整合。
圖25顯示在選擇(集落在轉染後第25天時選擇)後的iPS細胞(8個克隆497A_1 至A-8)的照片。上圖顯示相差圖像，並且下圖顯示GFP陽性集落。
圖26顯示5個iPS細胞克隆(497A-1至A_5)的基因組PCR分析結果。在497A-2 和497A-5中，無外源基因整合到基因組內。
具體實施方式
本發明的方法預期產生誘導的多潛能幹細胞，包括將至少一種非病毒表達載體引 入體細胞內的步驟，所述非病毒表達載體整合了編碼重編程序因子的至少一種基因。非病 毒表達載體優選是在染色體外自主可複製的表達載體，更優選質粒表達載體。
作為用於鑑定核重編程序因子的方法的例子，可以利用W02005/80598中描述的 核重編程序因子篩選法。其中的全部公開內容引入本文作為參考。通過參考上述出版物， 本領域技術人員能夠篩選核重編程序因子，並且利用它們用於本發明的方法。還可能使用 由上述篩選法修飾或改變的方法鑑定核重編程序因子。
編碼重編程序因子的基因組合的一些例子公開於W02007/69666中。其中的全部 公開內容引入本文作為參考。適當時通過參考上述出版物，本領域技術人員能夠選擇適合 於在本發明的方法中使用的基因。編碼重編程序因子的基因組合的其他例子在Science， 318，第1917-1920頁，2007、W02008/118820等中給出。因此，本領域技術人員能夠理解編 碼核重編程序因子的基因組合的多樣性；通過利用W0 2005/80598中描述的核重編程序因 子篩選法，除W02007/69666和Science，2007 (同上)中描述的組合外的合適基因組合可以 在本發明的方法中使用。
編碼重編程序因子的優選基因包括選自下述的一種或多種基因、優選2種基因的 組合、更優選3種基因的組合、並且特別優選4種基因的組合0ct家族基因、Klf家族基因、 Sox家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因和Nanog基因。
Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因和Myc家族基因的例子在 W02007/69666中給出。同樣，對於Lin家族基因，本領域技術人員同樣能夠提取家族基因。 例如作為Lin家族基因的例子，可以包括Lin28和Lin28B。[0053]更優選的組合包括但不限於，
(a)由Oct家族基因和Sox家族基因組成的2種基因的組合；
(b)由Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因組成的3種基因的組合；
(c)由Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因和Myc家族基因組成的4種基 因的組合；
(d)由Oct家族基因、Sox家族基因、Lin家族基因和Nanog基因組成的4種基因 的組合；
(e)由Oct家族基因、Sox家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因和 Nanog基因組成的6種基因的組合；
等等。
所有這些基因在哺乳動物包括人中共同存在。得自任選選擇的哺乳動物(例如， 人、小鼠、大鼠、牛、羊、馬、猴)的基因可以在本發明中使用。除野生型基因外，也可以使用 這樣的突變基因，其翻譯產物具有置換、插入和/或缺失的幾個(例如，1-10個、更優選1-6 個、更優選1-4個、更優選1-3個、特別優選1或2個)胺基酸，且具有與野生型基因產物的 那種相似的功能。例如，作為c-Myc基因，可以使用野生型，編碼穩定型突變體(T58A)的基 因等。這同樣適用於其他基因產物。
除上述基因外，可以進一步組合編碼誘導細胞無限增殖化的因子的基因。如 W02007/69666中公開的，例如，適當時，可以單獨或組合使用TERT基因和選自下述基因的 一種或多種基因SV40Large T 抗原、HPV16E6、HPV16E7 和 Bmil。
優選組合的例子包括
(f)由Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因和TERT基因組 成的5種基因的組合；
(g)由Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因和SV40Large T 抗原基因組成的5種基因的組合；
(h)由Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、TERT基因和 SV40Large T抗原基因組成的6種基因的組合；和
(i)由Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因、 Nanog基因和TERT基因或SV40 Large T抗原基因組成的7種基因的組合。
需要時，Klf家族基因可以從上述組合中排除。
此外，除上述基因外，可以組合選自Fbxl5、ERas、ECAT15-2、Tell和聯蛋白 的一種或多種基因，和/或也可以組合選自ECAT1、Esgl、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Soxl5、 ECAT15-1、Fthll7、Sall4、Rexl、UTF1、Stella、Stat3 和 Grb2 的一種或多種基因。這些組 合在W02007/69666中具體描述。
如果一種或多種這些基因已在待重編程序的體細胞中表達，那麼一種或多種基因 可以從待引入的基因中排除。當使用待整合到染色體內的載體將一種或多種這些基因引入 待重編程序的體細胞內時，剩餘的一種或多種基因可以根據本發明的方法使用非病毒表達 載體引入。可替代地，當這些基因的一種或多種基因產物藉助於融合蛋白或核顯微注射引 入核內時，剩餘的一種或多種基因可以根據本發明的方法使用非病毒表達載體引入。
特別優選的基因組合是，[0071]

組合；
(1)由0ct3/4和Sox2組成的2種基因的組合；
(2)由0ct3/4、Klf4和Sox2組成的3種基因的組合； 、Klf4、Sox2和c-Myc組成的4種基因的組合； 、Sox2、Lin28和Nanog組成的4種基因的組合； 、Sox2、c-Myc、TERT和SV40 Large T抗原組成的5種基因的組合；
'4、Klf4、Sox2、c-Myc、TERT 和 SV40 Large T 抗原組成的 6 種基因的
(3)由0ct3
(4)由0ct3
(5)由0ct3
(6)由0ct3
、Klf4、c-Myc、Sox2、Lin28和Nanog組成的6種基因的組合； 、Klf4、c-Myc、Sox2、Lin28、Nanog和TERT或SV40 Large T 抗原組
(7)由0ct3/
(8)由0ct3/4 成的7種基因的組合，
等等。
除上述基因外，可以進一步組合編碼誘導細胞無限增殖化的因子的基因。如 W02007/69666中公開的，例如，適當時，可以單獨或組合使用選自TERT基因和下述基因的 一種或多種基因HPV16E6、HPV16E7 和 Bmil。
當重編程序使用內源表達Sox2和c-Myc神經幹細胞等作為體細胞來源執行時，還 可以提及由0ct3/4和Klf4組成的2種基因的組合、或由0ct3/4和c-Myc組成的2種基因的 組合(參見 2008 年 6 月 29 日在線公開的 Nature，第 1-5 頁(doi 10. 1038/nature07061))。
