製造免疫球蛋白的組合物和方法

2023-05-19 08:59:11 1

專利名稱：：製造免疫球蛋白的組合物和方法
技術領域：
：無
背景技術：
：炭疽病是由產孢細菌炭疽芽孢桿菌(fiadW^fl""rac")引起的比較明確的傳染病。這種疾病歷史上與動物傳染，尤其諸如奶牛、綿羊和山羊的食草動物傳染相關聯，且在人類中通常不可見。然而，與發生傳染的畜產品一起工作的人處於傳染炭疽病的危險中。中東和撒哈拉以南的非洲的一些地區是炭疽高發區，但在世界的許多區域通常可見這種生物體。這種疾病以三種不同的方式表現皮膚炭疽病、胃腸炭疽病和吸入炭疽病，分別由開口創傷暴露於孢子、攝食受汙染肉製品中的孢子或吸入孢子引起。雖然皮膚炭疽病的致死率高達25%,但胃腸炭疽病或吸入炭疽病產生將近100%的致死率。炭疽病傳染的確診通常太遲而不能提供復生性護理。炭疽芽孢桿菌的主要病毒性因子是這種生物體分泌的多組分毒素。毒素由三種命名為保護性抗原(protectiveantigen,PA)、致死因子(lethalfactor,LF)和水腫因子(edemafactor,EF)的蛋白質組成，其分別由基因pag、Ze/和cya編碼。PA是分子量為83kDa的735個胺基酸的蛋白質。其與哺乳動物細胞表面的炭疽毒素受體(anthraxtoxinreceptor,ATR)結合，且接著經受弗林蛋白酶(furin)介導的裂解以產生63kDa受體結合產物。63kDaPA片段在細胞表面上形成能夠與LF或EF相互作用的七聚體複合體(heptamericcomplex),且接著使這一複合體內在化。LF是鋅金屬蛋白酶，其裂解MAP激酶激酶的數種同功異型物，從而破壞細胞內的信號轉導事件，最終導致細胞死亡。LF視為會造成炭疽病傳染的致死後果。EF是鈣調蛋白依賴性腺苷酸環化酶，其引起細胞生理學反常，產生包括水腫的臨床表現。PA和LF—起稱為致死毒素。CDC列出作為A類病原因子的炭疽且估算出每100,000人暴露於炭疽攻擊的成本超過260億美元。目前，在美國唯一許可人類使用的疫苗Biothrax(原先的吸附炭疽疫苗(Anthraxvaccineadsorbed或AVA))是基於保護性抗原PA的氫氧化鋁吸附性福馬林(formalin)處理的亞單位疫苗。其通過皮下注射傳送且誘發抗由芽孢桿菌分泌的致死毒素的免疫性。疫苗由炭疽芽孢桿菌的V770-NP1-R菌株的過濾培養物上清液部分製得。製造過程複雜，在疫苗製備批次中批料與批料間存在偏差，且不能確定疫苗的精確組成。此外，因為明礬作為當前疫苗的佐劑包括在內，所以疫苗存儲和分銷期間必須維持冷藏鏈，增加不便和成本。疫苗通過注射投與，此可使集體治療的後勤複雜化。因此，將希望具有能夠對抗炭疽暴發或攻擊的傳染潛在性的其他試劑。出於多種治療性以及診斷性、產業性和研究目的，單克隆抗體具有漸增的重要性。舉例來說，數個動物研究已證明接種動物的炭疽毒素特異性抗體可被動式保護接受者免受傳染的致死作用。然而，源自動物的血清具有阻止廣泛用作治療劑的明顯缺點。由融合瘤產生的單克隆抗體必須從培養融合瘤的培養基中收集或從小鼠腹水中收集。令人遺憾地，這些製造系統昂貴、勞動密集且具有其他顯著的缺點。出於這些原因和其他原因，將希望能夠利用替代性單克隆抗體製造系統，諸如涉及重組DNA技術的製造系統。關於試劑的充分需求和有限供應、產品成本和試劑純度的問題突出對改進產品和試劑的迫切需要。因此，明確需要且迫切要求對抗潛在炭疽病傳染的改進方法，以及診斷性檢測的改時方法和適用於檢查炭疽病傳染機理的研究工具。此外，希望提供以合理的成本允許大量製造適用於這些應用的產品的製造方法。
發明內容本發明提供適用於製備重組系統中的抗體的核酸和蛋白質序列。具體來說，本發明提供適用於製備編碼輕鏈抗體序列和重鏈抗體序列的核酸序列的寡核苷酸引物序列。本發明另外提供編碼由至少一個重鏈多肽或其功能片段組成的多肽的抗體核酸序列和編碼至少一個輕鏈多肽或其功能片段的抗體核酸序列。本發明也提供重鏈和輕鏈多肽和其功能片段。本發明另外提供各自獨立地包含至少一個CDR重鏈多肽和至少一個CDR輕鏈多肽的PA-1和LF-1抗體的抗體序列。本發明也提供各自獨立地包含一個或一個以上具有至少一個胺基酸取代的CDR的PA-1和LF-1抗體的抗體序列，其中PA-1或LF-結合活性增強。本發明另外提供編碼PA-1和LF-1重鏈和輕鏈的核酸以及編碼PA-1和LF-1抗體的核酸。類似地，本發明提供這些編碼核酸的功能片段。本文也提供所提供的組合物的製造和使用方法。圖1是展示PA和PANG(非糖基化)植物所產生抗體的SDS-PAGE分析的凝膠的照片。IgG標準物是純化總人類IgG。由箭頭指示重鏈(H)和輕鏈(L)的位置。圖2是描繪植物所產生PA(PA)或PANG(PANG)、LF(LF)抗體的大鼠半衰期研究結果的曲線圖。具體實施例方式定義術語"抗體"、"抗體鏈"、"可變區或可變域"、"恆定區或恆定域"、'、鏈"、"K鏈"、"入鏈"、"重鏈"、"輕鏈"和其他與抗體有關的術語在本文中根據如(例如)Goldby，R.A.,/mm訓o/ogy，前述和/或Harlow，前述中所述的所屬領域接受的含義使用。術語"cDNA"指與mRNA互補的單鏈DNA分子或指包含與mRNA互補的鏈的雙鏈DNA分子。雙鏈cDNA的另一條鏈將具有與mRNA相同的序列且因此將編碼與mRNA相同的多肽。"表達載體"是含有足以驅動核酸片段轉錄的調控序列(例如，啟動子和/或其他表達信號和視情況3'序列，諸如3'調控序列或終止信號的載體，所述調控序列可操作性連接所述核酸片段。表達載體也可包含適當轉譯核酸片段所需的可操作性連接的序列。核酸片段可能(但不必)是蛋白質編碼序列。核酸片段可嵌合，意謂其包括超過一個具有不同起源的序列，這些序列通過重組DNA技術連接在一起，產生天然不存在的核苷酸序列。術語"表達載體"可指插入可操作性連接的核酸片段之前或之後的載體。某些表達載體使DNA在宿主之間穿梭，諸如細菌-酵母，或細菌-動物細胞，或細菌-真菌細胞，或細菌-無脊椎動物細胞，或細菌-植物細胞。典型的表達載體應含有用於在宿主細胞中自發複製的複製起源、一個或一個以上可選擇標記、一個或一個以上(通常數個)適用限制酶位點、通常可能的高拷貝數目和一個或一個以上啟動子。"一致性"指兩個或兩個以上核酸序列相同的程度。評估窗口範圍內的第一與第二核酸之間的一致性百分比可通過使核酸比對，確定評估窗口內的與同一核苷酸相對的核苷酸數目，允許引入間隙以使一致性最大化，除以窗口中的核苷酸總數且乘以ioo來計算。當計算達成特定一致性％所需的同一核苷酸的數目時，分數近似為最接近的整數。當比較兩個或兩個以上序列時，其中任一個可視為參考序列。一致性百分比可使用所屬領域中已知的多種電腦程式計算。舉例來說，諸如BLASTN、BLASTP、GappedBLAST等的電腦程式產生比對且提供所關注的序列與任何多種公共資料庫中的序列之間的一致性％。將如在Karlin和Altschul,/Voc.WwZ.Ac^Z.Sd.C/SA90:5873-5877,1993中修改的Karlin禾BAltschul算法(Karlin和Altschul,Prac.iVa",脂87:22264-2268，1990)併入Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人，/.215:403-410，1990)中。為獲得用於比較目的的間隙性比對，利用如AItschul等人(Altschul等人,Wwc/e!'c25:3389-3402，1997)所述的GappedBLAST。當利用BLAST和GappedBLAST程序時，使用各程序的默認參數。參考URL為www.ncbi.nlm.nih.gov的網站。可使用PAM250或BLOSUM62矢巨陣。術語"分離"意謂1)與在自然界中通常與之相締合的至少某些組分分離；2)由包括人手動的方法製備或純化；和/或3)自然界中不存在。從自然界中可見的較大核酸(例如，染色體、游離體、病毒或細菌基因組)切除或擴增的核酸視為分離的。在一些實施例中，切除或擴增的核酸不再與非編碼區連接(但可與原生調控區或其部分連接)，或不再與位於較大核酸中可見的分離核酸的上遊或下遊的其他基因連接。分離的核酸包括插入質粒、柯斯質粒(cosmid)、人造染色體、病毒載體等中的核酸，B卩，構成重組核酸構造體的一部分的核酸視為分離的。分離核酸可以是擴增產物(例如，PCR產物)、分離mRNA、cDNA、限制片段等。分離多肽可以是表達於異源表達系統中的多肽，艮口，由不表達自然界中的多肽的細胞表達。分離抗體可以是存在於不為血液或血清的組合物中的抗體。由分離的核酸所表達的抗體視為分離抗體。任何本發明的核酸、抗體鏈或抗體都可以分離形式提供。術語"核酸"、"聚核苷酸"和"寡核苷酸"在本文中互換使用指具有至少3個核苷酸的聚合物。核苷包含與糖分子連接的含氮鹼基。在聚核苷酸中，磷酸基與相鄰核苷共價連接以形成聚合物。聚合物可包括天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)、核苷類似物、化學修飾鹼基、生物修飾鹼基(例如，甲基化鹼基)、嵌插鹼基、修飾糖(例如，修飾嘌呤或嘧啶)。參見Kornberg禾口Baker,DM47epZ!'ca"ow,第二版(Freeman,SanFrancisco,1992)，Scheit,NucleotideAnalogs(JohnWiley,NewYork,1980)和美國專利公開案第20040092470號和其中的參考文獻用於進一步討論可用於本文所述的聚核苷酸中的各種核苷酸、核苷和主鏈結構和其製造方法。諸如肽核酸、鎖核酸(lockednucleicacid)等的類似物也在本發明的範疇內。聚核苷酸可具有任何尺寸或序列，且其可為單鏈或雙鏈。寡核苷酸的長度通常小於100個核苷酸。本文所揭示的任何核酸可呈單鏈或雙鏈形式。當本發明提供核酸序列時，也提供互補序列。此外，當提供呈DNA的序列時，也提供相應RNA序列(即，T經U置換的序列)。使用術語"核酸構造體"指經人手動修飾的核酸或源自於這種核酸的核酸。舉例來說，核酸構造體相對於天然存在的核酸分子可含有突變、缺失或取代。核酸構造體可包含兩個或兩個以上源自或起源自諸如不同生物體的不同源的核酸片段，例如，重組聚核苷酸。核酸構造體的一個或一個以上部分的序列可完全由人發明。如本文所使用的術語"核酸序列"可指核酸物質本身且不局限於生物化學表徵特定核酸例如，DNA或RNA分子的序列信息(即，選自5個鹼基字母A、G、C、T或U的字母的接續)。"可操作性連接"或"可操作性締合"指兩個核酸之間的功能關係，其中一個序列的表達、活性、定位等由另一核酸控制、引導、調控、調節等。這兩個核酸視為可操作性連接或可操作性締合。"可操作性連接"或"可操作性締合"也指兩個多肽之間的關係，其中一個多肽的表達由另一多肽控制、引導、調控、調節等。這兩個核酸視為可操作性連接或可操作性締合。舉例來說，核酸的轉錄由可操作性連接的啟動子引導；核酸的後轉錄加工由可操作性連接的加工序列引導；核酸的轉譯由諸如轉譯起始序列的可操作性連接的轉譯調控序列引導；核酸或多肽的運輸、穩定或定位由諸如分泌信號序列的可操作性連接的運輸或定位序列引導；且多肽的後轉譯加工由可操作性連接的加工序列引導。雖然與第二核酸序列可操作性連接的第一核酸序列或與第二多肽操作性連接的第一多肽優選與這一序列直接或間接共價連接，但任何有效的三維締合是可接受的。所屬領域的技術人員應了解，多個核酸或多個多肽可可操作性連接或締合。術語"引物"指充當適當條件下(例如，在存在4種不同核苷三磷酸和諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶的聚合劑的情況下)在含有任何必要輔因子的適當緩衝溶液中且在適當溫度下的模板引導DNA合成的起始點的單鏈寡核苷酸。引物的適當長度取決於引物的預定用途，但通常在約IO到約50個核苷酸的範圍內。雖然引物不必與模板完全互補，但應充分互補以與之雜交。引物可以雙鏈形式提供，即，與其補體雜交。如本文所使用的"純化"意謂使實體或物質與一個或一個以上純化之前先前可見其的其他實體或物質分離。實體或物質可部分經純化，大體上經純化或是純的。當將諸如核酸或多肽的物質或實體從大體上所有不為溶劑和溶劑中所含的任何離子的其他化合物或實體移出時，其視為純的，即，其構成組合物的乾重的至少約90%，更優選至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或高於99%。部分或大體上純化的諸如核酸或多肽的化合物或實體可從天然可見(例如)諸如細胞蛋白和/或核酸的細胞物質的物質的至少50%、至少60%、至少70%或至少80%中移出。在某些實施例中，純化核酸或多肽以乾重計分別構成組合物中的總核酸或多肽的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或甚至更高。評定純度的方法在所屬領域中是已知的且包括色譜法、免疫學法、電泳法等。關於核酸的術語"調控元件"或"調控序列"在本文中通常用於描述引導或控制與之操作性連接的核酸序列的表達中的一個或一個以上步驟(尤其轉錄，但在一些情況下，諸如剪接或其他加工的其他事件)的核酸部分。術語包括啟動子且也可指增強子、沉默子(silencer)和其他轉錄控制元件。啟動子是包括轉錄起始之前與RNA聚合酶結合的位點且為出現均勻轉錄基底水平通常所必需的核酸區。這些元件通常包含TATA盒。增強子是涵蓋蛋白質結合位點的核酸區，其提升位於附近或遠處的啟動子的轉錄活性，通常在一定程度上高於在不存在增強子的情況下將存在的表達基底水平。在本發明的一些實施例中，調控序列可引導核苷酸序列的組成性表達，例如，表達可在大部分或所有細胞類型中和/或在大部分或所有條件下出現；在其他實施例中，調控序列可引導細胞或組織特異性和/或可誘導表達。舉例來說，表達可通過存在或添加諸如激素或其他小分子的誘導劑或通過增加溫度等來誘導。調控元件也可抑制或降低操作性連接的核酸的表達。以此方式表現的調控元件在本文中將稱為"負調控元件(negativeregulatoryelement)"。表達水平通常可使用測量mRNA或蛋白質的標準技術來測定。這些方法包括Northern印跡(Northernblotting)、原位雜交、RT-PCR、定序、免疫學法(諸如免疫印跡、免疫檢測或用螢光標記抗體染色後的螢光檢測)、寡核苷酸或cDNA微陣列或膜陣列、蛋白質陣列分析、質譜等。