一種以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針的製作方法

2023-05-19 09:36:11

一種以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針的製作方法
【專利摘要】一種以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針，為4′-苯碸基-2,2′:6′,2′′-聯三吡啶-6,6′′-二甲胺四乙酸，其化學結構式為；所述以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針可利用順磁螢光雙功能探針與人體泛素蛋白質的連接產物，用於核磁共振的螢光光譜和順磁標記。本發明的優點是：該順磁螢光雙功能探針可與蛋白質的特定位點進行選擇性連接，而且連接具有一定剛性，只有一套順磁信號峰，而且在激發光照射下可發出明顯的金屬離子（Eu3+和Tb3+）的特徵螢光；該探針的剛性可以從核磁共振來衡量，並應用到螢光光譜和電子自旋共振中。
【專利說明】一種以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物學研究中高性能探針，特別是一種以三聯吡啶為骨架含苯碸基 的順磁螢光雙功能探針。

【背景技術】
[0002] 蛋白質的分子結構是其生物功能的基礎，因此，研究蛋白質的分子結構和動態變 化將有助於我們更深入的了解蛋白質如何行使其功能。X射線晶體衍射和高分辨核磁共振 是目前獲得高解析度蛋白質結構的兩種主要技術手段，而相對於X射線晶體衍射，核磁共 振、螢光光譜和電子自旋共振在研究蛋白質動態學方面具有非常重要的作用。另外，核磁共 振可以在溶液中研究生物大分子的空間結構和功能之間的關係，並且測定條件更加接近生 理條件，可不破壞生物大分子的結構，得到的結果更加接近實際。
[0003] 蛋白質的化學修飾提供了研究其功能和動態變化的新技術，這種技術可以廣泛應 用到核磁共振、電子順磁共振和螢光光譜的研究中，藉助小分子基團及其金屬配合物的磁 學性質和光譜特性，可以獲得大分子蛋白質的動態行為、結構變化和作用機制。但是化學修 飾蛋白質需要強調位點單一併且剛性的問題是目前順磁技術和螢光能量共振轉移研究中 亟需解決的問題，另外蛋白質-探針連結的穩定性也是研究中的關鍵問題。
[0004] 生物大分子與順磁探針定點連接以後，由於順磁效應，順磁中心附近的胺基酸殘 基的化學環境會產生較大的變化，導致其核磁共振譜峰的化學位移產生明顯變化。人們就 可以藉助採集PCS、PRE或RDC等順磁數據來研究生物大分子的結構、功能以及生物大分子 之間的相互作用，參見J；沿眉7?，2010，46: 101-112。
[0005] Nguyen等人，參見2011，50，692 - 694,將非天然胺基酸 類化合物，如圖1中化合物L-1，引入NS2B-NS3蛋白酶中，分別取代NS3中的Q86，H87和 K88,他們發現只有在H87BpyAla突變體中滴加 Co2+，才有明顯的PCS，Q86BpyAla，K88BpyAla 突變體滴加 Co2+只有PRE，這說明在這兩個位點，順磁標籤的柔性比較大。但由於L-1隻能和 過渡金屬離子配位，而在過渡金屬離子中也只有Co 2+等少數金屬離子才能測得明顯的PCS， 可得數據較少，所以在一定程度上限制了 L-1的應用。