在上文組合(3)、(5)、(6)和(7)中，可以使用L-Myc代替c-Myc0
應當指出基因組合併不限於其。此外，本發明的範圍包括其中使用非病毒表達載 體將選自上述基因的一種或多種基因引入體細胞內，並且通過另一種方式將剩餘基因或基 因產物引入體細胞內的方法。例如，還可能使用非病毒表達載體將選自上述基因的一種或 多種基因引入體細胞內，並且使用病毒載體例如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載 體、腺伴隨病毒載體、仙臺病毒載體，將剩餘基因引入體細胞內。
當使用非病毒表達載體將編碼重編程序因子的2種或更多種基因引入體細胞內 時，待引入的2種或更多種基因中的一些可以在與其他基因的那種不同的時間引入體細胞 內，或待引入的所有種類的基因可以同時引入體細胞內；然而，優選待引入的所有基因同時 引入體細胞內。當2種或更多種不同非病毒表達載體用於引入2種或更多種基因時，所有 種類的非病毒表達載體可以同時引入體細胞內；這代表本發明的優選實施方案。
在本發明的方法中，作為編碼重編程序因子的基因，例如，可以使用由Oct家族基 因、K1 f家族基因、Sox家族基因和Myc家族基因組成的4種基因的組合。還可以使用由Oct 家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因組成的3種基因的組合，或選自上述3種基因的2 種基因的組合。
在本發明的方法中，優選上述4種、3種或2種基因同時引入體細胞內。為了引入 上述4種、3種或2種基因，可以使用整合了所有這些基因的一種非病毒表達載體。可替代 地，適當時，可以組合使用幾種非病毒表達載體，以便涵蓋這些基因的所有組合。當使用幾 種非病毒表達載體時，優選的是優選使用2種或3種、更優選2種非病毒表達載體。優選這 些非病毒表達載體同時引入體細胞內。
如果引入的基因數目超過4種，那麼適當時，可以組合幾種非病毒表達載體，以便 涵蓋這些基因的所有組合。當使用幾種非病毒表達載體時，優選的是優選使用2種至5種、更優選2種至4種、更優選3種或4種非病毒表達載體。這些非病毒表達載體優選同時引 入體細胞內。
優選方法的例子是其中具有Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因的一種 非病毒表達載體，以及具有Myc家族基因的一種非病毒表達載體同時或在不同時間引入體 細胞內的方法；在這種方法中，優選2種非病毒表達載體同時引入體細胞內。在另一個優選 實施方案中，還可能使用其中具有Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因和Myc家族基 因的一種非病毒表達載體引入體細胞內的方法。
在本發明的優選實施方案中，可以使用由0ct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc組成的4 種基因的組合，或選自這4種基因的3種或2種的任選選擇組合，優選3種或2種基因的組 合，其中所述組合不包含c-Myc。這個優選實施方案在下文中具體描述，本發明的範圍決不 限於其。
(al)其中將具有0ct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc的一種非病毒表達載體、更優選質 粒載體引入體細胞內的方法。
(bl)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4、SoX2和c-Myc的 2種基因，且所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4、Sox2和 c-Myc的剩餘2種基因。優選地，第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體可以同時 引入體細胞內。
(cl)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4、SoX2和c-Myc的 3種基因，且所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4、Sox2和 c-Myc的剩餘1種基因。優選地，第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體可以同時 引入體細胞內。
(dl)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4和Sox2的2種基 因，且所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4和Sox2的剩餘 1種基因和c-Myc。優選地，第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體可以同時引入 體細胞內。
(el)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有0ct3/4、Klf4和Sox2，且所述第二種 非病毒表達載體更優選質粒載體，具有c-Myc。優選地，第一種非病毒表達載體和第二種非 病毒表達載體可以同時引入體細胞內。
(fl)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4和Sox2的以這個 順序以從5'到3'末端方向的2種基因，且所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體， 具有c-Myc以及第一種非病毒表達載體中未包含的0ct3/4、Klf4和Sox2中的任何一種基 因。更具體而言，可以使用具有以這個順序以從5'到3'末端方向的(i)0ct3/4和Klf4、 (ii)Klf4和Sox2、或(iii)0ct3/4和Sox2的第一種非病毒表達載體，優選質粒載體；第一 種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體可以同時引入體細胞內。[0096](gl)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有以這個順序以從5'到3'末端方向 的0ct3/4、Klf4和Sox2，且所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有c-Myc。優選 地，第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體可以同時引入體細胞內。
當體細胞得自小鼠時，可以優選使用(fl)或(gl)的方法。
在上文(bl)至(f2)中，對於第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體中 的任何一種，可以使用病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨 病毒載體、仙臺病毒載體等)代替非病毒表達載體。
在本發明的另一個優選實施方案中，在上文(al)至(f2)中，可以使用L-Myc代替 c-Myco