測定表達水平的簡便方法是以與調控元件可操作締合的方式將編碼容易可檢測的標記(例如，螢光或發光蛋白質，諸如綠色螢光蛋白質或螢光素酶；酶，諸如鹼性磷酸酶等)的核酸放置在表達載體中，將載體引入到所關注的細胞類型中或生物體中，將細胞或生物體維持一段時間，然後利用任何使標記變得容易可檢測的性質(例如，螢光、發光、底物光學性質的變化等)測量容易可檢測的標記的表達。比較不存在或存在調控元件情況下的表達指示調控元件影響操作性連接序列的表達的程度。"特異性結合"泛指靶多肽(或更一般地說，靶分子)與諸如抗體或配體的結合分子之間的物理性締合。締合通常取決於由結合分子識別的諸如抗原決定子或抗原決定基的靶的特定結構特徵的存在。舉例來說，如果抗體對抗原決定基A具有特異性，那麼含有游離的標記A和與其結合的結合分子的反應中含有抗原決定基A的多肽的存在或游離的未標記A的存在將減少與結合分子結合的標記A的量。應理解，特異性不必是絕對的，而是泛指出現結合的情況。舉例來說，所屬領域中熟知許多抗體與除靶分子中所存在的抗原決定基以外的其他抗原決定基交叉反應。視待使用抗體的應用而定，這種交叉反應性可能是可接受的。所屬領域的技術人員應能夠選擇具有在任何給定應用(例如，檢測靶分子，治療目的等)中適當運行的足夠特異性度的抗體或配體。同時應理解，特異性可在結合分子對靶的親和力相對結合分子對其他靶(例如，競爭者)的親和力的附加因素的情況下評估。如果結合分子展示對於想要檢測的靶分子的高親和力和對非靶分子的低親和力，那麼抗體將可能是可接受的試劑。一旦在一種或一種以上情況下建立結合分子的特異性，就可應用於其他、優選類似情況下而不必再評估其特異性。如果在測試條件下，例如在生理條件下，親和力(平衡解離常數，Kd)為至少1(^M，優選1(T4M，更優選l(T5M,例如10—6M、l(T7M、10-8M或10—9M,那麼兩個或兩個以上分子的結合可視具有特異性。如本文所使用的"個體"指(例如)出於實驗、診斷和/或治療的目的，待對其傳送抗體組合物的個體。優選個體是哺乳動物，尤其馴養哺乳動物(例如，狗、貓等)、靈長類動物或人類。如本文所使用的"治療"通常可包括逆轉、減輕、降低、抑制這一術語所應用的疾病、病症或病狀或這種疾病、病症或病狀的一種或一種以上症狀或表現症狀的的進展或減小其可能性。"預防"指使得疾病、病症、病狀或其症狀或表現症狀或其嚴重程度的惡化不出現。"載體"在本文中使用指能夠介導核酸分子進入(例如轉移、運輸等)到細胞中的核酸或病毒、病毒基因組或其部分(例如，病毒殼體或病毒基因組的組分)。當載體是核酸時，待轉移的核酸分子通常連接於(例如，插入於)載體核酸分子。核酸載體可包括引導合適宿主細胞內的自發複製的序列(例如，複製起源)或可包括足以使所有核酸的部分整合於宿主細胞DNA中的序列。適用的核酸載體包括(例如)DNA或RNA質粒、柯斯質粒和天然存在或修飾病毒基因組或其部分或可包裝在病毒殼體中的核酸(DNA或RNA)。質粒載體通常包括複製起源和一種或一種以上可選擇標記。質粒可包括部分或所有病毒基因組(例如，病毒啟動子、增強子、加工或包裝信號等)。可用於將核酸分子引入到細胞中的病毒或其部分(例如，病毒殼體)稱為病毒載體。適用的動物病毒載體包括腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、痘苗病毒和其他痘病毒、單純皰疹病毒(herpexsimplexvirus)和其他類似物。適用的植物病毒載體包括那些基於菸草花葉病毒(tobamovirus)、等軸不穩環斑病毒(ilarvirus)等的病毒載體。當病毒載體引入宿主細胞中時，其可能會含有或可能不會含有足夠的製造傳染性病毒的病毒基因信息，艮卩，病毒載體可能具有複製缺陷且對本發明的某些實施例來說，這些複製缺陷病毒載體可能更優選。當缺乏足夠信息時，可能(但不必)由宿主細胞或引入細胞中的另一載體供應。本發明的某些實施例的詳細描述本發明涉及編碼單克隆抗體(MAb)PA的核酸和編碼單克隆抗體LF的核酸。核酸所編碼的抗體和其功能片段分別特異性識別炭疽蛋白PA和LF且抑制活性和產生性炭疽傳染。本發明也涉及編碼包含PA和/或LF的修飾形式和其功能片段的多肽的核酸和包含PA和/或LF的修飾形式和其功能片段的多肽。這些抗體和功能片段保留親本鼠類抗體PA和/或LF的結合特異性和抑制活性。本發明另外涉及PA和/或LF抗體的最佳形式，與PA禾B/或LF抗體的親本形式相比，其展示增加的結合親和力和特異性。廣泛使用首先由Kohler和Milstein，Nature256:495，1975描述的融合瘤法用於鑑別展示想要結合性質的單克隆抗體。簡單來說，這種技術通常包括從免疫哺乳動物中分離淋巴細胞，使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，和分離由融合產生的克隆細胞系(融合瘤)。篩選這些細胞系以鑑別那些產生與所關注的多肽或其特定部分或抗原決定子結合的抗體的細胞系。也可篩選細胞系以鑑別產生對靶多肽具有想要的親和力的抗體的細胞系。免疫哺乳動物可能已有意被免疫(例如，接種疫苗)或可能已被傳染性生物體傳染、暴露於抗原等。因此，"免疫哺乳動物"指產生與所關注的多肽特異性結合的抗體的任何哺乳動物。在本發明的一優選實施例中，哺乳動物是人類，例如已接種防傳染因子的疫苗、暴露於傳染因子等的人類。本發明提供用於(例如)使用聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)從融合瘤分離編碼抗體重鏈或輕鏈的cDNA的寡核苷酸引物和引物組。在一實施例中，寡核苷酸包含SEQIDNO:1-44中的任一個。在另一實施例中，寡核苷酸由SEQIDNO:l-44中的任一個組成。其他方面，某些引物中所提供的限制酶位點可被修飾為任何優選限制酶位點，以調適引物為合乎需要的載體插入位點。另一方面，本發明提供分離編碼抗體鏈或其部分的核酸的方法。在一實施例中，所述方法包含如下步驟(a)使由抗體產生細胞獲得的核酸與至少一個選自由SEQIDNO:^44組成的群組的寡核苷酸引物接觸；和(b)進行擴增反應。擴增反應通常是聚合酶鏈反應(PCR)。在本發明的某些實施例中，步驟(a)包含使核酸與至少兩個選自由SEQIDNO:l-44組成的群組的寡核苷酸引物接觸。應了解，儘管本發明的引物和方法可具有從融合瘤克隆抗體鏈cDNA(即，編碼抗體鏈的cDNA)的特定用途，其無論如何不局限於這個目的，而是可用於從任何抗體產生細胞、細胞株等克隆抗體鏈cDNA。抗體鏈優選是人類抗體鏈。另一方面，本發明提供編碼結合炭疽蛋白的抗體多肽鏈或其功能片段的核酸組合物。在一實施例中，編碼抗體多肽鏈或其功能片段的核酸組合物包含結合炭疽芽孢桿菌保護性抗原的功能蛋白。在一實施例中，本發明提供編碼與炭疽芽孢桿菌保護性抗原結合的單克隆抗體或其功能片段的K輕鏈的核酸。在一實施例中，核酸是cDNA序列或包含cDNA序列。在另一實施例中，本發明提供編碼與炭疽芽孢桿菌保護性抗原結合的單克隆抗體或其功能片段的y重鏈的核酸。在一實施例中，核酸是cDNA序列或包含cDNA序列。在一實施例中，編碼抗體多肽鏈或其功能片段的核酸組合物包含結合炭疽芽孢桿菌致死因子的功能蛋白。在一實施例中，本發明提供編碼與炭疽芽孢桿菌致死因子結合的單克隆抗體或其功能片段的k輕鏈的核酸。在一實施例中，核酸是cDNA序列或包含cDNA序列。在另一實施例中，本發明提供編碼與炭疽芽孢桿菌致死因子結合的單克隆抗體或其功能片段的y重鏈的核酸。在一實施例中，核酸是cDNA序列或包含cDNA序列。本發明進一步提供多種包含一種或一種以上本發明核酸、例如編碼抗體重鏈或輕鏈的核酸的核酸構造體，其中使用一個或一個以上本發明引物從表達抗體重鏈或輕鏈的細胞或細胞系中分離所述核酸。舉例來說，本發明提供含有一種或一種以上本發明核酸的載體，例如表達載體。在某些實施例中，載體是適於土壤桿菌(Agra^"en'wm)介導的轉型的雙元載體。在某些實施例中，載體是植物病毒。在某些實施例中，載體基於植物的病毒，g卩，其含有一種或一種以上植物病毒的基因組組分。本發明進步提供表達一種或一種以上所提供的核酸且產生單克隆抗體或其功能片段的重鏈或輕鏈的宿主細胞。本發明進一步提供產生抗體重鏈或輕鏈的方法，其包含(i)提供表達系統，其含有編碼單克隆抗體或其功能片段的重鏈或輕鏈的核酸，其中使用一個或一個以上本發明的引物分離所述核酸，其中所述核酸可操作性連接於在表達系統中引導核酸的表達的諸如啟動子的調控元件；(ii)將表達系統維持在表達發生的條件下。所述方法可進一步包含(iii)收集抗體或其功能片段。抗體或其功能片段可使用所屬領域中已知的多種技術中的任一種純化。表達系統可以是任何合適的表達系統，例如，細胞培養物、轉基因植物或動物、克隆根或植物細胞系等。完整抗體可通過使重鏈和輕鏈彼此締合來產生。本發明進一步提供產生包含重鏈和輕鏈的抗體或其功能片段的方法，其包含(i)提供表達系統，其含有編碼抗體重鏈或其功能片段的核酸且進一步含有編碼抗體輕鏈或其功能片段的核酸，其中所述核酸中的任一個或兩個可操作性連接於在表達系統中引導表達的諸如啟動子的調控元件；(ii)將表達系統維持在表達發生的條件下。兩個抗體鏈都是由表達系統產生且可在表達系統中彼此締合。所述方法可進一步包括收集抗體的步驟。可使用任何合適的表達系統。本發明進一步提供治療個體的方法，其包含投與包含重鏈和輕鏈的抗體或其功能片段，其中任一個鏈或兩個鏈都是根據本文所述的本發明方法產生的。本申請案提及多種專利、專利申請案、期刊文章和其他公開案，所有都以引用的方式併入本文中。另外，下列標準參考資料以引用的方式併入本文中Ausubd，F.(編),CWr加/Vwoco/i1!'Mo/ecwZarS!'o/og;y,CWrewf/VWocoZs/AnmimoZogy,Cwrrewf屍rafocok屍ra"z'/r5Wence禾口Cwrren/屍rafoco/j!'"CW/JohnWiley&Sons,N.Y.，2002年7月編；Sambrook，Russell禾口Sambrook,MoZecwZarC7om7ig.'ALaZwraroo1Ma肌aZ,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,2001;Harlow,E.等人，y4w"'6od!'":/\LaboratoryAfawwa/,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,第二版1988);Goldsby,R.A.等人(編)，AY<&;y/m,wo/ogy,第4版，W.H.Freeman&Company,NewYork,2000禾口Goodmanam/G!7ma"7Te屍/uAvnaco/og/a^BajZjo/T7iera/eM"'"，第10版,McGrawHi11，2001。如果任何所併入的參考文獻與本說明書或所屬領域的技術人員的理解之間存在衝突或不一致，那麼應以說明書為主，應理解，是否存在衝突或不一致的判定是在發明者的判斷內且可在任何時候進行。本發明提供用於(例如)使用聚合酶鏈反應(PCR)從融合瘤分離編碼抗體重鏈或輕鏈的核酸(例如，cDNA)的新穎的寡核苷酸引物和引物組。PCR在所屬領域是熟知的且描述於(例如)PC尺屍n'mer,ALaZ70rato7A^"船/,Dieffenbach,C.W.和Dveksler，G.S.(編)；屍C7Baw'cs:FromBacA:gro"wdtoBenc/j，SpringerVerlag,2000:M.J.McPherson等人,Mattila等人,Ac!'A19:4967(1991);Eckert等人，PCRMethodsandApplications,1:17(1991);PCR(McPherson等人編，IRLPress,Oxford)和美國專利第4,683,202號。在本發明的某些實施例中，從細胞或細胞系(諸如，融合瘤)中分離RNA，例如mRNA)。使RNA進行逆轉錄以產生cDNA。使用一個或一個以上本發明的寡核苷酸引物或引物組擴增編碼抗體重鏈或輕鏈的核酸。也可使用其他擴增技術將本發明引物用於擴增反應。本發明的寡核苷酸列於表1中，表1也指示抗體基因或cDNA的與引物雜交的部分，例如，y鏈恆定區(CG)、人鏈恆定區(CL)、K鏈恆定區(CK)、重鏈可變區(VG)、^鏈可變區(VL)或K鏈可變區(VK)。應了解，某些引物與編碼鏈或非編碼鏈雜交，因此"雜交"打算涵蓋這些可能性中的任一種。表1也指示可獲自GenBank的個別序列的數目，其可歸為應該可能會使用特定引物而加以擴增的"家族"。指示為"短"的某些引物不含工程化限制性位點。較長的其他引物含有位於相對於與抗體基因或cDNA雜交的部分的5'處的SfiI限制位點。這些引物在5'端處還含有CTC或CTCGC以提高由限制酶裂解的效率。本發明涵蓋包含具有表1的"短"引物的序列的部分且進一步包含位於相對於具有短引物的序列的部分的5'處的限制位點的其他寡核苷酸。包含Sfil位點(以粗體指示)的引物提供本發明的短引物可如何被修飾以併入限制位點的實例。因此，一方面，本發明提供序列包含SEQIDNO:1-44中的任一個或由SEQIDNO:1-44中的任一個組成的寡核苷酸。另一方面，本發明提供含有至少2個選自由SEQIDNO:l-44組成的群組的寡核苷酸的引物混合物。另一方面，本發明提供含有至少3個選自由SEQIDNO:1-44組成的群組的寡核苷酸的引物混合物。另一方面，本發明提供含有至少4個選自由SEQIDNO:l-44組成的群組的寡核苷酸的引物混合物。另一方面，本發明提供含有至少5個選自由SEQIDNO:1-44組成的群組的寡核苷酸的引物混合物。另一方面，本發明提供含有至少6個選自由SEQIDNO:1-44組成的群組的寡核苷酸的引物混合物。在本發明的某些實施例中，引物混合物中的至少1個引物是恆定區引物且引物混合物中的至少1個引物是可變區引物。在一些實施例中，引物混合物含有至少1個與編碼Y鏈恆定區的至少一部分的序列雜交的引物(CG引物)和至少1個與編碼重鏈可變區的至少一部分的序列雜交的引物(VG引物)。在一些實施例中，引物混合物含有至少1個與編碼X鏈的恆定區的至少--部分的序列雜交的引物(CL引物)和至少1個與編碼人鏈的可變區的至少一部分的序列雜交的引物(VL引物)。