[0006] 等k，參％ J· Am. Chem. Soc. 2009，131，14761 -14767, 報導了鑭系金屬離子螯合探針D0TA-M8,由於其骨架及臂上都增加了手性誘導基團，克服 了如圖1中化合物L-2等DOTA類似物骨架和臂的震動，參見Inorg. Chem.2W)\ 2342 - 2349,使其與鑭系金屬離子的螯合物具有單一構象，從而使D0TA-M8成為一個有效的 通過順磁標記來研究生物分子的結構與功能的探針。
[0007] Su 等人，參見泛6?·及/r. 7； 2013，19，1097-1103，報導了化合物4￥?7]\0^即 圖1中化合物L-3,它的體積小，與鑭系金屬離子有很強的結合能力，並且與鑭系金屬離子 結合後具有單一的構象，能夠與蛋白表面選擇性連接，而且連接後的產物非常穩定，可在原 位分析蛋白的結構。
[0008] 利用螢光探針與生物分子相互作用前後光譜信號的變化，人們可以在不破壞生物 分子結構與功能的條件下對生物分子的結構和生物過程進行定性及定量的研究。因此，熒 光測定術作為一種目前發展比較成熟的技術，其在生物體系研究領域也有著很好的應用前 景。雖然傳統的有機螢光探針具有合成簡單，螢光量子產率較高和易於進入細胞等優點，卻 因為它們水溶性差、Stokes位移較小、螢光壽命短以及容易被螢光背景幹擾等缺陷限制了 它們在生物體系中的應用。而鑭系螢光探針具有水溶性好、Stokes位移大、螢光壽命長以 及譜峰窄等諸多優勢，因而可以排除生理環境中螢光背景的幹擾，提高測定分析靈敏度，從 而彌補了傳統有機螢光探針的不足。
[0009] Barbara Imperiali 等人，參見7； ▲?· CXe?. 5bc. 2006，128，7346-7352,報導 了一種可用來研究蛋白質-蛋白質相互作用的含有15-20個天然胺基酸並結合有金屬離子 Tb (III)的多肽探針。藉助螢光共振能量轉移等手段，他們通過應用此探針來監測SH2區域 和不同磷酸肽之間的相互作用以及測量蛋白質-多肽的離解常數。但此探針的合成需藉助 固相合成的手段，合成難度較大。
[0010] Tetsuo Nagano等人，參見7； ▲?·泛￡麗 5bc. 2006, 128，6938-6946,報導了一系 列鑭系螢光探針，如圖1中化合物Ln-l-Ln-12,這些探針具有較長的螢光壽命，利用時間分 辨螢光實驗，可通過觀測探針與亮氨酸氨基肽酶（LAP)反應前後螢光的變化來研究亮氨酸 氨基肽酶的活性。
[0011] 順磁螢光雙功能探針是指特定的有機配體，它可與順磁金屬離子形成特定的螯合 物，其中鑭系金屬離子起到順磁中心的作用，在探針與生物大分子連接後，順磁中心可對其 附近的生物大分子的殘基產生影響，使這些殘基的化學位移值發生較大的變化，而且在激 發光的照射下，雙功能探針可產生順磁金屬離子的特徵發射峰。
[0012] 在將順磁螢光雙功能探針應用於生物體系中時，鑭系金屬離子螯合物在激發光的 照射下可發射出鑭系金屬離子特徵的螢光譜峰，而且可同時提供順磁中心，那些靠近順磁 中心的胺基酸殘基可產生較大的PCS。由於生物體系中沒有天然的鑭系金屬離子的結合位 點，所以即使有過量鑭系金屬離子的存在，也不會產生明顯的順磁效應和螢光噪音。因此， 順磁螢光雙功能探針在研究生物大分子的結構和功能的過程中，兼有順磁探針和螢光探針 的優點，可獲得更全面的數據。
[0013] Saha 等人，參見, 1993，76，1361-1378、Mukkala 等人， 參見 7； Am. Chem. Soc., 1993, 115, 11032-1W33、Takalo 等人，參見 Helv_ Chim. Jcia·, 1997,80，372-387 和 Nicolas Maindron 等人，參見 Crg. 2011， 9，2357 - 2370分別報導了如圖1中的螢光標籤L-4、L-5、L-6和L-7,它們的鑭系金屬離 子（Eu3+)螯合物均有較好的螢光特性，可有效的對蛋白質或多肽進螢光行研究。但這些標 籤有一個共同的特點，就是它們與蛋白質或多肽的連接有較大的柔性，不適合作為蛋白質 或多肽順磁研究的標籤。
[0014] Su 等人，參見 CXe?.及/r. 7； 2013，19，17141 - 17149,報導了圖 1 中的化合 物L-8,它與鑭系金屬離子有較強的結合能力，可與蛋白定點連接，且連接後，只有一套順磁 峰，而且可以得到大的PCS和RDC值，並且在340nm的激發下可以發出明顯的Tb 3+的特徵熒 光。他們運用順磁螢光雙功能探針來解析蛋白質的生物結構與功能，能夠同時得到順磁數 據和螢光數據，在研究蛋白質的結構與功能的過程中，比單一功能的探針具有更加明顯的 優勢。
[0015] 為了將順磁螢光雙功能標籤引入蛋白中，一般是將此標籤設計為具有雙功能團的 小分子化合物，一端能夠螯合順磁金屬離子，另一端可與蛋白質連接。合適的連接方式與螯 合基團在探針發揮其作用的過程中非常重要，因此，在設計順磁螢光雙功能探針的過程中， 必須綜合考慮以下幾個方面： 1) 與鑭系金屬離子有較強的結合能力。最好具有較高的齒合度，從而阻止水分子參與 配位，阻止發生由配體到溶劑的無輻射能量轉移所導致的螢光淬滅； 2) 能夠與蛋白的特定位點選擇性連接，而且連接要有一定的剛性。如果連接剛性不強， 標籤會相對蛋白進行運動，造成PCS和RDC的平均化； 3) 具有單一的構象。如果存在多種構象，核磁譜圖中會出現多套信號峰，對核磁譜圖的 分析帶來困難； 4) 具有較長的激發波長和較高的螢光量子產率。較低的激發波長容易對生物樣品造成 損傷。


【發明內容】

[0016] 本發明的目的是針對上述技術分析和存在問題，提供一種以三聯吡啶為骨架含苯 碸基的順磁螢光雙功能探針及其製備方法，該順磁螢光雙功能探針可與蛋白質的特定位點 進行選擇性連接，而且連接具有一定剛性，只有一套順磁信號峰，而且在激發光照射下可發 出明顯的金屬離子（Eu 3+和Tb3+)的特徵螢光；該探針的剛性可以從核磁共振來衡量，並應用 到螢光光譜和電子自旋共振中。
[0017] 本發明的技術方案： 一種以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針，為4'-苯碸 基-2, 2' : 6、2"-聯三吡啶-6, 6"-二甲胺四乙酸，其化學結構式為

【權利要求】
1. 一種以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針，其特徵在於：為4'-苯碸 基-2, 2' : 6、2"-聯三吡啶-6, 6"-二甲胺四乙酸，其化學結構式為
〇
2. -種如權利要求1所述以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針的製備 方法，其特徵在於步驟如下： 1) 吡啶-2, 6-二甲酸二乙酯的合成 將吡啶-2, 6-二甲酸和S0C12混合，回流3-12h，蒸出S0C12，然後在冰浴下滴加無水乙 醇，室溫攪拌8h後濃縮至幹，在殘餘物中加入水，然後在冰浴下用碳酸鉀中和，用二氯甲烷 萃取，合併有機相，有機相用飽和食鹽水洗滌，並用無水硫酸鈉乾燥，經過濾、旋幹，得土黃 色晶狀固體吡啶-2, 6-二甲酸二乙酯； 2) 1，5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1，3, 5-戊三酮的合成 將氫化鈉和四氫呋喃混合後，氬氣保護下，升溫至40-50°C，然後滴加吡啶-2, 6-二甲 酸二乙酯、丙酮和四氫呋喃的混合液，反應2-8h，冷卻至室溫，倒入冰水中，6M鹽酸溶液調 pH至7,然後濃縮至體積的3/5,冰水冷卻並趁冷過濾，將濾餅乾燥，得橘紅色固體1，5-二 (6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1，3, 5-戊三酮； 3) 4'-羥基-2, 2' :6' 2"-三聯吡啶-2, 6"-二甲酸乙酯的合成 將1，5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1，3, 5-戊三酮、乙酸銨和無水乙醇混合，回流 2-10h，冷卻至室溫，濃縮至幹，將殘餘物加入水清洗，過濾後將殘餘物溶於二氯甲烷，有機 相分別用水，〇. 5 Μ的稀鹽酸和飽和食鹽水清洗，有機相用無水硫酸鈉乾燥，經過濾、旋幹、 柱分離，得黃色固體粉末4'-羥基-2, 2':6、2~_三聯吡啶-2, 6~_二甲酸乙酯； 4) 4'-溴-2, 2':6、2?-三聯吡啶-2, 6?-二甲酸乙酯的合成 將4'-羥基-2, 2^6、2?-三聯吡啶-2, 6?-二甲酸乙酯、五溴化磷和DMF混合，氬氣 保護下，40_80°C反應6-12h,冷卻至室溫後蒸出DMF,在殘餘物中加入水後用飽和碳酸氫鈉 中和，用氯仿萃取後合併有機相，有機相分別用水和飽和食鹽水清洗，然後用無水硫酸鈉幹 燥，經過濾、旋幹、柱分離，得白色固體粉末狀4'-溴-2, 2^6、2"-三聯吡啶-2, 6"-二甲 酸乙酯； 5) 4、溴-2, 2^6、2?-三聯吡啶-2, 6二甲醇的合成 將4'-溴-2, 2^6、2…-三聯吡啶-2, 6…-二甲酸乙酯、四氫呋喃和無水乙醇混合，然 後加入硼氫化鈉，室溫下反應15_30h，加水使反應淬滅，旋出有機溶劑濃縮，過濾後將濾餅 用紅外乾燥，得到白色固體粉末狀4'-溴_2,2': 6、2"-三聯吡啶-2, 6"-二甲醇； 6. f -溴-6,6?-二溴甲基-2,2\6、2?-聯三吡啶的合成 將4'-溴-2, 2' : 6'，2…-三聯吡啶-2, -二甲醇和氯仿混合，攪拌下滴加三溴化磷， 回流2-8h，用飽和碳酸氫鈉溶液中和後用二氯甲烷萃取，合併有機層，有機層分別用水和 飽和食鹽水洗，然後用無水硫酸鈉乾燥，過濾後將濾液旋幹，得白色固體粉末狀f -溴-6, 6…-二溴甲基-2,2^6、2…-聯三吡啶； 7) 4'-溴-2, 2^6、2?-聯三吡啶-6, 6二甲胺四乙酸四乙酯的合成 將4'-溴_6,6?-二溴甲基-2, 2^6、2?-聯三吡啶、無水碳酸鉀、碘化鉀、亞氨基二 乙酸二乙酯和無水乙腈混合，回流2-8h後濃縮至幹，加入水，然後用二氯甲烷萃取，有機相 分別用水和飽和食鹽水清洗後，用無水硫酸鈉乾燥，經過濾、旋幹，得淡黃色油狀物，靜置後 變為淡黃色固體4'-溴-2,2':6、2"-聯三吡啶-6, 6"-二甲胺四乙酸四乙酯； 8) 4'-苯碸基-2, 2^6、2?-聯三吡啶-6, 6二甲胺四乙酸四乙酯的合成 將4'-溴-2, 2^6、2?-聯三吡啶-6, 6二甲胺四乙酸四乙酯、苯亞磺酸鈉、碘 化亞銅、喹啉和NMP混合，氬氣保護下，100-14(TC反應5-12h，冷卻至室溫後加入水，然後 用乙酸乙酯萃取，合併有機相，有機相分別用水和飽和食鹽水清洗有機層，再用無水硫酸 鈉乾燥，過濾後將濾液旋幹、柱分離，得淡黃色油狀物4'-苯碸基-2, 2' :6、2~_聯三吡 P定-6, 6…-二甲胺四乙酸四乙酯； 9) 4'-苯碸基-2, 2':6、2?-聯三吡啶-6, 6二甲胺四乙酸的合成 將4'-苯碸基-2, 2^6、2…-聯三吡啶-6, 6二甲胺四乙酸四乙酯、氫氧化鈉、 THF和水混合，室溫下反應2-8h,用濃度為4 Μ的鹽酸溶液調pH至2~3,濃縮後過濾，用水 清洗濾餅後用紅外乾燥，得到白色固體粉末狀目標物4'-苯碸基-2, 2' :6、2~_聯三吡 啶-6, 6"-二甲胺四乙酸。
3.根據權利要求2所述以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針的製備 方法，其特徵在於：所述步驟1)中吡啶-2, 6-二甲酸、S0C12、無水乙醇與水的用量比為 lg:4. 2mL ：5mL ：5mL ； 步驟2)中氫化鈉與四氫呋喃的用量比為lg:20mL，吡啶-2, 6-二甲酸二乙酯、丙酮與四 氫呋喃的用量比為6. 6g: lmL: 22mL ; 步驟3)中1，5-二（6-甲酸乙酯-2-吡啶基）-1，3, 5-戊三酮、乙酸銨、無水乙醇、水與 二氯甲烷的用量比為 lg: 1. 3g :18mL :25ml :37. 5mL ; 步驟4)中4'-羥基-2, 2':6、2?-三聯吡啶-2, 6?-二甲酸乙酯、五溴化磷、DMF與 水的用量比為lg: 3g :23mL :30mL ; 步驟5)中4'-溴-2, 2':6、2?-三聯吡啶-2, 6?-二甲酸乙酯、四氫呋喃、無水乙醇、 硼氫化鈉與水的用量比為lg:50mL :12mL :0. 4g :15mL ; 步驟6)中的4'-溴-2, 2':6、2…-三聯吡啶-2, 6二甲醇、三溴化磷和氯仿的用量 比為 lg: lmL ：37. 5mL ； 步驟7)中4'-溴_6,6…-二溴甲基-2, 2':6、2…-聯三吡啶、無水碳酸鉀、碘化鉀、亞 氨基二乙酸二乙酯、無水乙腈與水的用量比為lg: 1. 2g:0. 5g :0. 8mL :50mL :50mL ; 步驟8)中4'-溴-2, 2^6、2?-聯三吡啶-6, 6?-二甲胺四乙酸四乙酯、苯亞磺酸鈉、 碘化亞銅、喹啉、NMP 與水的用量比為 lg:〇. 35g:0. 023g:0. 02mL:16. 7mL :150mL ; 步驟9)中4'-苯碸基-2, 2^6、2?-聯三吡啶-6, 6?-二甲胺四乙酸四乙酯、氫氧化 鈉、THF與水的用量比為lg:0. 41g:80mL:80mL。
4. 一種如權利要求1所述以三聯吡啶為骨架含苯碸基的順磁螢光雙功能探針的應用， 其特徵在於：利用順磁螢光雙功能探針與人體泛素蛋白質的連接產物，用於核磁共振的熒 光光譜和順磁標記，所述順磁螢光雙功能探針與人體泛素蛋白質的連接方法如下： 1) 配製10 mM的4'-苯碸基-2, 2' :6、2…-聯三吡啶-6, 6二甲胺四乙酸標籤溶 液； 2) 採集人體泛素蛋白質G47C在三羥甲基氨基甲烷（Tris)緩衝液pH=8. 0時的1H-15N HSQC譜圖作為空白對照； 3) 在人體泛素蛋白質G47C中加1.0倍量的三（2-羧基乙基）膦（TCEP); 4) 將人體泛素蛋白質G47C加入5倍量的4'-苯碸基-2, 2' : 6、2"-聯三吡 啶-6, 6〃-二甲胺四乙酸中，此時pH為8.0 ; 5) 通過採集混合物在不同時刻的1H-15N HSQC譜圖來監測反應，直至反應完全； 6) 反應完全後，通過roio脫鹽柱分離產物，將剩餘的標籤和新生成的小分子出去，最 後得到人體泛素蛋白質G47C與4'-苯碸基-2, 2': 6、2"-聯三吡啶-6, 6"-二甲胺四乙 酸的連接產物。
【文檔編號】G01N24/10GK104193673SQ201410398008
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月14日 優先權日:2014年8月14日
【發明者】蘇循成, 劉洪開, 楊茵, 劉琛欣, 孫季宇 申請人:南開大學