在另外一個優選實施方案中，可以使用由0ct3/4、Klf4和Sox2組成的3種基因的 組合。這個優選實施方案在下文中具體描述，本發明的範圍決不限於其。
(a2)其中將具有0ct3/4、Klf4和Sox2的一種非病毒表達載體，更優選質粒載體 引入體細胞內的方法。
(b2)其中將一種非病毒表達載體更優選質粒載體引入體細胞內的方法，所述非 病毒表達載體更優選質粒載體具有以這個順序以從5'到3'末端方向的0ct3/4、Klf4和 Sox20
(c2)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4和Sox2的2種基 因，且所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4和Sox2的剩餘 1種基因。優選地，第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體可以同時引入體細胞 內。
(d2)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4和Sox2的以這個 順序以從5'到3'末端方向的2種基因，且所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體， 具有第一種非病毒表達載體中未包含的0ct3/4、Klf4和Sox2中的任何一種基因。更具體 而言，可以使用具有以這個順序以從5'到3'末端方向的(i)0ct3/4和Klf4、(ii)Klf4和 Sox2、或(iii)0ct3/4和Sox2的第一種非病毒表達載體，優選質粒載體，並且第一種非病毒 表達載體和第二種非病毒表達載體可以同時引入體細胞內。
當體細胞得自小鼠時，可以優選使用(b2)或(d2)的方法。
在上文(c2)或(d2)中，對於第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體中 的任何一種，還可以使用病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺伴 隨病毒載體、仙臺病毒載體等)代替非病毒載體。
在本發明的另外一個優選實施方案中，可以使用選自0ct3/4、Klf4和Sox2的2種 基因的組合。這個優選實施方案在下文中具體描述，本發明的範圍決不限於其。
(a3)其中將具有選自0ct3/4、Klf4和Sox2的2種基因的一種非病毒表達載體， 更優選質粒載體引入體細胞內的方法。
(b3)其中將一種非病毒表達載體更優選質粒載體引入體細胞內的方法，所述非病 毒表達載體更優選質粒載體具有以這個順序以從5'到3'末端方向的(i)0ct3/4和Klf4、
12(ii)Klf4 和 Sox2、或(iii)0ct3/4 和 Sox2。
(c3)其中將第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體引入體細胞內的方 法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4和Sox2的1種基 因，且所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有第一種非病毒表達載體中未包含 的0ct3/4、Klf4和Sox2中的任何一種基因。優選地，第一種非病毒表達載體和第二種非病 毒表達載體可以同時引入體細胞內。
當體細胞得自小鼠時，可以優選使用(b3)的方法。
在上文(c3)中，對於第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達載體中的任何 一種，可以使用病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載 體、仙臺病毒載體等)代替非病毒載體。
在本發明的另外一個優選實施方案中，可以使用選自0Ct3/4、Klf4、SOX2、C-MyC、 Lin28和Nanog的6種基因的組合。這個優選實施方案在下文中具體描述，本發明的範圍決 不限於其。
(a4)其中將第一種非病毒表達載體、第二種非病毒表達載體和第三種非病毒表達 載體引入體細胞內的方法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、 Klf4和Sox2的2種基因，所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、 Klf4和Sox2中的剩餘1種基因，且所述第三種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有 C-MyC、Lin28和Nanog基因。優選地，第一種、第二種和第三種非病毒表達載體可以同時引 入體細胞內。
(b4)其中將第一種非病毒表達載體、第二種非病毒表達載體和第三種非病毒表達 載體引入體細胞內的方法，所述第一種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有以這個順序 以從 5'到 3'末端方向的(i)0ct3/4 和 Klf4、(ii)Klf4 和 Sox2、(iii)0ct3/4 和 Sox2 或 (iv) Sox2和Klf4，所述第二種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有選自0ct3/4、Klf4和 Sox2中的剩餘1種基因，且所述第三種非病毒表達載體更優選質粒載體，具有C-MyC、Lin28 和Nanog基因。
當編碼誘導細胞無限增殖化的因子的基因，例如TERT、SV40 largeT抗原、 HPV16E6、HPV16E7或Bmil，與上文提及的2、3、4或6種基因進一步組合時，它可以優選整合 入另一種非病毒表達載體內。
在上文背景中，當將多種基因(例如，Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基 因)整合入一種非病毒表達載體中時，這些基因可以優選與使得能夠進行多順反子表達的 間插序列一起插入非病毒表達載體內。通過使用使得能夠進行多順反子表達的間插序列， 可能更有效表達在一種非病毒表達載體中整合的多種基因。使得能夠進行多順反子表達 的有用序列包括例如，口蹄疫病毒的2A序列(SEQ ID NO :61，有時稱為FMDV 2A自加工序 列)(PLoS ONE 3,e2532,2008 ；Stem Cells 25，1707，2007)、IRES 序列等，優選 2A 序列。更 具體而言，當構建這樣的非病毒表達載體時，所述非病毒表達載體具有以這個順序以從5' 到 3'末端方向的(i)0ct3/4、Klf4 和 Sox2、(ii)0ct3/4 和 Klf4、(iii)Klf4 和 Sox2、(iv) 0ct3/4 和 Sox2、(v) Sox2 和 Klf4 或(vi) c_Myc、Lin28 和 Nanog，優選將 2k 序列插入這些基 因之間。因此，本發明還提供了 2A序列用於製備用於iPS細胞誘導的非病毒表達載體的用 途，所述非病毒表達載體具有2種或更多種重編程序因子。[0118]將非病毒表達載體引入體細胞內的操作的重複次數並無具體限制，只要可以完成 本發明使體細胞重編程序以產生誘導的多潛能幹細胞的作用，轉染可以執行一次或更多任 選選擇次數(例如，1次至10次、1次至5次等)。當將2種或更多種非病毒表達載體引入 體細胞內時，優選這些所有種類的非病毒表達載體同時引入體細胞內；然而，即使在這種情 況下，轉染也可以執行一次或更多任選選擇次數(例如，1次至10次、1次至5次等)，優選 地轉染可以重複執行2次或更多次(例如，3次或4次)。