在一些實施例中，引物混合物含有至少1個與編碼K鏈的恆定區的至少一部分的序列雜交的引物(CK引物)和至少1個與編碼K鏈的可變區的至少一部分的序列雜交的引物(VK引物)。在本發明的一些實施例中，引物混合物含有至少2個或3個VG引物和至少1個CG引物。在本發明的一些實施例中，引物混合物含有至少2個或3個VL引物和至少1個CL引物。在本發明的一些實施例中，引物混合物含有至少2個或3個VK引物和至少1個CK引物。在任何前述實施例中，引物可能是短的或長的。在本發明的一些實施例中，使用引物組或一對短引物進行第一PCR反應且使用引物組或一對含有限制位點的引物(長引物)進行第二PCR反應。長引物可包含如實例1中所述的短引物的序列。表1:RT-PCR引物tableseeoriginaldocumentpage18重鏈可變區纖可變區CL"短VG1+784VG234VG32124VG4無VG51無VG61無VGl+7short84VG2短34VG3短2124VG4短7無VG5短1無VG6短1無VL1524VL25無VL3824VL41無VL532VL6+92無5'-TAACACTCTCCCCTGTTCA-3，(SEQBDNO:6)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGACTGSAYCTGGAG-3，(SEQID戮7)'CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGACAYACTTTGCTMCAC-3,(SEQIDNO:8)5，-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGSAGTTKKGGCTGHGCTG-3，(SEQIDNO:9)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGAAACACCTGTGCJTTCTT-3'(SEQIDNO:10)CTC(JCGGCCCAGCC(GCCATGGGGTCAACCGCCATCCT-3，(SEQIDNO:11)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGTCTGTCTCCTTCCTCAT-3,(SEQIDNO:12)5'-ATGGACTGSAYCTGGAG-3'(SEQIDNO:13)5'-ATGGACAYACTTTGCTMCAC-3'(SEQIDNO:14)5，-ATGSAGTTKKGGCTGHGCTG-3'(SEQIDNO:15)5，-ATGAAACACCTGTGGTTCTT-3'(SEQIDNO:16)5，-ATGGGGTCAACCGCCATCCT-3'(SEQIDNO:17)5，-ATGTCTGTCTCCTTCCTCAT-3'(SEQIDNO:18)5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGRCCDGSTYTCCTCTC-3，(SEQIDNO:19)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTGGGCTCTGCTGCT-3'(SEQIDNO:20)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTGGRYCVYTCTC-3'(SEQIDNO:21)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTGGGTCTCCTTCTA-3'(SEQIDNO:22)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTGGACTCYTCTCCT-3，，(SEQIDNO:23)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTGGGCTCCACTACT-3'(SEQIDNO:24)K鏈VL72無10-54+8-6128VL1-短524VL2-短5無VL3-短824VL4-短1無VL5-短32VL6+9-短2無VL7-短2無10-54+8-61-短28VK1162VK2+1.8104VK362VK41無VK5I無VK1-短162VK2+1.8-短104VK3-短62VK4-短1無VK5-短1無5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTGGACTCCTCTCTT-3，(SEQIDNO:25)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGSCCTGGRTSATGCTTCT-3，(SEQIDNO:26)5'-ATGRCCDGSTYTCCTCTC-3'(SEQIDNO:27)5，-ATGGCCTGGGCTCTGCTGCT-3'(SEQIDNO:28)5，-ATGGCCTGGRYCVYTCTC-3'(SEQIDNO:29)5，-ATGGCCTGGGTCTCCTTCTA-3，(SEQIDNO:30)5，-ATGGCCTGGACTCYTCTCCT-3'(SEQIDNQ:31)5'-ATGGCCTGG(3CTCCACTACT-3'(SEQIDNO:32)5'-ATGGCCTGGACTCCTCTCTT-3'(SEQIDNO:33)5'-ATGSCCTGGRTSATGCTTCT-3,(SEQIDNO:34)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGACATGAGGGTCCYCGC-3，(SEQIDNO:35)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGAGGSTCCYTGCTCAGCT-3'(SEQIDNO:36)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGAARCCCCAGCGCAGCT-3，(犯QIDNO:37)5'-CTCGCGGCCCACCCGGCCATGGTGTTGCAGACCCAGGT-3，(SEQIDNO:38)CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGGGTCCCAGGTTCACCT-3，(SEQIDNO:39)5，-ATCJGACATGAGGGTCCYCGC-3'(SEQIDNO:40)5'-ATGAGGSTCCYTGCTCAGCT-3'(SEQEDNQ:41)5'-ATGGAARCCCCAGCGCAGCT-3，(SEQH)NO:42)5'-ATGGTGTTGCAGACCCAGGT-3，(SEQIDNO:43)5，-ATGG(3GTCCCAGGTTCACCT-3，(SEQIDNO:44)應了解，表1中所列的序列表示具有所列序列的單一寡核苷酸分子或各自具有所列序列的寡核苷酸分子群體。表1中所列的某些引物是簡併的，g卩，由序列表示的寡核苷酸分子群體含有序列在簡併位置處不同的個別成員。術語"位置"指聚核苷酸中分配給各核苷的數值，通常相對於5'端。簡併引物的概念在所屬領域中是熟知的且在本文中與所屬領域中的理解一致使用。表2含有IUPAC模糊代碼，其列出表示可在簡併位置存在的核苷酸的縮寫。舉例來說，K表示G或T。表2:模糊代碼tableseeoriginaldocumentpage21如果在寡核苷酸的給定位置處存在"N"種可能的核苷酸，那麼認為這一位置為N重簡併。因此，引物序列"CG"，g卩，5'-CTCGCGGCCTCCGAGGCCTCATTTACCCKGAGACAGG-3'(SEQIDNO:1)表示含有位置29被G佔據的一些成員和位置29被T佔據的一些成員的寡核苷酸群體。本發明包括簡併位置被任何在這一位置處可能的替代物佔據的寡核苷酸。舉例來說，本發明涵蓋具有位置29被G佔據的SEQIDNO:1序列的寡核苷酸以及涵蓋具有位置29被T佔據的SEQIDNO:1的序列的寡核苷酸。涵蓋所有可能。舉例來說，引物VG1+7短"(SEQIDNO:13)在位置9處和11處是2重簡併。因此，除涵蓋由SEQIDNO:13表示的含有具有4種不同序列中的任一種序列的寡核苷酸分子的簡併寡核苷酸外，本發明還涵蓋SEQIDNO:13的4種非簡併變異體。本發明還涵蓋比表1中所指示的少的位置是簡併的實施例。舉例來說，本發明涵蓋僅SEQIDNO:13的位置9是簡併(且位置11是由Y表示的任一核苷酸)的實施例和僅SEQIDNO:13的位置11是簡併(且位置9是由S表示的任一寡核苷酸)的實施例。簡併寡核苷酸的寡核苷酸群體中的不同寡核苷酸的比例可變化。群體中各序列通常大致相等地呈現。然而，可能希望偏離混合物的組成。表1中所列的簡併寡核苷酸的任何特定百分比組成都在本發明的範疇內。寡核苷酸的總簡併度是寡核苷酸群體中可存在的不同序列的總數。舉例來說，如果存在3個簡併位置，各簡併位置是2重簡併，那麼寡核苷酸群體的簡併度是23=8。表達系統和抗體產生使用任何本發明寡核苷酸引物分離的編碼抗體重鏈或輕鏈的核酸可表達於多種表達系統的任一種中。表達系統是能夠合成多肽的任何合適的生物系統，諸如細胞系或轉基因動物或植物。通常將核酸插入表達載體中，已知有多種表達載體。表達所關注聚核苷酸的合適方法在所屬領域中是已知的且描述於Ausubel(前述)和Sambrook(前述)中。也參見美國專利第4,816,567號和第6,331,415號。可使用任何原核或真核表達系統。在本發明的某些實施例中，表達系統不是融合瘤且不是人類，即，表達系統是不天然產生抗體鏈的表達系統。在本發明的某些實施例中，使用基於植物的表達系統。基於植物的表達系統是任何使用植物或其部分的細胞的表達系統。表達系統可以是植物細胞系、整株植物、克隆根細胞系等。植物細胞系、整株植物、克隆根細胞系等可以是轉基因的或非轉基因的。在基於植物的表達系統中表達所關注的聚核苷酸(例如抗體重鏈或輕鏈)的方法和載體在所屬領域中是熟知的。參見，例如美國專利第6,852,319號。在本發明的某些實施例中，使用基於植物病毒基因組的載體。本發明涵蓋且不限於使用任何基於植物病毒或病毒基因組(例如，RNA植物病毒或病毒基因組、DNA植物病毒或病毒基因組等)的載體。參見，例如美國專利第5,602,242號、第5,500,360號和第5,846,795號。在本發明的某些實施例中，使用轉基因或非轉基因芽作為表達系統。參見，例如美國公開案第20040093643號和Ensley等人在2005年2月11日申請的標題為"ProductionofForeignNucleicAcidsandPolypeptidesinSproutSystems"的U.S.S.N.60/652,186。在本發明的某些實施例中，使用克隆根細胞系或其他克隆細胞系。參見，例如2005年2月18日申請的標題為"SYSTEMSANDMETHODSFORCLONALEXPRESSIONINPLANTS"的U.S.S.N.11/061,980。含有表達所關注聚核苷酸的相關信息的其他專利申請案包括美國公開案第20050026291號、第20050114920號、第WO2005026375號、第WO0046350號、第WO0025574號、第WO2005049839號和美國專利第US6448070號。本發明明確地涵蓋編碼抗體輕鏈或重鏈的核酸的表達，其中使用本文所揭示的方法和/或引物使用這一部分所列的任何專利申請案和公開案中所述或所參考的表達系統和方法分離所述核酸。可使用其中所描述的任何特定植物、植物病毒、植物病毒複製子等。在一些實施例中，病毒複製子含有充分序列元件，如此其可視情況利用諸如由轉型植物(例如，植物是轉基因的或包含另一表達RNA聚合酶的載體)供應的RNA聚合酶的組分複製於植物細胞中。複製子可能會包括或可能不會包括外殼蛋白基因或運動蛋白基因。可使用任何特殊的將植物病毒或複製子引入植物或植物細胞或植物部分中的方法。實例包括塗敷於諸如葉的植物部分，磨蝕(例如，將病毒轉錄體引入到葉中)、農桿菌滲入法(agroinfiltration)、土壤桿菌介導的轉型、生物彈法(biolistics)等。本發明涵蓋任何包含根據本文所述的方法分離的核酸的植物病毒載體或複製子，例如，重組植物病毒載體或複製子，且進一步涵蓋包含載體的植物、植物部分或源自植物的克隆培養物。本發明進一步涵蓋轉基因植物，其基因組包含核酸。在本發明的一些實施例中，共表達編碼重鏈和輕鏈的核酸序列，如此這些鏈可彼此締合以在收集之前形成完整抗體。可使用任何合適的方法收集且視情況純化根據本發明方法產生的抗體鏈或抗體。當然，也可化學合成抗體的重鏈或輕鏈。具有編碼重鏈或輕鏈的核苷酸序列提供胺基酸序列。使用任何本發明寡核苷酸引物所分離的編碼抗體重鏈或輕鏈的核酸可以多種方式中的任一種修飾。舉例來說，其可經修飾以破壞否則將會發生在真核細胞中的糖基化事件或其他後轉譯加工事件。舉例來說，可進行改變會被糖基化的胺基酸或相鄰或附近位點的突變。如所屬領域中所熟知，Asn-X-(Ser/Thr)是可由真核N-連接的糖基化手段識別的序列。可考慮待使用的表達系統中可見的特定糖基化手段選擇待修飾的特定位點。其可經修飾以包括編碼多肽標記(例如，促進純化)的部分、使抗體鏈靶向特定細胞器的序列等。可使用多種變異而不幹擾抗體的特異性抗原結合性質且這些變異在本發明的範疇內。在某些實施例中，這些變異產生與天然存在的抗體為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%序列一致性的抗體。根據本發明的方法產生的抗體可能是抗體片段，諸如Fab'、F(ab')2、scFv(單鏈可變)或保留抗原結合位點的其他片段。片段可表達為片段，即，可表達僅編碼這一片段的核酸，或可使用已知技術(例如，裂解或消化)加工完整抗體以產生片段。載體如以上所提及，使用本發明引物和方法所分離的cDNA可插入到多種載體中且表達於多種細胞類型和表達系統中。本發明提供適於插入使用包含限制位點的本發明引物所分離的核酸的其他載體。載體含有與引物中所存在的相同的限制位點。限制位點存在於載體的一個或一個以上位置。在一些實施例中，(例如)使用定點突變(site-directedmutagenesis)移除載體的不想要的位置處的限制位點。