當轉染重複2次或更多次時，時間間隔由下述例示但不限於下述12小時至1周、 優選12小時至4天，例如1天至3天。
如本文所使用的，術語「誘導的多潛能幹細胞(iPS細胞)」指具有與ES細胞的那 種相似的性質的細胞，更具體而言包括由具有多潛能性和增殖(自我更新)能力的體細胞 重編程序的未分化細胞。然而，應當指出，這個術語不得在各種意義上解釋為限制性的，並 且必須以最廣泛的含義解釋。在W02005/80598(在這個出版物中，使用術語ES樣細胞)中 描述了藉助於假定核重編程序因子製備誘導的多潛能幹細胞的方法，並且還特別描述了分 離誘導的多潛能幹細胞的方法。W02007/69666公開了重編程序因子的具體例子和使用其使 體細胞重編程序的方法。因此，希望在實現本發明中，本領域技術人員參考這些出版物。
除編碼重編程序因子的基因外，轉錄所需的調節序列(例如，啟動子、增強子和/ 或終止子等)優選與非病毒表達載體中的基因可操作地連接。
作為啟動子，可以使用在體細胞中顯示轉錄活性的DNA序列，並且適當時可以根 據動物物種和體細胞種類選擇啟動子。可以在哺乳動物細胞中表達的有用啟動子的例子包 括巨細胞病毒(人CMV)的IE (立即早期)基因啟動子、SV40起始啟動子、逆轉錄病毒啟動 子、金屬硫蛋白啟動子、熱激啟動子、SRa啟動子等。人CMV的IE基因增強子可以與啟動 子一起使用。有用的啟動子是CAG啟動子(包含巨細胞病毒增強子、雞肌動蛋白啟動 子和0-珠蛋白基因多腺苷酸化信號位點)。
非病毒表達載體可以整合允許表達載體在哺乳動物體細胞中自主複製的DNA序 列。DNA序列的例子是SV40複製起點。
非病毒表達載體優選是在染色體外自主可複製的表達載體，並且非病毒表達載體 優選是不整合到染色體中的那種。更優選的例子包括質粒載體。質粒載體的例子包括但 不限於，大腸桿菌(Escherichia coli)衍生的質粒(ColE系列質粒例如pBR322、pUC18、 pUC19、pUC118、pUC119 和 pBluescript 等)、放線菌屬(Actinomyces)衍生的質粒(pIJ486 等)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)衍生的質粒(例如，pUBllO、pSH19及其他)、酵 母衍生的質粒(YEpl3、YEp 24、Ycp50等)等，以及人工質粒載體等。
容易獲得的非病毒表達載體的例子包括但不限於PCMV6-XL3 (OriGene Technologies Inc. )、EGFP-C1 (Clontech)、pGBT-9 (Clontech)、pcDNAI (FUNAKOSHI)、 pcDM8 (FUNAKOSHI)、pAGE 107 (Cytotechnology, 3, 133，1990)、pCDM8 (Nature, 329, 840, 1987) 、pcDNAI/AmP(Invitrogen)、pREP4(Invitrogen)、pAGE103(J. Blochem. ，101，1307, 1987)、pAGE210 等。
需要時，非病毒表達載體可以可以整合選擇標記。選擇標記的例子包括 在宿主細胞中缺陷的基因，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因或粟酒裂殖糖酵母 (Schizosaccaromyces pombe)TPI基因，以及關於對藥物例如氨苄青黴素、卡那黴素、四環
14素、氯黴素、新黴素或潮黴素的抗性的基因。
雖然引入體細胞內的非病毒表達載體例如質粒載體一般不整合到細胞的基因組 內，但在關於iPS細胞誘導的選擇壓力下，由於重編程序因子的穩定表達的必要性，可能觀 察到非病毒表達載體增加的整合效率。因此，當目的iPS細胞預期用於再生醫學等時，非病 毒表達載體可以優選包含使得能夠切除轉基因的序列，例如loxP序列(Chang等人，在2009 年 2 月 12 日在線公開的 STEM CELLS (doi 10. 1002/stem. 39))、piggyback 轉座子(Kaji 等 人，在 2009 年 3 月 1 日提前在線公開的 Nature (doi 10. 1038/nature07864) ；Wolt jen 等 人，在2009年3月1日提前在線公開的Nature (doi 10. 1038/nature07863))和在啟動子 區中的四環素應答元件(Tet-0nR & Tet-0ff R Gene Expression Systems，Clontech)。
使在本發明中使用的編碼重編程序因子的基因、啟動子、增強子和/或終止子等 以合適順序連接，以構建能夠在體細胞中表達重編程序因子的非病毒表達載體的方法，對 於本領域技術人員是顯而易見的。
當使用編碼重編程序因子的2種或更多種基因時，基因可以整合入一種非病毒表 達載體中。可替代地，可以使用整合了不同基因的2種或更多種非病毒表達載體。在後面 一種情況下，適當時，可以組合整合了 2種或更多種基因的一種非病毒表達載體和整合了 與其不同的一種或多種基因的非病毒表達載體。
本領域技術人員可獲得的將表達載體引入動物細胞內的任何方法都可以用於將 非病毒表達載體引入體細胞內。有用方法的例子包括轉染試劑例如FuGENE 6轉染試劑 (Roche)的使用、microporator的使用、電穿孔法、磷酸鈣法、脂轉染法、DEAE-葡聚糖介導 的轉染法、轉染法、顯微注射法、陽離子脂質介導的轉染法等。核轉染(nucleofection)也 可以用於引入基因。這些方法可以組合使用。
在將非病毒表達載體弓丨入體細胞內中，表達載體可以弓I入在飼養細胞上培養的體 細胞內，並且可以僅引入體細胞內。為了增加表達載體引入效率，後面一種方法有時是合適 的。使用的飼養細胞可以是用於培養胚胎幹細胞的那些；例如，可以使用用化學試劑例如絲 裂黴素C處理或暴露於輻射等的來自14至15天小鼠胚胎的原代培養成纖維細胞、ST0(成 纖維細胞衍生的細胞系)等。
通過在合適條件下培養整合了非病毒表達載體的體細胞，可能允許核重編程序 自主進展，並且由體細胞產生誘導的多潛能幹細胞。培養整合了非病毒表達載體的體細 胞以獲得誘導的多潛能幹細胞的步驟可以以與使用逆轉錄病毒的常規方法相同的方式進 行；例如，這可以如出版物例如Cell，126，第1-14頁，2006 ；Cell，131，第1_12頁，2007 ；和 Science, 318，第1917-1920頁，2007中所述來達到。在產生人誘導的多潛能幹細胞中，有時 希望在表達載體引入後的細胞培養密度設定為比關於普通動物細胞培養的那種更低的水 平。例如，優選以10，000至100，000細胞、優選約50，000細胞/細胞培養皿的細胞密度繼 續培養。任何培養基都可以用於培養，適當時由本領域技術人員選擇；例如，在產生人誘導 的多潛能幹細胞中，有時優選使用適合於人ES細胞培養的培養基。關於培養基和培養條件 的選擇，上述出版物充當參考。