在一些實施例中，限制位點是SfiI限制位點。在一特定實施例中，本發明提供適於土壤桿菌介導的轉型的雙元載體pBI121的修飾形式，其中位置11031處的內部SfiI位點突變且其中產生一個或一個以上新SfiI位點。簡單來說，pBI121運載新黴素磷酸轉移酶(neomycinphosphotransferase,W/T//)基因和a-葡糖醛酸酶(a-glucuronidase，GUS)基因(Jefferson等人，￡MfiO/，6:3901-3907，1987)。新黴素磷酸轉移酶(yv屍r//)基因受胭脂鹼合酶(nopalinesynthase,"o"啟動子和提供聚腺嘌呤信號的胭脂鹼合酶("w)的終止子控制。新黴素磷酸轉移酶(NPTII)基因給予卡那黴素(kanamycin)耐藥性。a-葡糖醛酸酶(GUS)活性受花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus)35S啟動子和提供聚腺嘌呤的胭脂鹼合酶("w)的終止子控制。本發明提供pBI121的修飾形式，其中最初SfiI位點突變且其中引入兩個新SfiI位點以使得方便插入異源核酸，諸如編碼抗體重鏈或輕鏈的核酸。試劑盒本發明提供試劑盒，其包含--種或一種以上表1中所列的寡核苷酸。試劑盒優選含有至少兩種寡核苷酸。在特定實施例中，試劑盒含有至少3與44之間的任何數目的寡核苷酸。試劑盒通常含有一對或一組適於擴增編碼重鏈(例如，Y重鏈)核酸的寡核苷酸和/或一對或一組適於擴增編碼輕鏈(例如，K或人輕鏈)的核酸的寡核苷酸。在一些實施例中，試劑盒含有一對或一組適於擴增y重鏈的寡核苷酸、一對或一組適於擴增K輕鏈的寡核苷酸和一對或一組適於擴增人輕鏈的寡核苷酸。上述任一對或任一組寡核苷酸可包括在試劑盒中。試劑盒通常應包括使用試劑盒從諸如融合瘤的細胞或細胞系中分離編碼一個或一個以上抗體鏈的核酸的說明書。除一種或一種以上寡核苷酸外，試劑盒可進一步包含任何多種其他試劑。舉例來說，試劑盒可含有進行PCR反應(例如，RT-PCR反應)的試劑。因此，試劑盒可含有(例如)逆轉錄酶、熱穩定DNA聚合酶、核苷酸、緩衝液等。試劑盒可含有從融合瘤或其他RNA細胞源純化RNA的試劑。試劑盒可含有一個或一個以上使用試劑盒可將所擴增的核酸插入其中的載體。載體可能是表達載體，其含有足以引導細胞(例如，植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等)中的表達的調控元件(例如，啟動子)。也可包括其他合適的元件，諸如轉錄終止子等。在所屬領域中，可利用多種表達載體，且任何這些表達載體都可包括在試劑盒內。在一實施例中，載體是適於土壤桿菌介導的轉型的雙元載體。載體可含有一個或一個以上方便的限制位點，如此用限制酶裂解載體產生與試劑盒中所存在的一個或一個以上寡核苷酸引物中所存在的限制位點相容(即，雜交)的"粘端"。在一些實施例中，載體含有一個或一個以上識別8個核苷酸的識別位點的酶的限制位點。這8個核苷酸可能是連續的或可能被一個或一個以上其他核苷酸(例如，1-10個核苷酸)隔開，這其他核苷酸不被特異性識別，即使間隔對識別來說可能是必不可少的。舉例來說，在某些實施例中，酶在XXXXNNNNNXXXX內切害ij，其中N代表任何核苷酸且X代表任何特異性核苷酸(即，X各自獨立選擇)。這些位點會是有利的，因為其允許僅使用一種酶通過在插入的5'端和3'端處具有不同的5個核苷酸序列進行定向克隆。在一些實施例中，載體含有一個或一個以上SfiI限制位點，其在位點GGCCNNNNNGGCC內切割。這一載體可以直線或環形形式提供。也可提供裂解載體的限制酶。可包括進行連接的試劑，例如連接酶、連接酶緩衝液等。試劑盒內或試劑盒上可存在標識符，例如條形碼、射頻ID標記等。出於質量控制、庫存控制、跟蹤、工作站之間的移動等的目的，可使用標識符(例如)唯一地鑑別試劑盒。試劑盒通常將包括一個或一個以上容器，如此某些個別試劑可單獨安置。試劑盒也可包括以相對封閉限制裝入個別容器以進行商業銷售的構件，例如塑料箱，其中可裝入說明書、諸如泡沫聚苯乙烯(styrofoam)的包裝材料等。編碼抗炭疽抗原的人類單克隆抗體和分離重鏈和輕鏈的核苷酸序列如實例1中更詳細地描述，使用表1中所列的引物分離編碼兩種不同人類單克隆抗體(humanmonoclonalantibody,huMAb)的y重鏈和k輕鏈的cDNA序列。分離這些cDNA是本發明的寡核苷酸引物的用途的例示。一個huMAb與炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)多肽(稱為PA-1)的域4特異性結合。另一個huMAb與炭疽芽孢桿菌致死因子(LF)多肽(稱為LF-1)特異性結合。炭疽芽孢桿菌是炭疽的病原體。PA和LF在細菌發病機理中和免疫反應中的作用在所屬領域中是熟知的。從融合瘤細胞系中分離cDNA序列，所述融合瘤細胞系是通過使己接收炭疽接種疫苗的個體的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合且使用標準方法篩選對炭疽芽孢桿菌具有特異性的抗體獲得。本發明提供分離核酸，其包含PA-1huMAbk輕鏈cDNA的DNA序列(SEQIDNO:45)、PA-1huMAby重鏈cDNA的DNA序歹lJ(SEQIDNO:47)、LF-1huMAbK輕鏈cDNA的DNA序列(SEQIDNO:49)或LF-1huMAb丫重鏈cDNA的DNA序列(SEQIDNO:51)。本發明也提供相應RNA序列，其中T經U置換。本發明也提供由SEQIDNO:45、47、49或51中的任一個所編碼的分離多肽。這些多肽的胺基酸序列以SEQIDNO:46、48、50和52闡明。本發明也提供與SEQIDNO:46、48、50或52的多肽為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更高一致性的分離多肽。本發明也提供抗體組合物，其中SEQIDNO:45、47、49或51中的一個或一個以上表達於不為融合瘤或人類的表達系統中。PA-1huMAbk輕鏈cDNA的DNA序歹ij:5'-ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACCTGGCCAGGCTCCCAGCCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGCCAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGATATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCTCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG-3，(SEQIDNO:45)PA-1huMAbK輕鏈的胺基酸序列:MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSYSSLAWYQQKPGQAPSLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGPDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGNSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD卿KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:46)PA-1huMAbk輕鏈的CDR序列以粗體描繪，且對應於SEQIDNO:46的胺基酸殘基50-61(PA-1CDR1)、胺基酸殘基77-83(PA-1CDR2)，和和胺基酸殘基116-124(PA-1CDR3)。分離的各CDR序列由以下各者組成PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59)PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60)PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)PA-1huMAby重鏈cDNA的DNA序列5'-TTTGCAAAGAGGGGGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCTTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA(JGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGCJGCACCCAGACCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT(CCCAGCACCT(5AACTCCTGGGGGGTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA(3ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC(KJCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA-3'(SEQIDNO:47)PA-1huMAbY重鏈的胺基酸序列MDWIWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNAIQWVRQAPGQRLEWVGWINGGDGNTKYSQKFQGRVTISRDISASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHRLQRGGFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS聰SGAITSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSOKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKJPTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP正KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM旭ALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:48)PA-1huMAby重鏈的CDR序列以粗體描繪，且對應於SEQIDNO:48的胺基酸殘基51-60(PA-hCDRl)、胺基酸殘基75-90(PA-hCDR2)和和胺基酸殘基124-133(PA-hCDR3)。PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62)PA陽hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63)PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)在某些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含一個或一個以上選自以下各者的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA為至少90%序列一致性的輕鏈CDRl(SEQIDNO:59);(ii)與PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;禾B(iii)與PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含兩個或兩個以上選自以下各者的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59)為至少90%序列一致性的輕鏈CDRl;(ii)與PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;和(iii)與PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與PA-lCDRl:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59)為至少卯％序列一致性的輕鏈CDRl;(ii)與PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;禾B(iii)與PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。進一步提供編碼前述抗體或片段序列的核酸組合物。在某些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含一個或一個以上選自以下各者的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)與GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62)PA-hCDRl為至少90%序列一致性的重鏈CDRl;(ii)與PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(iii)與PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3,且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含兩個或兩個以上選自以下各者的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)與PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62)為至少90%序列一致性的重鏈CDRl;(ii)與PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;禾卩(iii)與PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)與PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62)為至少90%序列一致性的重鏈CDR1;(ii)與PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;禾口(iii)與PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)為至少卯％序列一致性的重鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。