所得到的誘導的多潛能幹細胞可以使用未分化細胞特有的各種標記進行鑑定；用 於這種鑑定的方法也在上述出版物中具體且詳細地描述。允許維持ES細胞的未分化狀態 和多潛能性的各種培養基或不允許維持這些性質的培養基是本領域已知的；通過組合使用合適的培養基，可以有效分離誘導的多潛能幹細胞。通過利用用於ES細胞的共同鑑定方 法，分離的誘導的多潛能幹細胞的分化潛力和增殖潛力對於本領域技術人員可容易證實。 當所得到的誘導的多潛能幹細胞在合適條件下增殖時，獲得誘導的多潛能幹細胞集落；可 能基於集落形狀鑑定誘導的多潛能幹細胞的存在。例如，已知小鼠誘導的多潛能幹細胞形 成隆起集落，而人誘導的多潛能幹細胞形成扁平集落，並且這些集落的形狀分別與小鼠ES 細胞和人ES細胞集落的那些極其類似；因此，本領域技術人員可能基於集落形狀鑑定所得 到的誘導的多潛能幹細胞。當使用體細胞進行重編程序時，所述體細胞具有在ES細胞中特 異性表達的基因啟動子下遊整合標記基因例如GFP的基因，如果細胞變得對於標記(GFP) 陽性，則可能鑑定誘導的多潛能幹細胞。
待通過本發明的方法重編程序的「體細胞」指任何細胞，除全能和多潛能細胞例如 早期胚胎和ES細胞外，並且它的選擇並無限制。例如，還可以使用處於胎兒期中的體細胞、 新生兒體細胞和成熟體細胞。優選地，使用得自哺乳動物包括人的體細胞；更優選使用人或 小鼠衍生的體細胞。具體地，可以提及⑴組織幹細胞(體幹細胞(somatic stem cells)) 例如神經幹細胞、造血幹細胞、間充質幹細胞和牙髓幹細胞，(2)組織祖細胞，或(3)分化的 細胞例如淋巴細胞、上皮細胞、肌細胞、成纖維細胞(真皮細胞等)、毛細胞、肝細胞和胃粘 膜細胞。當誘導的多潛能幹細胞用於治療疾病時，希望使用從待治療的患者或共享與患者 的那種相同類型HLA的另一個人分離的體細胞；例如，可以使用牽涉於疾病的體細胞和牽 涉於疾病治療的體細胞。
在本發明中，為了增加誘導的多潛能幹細胞確立的效率，除引入本發明的非病毒 表達載體外，還可以引入或添加各種確立效率改進劑。iPS細胞確立效率改進劑的例子包括 但不限於，組蛋白脫乙醯酶(HDAC)抑制劑[例如，丙戊酸(VPA) (Nat. Biotechnol. ,26(7) 795-797 (2008))，低分子抑制劑例如制滴菌素A、丁酸鈉、MC 1293和M344，基於核酸的表達 抑制劑例如針對 HDAC 的 siRNA 和 shRNA(例如，HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore)、 針對HDAC1的HuSH 29聚體shRNA構建體(OriGene)等)，等]，G9a組蛋白甲基轉移酶 抑制劑[例如，低分子抑制劑例如BIX-01294(Cell Stem Cell，2 :525_528 (2008))，基於 核酸的表達抑制劑例如針對G9a的siRNA和shRNA (例如，G9a siRNA (人)(Santa Cruz Biotechnology)等)，等]，L_ 通道鈣激動劑(例如，Bayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574(2008))，UTFl(Cell Stem Cell，3，475-479 (2008))，Wnt 信號傳導(例如，可溶性 Wnt3a) (Cell StemCell，3，132-135 (2008))，2i/LIF(2i 是促分裂原活化蛋白激酶信號傳導 和糖原合酶激酶-3的抑制劑；PloS Biology，6 (10) ,2237-2247 (2008))，p53抑制劑(例如， 針對 p53 的 siRNA 和 shRNA (Cell StemCel 1, 3,475-479 (2008))等。基於核酸的表達抑制 劑可以為具有編碼siRNA或shRNA的DNA的表達載體形式。在這種情況下，編碼siRNA或 shRNA的DNA可以連同重編程序因子一起插入本發明的非病毒表達載體內。
對通過本發明的方法產生的誘導的多潛能幹細胞不實施關於其用途的限制，並且 其可以用於使用ES細胞的所有類型的研究和調查，以及用於使用ES細胞的疾病治療，以代 替ES細胞。例如，通過用視黃酸、生長因子例如EGF或糖皮質激素等處理經由本發明的方 法由從患者收集的體細胞獲得的誘導的多潛能幹細胞，可以誘導所需分化細胞(例如，神 經細胞、心肌細胞、血細胞等)以形成合適組織。通過將因此獲得的分化細胞或組織送回患 者，可以完成通過自體細胞移植的幹細胞療法。應當指出本發明的誘導的多潛能幹細胞的用途並不限於上述具體實施方案。
本發明還提供了用於在產生誘導的多潛能幹細胞的上述方法中使用的非病毒表 達載體，即整合了編碼重編程序因子的至少一種基因的非病毒表達載體(優選質粒載體)。 載體的結構如本發明的產生誘導的多潛能幹細胞方法部分中詳細描述的。
例子是整合了 Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因的非病毒表達載體，優 選以這個順序以從5'到3'末端方向整合。更優選的例子是這些基因與使得能夠進行多 順反子表達的間插序列一起整合的非病毒表達載體，特別優選其中0CT3/4、Klf4和Sox 2 與使得能夠進行多順反子表達的間插序列一起，以這個順序以從5'到3'末端方向整合 的非病毒表達載體，所述間插序列優選FMDV 2A自加工序列。
因為引入體細胞內的非病毒表達載體例如質粒載體一般不整合到細胞的基因組 內，所以在優選實施方案中，本發明提供了其中轉基因不整合到基因組內的誘導的多潛能 幹細胞。因為此種iPS細胞減少在由其分化的組織或器官中引起腫瘤發生和/或幹擾(例 如，破壞或激活)內源基因的危險，所以它可以優選用於再生醫學例如細胞移植療法。
然而，在關於iPS細胞誘導的選擇壓力下，由於重編程序因子的穩定表達的必要 性，可以觀察到非病毒表達載體增加的整合效率。因此，在另一個優選實施方案中，本發 明提供了其中轉基因以質粒形式整合到基因組內的誘導的多潛能幹細胞。與通過逆轉錄 病毒感染誘導的iPS細胞相比較，此種iPS細胞可以減少在由其分化的組織或器官中引 起腫瘤發生的危險。此外，需要時，可以使用Cre/loxP系統(Chang等人，2009 (同上)) 或piggyback轉座子載體和piggyback轉座子(Kaji等人，2009 (同上)；Woltjen等人， 2009(同上))或四環素依賴性基因誘導，從基因組中切除轉基因。使用質粒載體或腺病毒 載體，可以將用於切除的Cre重組酶或轉座酶引入iPS細胞內且在iPS細胞中表達。在使 用四環素依賴性基因誘導的情況下，同時表達Tet阻抑蛋白或突變的Tet阻抑蛋白。
實施例
本發明在下文中藉助於下述實施例更詳細地描述，然而，所述實施例不應解釋為 限制本發明的範圍。
實施例1
具有Nanog報導分子的小鼠用作實驗系統(Okita等人Nature，第448卷，第 313-317頁，2007)。通過將EGFP和嘌呤黴素抗性基因整合入購自BACPAC Resources的 BAC (細菌人工染色體)的Nanog基因座內製備這些小鼠。小鼠Nanog基因在多潛能細胞 例如ES細胞和早期胚胎中特異性表達。已顯示對這種報導分子陽性的小鼠iPS細胞具有 幾乎等價於ES細胞的那種的分化潛能。使這些Nanog報導小鼠與Fbx 15報導小鼠交配 (Tokuzawa 等人 Mol Cell Biol，第 23 卷，2699-2708 (2003))，由此產生具有 Nanog 報導分 子和Fbx 15報導分子的突變小鼠。
用於重編程序的質粒這樣進行製備用EcoRI處理pCX-EGFP (由在Osaka University 的 Dr. Masaru Okabe 提供的質粒FEBS Letters, 407, 313-319，1997)，並且插 入其中0ct3/4、Sox2和Klf4(全是小鼠衍生的基因)的編碼區經由口蹄疫病毒的2A序列 以0ct3/4、Klf4和Sox2的順序連接的構建體代替EGFP (pCX-2A_m0KS ；圖2)。同樣，製備具 有在其中插入的c-Myc編碼區的質粒(pCX-c-Myc ；圖2)。
在製備2A序列以及0ct3/4、Klf4和Sox2連接在一起的構建體中，首先，使有義
17和反義寡核苷酸退火且插入用Xbal和PstI消化的pBluescript II KS(-)載體內，所述寡 核苷酸包含口蹄疫病毒的2A序列(SEQ ID NO :61)、上遊限制性內切核酸酶位點(Xbal和 Bglll)、和下遊限制性內切核酸酶位點(BspHI.Mfel和PstI) (pBS_2A)。隨後，通過PCR擴 增編碼0ct3/4或Klf4的小鼠cDNA，用BamHI位點替換翻譯終止密碼子，並且將每種cDNA 克隆到pCR2. 1內。隨後，使用合適的限制性內切核酸酶，使0ct3/4和Klf4的cDNAs與 PBS-2A連接在一起，以產生pBS-0ct3/4-2A和pBS_Klf4_2A。隨後，使用合適的限制性內切 核酸酶，將Klf4-2A框內插入pBS-0ct3/4-2A，由此產生pBS-0ct3/4-2A-Klf4_2A。隨後，使 用合適的限制性內切核酸酶，使所得到的0ct3/4-2A-Klf4-2A構建體框內與具有翻譯終止 密碼子的Sox2cDNA連接在一起。最後，使所得到的其中2A序列與0ct3/4、Klf4和Sox2連 接在一起的0ct3/4-2A-Klf4-2A-Sox2-ST0P構建體插入pCX-EGFP的EcoRI位點內，從而制 備 pCX-2A-m0KS。
從上述突變小鼠胎兒(受精後13. 5天)中分離成纖維細胞(MEFs)。不表達 Nanog基因，MEFs不表達產生綠色螢光的EGFP。同樣，將MEFs以1. 3xl05細胞/孔播種 至先前用0. 1 %明膠(Sigma)包被的6孔培養板(Falcon)。使用的培養基是DMEM/10 % FCS(補加有10%胎牛血清的DMEM(Nacalai Tesque)，MEFs在37°C、5% C02下進行培養。 第二天，將 4. 5iiL FuGene6 轉染試劑(Roche)加入 lOOyL Opti-MEM IReduced-Serum Medium (Invitrogen)中，並且允許培養基在室溫下靜置5分鐘。其後，加入1. g表達載 體(pCX-2A-m0KS)，並且允許培養基在室溫下靜置15分鐘，這之後將培養基加入MEF培養基 中。第二天，取出培養基，並且如上所述用FuGenee轉染試劑引入1. g另一種表達載體 (pCX-c-Myc)。
第二天，用新鮮供應(DMEM/10%FCS)替換培養基，並且如上所述引入表達載 體(pCX-2A-m0KS)；第二天，用ES細胞培養基(補加有15%胎牛血清、2mM L-穀氨醯胺 (Invitrogen)、100 iiM 非必需胺基酸(Invitrogen) >100 u M 2-巰基乙醇(Invitrogen)、 50U/mL 青黴素(Invitrogen)和 50mg/mL 鏈黴素(Invitrogen)的 DMEM(NacalaiTesque)) 替換培養基，並且如上所述使用FuGenee轉染試劑引入表達載體(pCX-c-Myc)。
第二天，用ES細胞培養基替換培養基。在播種後第9天時，取出MEF培養基， 並且通過添加PBS 2mL洗滌細胞。取出PBS後，加入0.25%胰蛋白酶(Trypsin)/ImM EDTA (Invitrogen)，並且使反應在37°C下執行約5分鐘。細胞增加後，加入ES細胞培養基， 使細胞懸浮，並且將lxl06(Exp432A)或2xl05(Exp432B)細胞播種到先前在其上已播種飼養 細胞的100mm皿上。使用的飼養細胞是已用絲裂黴素C處理以終止其細胞分裂的SNL細胞。
隨後，每2天用新鮮供應更換ES細胞培養基，直至出現可見集落；約第17天開始 建群，並且約第24天觀察到完全建群(圖1)。上文時間表概括於圖1和3中的Exp432中。
獲得的細胞逐漸變得GFP陽性，顯示與小鼠ES細胞的那種不能區分的形態學(圖 4中的432A-1)，對於各種ES細胞標記在與ES細胞相似的水平下測試陽性(圖5中的 iPS-432A-l)，並且產生成年嵌合小鼠。基於小鼠iPS細胞的集落形狀特徵以及GFP陽性結 果和對其他非分化標記陽性的結果，得出結論為，通過將上述表達載體引入MEF細胞內，核 重編程序完全進展以產生iPS細胞，並且iPS細胞增殖且形成可見集落。因此，這些結果顯 示無需使用逆轉錄病毒或慢病毒即可製備iPS細胞。PCR分析檢測出上述表達載體整合到 宿主基因組內(圖6中的iPS-432A-l)。[0152]實施例2
為了避免pCX-2A_m0KS和pCX-c-Myc整合到宿主基因組內，修改轉染規程。
在實驗開始後第1、3、5和7天時，一起轉染pCX-2A_m0KS和pCX-c-Myc (圖3中的 Exp440)。結果，獲得許多GFP陽性集落，並且產生在形態上與ES細胞不能區分的細胞(圖4 中的440A-3)。獲得的細胞在與ES細胞相同的水平表達ES細胞標記(圖5中的iPS_440A)。 為了檢查質粒DNA到基因組內的整合，設計了能夠擴增質粒的每個部分的16組PCR引物 (圖2、13和14)。在通過修改規程獲得的11個GFP陽性克隆的9個中，未觀察到外源DNA 的擴增(圖6)。此外，在DNA印跡分析中，在這些克隆中未檢測到外源基因的整合(圖11)。 儘管未明確排除小質粒片段的可能存在，但上文結果顯示這些iPS細胞的確不具有整合到 宿主基因組內的pCX-2A-m0KS和pCX-c-Myc質粒。
為了排除無整合的iPS細胞得自可能的汙染Nanog-GFP ES細胞的可能性，執行 SSLP分析。在圖3中的Exp440中，使用來自5個胎兒的MEF細胞。在SSLP分析中，這5個 胎兒是可區分的，並且鑑定無整合的iPS細胞的衍生(圖12)。這個分析還顯示無整合的 iPS細胞與得自129S4品系的ES細胞不同(圖12)。
實施例3
為了證實無整合的iPS細胞的多潛能性，將如實施例2中所述獲得的iPS細胞皮 下移植給裸鼠。測試的所有克隆(440A-3、-4、-8和-10)都產生腫瘤，所述腫瘤包括廣泛 多樣的細胞類型，包括得自所有3個胚層的細胞(圖7)。此外，將無整合的iPS細胞注射 到ICR小鼠胚泡內。根據毛色判斷，由注射的所有克隆(440A-3、-4、-6、-8、-9和-10)獲 得成年嵌合體(圖8)。在這些嵌合小鼠中，PCR分析未檢測出任何轉基因的整合(圖9)。 PCR分析檢測出在嵌合體中的Nanog和Fbxl5報導分子(圖9)。與無整合的iPS細胞自雙 重報導小鼠出現，以及本發明人的實驗室未保存雙重報導ES細胞的事實組合，這些結果顯 示嵌合體得自無整合的iPS細胞，而不是汙染ES細胞。因此，這些結果證實無整合的iPS 細胞具有多潛能性。