進一步提供編碼前述抗體或片段序列的核酸組合物。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;禾B(iii)與PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3;和三個由以下各者組成的重鏈互補決定區(CDR):(i)與PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62)為至少90%序列一致性的重鏈CDRl;(ii)與PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(iii)與PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)為至少90免序列一致性的重鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在某些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含一個或一個以上選自以下各者的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)輕鏈PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59);(ii)輕鏈PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60);和(iii)輕鏈PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61),且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含兩個或兩個以上選自以下各者的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)輕鏈PA-lCDRl:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59);(ii)輕鏈PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60);禾Q(iii)輕鏈PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)輕鏈PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59);(ii)輕鏈PA-1CDR2:GASS女AT(SEQIDNO:60);和(iii)輕鏈PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。進一步提供編碼前述抗體或片段序列的核酸組合物。在某些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含一個或一個以上選自以下各者的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)重鏈PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62);(ii)重鏈PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63);禾卩(iii)重鏈PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含兩個或兩個以上選自以下各者的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)重鏈PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62);(ii)重鏈PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63);和(iii)重鏈PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)重鏈PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62);(ii)重鏈PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63);和(iii)重鏈PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。進一步提供編碼前述抗體或片段序列的核酸組合物。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)輕鏈PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59);(ii)輕鏈PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60);禾口(iii)輕鏈PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61);和三個由以下各者組成的重鏈互補決定區(CDR):(i)重鏈PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62);(ii)重鏈PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63);禾卩(iii)重鏈PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。在某些實施例中，PA-1抗體功能片段是Fv、Fab、F(ab)2或scFV功能片段中的任一個。LF-1huMAbk輕鏈cDNA的DNA序列AGATGCTGCAACGTATTACTCTCATCAGAGTAGTAGTTTACCTCTCACTTTCGGCGGAGGTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACACJTGGAAQGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQIDNO:49)LF-lhuMAbK輕鏈的胺基酸序歹iJ:MLPSQLIGFLLLWVPASRGEIVLTQSPDFQSVSPKEKVTITCRASQSVGSSLHWYQQKPDQSPKIXIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLETEDAATYYCHQSSSLPLTFCJGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT石QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:50)LF-lhuMAbK輕鏈的CDR序列以粗體描繪且對應於SEQIDNO:50的胺基酸殘基51-60(LF-1CDR1)、胺基酸殘基75-90(LF-1CDR2)和和胺基酸殘基124-133(LF-ICDR3)。LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65)LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66)LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)LF-lh函Aby重鏈cDNA的DNA序歹ij:ATGCJAGTTGGGGCTGTGCTGGCTTTTTCTTCJTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCC5GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGCAACTGGTACGTCiGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGACJCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQIDNO:51)LF-lhuMAbY重鏈的胺基酸序列-MEL(LCWLFLVAILKGVQCEVQIXESGGGLVQPGGSLRLSCSGSGFMFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGTTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYMQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVYGRLGGSDYWGQGTLVTVSSASTKQPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS額SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLQTQTYICNVNHKPSNITCVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEIXGGPSVFLFPPKPKPTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP孤TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:52)LF-lhuMAby重鏈的CDR序列以粗體描繪，且對應於SEQIDNO:52的胺基酸殘基51-60(LF-hCDRl)、胺基酸殘基75-90(LF-hCDR2)和和胺基酸殘基124-133(LF-hCDR3)。LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68)LF匿hCDR2:GISGSGGTTNYADSYKG(SEQIDNO:69)LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)在某些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含一個或一個以上選自以下各者的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;禾卩(iii)與LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含兩個或兩個以上選自以下各者的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2:和(iii)與LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;禾口(iii)與LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。進一步提供編碼前述抗體或片段序列的核酸組合物。在某些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含一個或一個以上選自以下各者的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)與LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68)為至少卯％序列一致性的重鏈CDR1;(ii)與LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;禾口(iii)與LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含兩個或兩個以上選自以下各者的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)與LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68)為至少90%序列一致性的重鏈CDR1;(ii)與LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(iii)與LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)為至少90呢序列一致性的重鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)與LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68)為至少90%序列一致性的重鏈CDR1;(ii)與LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(iii)與LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。進一步提供編碼前述抗體或片段序列的核酸組合物。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;和(iii)與LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3，和三個由以下各者組成的重鏈互補決定區(CDR):(i)與LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68)為至少90%序列一致性的重鏈CDRl;(ii)與LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(iii)與LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)為至少90呢序列一致性的重鏈CDR3，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在某些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含一個或一個以上選自以下各者的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)輕鏈LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65);(ii)輕鏈LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66);和(iii)輕鏈LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含兩個或兩個以上選自以下各者的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)輕鏈LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65);(ii)輕鏈LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66);和(iii)輕鏈LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)輕鏈LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65);(ii)輕鏈LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66);和(iii)輕鏈LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)，且抗體或其功能片段可與炭疸芽孢桿菌致死因子特異性結合。進一步提供編碼前述抗體或片段序列的核酸組合物。在某些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含一個或一個以上選自以下各者的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)重鏈LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68);(ii)重鏈LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69);禾卩(iii)重鏈LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含兩個或兩個以上選自以下各者的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)重鏈LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68);(ii)重鏈LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69);和(iii)重鏈LF陽hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(i)重鏈LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68);(ii)重鏈LF匿hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69);禾口(iii)重鏈LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。進一步提供編碼前述抗體或片段序列的核酸組合物。在一些實施例中，提供分離抗體或其功能片段，其中抗體包含三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)輕鏈LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65);(ii)輕鏈LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66);和(iii)輕鏈LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67);和三個由以下各者組成的重鏈互補決定區(CDR):(i)重鏈LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68);(ii)重鏈LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69);禾B(iii)重鏈LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)，且抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。在某些實施例中，LF-l抗體功能片段是Fv、Fab、F(ab)2或scFV功能片段中的任何一個。抗體組合物和傳送工具和方法
技術領域：
：本發明提供包含一種或一種以上根據本發明方法製備的抗體的抗體組合物。"抗體組合物"指包含一種或一種以上抗體或其功能片段和視情況抗體純化過程中未移除的任何製造系統組分的組合物。因此，應了解，包含通過將使用本發明的寡核苷酸引物分離的cDNA表達於所選擇的表達系統(例如，基於植物的表達系統)中製備的抗體或其功能片段的第一抗體組合物可能與包含相同抗體的第二抗體組合物不同，其中第二抗體組合物使用不同表達系統製備。舉例來說，包含由維持在組織培養物中的融合瘤產生的抗體的抗體組合物可含有可見於組織培養基中的殘餘組分，而使用基於植物的表達系統產生的抗體通常將不含這些組分中的某些組分。因此，在某些實施例中，本發明的抗體組合物不同於含有相同抗體的其他抗體組合物。在一些實施例中，在適於投與個體以達到診斷和/或治療目的的醫藥組合物中提供一種或一種以上根據本發明方法製備的抗體，其中"治療目的"理解為包括預防性目的(即，在出現疾病或病狀的任何病徵或症狀之前投與)和治療目的(即，在出現疾病或病狀的一種或一種以上病徵或症狀之後投與)。本發明的抗體可(但不限於)用於診斷、預防和/或治療傳染病(例如，細菌性、病毒性、真菌性或寄生蟲性疾病)；癌症(這一術語涵蓋癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓發育不良綜合症、良性腫瘤等)；以不希望的血管生成、移植排斥反應、移植對宿主疾病等為特徵的發炎性病狀、病症。本發明抗體的其他應用包括不期望細胞(諸如癌細胞、淋巴細胞等)的活體外免疫耗竭(immunodepletion)。也可使用抗體以使其他藥劑(例如，診斷劑或治療劑)靶向體內表達抗體所識別抗原的位點。例如抗體的大體上純的製劑的合適製劑可與醫藥學上可接受的載劑、稀釋劑、溶劑等組合以產生適當的醫藥組合物。因此，本發明提供投與個體的多種醫藥學上可接受的組合物，其包含(i)抗體；和(ii)醫藥學上可接受的載劑、佐劑或媒劑。應理解，當將本發明的醫藥組合物投與個體時，其優選投與一段時間且以足以治療或預防投與其以治療或預防的疾病或病狀的量投與。在本發明的各實施例中，通過任何合適的投藥途徑向個體投與有效量的醫藥組合物，所述投藥途徑包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、吸入、導管、眼內、口服、直腸、皮內、塗敷於皮膚等。本發明組合物可經調配以通過任何可用途徑傳送，這些途徑包括(但不限於)非經腸、口服、吸入到肺、鼻用、支氣管、經眼、經皮(局部)、黏膜、直腸和陰道途徑。如本文所使用的術語"非經腸"包括皮下、靜脈內、肌肉內、關節內、滑液內、胸骨內、鞘內、肝內、器官內和顱內注射或輸注技術。術語"醫藥學上可接受的載劑、佐劑或媒劑"指不破壞與之調配的化合物的藥理學活性的無毒載劑、佐劑或媒劑。本發明的組合物中可使用的醫藥學上可接受的載劑、佐劑或媒劑包括(但不限於)離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白，諸如人類血清白蛋白、緩衝物質，諸如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質，諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素基物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧化丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。可包括與醫藥投藥相容的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等。也可將例如具有獨立抵抗待治療的疾病或臨床病狀的活性的化合物或增強化合物活性的化合物的補充活性化合物併入組合物中。本發明的化合物的醫藥學上可接受的鹽包括那些衍生自醫藥學上可接受的無機及有機的酸和鹼的鹽。合適的酸性鹽的實例包括乙酸鹽、己二酸鹽、褐藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、擰檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽(dighiconate)、十二垸基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽(fumarate)、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、羥乙酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽(maleate)、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽(palmoate)、膠質酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。諸如草酸的其他酸，雖然其本身不為醫藥學上可接受，但可用於製備適用作獲得本發明的化合物和其醫藥學上可接受的酸加成鹽的中間體的鹽。衍生自適當鹼的鹽包括鹼金屬(例如，鈉和鉀)鹽、鹼土金屬(例如，鎂)鹽、銨鹽和N+(Cl-4烷基)4鹽。本發明還預想本文所揭示的化合物的任何鹼性含氮基團的季銨化。由所述季銨化作用可獲得水或油可溶或可分散產物。調配醫藥組合物以使其與預定的投藥途徑相容。用於非經腸(例如，靜脈內)、肌肉內、真皮內或皮下施用的溶液或懸浮液可包括下列組分無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮髮油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝液，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和調節張力的試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用諸如鹽酸或氫氧化鈉的酸或鹼調節pH值。可將非經腸製劑裝入由玻璃或塑料製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。適於注射使用的醫藥組合物通常包括無菌水性溶液(其中水可溶)或分散液和用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的無菌散劑。對於靜脈內投藥來說，合適的載劑包括生理鹽水、抑菌水、CremophorELtm(BASF,Parsippany，NJ)、磷酸鹽緩衝鹽水(phosphatebufferedsaline,PBS)或林格氏溶液(Ringer'ssolution)。通常使用無菌不揮髮油作為溶劑或懸浮介質。出於此目的，可使用任何溫和的不揮髮油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。諸如油酸和其甘油酯衍生物的脂肪酸適用於製備可注射劑，因為其為天然的醫藥學上可接受的油類，諸如橄欖或蓖麻油，特別是其聚乙氧基化的形式。這些油溶液或懸浮液也可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，諸如羧甲基纖維素或調配醫藥學上可接受的劑型(包括乳液和懸浮液)中通常使用的類似分散劑。出於調配的目的，也可使用其他常用表面活性劑，諸如製造醫藥學上可接受的固體、液體或其他劑型通常使用的吐溫類(Tweens)、司盤類(Spans)和其他乳化劑或生物可用性增強劑。在所有情況下，如果可能，組合物應為無菌的，且應達到容易注射的流動程度。優選醫藥配方在製造和存儲條件下是穩定的且必須防腐以免受諸如細菌和真菌的微生物的汙染作用。通常，相關載劑可以是溶劑或分散介質，含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適混合物。(例如)通過利用諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下維持所需的粒度和通過利用表面活性劑，可維持適當的流動性。通過各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等可達成對微生物作用的預防。在許多情況下，將優選在組合物中包括等張劑(例如糖)、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來引起。口服組合物的延長吸收可通過各種包括膠囊化的方式達成。無菌可注射溶液可通過將所需量的活性化合物併入根據需要具有以上所列舉的一種成分或其組合的適當溶劑中，接著過濾殺菌來製備。注射用溶液優選不含內毒素。分散液通常通過將活性化合物併入含有鹼性分散介質和來自以上所列舉的那些成分的所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液的無菌散劑的情況下，優選製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，此由其先前的無菌過濾溶液產生活性成分加任何其他想要成分的散劑。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或食用載劑。出於口服治療投藥的目的，可使活性化合物合併有賦形劑且以片劑、含片或膠囊(例如，明膠膠囊)的形式使用。口服組合物也可使用流體載劑製備而用作嗽口水。可包括醫藥學上相容性的粘合劑和/或佐劑物質作為組合物的部分。片劑、丸劑、膠囊、含片等可含有任何下列成分或具有類似性質的化合物粘合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，硬脂酸鎂或硬酯酸鹽類(Sterotes);助流劑，諸如膠狀二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。經口傳送配方可有利地合併有改進在胃腸道中的穩定性和/或增強吸收的試劑。對於吸入投藥來說，本發明組合物優選從含有合適的推進劑(例如，諸如二氧化碳的氣體)的加壓容器或分配器或噴霧器中以氣霧劑噴霧的形式傳送。可使用液體或無水氣霧劑(例如，無水散劑、多孔大粒子等)。本發明還涵蓋使用鼻用噴霧傳送組合物。對於局部施用來說，醫藥學上可接受的組合物可以含有懸浮或溶解於一種或一種以上載劑中的活性組分的合適軟膏形式調配。用於局部投與本發明的化合物的載劑包括(但不限於)礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯化合物、乳化蠟和水。或者，醫藥學上可接受的組合物可以含有懸浮或溶解於一種或一種以上醫藥學上可接受的載劑中的活性組分的合適洗劑或乳膏形式調配。合適的載劑包括(但不限於)礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、十六酯蠟、十六醇十八醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。對於局部傳送到眼睛來說，醫藥學上可接受的組合物可調配為於等張的pH值調節無菌生理鹽水的微粒化懸浮液或優選為於等張的pH值調節無菌生理鹽水中的溶液，含有或不含諸如苯甲基氯化銨的防腐劑。或者，對於眼睛使用來說，醫藥學上可接受的組合物可以諸如凡士林的軟膏形式調配。本發明的醫藥學上可接受的組合物也可通過鼻用氣霧劑或吸入投與。這些組合物可根據醫藥配方領域熟知的技術製備且可使用苯甲醇或其他合適的防腐劑、增強生物可用性的吸收促進劑、碳氟化合物和/或其他常規溶解劑或分散劑製備為於生理鹽水中的溶液形式。也可通過黏膜或經皮方式全身性投藥。對於黏膜或經皮投藥來說，在調配物中使用適於滲透障壁的滲透劑。這些滲透劑通常在所屬領域中是已知的且對於黏膜投藥來說，包括(例如)洗滌劑、膽鹽和夫西地酸(fusidicacid)衍生物。黏膜投藥可通過使用鼻用噴霧或栓劑來實現。對於經皮投藥來說，可將抗體調配為如所屬領域中通常已知的軟膏、油膏、凝膠或乳膏。抗體組合物也可以用於直腸傳送的栓劑(例如，與諸如可可油和其他甘油酯的常規栓劑基質一起)或保留灌腸劑形式製備。除上述試劑外，在本發明的某些實施例中，抗體組合物用將保護抗體以免從身體快速排出的載劑製備，諸如控釋配方，包括植入物和微囊化傳送系統。可使用生物可降解的生物相容聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚醚和聚乳酸。製備這些配方的方法對所屬領域的技術人員來說應顯而易見。某些這種物質也可在商業上從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc.獲得。也可使用脂質懸浮液作為醫藥學上可接受的載劑。這些可根據所屬領域的技術人員已知的方法製備，例如如美國專利第4,522,811號和本文所列的其他參考文獻所述。已描述脂質體，包括耙脂質體(例如，抗體靶脂質體)和聚乙二醇化脂質體(HansenCB等人，fi!'oc/n'mS!'op/iw1239(2):133-44，1995;TorchilinVP等人，￡/。c/>tifi—/z;^4cto,1511(2):397-411，2001;IshidaT等人，L"f.460(1):129-33，1999)。所屬領域的技術人員應了解，為製備控釋配方、植入物等所選擇的物質和方法應使得保留抗體的活性。舉例來說，可能會希望避免過度加熱諸如抗體的多肽，過度加熱可導致變性和活性損失。為便於投藥和使劑量均一，以單位劑型調配口服或非經腸組合物通常是有利的。如本文所使用的單位劑型是指對於待治療的個體來說適合作為單一劑量的物理上離散單元；各單元含有經計算產生想要治療作用的預定數量的抗體以及所需的醫藥載劑。可由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中確定這些組合物的毒性和治療功效，例如，確定LD5Q(使50%的群體致死的劑量)和ED5Q(治療上對50%的群體有效的劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比率是治療指數，且其可表示為比率LD5。/ED50。展示高治療指數的組合物優選。雖然可使用展示毒性副作用的組合物，但應小心設計使這些組合物耙向被感染組織的位點的傳送系統以使對未被傳染細胞的潛在損害最小且從而減小副作用。在調配用於人類的劑量範圍中可使用由細胞培養物分析和動物研究所獲得的數據。劑量優選位於包括具有極小毒性或沒有毒性的ED5q的循環濃度的範圍內。劑量可在視所使用的劑型和所利用的投藥途徑而定的範圍內變化。對於本發明的方法中所使用的任何抗體或其他化合物來說，治療有效劑量最初可由細胞培養物分析估算。可在動物模型中調配劑量以獲得包括細胞培養物中所確定的ED5o的循環血漿濃度範圍。這些信息可用於更精確地確定人類中適用的劑量。可(例如)通過高效液相色譜測量血漿中的含量。醫藥組合物的治療有效量通常在每公斤體重約0.001mg到100mg、優選每公斤體重約0.01mg到25mg、更優選每公斤體重約0.1mg到20mg且甚至更優選每公斤體重約1mg至lj10mg、2mg歪U9mg、3mg至lj8mg、4mg至U7mg或5mg至[J6mg的範圍內。醫藥組合物可根據需要以各種間隔和經不同時段投與，例如一天多次，每天一次、隔天一次、每周一次持續約1周到10周、2周到8周、約3周到7周、約4周、5周或6周等。所屬領域的技術人員應了解，某些因子可影響有效治療個體所需的劑量和時限，包括(但不限於)疾病或病症的嚴重程度、先前治療、個體的一般健康狀況和/或年齡和所存在的其他疾病。用本發明組合物治療個體通常可包括單一治療，或在許多情況下，可包括一系列治療。應了解，可使用一定範圍的不同劑量組合(即，兩種或兩種以上抗體或一種或一種以上抗體和一種或一種以上其他活性劑的劑量)。例示性劑量包括每公斤個體或樣品重量的抗體毫克量或微克量(例如，每公斤約1微克到每公斤約500毫克、每公斤約100微克到每公斤約5毫克或每公斤約1微克到每公斤約50微克)。對於局部投藥(例如，鼻內)來說，可使用比這些劑量小得多的劑量。更進一步了解，適當的劑量取決於藥劑的效能且可視情況隨特定接受者而調整，例如通過投藥遞增劑量直到達成預定的想要的反應。應理解，對任何特定個體來說，特定劑量可取決於多種因素，包括所使用的特定化合物的活性；個體的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；投藥時間；投藥途徑；分泌速率；任何藥物組合和待調節的表達或活性的程度。本發明進一步提供包含兩種或兩種以上本發明的抗體和視情況一種或一種以上其他活性劑的醫藥組合物。實例下列實例描述從產生與炭疽芽孢桿菌PA或LF蛋白質特異性結合的抗體的人類融合瘤細胞系克隆的cDNA。從由從用許可炭疽疫苗免疫的人類患者分離的細胞產生的融合瘤細胞系分離特異性識別PA(本文稱為PA)或LF(本文稱為LF)的單克隆抗體的人類重鏈和輕鏈的cDNA。頻/,崖會詹庠潔礙乂郝克贗龍鋪c應這一實例描述使用表1中所列的某種寡核苷酸引物分離編碼人類單克隆抗體的cDNA。根據製造商的指南使用所有試劑盒。從融合瘤細胞系純化RNA所有RNA都是使用RNeasyMiniKit(Qiagen)從任何給定融合瘤細胞系的105個細胞中純化。在50)!l水中洗脫RNA(不計算產率)且各RT-PCR反應中使用5pl。逆轉錄-PCR用於RT-PCR的引物列於表1中。用SuperscriptOne-StepRT-PCR以PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen)進行RT-PCR。為高效靶向任何給定重鏈或輕鏈序列中的所有可能的可變區，各RT-PCR反應使用引物的組合，且同時進行數個RT-PCR反應來擴增各抗體基因。對重鏈來說，在一個反應中，使2hM引物VG1+7短、VG2短和VG3短中的每一個與2pMy鏈恆定區短(CG短)引物組合，且在第二反應中，使2pM引物VG4-短、VG5-短和VG6-短中的每一個與2inMy鏈恆定區短(CG-短)引物組合。然後使用QiaexII(Qiagen)純化任何產物，且如果產物來自第一初始反應，那麼用2pM引物VG1、VG2和VG3的每一個與2pM引物CG再擴增，或如果產物來自第二RT-PCR反應，那麼用2nM弓|物VG4、VG5和VG6中的每一個與2[iM引物CG再擴增，使用PlatinumPCRS叩erMixHighFidelity(Invitrogen)引入不同的5'和3'SfiI限制位點。對於輕鏈來說，RT-PCR產物產率一直足以使產物立即亞克隆，從而消除對短引物的初始RT-PCR反應的需要。實情為，使2^M三個可變區引物中的每一個與2pM恆定區引物(表l)組合，產生人輕鏈的三個獨立反應和K輕鏈的兩個獨立的反應。反應尤其含有2個或3個可變區引物，如下CK+VK1、2+1.8禾Q3CK+VK4禾口5CL+VL1、2和3CL+VL4、5禾卩6+9CL+VL7禾口10+8應了解，可能已使用其他組合。PCR循環條件由Krebber，A.,Bornhauser,S.，Burmester，J.，Honegger,A.,Willuda，J.,Bosshard，H.R.禾口Pluckthun,A.(1997).Reliablecloningoffunctionalantibodyvariabledomainsfromhybridomasandspleencellrepertoiresemployingareengineeredphagedisplaysystem.//mm訓WAf"/u心201，35-55改編而來。對於RT-PCR，循環條件如下45。C下30分鐘，94。C2分鐘，將94。C1分鐘、63。C下30秒、58。C下50秒、72。C下3分鐘循環7次，且將94。C下1分鐘、63'C下1min和72。C下3分鐘循環33次，接著72°C下7分鐘。對於常規PCR(非RT-PCR)，省略45'C下30分鐘和94'C下2分鐘的起始步驟。將擴增產物克隆到雙元載體pBISfi中，pBISfi的構造描述於實例2中。實^2;賴遣載體pBJS/i這一實例描述修飾雙元載體pBI121以促進其在植物中表達抗體的用途。首先，如下使載體pBIl21的11031鹼基對處的內部SfiI位點突變用SfiI消化載體且使用Klenow填充所得單鏈懸臂且再連接所得鈍端。為產生5'唯一性Sfil位點，使寡核苷酸BamSfil(5'-GATCCGGCCCAGCCGGCCG-3';SEQIDNO:53)與BamSfi2(5'-GATCCGGCCGGCTGGGCCG-3';SEQIDNO:54)彼此粘接且連接到載體pBI121(缺乏內部SfiI位點)的BamHI位點。類似地，使寡核苷酸SacSfi1(5'-GCCTCGGGGGCCGAGCT-3';SEQIDNO:55)與SacSfi2(5'-GCCCCCGAGGCCGAGCT-3';SEQIDNO:56)粘接且連接到pBI121(缺乏內部SfiI位點)的SacI位點產生3'唯一性SfiI位點。實翔L使箱^屍A拔沐置舒遊cDiV4,變使用Irwitrogen的QeneTailor試劑盒根據製造商的建議使編碼PAy鏈的cDNA突變以改變PAY鏈的位置318處的N-糖基化位點。使用如下突變引物5'-ccgcgggaggagcagtacCAAagcacgtaccgt-3'(SEQIDNO:57)。反向弓l物是-gtactgctcctcccgcggctttgtcttggca(SEQIDNO:58)。作為突變的結果，AAC密碼子被CAA密碼子置換，產生Asn->Gln的變異。實激心在潛欽W產主磬基眾浙求瀞基必/M貧沐在pBISfil的35S啟動子下，用攜帶輕鏈或重鏈cDNA的農桿菌培養物(Agro^"er^Zculture)的1:1混合物農桿菌滲入後從菸草(Mco"a"a6e"Aam!'a"a)植物的葉子中純化糖基化和非糖基化PA抗體(分別為PA和PANG)。使用蛋白質A和T凝膠色譜法純化抗體且使用SDS-PAGE比較抗體。圖1展示凝膠圖像，其清楚地展示歸因於缺乏糖基化PANG重鏈的電泳遷移率的差，S卩，因為PANG重鏈較輕，所以其比PA重鏈遷移得快。西方印跡(Westernblot)和ELISA分析證實PA、PANG和LF抗體分別對PA和LF具有特異性結合活性，表明在植物中產生並不減弱抗體結合特異性。實銀5.*犬嚴W貧M布貧LF乂類卓克靨貧琳遊^g^^宛用50^g植物產生的PA、植物產生的PANG或植物產生的LF腹膜內注射雄性Fischer大鼠。注射前以及注射後2小時和第1、2、3、4、5、10、15和20天時採集血清樣品。用PA或LF特異性結合ELISA分析血清。植物產生的PA和PANG展示類似的半衰期，而與兩個植物產生的PA抗體相比，LF抗體具有稍低的半衰期。頻"動教，好秀根據Beedham和其同事的方法測定植物產生的PA保護A/J小鼠以免受炭疽芽孢桿菌史特內菌株(Stemestrain)的孢子的激發的能力。通過腹膜內途徑給予5隻小鼠的組存於PBS中的180嗎植物產生的PAmAb。對照小鼠接受PBS。被動免疫後2.5小時，動物接受炭疽芽孢桿菌孢子，劑量為於O.lmLPBS中的1乂104個孢子(約30半致死劑量)。激發之後，每日監測動物持續14天從而為發病率或死亡率提供證據。接受植物產生的mAb的動物不顯示疾病症狀，仍健康且倖免於激發，而所有對照動物出現疾病且在激發後3天內死亡。僅僅使用常規實驗，所屬領域的技術人員應認識到或能夠探知本文所述的本發明的特定實施例的許多等價物。本發明的範疇不打算受上述描述限制，而是如附加權利要求書中所述。在權利要求書中，除非上下文明確指示相反意思，否則諸如"一"和"所述"的用語可能意謂一個或一個以上。除非上下文明確指示相反意思，否則包括群組的一個或一個以上成員之間的"或"的權利要求或描述視為滿足在給定產物或過程中存在、使用或與之相關的一個、一個以上或所有群組成員的情況。此外，應理解本發明涵蓋所有變化、組合和排列，其中一個或一個以上所列權利要求的一個或一個以上限定、要素、從句、描述性術語等引入到另一權利要求中。具體來說，依賴於另一權利要求的任何權利要求可經修飾以包括依賴於同一基礎權利要求的任何其他權利要求中可見的一個或一個以上限定。另外，應理解，屬於現有技術的本發明的任何特定實施例可能明確地排除在權利要求書之外。因為認為這些實施例為所屬領域的技術人員所知，所以即使在本文中沒有明確陳述，其也可能被排除。舉例來說，可從權利要求書中排除任何特定的寡核苷酸、cDNA、核酸或抗體。權利要求1.一種分離抗體或其功能片段，其包含(a)一個或一個以上選自由以下各者組成的群組的輕鏈(LC)互補決定區(CDR)(i)與PA-1CDR1RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59)為至少90％序列一致性的輕鏈CDR1；(ii)與PA-1CDR2GASSRAT(SEQIDNO:60)為至少90％序列一致性的輕鏈CDR2；和(iii)與PA-1CDR3QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)為至少90％序列一致性的輕鏈CDR3；和(b)一個或一個以上選自由以下各者組成的群組的重鏈(HC)互補決定區(CDR)(iv)與PA-hCDR1GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62)為至少90％序列一致性的重鏈CDR1；(v)與PA-hCDR2WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63)為至少90％序列一致性的重鏈CDR2；和(vi)與PA-hCDR3HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)為至少90％序列一致性的重鏈CDR3；其中所述抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)保護性抗原特異性結合。2.根據權利要求l所述的抗體或功能片段，其包含(a)兩個或兩個以上選自由以下各者組成的群組的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與PA-ICDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;(iii)與PA-1CDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3:和(b)兩個或兩個以上選自由以下各者組成的群組的重鏈互補決定區(CDR):(iv)與PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62)為至少90%序列-致性的重鏈CDR1:(v)與PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(vi)與PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3;其中所述抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。3.根據權利要求1所述的抗體或功能片段，其包含(a)三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與PA-1CDR1:RASQSVSYSSLA(SEQIDNO:59)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與PA-1CDR2:GASSRAT(SEQIDNO:60)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;禾卩(iii)與PA-ICDR3:QHYGNSPYT(SEQIDNO:61)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3:和(b)三個由以下各者組成的重鏈互補決定區(CDR):(iv)與PA-hCDRl:GYTFTSNAIQ(SEQIDNO:62)為至少90%序列一致性的重鏈CDR1;(v)與PA-hCDR2:WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQIDNO:63)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;禾口(vi)與PA-hCDR3:HRLQRGGFDP(SEQIDNO:64)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3;其中所述抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌保護性抗原特異性結合。4.一種分離抗體或其功能片段，其包含(a)—個或一個以上選自由以下各者組成的群組的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65)為至少卯免序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;和(iii)與LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3;和(b)—個或一個以上選自由以下各者組成的群組的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(iv)與LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68)為至少90%序列一致性的重鏈CDR1;(v)與LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(vi)與LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3;其中所述抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。5.根據權利要求4所述的抗體或其功能片段，其包含(a)兩個或兩個以上選自由以下各者組成的群組的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;禾口(iii)與LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3;和(b)兩個或兩個以上選自由以下各者組成的群組的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(iv)與LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68)為至少90%序列一致性的重鏈CDR1;(v)與LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(vi)與LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3;其中所述抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。6.根據權利要求4所述的抗體或其功能片段，其包含(a)三個由以下各者組成的輕鏈(LC)互補決定區(CDR):(i)與LF-1CDR1:RASQSVGSSLH(SEQIDNO:65)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR1;(ii)與LF-1CDR2:YASQSFS(SEQIDNO:66)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR2;禾口(iii)與LF-1CDR3:HQSSSLPLT(SEQIDNO:67)為至少90%序列一致性的輕鏈CDR3;和(b)三個由以下各者組成的重鏈(HC)互補決定區(CDR):(iv)與LF-hCDRl:GFMFSSYAMS(SEQIDNO:68)為至少90%序列一致性的重鏈CDR1;(v)與LF-hCDR2:GISGSGGTTNYADSVKG(SEQIDNO:69)為至少90%序列一致性的重鏈CDR2;和(vi)與LF-hCDR3:DGVYGRLGGSDY(SEQIDNO:70)為至少90%序列一致性的重鏈CDR3;其中所述抗體或其功能片段可與炭疽芽孢桿菌致死因子特異性結合。7.根據權利要求1-3中任一權利要求所述的抗體或其功能片段，其中所述功能片段選自由Fv、Fab、F(ab)2和scFV組成的群組。8.—種核酸，其編碼根據權利要求1所述的抗體或功能片段。9.一種組合物，其包含根據權利要求1所述的抗體或功能片段和醫藥學上可接受的載劑。10.根據權利要求4所述的抗體或其功能片段，其中所述功能片段選自由Fv、Fab、F(ab)2和scFV組成的群組。11.一種核酸，其編碼根據權利要求4所述的抗體或功能片段。12.—種組合物，其包含根據權利要求4所述的抗體或功能片段和醫藥學上可接受的載劑。13.—種分離多肽，其包含由SEQIDNO:46、48、50或52中的任一個組成的多肽序歹ij。14.一種分離多肽，其由SEQIDNO:46、48、50或52中的任一個的多肽序列組成。15.根據權利要求13或權利要求14所述的多肽，其中所述多肽未經糖基化。16.—種分離核酸，其編碼根據權利要求13所述的多肽。17.根據權利要求16所述的分離核酸，其中所述核酸序列不是天然存在的序列。18.—種寡核苷酸引物，其序列由SEQIDNO:1-44中的任一個組成或包含SEQIDNO:1-44中的任一個。19.一種引物混合物，其含有至少兩種根據權利要求18所述的寡核苷酸引物。20.根據權利要求19所述的引物混合物，其含有至少兩種引物，其中所述至少兩種引物用於擴增反應中以擴增抗體重鏈或輕鏈。21.—種核酸，其是使用根據權利要求18所述的引物從抗體產生細胞或細胞系擴增。22.—種表達載體、細胞、轉基因動物或轉基因植物，其含有根據權利要求21所述的核酸。23.—種植物病毒載體或複製子，其包含根據權利要求21所述的核酸。24.—種產生抗體鏈的方法，其包含將根據權利要求21所述的核酸在合適的表達系統中表達。25.根據權利要求24所述的方法，其中所述表達系統是基於植物的表達系統。26.—種分離編碼抗體重鏈或輕鏈的核酸的方法，其包含使用一種或一種以上選自由SEQJDNO:1-44組成的群組的引物從產生所述抗體重鏈或輕鏈的細胞或細胞系擴增所述核酸。27.—種分離核酸，其包含由SEQIDNO:45、47、49或51中的任一個組成的核酸序歹ij。28.—種分離核酸，其由SEQIDNO:45、47、49或51中的任一個的核酸序列組成。29.—種表達載體，其包含根據權利要求27或權利要求28所述的核酸。30.—種宿主細胞，其包含根據權利要求29所述的表達載體。31.根據權利要求30所述的宿主細胞，其是植物細胞。32.—種產生抗體或其功能片段的方法，其包含在足以產生抗體的條件下培養根據權利要求30或權利要求31所述的宿主細胞和純化所產生的抗體。全文摘要本發明提供從諸如融合瘤的細胞或細胞系分離人類抗體cDNA的寡核苷酸。本發明也提供編碼至少一個所提供的具有與炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)保護性抗原結合的人類單克隆抗體的重鏈或輕鏈CDR的cDNA；和編碼至少一個所提供的具有與炭疽芽孢桿菌致死因子結合的人類單克隆抗體的重鏈或輕鏈CDR的cDNA。本發明進一步提供含有一個或一個以上根據本發明方法分離的cDNA的表達載體、表達一個或一個以上本發明cDNA的宿主細胞和表達一個或一個以上本發明cDNA的轉基因植物和動物。在本發明的某些實施例中，表達系統是基於植物的表達系統。本發明進一步提供包含一種或一種以上通過在合適的表達系統中表達根據本發明方法分離的cDNA產生的抗體的抗體組合物。本發明另外涵蓋含有一種或一種以上所提供組合物的試劑盒以及所提供組合物的製備和使用方法。文檔編號A61P31/04GK101378781SQ200680036136公開日2009年3月4日申請日期2006年8月3日優先權日2005年8月3日發明者安娜·赫爾,瓦季姆·梅特,維達季·尤西波夫申請人:美國弗勞恩霍夫股份有限公司