獲得的71隻嵌合小鼠及其後代的長期檢查顯示，在得自通過使用逆轉錄病毒引 入4種基因(0ct3/4、Klf4、Sox2, c-Myc)製備的iPS細胞的嵌合小鼠及其後代中，與正常 小鼠比較，死亡率較早開始增加，而得自無4種基因整合的iPS細胞的嵌合小鼠及其後代顯 示類似於正常小鼠的那種的存活曲線。
當獲得的嵌合小鼠和野生小鼠交配時，獲得F1小鼠；因此，證實無整合的iPS細胞 對種系產生影響(種系傳遞)。
實施例4
人牙髓幹細胞(克隆名稱；DP31，PCT/JP2008/068320、J.Dent. Res.，87(7) 676-681(2008))用作實驗系統。使用如Cell，131，861-872 (2007)中所述的慢病毒，允許 DP31表達小鼠親嗜性病毒受體Slc7al基因。這些細胞使用MSCGM bullet試劑盒(Lonza) 進行培養。
以與實施例1相同的方式，由pCX-EGFP(由在Osaka University的Dr. Masaru Okabe提供，FEBS Letters，407，313-319，1997)製備用於重編程序的質粒。具體地，用 EcoRI處理pCX-EGFP，並且插入其中S0X2和KLF4的編碼區經由口蹄疫病毒的2A序列 連接的構建體代替EGFP，由此製備質粒pCX-hSK。同樣，製備具有在其中c-Myc、Lin28和Nanog經由2A序列連接的質粒(pCX_hMLN)、具有在其中插入0CT3/4編碼區的質粒 (pCX-h0CT3/4)、和具有在其中插入SV40LargeT抗原的質粒(pCX_SV40LT)。
用PBS洗滌在100mm皿中培養的DP31，加入0. 25 %胰蛋白酶/ImM EDTA(Invitrogen)，並且使反應在37°C下執行約5分鐘。細胞增加後，加入MSCGM，使細胞 懸浮，並且將6xl05細胞回收在15mL管中。使細胞在800rpm下離心5分鐘；取出上清液後， 並且使用 HumanDermal Fibroblast Nucleofector Kit (Amaxa)弓|入表達質粒。使用的質 粒量對於 pCX-h0CT3/4 是 0. 5 ii g，對於 pCX-hSK 是 1. 0 y g，對於 pCX-hMLN 是 1. 5 y g，並且 對於PCX-SV40LT是0. 5iig。處理後，將細胞播種至6孔板。用MSCGM培養10天後，細胞 再次用PBS洗滌，加入0. 25%胰蛋白酶/ImM EDTA (Invitrogen)，並且使反應在37°C下執 行約5分鐘。細胞增加後，加入MSCGM，使細胞懸浮，並且將lxlO6細胞播種在先前在其上已 播種飼養細胞的100mm皿上。使用的飼養細胞是已用絲裂黴素C處理以終止其細胞分裂的 SNL細胞。其後，直至開始觀察到集落，每2天用新鮮供應替換培養基。通過使分別補加有 MSCGM和bFGF(4ng/mL)的等體積靈長類動物ES細胞培養基(R印roCELL)混合來製備使用 的培養基。約第19天開始建群，從而證實人iPS細胞的確立(圖15)。
接下來，用與上文所述相同的7種基因轉染胎兒人HDF(CellappliCati0nS，INC)。 轉染後，使用補加有4ng/ml重組人bFGF(WAKO)的靈長類動物ES細胞培養基(IteproCELL) 培養細胞。MST0細胞充當飼養細胞。在轉染後第31天時的細胞照片(5個克隆203A-1至 203A-5，其中挑取203A-4作為陰性對照)顯示於圖16中，並且在第二代傳代培養物中的細 胞照片顯示於圖17中。203A-1至203A-3和203A-5克隆顯示一般的ES細胞樣形態學，從 而證實人iPS細胞的確立。
對這些細胞實施基因組PCR分析，並且檢查轉基因到基因組內的整合。結果顯示 於圖18中。在所有克隆中，檢測出0ct3/4 (pCX-h0CT3/4)和c_Myc (pCX_hMLN)的整合。 在除203A-4外的克隆中檢測出Klf4(pCX-hSK)的整合。在任何一種克隆中都未檢測出 SV40LT(pCX-SV40LT)的整合。
實施例5
以與實施例4中相同的方式，用排除SV40Large T抗原的6種基因(pCX_hSK、 pCX-hMLN、pCX-h0CT3/4)轉染實施例4中使用的牙髓幹細胞DP31。在轉染後第35天時的 細胞照片(5個克隆217A-1至-4和-6)顯示於圖19中。在第二代傳代培養物中的細胞 照片顯示於圖20中。所有克隆都顯示一般的ES細胞樣形態學，從而證實人iPS細胞的確立。
對確立的這些人iPS細胞克隆(217A-1至217A-4、217A-6)實施基因組PCR分析。 結果顯示於圖21中。在所有這些克隆中，證實轉基因的整合。
實施例6
允許得自6歲大的日本女性的HDF細胞系(HDF-120 JCRB)表達Slc7al基因。 用上述6種基因和針對p53的shRNA(shRNA2 :SEQ IDN0 62)(引入的載體:pCX_h0CT3/4、 pCX-hSK、pCX-hMLN-shp53)轉染所得到的細胞(HDF_120_Slc)。
使用Microporator(100u L 尖端，1600V, 10ms, 3 次)，將 pCX-h0CT3/4 (0. 5 u g)、 pCX-hSK(1. 0u g)、禾口 pCX-hMLN-shp53(l. 5u g)的每一個電引入 6. 0xl05HDF-120_Slc 細胞 內。10天後，每種載體再次在相同條件下電引入，並且將細胞播種在MST0上(100mm皿)。這
20些細胞使用DMEM/10% FCS培養直至第10天時，其後使用補加有4ng/ml重組人bFGF (WAK0) 的靈長類動物ES細胞培養基(ReproCELL)。在第一次電穿孔後第35天時的細胞照片顯示 於圖22中。在傳代培養後的細胞照片顯示於圖23中。顯示一般的ES細胞樣形態學，從而 證實人iPS細胞的確立。基因組PCR分析證實轉基因的整合(圖24中的泳道279A-2)。
實施例7
根據實施例2中的規程，將分別整合了 4種基因0ct3/4、Klf4、SoX2和c-Myc的表 達載體(pCX-0ct4、pCX-Sox2、pCX-Klf4, pCX-c-Myc)引入得自 Nanog 報導小鼠(Okita 等 人 Nature，第 448 卷，第 313-317 頁，2007)的 MEF 細胞內。
首先，將Nanog報導MEF細胞播種到明膠包被的6孔板上(1. 3xl05細胞/孔)， 並且在第 1、3、5 和 7 天時，使用 FuGene6 由 pCX_0ct4 (0. 37 ii g)、pCX_Sox2 (0. 36 ii g)、 pCX-Klf4 (0. 39 u g)和 pCX-c-Myc (0. 38 ii g)的每一個轉染。在第 9 天時，將 lxlO6 細胞 (1. 0)或0. 2xl06細胞(0. 2)播種到MST0-PH或明膠(100-mm皿)上，並且在第25天時選 擇集落。選擇後的細胞照片顯示於圖25中。獲得小鼠iPS細胞特有的集落形狀和GFP陽 性結果，從而證實小鼠iPS細胞的確立。對確立的小鼠iPS細胞克隆(497A-1至A-5)實施 基因組PCR分析。結果顯示於圖26中。497A-2和497A-5兩者都顯示是無任何外源基因整 合的iPS細胞。
工業適用性
根據本發明的方法，可能例如由患者的體細胞製備高度安全的誘導的多潛能幹細 胞。通過使誘導的多潛能幹細胞分化獲得的細胞(例如，心肌細胞、胰島素生產細胞、神經 細胞等)可以安全地用於幹細胞移植療法，以用於用於廣泛多樣的疾病，包括心力衰竭、胰 島素依賴性糖尿病、帕金森氏病和脊髓損傷。
雖然本發明已著重於優選實施方案進行了描述，但對於本領域技術人員顯而易見 的是，優選實施方案可以進行修改。本發明預期本發明可以通過除本說明書中詳細描述的 那些外的方法來實現。因此，本發明包含了在附加「權利要求
」的要旨和範圍中包含的所有 修飾。
本文引用的任何出版物包括專利和專利申請中公開的內容在此整體引入作為參 考，其程度與它們已在本文中公開一樣。
本申請基於美國臨時專利申請號61/071，508,61/136, 246,61/136, 615和 61/193，363，所述美國臨時專利申請的內容在此引入作為參考。
權利要求
一種產生誘導的多潛能幹細胞的方法，其包括將至少一種非病毒表達載體引入體細胞內的步驟，所述非病毒表達載體整合了編碼重編程序因子的至少一種基因。
2.權利要求
1的方法，其中所述載體是在染色體外自主可複製的非病毒表達載體。
3.權利要求
1或2的方法，其中所述載體是質粒載體。
4.權利要求
1-3中任一項的方法，其中編碼重編程序因子的所述基因是選自如通過WO 2005/80598中描述的核重編程序因子篩選法確定的測試為陽性的基因的一種或多種。
5.權利要求
1-4中任一項的方法，其中編碼重編程序因子的所述基因是選自Oct家族 基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因和Nanog基因的一種或多 種基因。
6.權利要求
1-5中任一項的方法，其中編碼重編程序因子的所述基因是下述組合之(a)由Oct家族基因和Sox家族基因組成的2種基因的組合；(b)由Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因組成的3種基因的組合；(c)由Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因和Myc家族基因組成的4種基因的 組合；(d)由Oct家族基因、Sox家族基因、Lin家族基因和Nanog基因組成的4種基因的組 合；和(e)由Oct家族基因、Sox家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因和Nanog 基因組成的6種基因的組合，或進一步包含TERT基因和/或SV40Large T抗原基因的這些組合中的任何一種。
7.權利要求
1-6中任一項的方法，其中編碼重編程序因子的所述基因是下述組合之(a)由0ct3/4和Sox2組成的2種基因的組合；(b)由0ct3/4、Klf4和Sox2組成的3種基因的組合；(c)由0ct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc組成的4種基因的組合；(d)由0ct3/4、Sox2、Lin28和Nanog組成的4種基因的組合；和(e)由0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc, Lin28 和 Nanog 組成的 6 種基因的組合，或進一步包含TERT基因和/或SV40Large T抗原基因的這些組合中的任何一種。
8.權利要求
1-7中任一項的方法，其中引入所述體細胞內的所述非病毒表達載體的種 類數目是1、2、3或4。
9.權利要求
8的方法，其中編碼核重編程序因子的所述基因是由Oct家族基因、Klf家 族基因和Sox家族基因組成的3種基因的組合，或由Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族 基因和Myc家族基因組成的4種基因的組合，其中將Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家 族基因整合入一種非病毒表達載體中。
10.權利要求
9的方法，其中所述Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因以這種 順序以從5'到3'末端方向整合入一種非病毒表達載體中。
11.權利要求
9或10的方法，其中所述Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因與 使得能夠進行多順反子表達的間插序列一起整合入一種非病毒表達載體中。
12.權利要求
9-11中任一項的方法，其中所述Oct家族基因是0ct3/4，所述Klf家族基因是Klf4，所述Sox家族基因是Sox2，並且所述Myc家族基因是c_Myc。
13.權利要求
8-12中任一項的方法，其中第一種非病毒表達載體和第二種非病毒表達 載體同時引入體細胞內。
14.權利要求
13的方法，其中所述引入重複執行2次或更多次。
15.權利要求
1-14中任一項的方法，其中所述體細胞是哺乳動物包括人的體細胞。
16.一種誘導的多潛能幹細胞，其可以通過權利要求
1-15中任一項的方法獲得。
17.權利要求
16的誘導的多潛能幹細胞，其中所述引入的至少一種非病毒表達載體的 全部或部分基本上不整合到染色體中。
18.一種非病毒表達載體，其整合了編碼至少一種重編程序因子的基因。
19.權利要求
18的載體，其中所述載體是質粒載體。
20.權利要求
18或19的載體，其中整合了Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因。
21.權利要求
20的載體，其中所述Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因以這種 順序以從5'到3'末端方向整合。
22.權利要求
21的載體，其中所述Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因經由使 得能夠進行多順反子表達的序列整合。
23.權利要求
20-22中任一項的載體，其中所述Oct家族基因是0ct3/4，所述Klf家族 基因是Klf4，並且所述Sox家族基因是Sox2。
24.一種誘導的多潛能幹細胞，其中編碼重編程序因子的一種或多種轉基因以質粒的 形式整合到細胞基因組內。
25.一種誘導的多潛能幹細胞，其中無誘導的外源基因整合到細胞基因組內。
26.得自口蹄疫病毒的2A序列用於製備用於誘導的多潛能幹細胞誘導的非病毒表達 載體的用途，所述非病毒表達載體具有2種或更多種重編程序因子。
專利摘要
本發明提供了產生誘導的多潛能幹細胞的方法，其包括將至少一種非病毒表達載體(更優選質粒載體)引入體細胞內的步驟，所述非病毒表達載體整合了編碼重編程序因子的至少一種基因。還提供了其中無誘導的外源基因整合到細胞基因組內的誘導的多潛能幹細胞。
文檔編號C12N15/09GKCN101855350SQ200980100078
公開日2010年10月6日 申請日期2009年5月1日
發明者山中伸彌, 沖田圭介 申請人:國立大學法人京都大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan