椎間盤退化的治療的製作方法

2023-05-19 14:39:56

專利名稱：椎間盤退化的治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及椎間盤退化的阻止和延緩。本發明也涉及通過阻止或延緩椎間盤退化 治療退化的椎間盤。本發明也涉及將軟骨細胞引入到損傷的椎間盤區中以及阻止或延緩該 椎間盤退化的方法。本發明也涉及將至少一種編碼轉化生長因子β超家族成員的基因引 入到至少一種哺乳動物結締組織細胞中的方法，用於阻止或延緩哺乳動物宿主中的椎間盤 退化。本發明也涉及將軟骨細胞和含有編碼轉化生長因子β超家族成員的基因的結締組 織細胞的混合物引入到損傷的椎間盤區中以及阻止或延緩該椎間盤退化的方法。發明內容
一方面，本發明涉及阻止或延緩椎間盤缺損部位的椎間盤退化的方法，該方法包 括將哺乳動物結締組織細胞注射到椎間盤缺損部位中。該過程優選不使用支架或任何細胞 支撐結構。優選地，使用軟骨細胞或成纖維細胞，並且受試者優選為人類。如果使用軟骨細 胞，則該軟骨細胞優選為非盤軟骨細胞(non-disc chondrocyte)，或者幼年軟骨細胞，即從 小於兩歲的孩子中分離出的細胞。其它方面，該軟骨細胞可以是預處理的軟骨細胞(primed chondrocyte)。特別地，該結締組織細胞可以是相對需要治療的哺乳動物受試者的同種異 體(allogeneic)型的。
一方面，本發明涉及將同種異體幼年軟骨細胞或同種異體的非盤軟骨細胞引入到 損傷的椎間盤區中並阻止或延緩該椎間盤退化的方法。
一方面，本發明可用來阻止或延緩已損傷、撕裂或突出的椎間盤區域的進一步退 化。
另一方面，本發明涉及阻止或延緩哺乳動物椎間盤缺損部位的椎間盤退化的方 法，該方法包括a)將編碼具有椎間盤再生功能的蛋白質的基因插入到哺乳動物細胞中，和 b)將哺乳動物結締組織細胞移植到椎間盤缺損部位中。該過程優選不使用支架或任何細胞 支撐結構。在這種方法中，該基因可屬於TGF-β超家族，例如TGF-β，並優選為TGF-β 1。 該結締組織細胞可以是軟骨細胞或成纖維細胞。更優選使用軟骨細胞，且哺乳動物受試者 優選為人類。該結締組織細胞可以是相對哺乳動物受試者的同種異體型的。
又一方面，本發明涉及阻止或延緩哺乳動物椎間盤缺損部位的椎間盤退化的方 法，該方法包括a)將編碼具有椎間盤再生功能的蛋白質的基因插入到第一哺乳動物結締 組織細胞中，和b)將a)中哺乳動物結締組織細胞和未經修飾的(unmodified)第二哺乳動 物結締組織細胞的混合物移植到椎間盤缺損部位中。該過程優選不使用支架或任何細胞支 撐結構。在這種方法中，該基因可屬於TGF-β超家族，例如TGF-β，優選TGF-β 1。該第一 和第二哺乳動物結締組織細胞可以是軟骨細胞或成纖維細胞。在軟骨細胞的情況下，該軟 骨細胞可以是非盤軟骨細胞或幼年軟骨細胞。特別地，用作第二哺乳動物結締組織細胞的 軟骨細胞可以是預處理的軟骨細胞。在另一方面，該第一或第二哺乳動物結締組織細胞中 的一個或兩個都可以為相對哺乳動物受試者或相對彼此的同種異體。


圖1A-1F示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。㈧示出手術前兔脊柱的MRI放射 圖片；(B)示出手術後四⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中⑴使L1/2盤損傷並注射產生 TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)可以看到脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，和(iii)使L3/4盤 損傷並注射1 3比例的產生TGF-βΙ的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合物；箭頭指 向L1/2和L3/4盤區。(C)示出手術後八⑶周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2 盤損傷並注射產生TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組， 和(iii)使L3/4盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的人軟 骨細胞混合物；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖 片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(E)示出上 面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。(F)示出上面(C) 中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。特別地，混合的細胞治療 具有椎間抗退化作用。
圖2A-2F示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。㈧示出手術前兔脊柱的MRI放射 圖片；(B)示出手術後四⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中⑴使L1/2盤損傷並注射產生 TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4 盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合物；箭 頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出手術後八⑶周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使 L1/2盤損傷並注射產生TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)可以看出脊柱部位L2/3處無穿刺和無 治療，和(iii)使L3/4盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的 人軟骨細胞混合物；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射線 放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(E) 示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。(F)示出上 面(C)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。特別地，混合的細 胞治療具有椎間抗退化作用。
圖3A-3D示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放 射圖片；(B)示出手術後四(4)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射 產生TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使 L3/4盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-βΙ的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合 物；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於 獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描 述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。特別地，混合的細胞治療具有 椎間抗退化作用。
圖4A-4D示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放 射圖片；(B)示出手術後四(4)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射 1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合物，(ii)脊柱部位L2/3 處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損傷並注射產生TGF-β 1的軟骨細胞；箭 頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎 間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。特別地，產生TGF-β 1的軟骨細胞治 療具有椎間抗退化作用。
圖5A-5D示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放 射圖片；(B)示出手術後四(4)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射 1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合物，(ii)脊柱部位L2/3 處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損傷並注射產生TGF-β 1的軟骨細胞；箭 頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎 間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔 的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。特別地，產生TGF-β 1的軟骨細胞治 療和混合細胞治療具有椎間抗退化作用。
圖6A-6D示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。㈧示出手術前兔脊柱的MRI放射 圖片；(B)示出手術後四⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射細 胞培養基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損傷 並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X 射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。 (D)示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。未轉導 的軟骨細胞治療具有椎間抗退化作用。
圖7A-7F示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放 射圖片；(B)示出手術後四(4)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射 細胞培養基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損 傷並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出手術後八(8)周兔脊 柱的MRI放射圖片，其中⑴使L1/2盤損傷並注射細胞培養基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3 處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損傷並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向 L1/2和L3/4盤區。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的 盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射 線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射線放射 圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。未轉導的軟骨細胞治療具有椎間抗退化作用。
圖8A-8F示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。㈧示出手術前兔脊柱的MRI放射 圖片；(B)示出手術後四⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中⑴通過針穿刺使T12/L1盤 損傷，無注射，(ii)脊柱部位L1/2處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L2/3盤損傷 並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向T12/L1和L2/3盤區。(C)示出手術後八(8)周兔脊 柱的MRI放射圖片，其中⑴通過針穿刺使T12/L1盤損傷，無注射，(ii)脊柱部位L1/2處 無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L2/3盤損傷並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向 T12/L1和L2/3盤區。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤 的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X 射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射線放 射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。未轉導的軟骨細胞治療具有椎間抗退化作用。
圖9A-9D示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。㈧示出手術前兔脊柱的MRI放射 圖片；(B)示出手術後八(8)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L2/3盤損傷並注射細胞培養基DMEM，(ii)脊柱部位L3/4處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L4/5盤損傷 並注射預處理的軟骨細胞；箭頭指向L2/3和L4/5盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X 射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。 (D)示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。預處理 的軟骨細胞治療具有椎間抗退化作用。
具體實施方式
如本文使用的關於核酸、蛋白質、蛋白質片段或其衍生物的術語「生物活性」，定義 為該核酸或胺基酸序列模擬野生型核酸或蛋白質所誘導的已知生物功能的能力。
如本文使用的術語「結締組織」是連接和支撐其它組織或器官的任何組織，包括但 不限於哺乳動物宿主的韌帶、軟骨、腱、骨和滑膜。
如本文使用的術語「結締組織細胞」或「結締組織的細胞」包括在結締組織中發現 的細胞，例如分泌膠原細胞外基質的成纖維細胞、軟骨的細胞(軟骨細胞)和骨的細胞(成 骨細胞/骨細胞)，以及脂肪的細胞(脂肪細胞)和平滑肌細胞。優選地，該結締組織細胞 是成纖維細胞、軟骨細胞或骨細胞。更優選地，該結締組織細胞是軟骨細胞。應當認識到本 發明可用結締組織細胞的混合培養物實施，也可以用單一類型的細胞。還應當認識到組織 細胞可用例如化學物或放射治療，以便該細胞穩定表達感興趣的基因，優選TGF-β 1。優選 地，該結締組織細胞在注入到宿主有機體中時不會引起不良免疫反應。應當理解同種異體 細胞可應用於此，以及自體細胞可應用於細胞介導的基因治療或體細胞治療。
如本文使用的「結締組織細胞系」包括起源於共同親本細胞的多種結締組織細胞。
如本文使用的「透明軟骨」是指覆蓋關節表面的結締組織。僅為舉例，透明軟骨包 括但不限於關節軟骨、肋軟骨和鼻軟骨。
特別地，已知透明軟骨能自我更新，對變化起反應並提供較少摩擦的穩定運動。發 現甚至在同一關節內或在厚度、細胞密度、基質組成和機械特性不同的關節中透明軟骨仍 保持相同的總體結構和功能。透明軟骨的一些功能包括對壓力有驚人的剛性、回彈性和分 散重量負荷的特殊能力、將軟骨下骨上的峰壓力減至最小的能力，和很好的耐久性。
大體上和組織學上，透明軟骨表現為抵抗變形的光滑、堅固的表面。軟骨的細胞外 基質包含軟骨細胞，但缺少血管、淋巴管或神經。維持軟骨細胞和基質之間相互作用的精 巧、高度有序的結構起保持透明軟骨結構和功能的作用，同時保持低水平的代謝活動。參考 文獻 0' Driscoll, J. Bone Joint Surg.，80A :1795-1812,1998 詳細描述了透明軟骨的結 構和功能，該文獻通過引用整體地合併在此。
如本文使用的「可注射的」組合物是指不包括這種結構的組合物，這種結構為用允 許細胞附在其上並允許細胞生長成一層以上的任何材料或形狀製成的，一般是植入而非注 射的各種三維支架、框架、篩網或氈結構。在一個實施例中，本發明注射方法典型地通過注 射器進行。但可採用任何方式注射感興趣的組合物。例如，也可採用導管、噴霧器，或溫度 依賴性聚合凝膠。
如本文使用的「幼年軟骨細胞」是指從小於兩歲的人中獲取的軟骨細胞。典型地， 該軟骨細胞優選從肢體的透明軟骨區中獲得，例如手指、鼻子、耳垂等。幼年軟骨細胞可用 作治療缺損或損傷的椎間盤的同種異體的供體軟骨細胞。
如本文使用的術語「哺乳動物宿主」包括動物王國的成員，包括但不限於人類。
如本文使用的「混合細胞」或「細胞的混合物」或「細胞混合物」是指多種細胞的組 合，該細胞包括用感興趣的基因轉染或轉導的第一細胞群和未轉導的第二細胞群。
在本發明的一個實施例中，混合細胞可以指多種結締組織細胞的組合，該結締組 織細胞包括已用編碼轉化生長因子β超家族成員的基因或DNA轉染或轉導的細胞和未用 編碼轉化生長因子β超家族成員的基因轉染或轉導的細胞。典型地，未用編碼轉化生長 因子β超家族成員的基因轉染或轉導的細胞與已用TGF超家族基因轉染或轉導的細胞的 比例為3-20 1。該範圍可包括約3-10 1。特別地，就細胞數而言，該範圍可以為約 10 1。但應當理解，這些細胞的比例無需固定到任何特定範圍，只要這些細胞的組合可通 過減慢或延緩缺損椎間盤的退化而有效治療損傷的椎間盤即可。
如本文使用的「非盤軟骨細胞」是指從除椎間盤軟骨組織以外的身體任何部分分 離出的軟骨細胞。本發明的非盤軟骨細胞可用於同種異體移植或注射到患者中從而治療缺 損或損傷的椎間盤。
如本文使用的術語「患者」包括動物王國的成員，包括但不限於人類。
如本文使用的術語「預處理的」細胞是指已被活化或改變從而表達某些基因的細 胞。
如本文使用的椎間盤退化的「減慢」或「阻止」是指與給定時間內在導致正常退 化的損傷部位正常發現的體積或高度水平相比，椎間盤體積或盤高度隨著時間的不斷保 留。這可表示為與給定時間內預期的正常退化水平相比，體積或高度增大的百分比，例如約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，或90%，或可表示為該部位椎間盤的體積或 高度損傷或消耗的減輕。
如本文使用的「轉化生長因子-β (TGF-β)超家族」包括在胚胎發育期間 影響各式各樣的分化過程的結構相關的一組蛋白質。該家族包括，正常雄性性發育 所需(Behringer等人，Nature, 345 167，1990)的穆勒氏抑制物質(MIS)、背腹軸形 成和成蟲盤形態發生所需O^adgett，等人，Nature, 325 =81-84,1987)的黑腹果蠅 (Drosophiladecapentaplegic) (DPP)基因產物、位於卵植物極(Weeks 等人，Cell,51 861-867，1987)的非洲爪蟾Vg-I基因產物、可誘導非洲爪蟾胚胎的中胚層和前結構 形成(Thomsen 等人，Cell，63 :485，1990)的活化素(Mason 等人，Biochem，Biophys. Res. Commun.，1；35 :957-964,1986)，和可誘導新生軟骨(de novo cartilage)和骨形成 (Sampath 等人，J. Biol. Chem.，265 :13198,1990)的骨形態發生蛋白(BMP，如BMP_2、3、4、5、 6和7，成骨素，0P-1)。TGF-β基因產物可影響各種分化過程，包括脂肪形成、肌形成、軟骨 形成、血細胞形成和上皮細胞分化(綜述參見Massague，Cell 49 :437，1987)，其通過引用 完整地合併在此。
最初合成了作為大前體蛋白的TGF-β家族蛋白質，然後在距C-端約110-140個 胺基酸的一簇鹼性殘基處進行蛋白水解切割。這些蛋白質的C-端區都是結構相關的，不 同家族成員可基於其同源性程度分成不同亞組。雖然特定亞組內胺基酸序列的同源性為 70 % 90 %，但亞組之間的同源性明顯較低，一般為20 % 50 %。在各種情況下，活性種類 似乎是C-端片段經二硫化物連接的二聚體。對於已研究的大部分家族成員，發現同源二聚 體種類具有生物活性，但對於其它家族成員，如抑制素(Ung等人，Nature, 321 :779,1986)和TGF-β (Cheifetz等人，Cell,48 :409，1987)，也檢測到異源二聚體，這些異源二聚體似 乎有著不同於各同源二聚體的生物學性質。
TGF- β 基因超家族成員包括 TGF- β 3、TGF- β 2、TGF- β 4 ( )、TGF- β 1、 TGF- β 5 (非洲爪蟾)、BMP-2、BMP-4、果蠅 DPP、BMP-5、BMP-6、Vgrl、0P-1/BMP-7、果蠅 60A、 GDF-I、非洲爪蟾 Vgf、BMP-3、抑制素- β Α、抑制素- β B、抑制素- α 和 MIS。Massague，Ann. Rev. Biochem. 67 :753-791中討論了這些基因，其通過引用整體地合併在此。
優選地，TGF-β 基因的超家族成員為 TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、 ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、或 ΒΜΡ-7。
椎間盤
椎間盤構成脊柱長度的四分之一。寰椎(Cl)與樞椎(以)和尾骨之間無椎間盤。 椎間盤無血管，因此需要依靠終板來滲透所需營養。終板的軟骨層將盤固定在適當的位置。
椎間盤是用作脊柱減震系統的纖維軟骨墊，其可以保護椎體、腦和其它結構(即， 神經)。該椎間盤可以允許一些椎體活動伸展和彎曲。單個椎間盤的移動是非常有限 的-但當數個椎間盤的力結合時可發生相當強的運動。
椎間盤由纖維環和髓核組成。纖維環是堅固的輻射輪胎狀結構，該結構由片層 (lamellae)，連接到椎體終板的膠原纖維同心薄片組成。該薄片以不同角度取向。纖維環 包圍著髓核。
儘管纖維環和髓核都由水、膠原蛋白，和蛋白聚糖(PG)組成，但髓核中流體(水和 PG)量是最多的。PG分子是很重要的，因為它可吸收並保留水分。髓核含有水合凝膠狀物 質，其可以抵抗壓力。髓核中的水分量可因為每天的活動而有所變化。隨著人變老，髓核開 始脫水，這限制了它的減震能力。纖維環隨著年齡逐漸變得脆弱並開始撕裂。雖然對於一 些人這不會引起疼痛，但對於另一些人或這兩類人都可引起慢性疼痛。
由脫水的髓核不能減震引起的疼痛稱為軸性痛或盤間隙痛。這一般是指髓核因退 化性椎間盤疾病逐漸退化。當纖維環由於損傷或老化過程撕裂時，髓核可開始通過裂隙伸 出(exclude)。這稱為椎間盤突出症。在整個脊柱中每個椎間盤的後側附近，主要脊神經伸 出到不同的器官、組織、肢體等。非常常見的是，突出椎間盤壓迫這些神經(擠壓神經)，引 起放射痛、麻木、刺痛、活動強度和/或範圍減小。另外，含有炎性蛋白的內核凝膠與神經的 接觸還可引起明顯疼痛。神經相關的疼痛稱為神經根痛。
突出椎間盤有許多名稱，對醫務人員來說，這些名稱可表示不同狀況。滑行椎間 盤、破裂椎間盤，或膨出椎間盤都可以表示相同的醫學病況。椎間盤突出到鄰近椎體中稱為 許莫氏結節(Schmorl，nodes)。
預處理的細胞治療
本發明包括向哺乳動物的椎間盤區施用預處理的細胞從而通過阻止或延緩椎間 盤退化治療損傷的椎間盤。預處理的細胞典型地為結締組織細胞，並包括軟骨細胞或成纖 維細胞。
例如，當原始軟骨細胞群被傳代約3或4次時，它們的形態典型地變為形成纖維 的軟骨細胞(fibroblastic chondrocyte)。由於原始軟骨細胞被傳代，因此它們開始喪失 一些軟骨細胞特徵，並開始呈現形成纖維的軟骨細胞特徵。當用細胞因子，例如TGF-β超 家族蛋白質孵化或「預處理」這些形成纖維的軟骨細胞時，這些細胞可重新獲得軟骨細胞特徵，該特徵包括產生膠原蛋白。
此種預處理的細胞包括形成纖維的軟骨細胞，該形成纖維的軟骨細胞已用TGFi3 1 孵化並從而恢復為產生膠原蛋白的軟骨細胞。使用預處理的細胞延緩椎間盤退化的優點在 於容易形成可用於引入到椎間盤中產生膠原蛋白的軟骨細胞，另外的優點在於可維持軟骨基質。
該細胞可包括但不限於原始細胞或已經歷約1次 20次傳代的細胞。該細胞可 以是結締組織細胞。該細胞可包括已經歷形態發生變化的細胞，其中預處理使原始細胞特 性恢復。該細胞包括但不限於軟骨細胞、成纖維細胞，或形成纖維的軟骨細胞。預處理可這 樣進行，即，用細胞因子孵化該細胞至少40小時，或1 40小時、2 30小時、3 25小 時、4 20小時、5 20小時、6 18小時、7 17小時、8 15小時或9 14小時，然後 可選地將該細胞與該細胞因子分離，並將該預處理的細胞注射到感興趣的軟骨缺損部位以 便產生軟骨，優選透明軟骨。一方面，該細胞因子可以為TGF-β超家族成員。特別地，該細 胞因子可以是TGF-β，特別是TGF-β 1。
該預處理孵化混合物中存在細胞因子，其量可以充分「預處理」軟骨細胞從而使它 對椎間治療方法有用。在這方面，該預處理孵化混合物可含有至少約lng/ml細胞因子。特 別地，該混合物含有的細胞因子量可以為約1 1000ng/ml、約1 750ng/ml、約1 500ng/ ml、約 1 400ng/ml、約 1 300ng/ml、約 1 250ng/ml、約 1 200ng/ml、約 1 150ng/ ml、約 1 100ng/ml、約 1 75ng/ml、約 1 50ng/ml、約 10 500ng/ml、約 10 400ng/ ml、約 10 300ng/ml、約 10 250ng/ml、約 10 200ng/ml、約 10 150ng/ml、約 10 100ng/ml、約 10 75ng/ml、約 10 50ng/ml、約 15 500ng/ml、約 15 400ng/ml、約 15 300ng/ml、約 15 250ng/ml、約 15 200ng/ml、約 15 150ng/ml、約 15 100ng/ml、約 15 75ng/ml、約 15 50ng/ml、約 20 500ng/ml、約 20 400ng/ml、約 20 300ng/ml、 約 20 250ng/ml、約 20 200ng/ml、約 20 150ng/ml、約 20 100ng/ml、約 20 75ng/ ml、約 20 50ng/ml、約 25 500ng/ml、約 25 400ng/ml、約 25 300ng/ml、約 25 250ng/ml、約 25 200ng/ml、約 25 150ng/ml、約 25 100ng/ml、約 25 75ng/ml、約 25 50ng/ml、約 30 500ng/ml、約 30 400ng/ml、約 30 300ng/ml、約 30 250ng/ml、 約 30 200ng/ml、約 30 150ng/ml、約 30 100ng/ml、約 30 75ng/ml、約 30 50ng/ ml、約 35 500ng/ml、約 35 400ng/ml、約 35 300ng/ml、約 35 250ng/ml、約 35 200ng/ml、約 35 150ng/ml、約 35 100ng/ml、約 35 75ng/ml、約 35 50ng/ml、約 40 500ng/ml、約 40 400ng/ml、約 40 300ng/ml、約 40 250ng/ml、約 40 200ng/ml、約 40 150ng/ml、約 40 100ng/ml、約 40 75ng/ml 或約 40 50ng/ml。
實施本發明的一個方法可包括用細胞因子孵化細胞一定的時間從而形成預處理 的細胞，和可選地將細胞因子與該細胞分離，以及將該預處理的細胞注射到椎間盤或靠近 它的感興趣部位中。或者，可用感興趣的細胞因子孵化該細胞一段時間，並可在不分離出細 胞因子的情況下將該組合物施用到缺損部位。
應當理解，儘管在本發明的預處理細胞治療方案中可一起植入諸如支架或框架以 及各種外源性組織等物質，但本發明的注射系統中也可以不包括此種支架或組織。在創造 性體細胞治療的優選實施例中，本發明涉及將預處理的結締組織細胞群注射到椎間盤間隙 中的簡單方法。
技術人員應當理解，用於治療人患者的細胞來源可以是患者自身的結締組織細 胞，例如自體成纖維細胞或軟骨細胞，但也可使用所有的同種異體細胞以及異種細胞，無需 考慮細胞的組織相容性。或者，在本發明的一個實施例中，可以使用與哺乳動物宿主的組織 相容性匹配的同種異體細胞。為進一步詳細地描述，確定供體和患者的組織相容性以便向 哺乳動物宿主施用組織相容性細胞。同樣地，也可異體地使用幼年軟骨細胞，無需確定供體 和患者之間的組織相容性。
基因遞送
一方面，本發明公開了遞送感興趣的DNA序列到哺乳動物宿主結締組織細胞的離 體法(ex vivo)和體內(in vivo)技術。該離體法技術涉及培養靶結締組織細胞、體外轉 染DNA序列、將DNA載體或其它感興趣的遞送載體導入到結締組織細胞中，然後將該修飾的 結締組織細胞移植到哺乳動物宿主的靶區域中，以便影響感興趣基因產物的體內表達。
應當理解，儘管在本發明方案中可一起植入諸如支架或框架以及各種外源性組織 等物質，但優選本發明的注射系統中不包括此種支架或組織。在一個實施例中，本發明涉及 將TGF超家族蛋白質或者培養的、未轉染/未轉導的或轉染/轉導的結締組織細胞群或其 混合物注射到椎間盤間隙中的簡單方法，以便外源性TGF超家族蛋白質在椎間盤間隙中被 表達或是活性的。
技術人員應當理解，用於治療人患者的一種細胞來源是患者自身的結締組織細 胞，例如自體軟骨細胞。另一種細胞來源包括同種異體細胞，無需考慮該細胞對需要治療的 患者的組織相容性。
更具體地，這個方法包括採用基因產物，或其生物活性衍生物或片段。該基因產物 為轉化生長因子β超家族成員，或其生活活性衍生物或片段。
在本發明的另一個實施例中，提供了用於腸胃外給予病人治療有效量的化合物， 該化合物含有TGF-β超家族蛋白質和合適的藥物運載體。
本發明的另一個實施例提供了用於腸胃外給予病人預防有效量的化合物，該化合 物包括TGF-β超家族蛋白質和合適的藥物運載體。
在治療應用中，TGF-β蛋白質可配製用於局部給藥。技術和配方一般可在 Remington『 s Pharmaceutical Sciences, Mack 出版公司，Easton, Pa.,最新版中找至Ij0 活性成分TGF蛋白質一般與運載體結合，例如賦形劑稀釋液，其可包括填充劑、補充劑、粘 合劑、溼潤劑、崩解劑、表面活性劑、可侵蝕性聚合物或潤滑劑，這取決於給藥模式和劑型特 點。典型劑型包括粉劑，包括懸浮劑、乳劑和溶液的液體製劑，顆粒和膠囊。
本發明TGF蛋白質也可與藥物可接受的運載體結合以便給予受試者。合適的藥 物可接受的運載體實例是多種多樣的陽離子脂質，包括但不局限於N-(l-2，3-二油基氧 基)丙基)-n，n，n-三甲基氯化銨(DOTMA)和二油基磷脂醯乙醇胺(dioleoylphophotidyl ethanolamine) (DOPE)。脂質體也是本發明TGF蛋白質分子的合適的運載體。另外合適的 運載體是緩釋凝膠或包含TGF蛋白質分子的聚合物。
TGF^蛋白質可與大量生理可接受的運載體或稀釋液混合，例如生理鹽水或其它 合適的液體。TGF蛋白質分子也可與其它運載體裝置結合從而保護該TGF蛋白質和其生物 活性形式在到達它們的靶之前不被降解和/或促進該TGF蛋白質或其生物活性形式穿過組 織屏障。
本發明的進一步實施例包括在轉染細胞之前儲存結締組織細胞。所屬領域技術人 員應當理解，該結締組織細胞可冷凍儲存在於液氮中的10% DMSO中。
在本申請中，提供了通過注射用編碼轉化生長因子β (TGF-β)超家族成員的基 因轉染或轉導的適當的哺乳動物細胞，使椎間盤再生或阻止椎間盤退化的方法，該TGF-β 超家族成員包括，但不限於ΒΜΡ-2和TGF-β 1、2和3。
在本申請的另一個實施例中，提供了通過注射未用編碼轉化生長因子β (TGF-β) 超家族成員的基因轉染或轉導，或者未用任何其它基因轉染或轉導的適當的哺乳動物細 胞，阻止或延緩椎間盤退化的方法。另一方面，本發明涉及通過使用上述方法阻止或延緩椎 間盤退化來治療損傷或退化的椎間盤。
在本申請的另一個實施例中，提供了通過注射用編碼轉化生長因子β (TGF-β) 超家族成員的基因轉染或轉導的適當的哺乳動物細胞，延緩或阻止椎間盤退化的方法。另 一方面，本發明涉及通過使用上述方法阻止或延緩椎間盤退化來治療損傷或退化的椎間盤。
在本發明的另一個實施例中，提供了通過注射用編碼轉化生長因子β (TGF-β) 超家族成員的基因轉染或轉導的適當的哺乳動物細胞，和未用編碼轉化生長因子 β (TGF-β)超家族成員的基因轉染或轉導或者未用任何其它基因轉染或轉導的適當的哺 乳動物細胞的組合物或混合物，阻止或延緩椎間盤退化的方法。
在本發明的實施例中，應當理解，可將該細胞注射到其中椎間盤退化需要通過使 用上述細胞組合物阻止或延緩的區域中，該組合物含有或不含有支架材料或任何其它輔助 材料，例如外源性細胞或任何其它生物相容性載體。也就是說，可將僅經修飾的細胞、僅未 經修飾的細胞，或其混合物或組合物注射到其中椎間盤退化需要被阻止或延緩的區域中。
下列實例是為了說明本發明，而不是限制。
實施例
實施例1-材料和方法
脂粒構建
通過將含有TGF- β 1編碼序列和3』末端處的生長激素聚A位點的1. 2-kb Bgl II 片段亞克隆到pMTMLV的Bam HI位點中，產生質粒pMTMLV β 1。pMTMLV載體通過除去全部 gag和env序列以及一些Ψ包裝序列從逆轉錄病毒載體MGF衍生而得。
細胞培養和轉導-將在逆轉錄病毒載體中克隆的TGF_i3cDNA單獨轉導到軟 骨細胞(hChon-TGF-β 1)中。在含10 %胎牛血清的Dulbecco 『 s改良fegles培養基 (GIBCO-BRL, Rockville, MD)中培養這些軟骨細胞。
為了選擇具有轉導的基因序列的細胞，將新黴素(300yg/ml)加入到該培養基 中。有時將具有TGF-β 1表達的細胞儲存在液氮中，在注射之前進行培養。
用Fugene轉染方法將pMTMLV β 1和pVSVG質粒DNA共轉染到GP2-293細胞中。 培養48小時之後，用0. 45 μ m聚碸過濾器過濾上清液。該濾過的培養上清液然後用培養基 和10% FBS進行二倍稀釋，並用來感染人軟骨細胞。用該濾液和聚凝膠(8μ g/ml，Sigma, St. Louis, MO)對感染前18小時在60mm培養皿中接種的人軟骨細胞進行感染。培養4小 時之後，用新鮮培養基替換該培養基。M小時之後，用儲存的病毒上清液進行重複感染。 在二次感染之後，在含10%胎牛血清的Dulbecco改良fegle培養基中培養該轉導的細胞。將挑選的菌落轉移到M或6孔板中，並使用QuantikineELISA分析試劑盒(R&D system, Minneapolis, MN)測量 TGF-β 1 產量。
椎間盤高度的X射線放射圖片分析
在穿刺後每周(various week intervals)施用鹽酸氯胺酮(25mg/kg)和 Rompun (lmg/kg)之後，拍攝X射線放射圖片。應特別小心地將每個動物在X射線放射圖片 拍攝期間和每個時間的麻醉維持在一致水平上，從而獲得相似程度的肌肉鬆弛，肌肉鬆弛 可影響椎間盤高度。因此，總是用術前X射線放射圖片作為基線測量。也應儘量將脊柱保 持在輕度屈曲位。為了減小來自脊柱的軸向旋轉和光束髮散角的誤差，對處於側臥位的每 個動物重複拍攝X射線放射圖片至少兩次，將光束集中在距離兔髂嵴4em處。數位化掃描 X射線放射圖片，並使用圖像捕捉軟體進行數位化存儲。
影像分析
利用數位化放射圖片，運用公用圖像分析軟體分析包括椎體高度和IVD高度的測 量值。將數據導入Excel軟體中，使用Lu等人的方法將IVD高度表示為DHI。「 Effects of chondroitinase ABC and chymopapain on spinal motion segment biomechanics。 Aninvivo biomechanical，radiologic，and histologic canine study「 ，Spinel997 ;22 : 1828-340通過求得從IVD的前部、中部和後部獲得的測量值的平均值並將它除以相鄰椎體 高度的平均值，計算出平均IVD高度(DHI)。被注射的椎間盤的DHI變化表示為DHI %，並 歸一化到術前IVD高度(DHI 術後DHI/術前DHI X 100)。使用下面等式計算出受試者 內部標準差
V ( Σ (X1-X2) 2/2η)
其中Xl是第一測量值，Χ2是第二測量值，並且η = 450。按(Sw/所有測量結果 的平均值X 100)計算變異係數百分率(CV% )。DHI測量的觀察者內誤差(intraobserver error)估算為極小(Sw :0. 001800316 ；CV % :3. 13)。報導DHI測量的觀察者間誤差 (interobserver error)也 艮小(Sw :0. 003227 ；CV% :9. 6)。
MRI 評價
使用帶有正交象限線圈接收器(quadratureextremity coil receiver)的0. 3_T 成像儀(Airis II，4· OA版；Hitachi Medical System America，he.)對本研究中的所有兔 進行MRI檢查。處死之後，分離出帶有周圍軟組織的脊柱，對其進行MRI分析。在下面環境 中獲得矢狀面中的T2-權重橫斷面快速自旋迴波序列，TR(重複時間)4000毫秒和TE(回 波時間)120毫秒、256(h) X 128 (ν)矩陣、視野(field of view)沈0、刺激次數4次。層厚 (section thickness)為2_，間距為0_mm。基於1 4級(1 =正常、2 =信號強度降低極 小但高信號範圍明顯縮小、3 =信號強度降低中度，以及4 =信號強度降低嚴重)信號強度 的等級和範圍變化，不知情的觀察者利用改良的Thompson分類法評價MRI。基於2次評價， MRI分級的觀察者內和觀察者間的可信度相關係數優異(分別為K = 0. 98、0. 90)，如Cohen kappa相關係數確定的。
實施例II-實驗方法和結果
阻止損傷的椎間盤退化
使用紐西蘭白色雄性兔。運用開放式手術技術。用實驗方法治療每個動物腰脊柱 的3個椎間層面L2-3、L3-4、L4-5或將它們作為對照組觀察。均衡治療這些層面，觀察每個兔的多個部位/盤。在主題設計範圍內，手術前後的比較、盤層面的變化用作對照。
實施例III
通過僅將來轉導的軟骨細胞、僅產生TGF-β 1的軟骨細胞，或混合的細胞(人軟骨 細胞和產生TGF-β 1的軟骨細胞)注射到兔中，阻止損傷的椎間盤退化
實施例I-V中使用的軟骨細胞都是非盤軟骨細胞，並且是從小於2歲孩子手指的 透明軟骨部分中獲得的幼年軟骨細胞。
在腰脊柱椎間盤中進行針穿刺。針穿刺之後，注射產生TGF-β 1的軟骨細胞、原始 未轉導的人軟骨細胞、產生TGF-β 1的軟骨細胞和原始未轉導的人軟骨細胞的混合物、預 處理的未轉導的人軟骨細胞或運載體/培養基。使用多個對照組。實驗條件在下表1中列出ο
表I手術準備 針穿刺
針穿刺針穿刺 針穿刺 針穿刺 針穿刺 未穿刺
合4周注射治療產生TGF-βΙ的軟骨細^< 5 χ IO6個細月 混合產生TGF-βΙ的軟骨細胞 原始未轉導的人軟骨細胞( 3至1的比例，5 χ IO6) 原始未轉導的人軟骨細胞( 5 χ IO6) 預處理的未轉導的人軟骨細胞( 5 χ IO6) DMEM僅針穿刺，未注射未針穿刺未治療的對照組簡言之，在兔或豬的腰脊柱椎間盤中進行針穿刺損傷。在這個針穿刺之後，讓兔愈 然後在第二手術程序中，注射包括產生TGF-β 1的軟骨細胞和/或原始未轉導的 人軟骨細胞( 5Χ105)的實驗治療組合物，或者觀察對照條件(表I)。
在氣管內插管，和例如通過施用鹽酸氯胺酮和Rompun 實現全身麻醉之後，將 動物擺成側臥位。使用乳酸林格液(Lactatedringers)J^] (5ml/kg/hr)。切口區脫毛、備 皮、交替地用聚烯吡酮磺擦洗和酒精擦拭(> 3次)進行常規消毒鋪巾。將溫和的眼藥膏放 在眼睛上。採用左側腹膜後途徑暴露L2 L5 (兔具有6 7個腰椎體)椎間盤的右前面觀。 使用各種準備方案，並將治療方案應用到每個盤層面。對於椎間盤的「針穿刺」準備，使用18 號針穿刺椎間盤，穿刺深度為5mm(Aoki等人〃 Nerve fiber ingrowth into scar tissue formed following nucleus pulposus extrusion in the rabbit anular-puncture disc degeneration model :effects of depth of puncture. " Spine. 2006 ；31 (21) :E774_80)。 穿刺之後，注射表I中列出的測試材料。將測試組合物給予到每隻兔的Ll-2、L2-3、L3-4、 L4-5區中的任何一個中。
每月使用X射線放射圖片監測任何盤的變化。在手術後2、8和M周處死動物。
放射圖片/MRI。相比其它盤層面處的盤，基線處(手術前(pre op))相同盤的盤 高度增大的可檢測的放射圖片的變化指示癒合。僅在針穿刺之前和之後與其它盤相比較，前後均未針穿刺的其它盤隨時間逐漸產生正常退化指數。
逆轉錄PCR。進行逆轉錄PCR從而測定存活的轉染的軟骨細胞相對量。
組織學分析。也利用組織學分析確認膠原蛋白I型和II型的特性，新生軟骨細胞 的大體形態和評價(evaluation)。
Western印跡分析和/或ELISA。膠原蛋白I型和II型的定量表達、蛋白聚糖濃 度、Smads 2/3、Sox_9。另夕卜，利用ELISA評價TGF β-1、BMP2、BMP7、GDF5以及其它具有可 用抗體的相關生長因子。
通過觀察Capase-3的表達，在椎間盤其它組織結構中檢查細胞凋亡情況。
實施例IV
結果
結果如圖和本申請附圖描述中所示。與載體對照組相比，僅用未轉導的軟骨細胞、 僅用轉導的軟骨細胞、僅用預處理的軟骨細胞，或轉導和未轉導的軟骨細胞混合物治療的 穿刺的椎間盤表現出阻止或延緩盤退化的有益作用。
實施例IV-I用混合細胞(轉導和未轉導的軟骨細胞)治療兔穿刺的椎間盤
當對兔測試時，混合細胞的治療具有抗椎間退化的作用。該作用見圖1-4的各個 實驗。圖1A-1F示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放射 圖片；(B)示出手術後四⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中⑴使L1/2盤損傷並注射產 生TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)可以看出脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，和(iii)使L3/4 盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合物；箭 頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出手術後八⑶周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使 L1/2盤損傷並注射產生TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對 照組，和(iii)使L3/4盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的 人軟骨細胞混合物；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射線 放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(E) 示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。(F)示出上 面(C)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。
圖2A-2F示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。㈧示出手術前兔脊柱的MRI放射 圖片；(B)示出手術後四⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中⑴使L1/2盤損傷並注射產生 TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4 盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合物；箭 頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出手術後八⑶周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使 L1/2盤損傷並注射產生TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)可以看出脊柱部位L2/3處無穿刺和無 治療，和(iii)使L3/4盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的 人軟骨細胞混合物；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射線 放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(E) 示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。(F)示出上 面(C)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。
圖3A-3D示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放 射圖片；(B)示出手術後四(4)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射產生TGF-β 1的軟骨細胞，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使 L3/4盤損傷並且注射1 3比例的產生TGF-βΙ的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合 物；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於 獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描 述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。
實施例IV-2用轉導的軟骨細胞治療兔穿刺的椎間盤
產生TGF-β 1的軟骨細胞的治療具有抗椎間退化作用。該作用見圖4A-4D，其示出 損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放射圖片；(B)示出手術後四 ⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中⑴使L1/2盤損傷並注射1 3比例的產生TGF-βΙ 的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合物，( )脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照 組，和(iii)使L3/4盤損傷並注射產生16 -3 1的軟骨細胞；箭頭指向1^1/2和L3/4盤區。 (C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數從而測量 它的形態、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於 獲得椎間盤的盤高度指數。
實施例IV-3用轉導的軟骨細胞和混合細胞治療兔穿刺的椎間盤
產生TGF-β 1的軟骨細胞的治療和混合細胞的治療具有抗椎間退化作用。該作用 見圖5A-5D，其示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放射圖 片；(B)示出手術後四⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中⑴使L1/2盤損傷並注射1 3 比例的產生TGF-β 1的軟骨細胞和未轉導的人軟骨細胞混合物，(ii)脊柱部位L2/3處無 穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損傷並注射產生TGF-β 1的軟骨細胞；箭頭指 向L1/2和L3/4盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤 的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X 射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。
實施例IV-4未轉導的軟骨細胞治療兔穿刺的椎間盤
未轉導的軟骨細胞的治療具有抗椎間退化作用。該作用見圖6-8的各個實驗中。 圖6A-6D示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。㈧示出手術前兔脊柱的MRI放射圖片；(B) 示出手術後四(4)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射細胞培養基 DMEM，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損傷並注射未 轉導的軟骨細胞；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放 射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(D)示 出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。
圖7A-7F示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放 射圖片；(B)示出手術後四(4)周兔脊柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射 細胞培養基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損 傷並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向L1/2和L3/4盤區。(C)示出手術後八(8)周兔脊 柱的MRI放射圖片，其中(i)使L1/2盤損傷並注射細胞培養基DMEM，(ii)脊柱部位L2/3 處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L3/4盤損傷並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向 L1/2和L3/4盤區。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的 盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射線放射 圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。
圖8A-8F示出損傷盤退化的減慢、延緩或阻止。㈧示出手術前兔脊柱的MRI放射 圖片；(B)示出手術後四⑷周兔脊柱的MRI放射圖片，其中⑴通過針穿刺使T12/L1盤 損傷，無注射，(ii)脊柱部位L1/2處無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L2/3盤損傷 並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向T12/L1和L2/3盤區。(C)示出手術後八(8)周兔脊 柱的MRI放射圖片，其中⑴通過針穿刺使T12/L1盤損傷，無注射，(ii)脊柱部位L1/2處 無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L2/3盤損傷並注射未轉導的軟骨細胞；箭頭指向 T12/L1和L2/3盤區。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤 的盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(E)示出上面(B)中描述的兔的X 射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射線放 射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。
實施例IV-5用未轉導的預處理的軟骨細胞治療兔穿刺的椎間盤
預處理的軟骨細胞具有抗椎間退化作用。該作用見圖9A-9D，其示出損傷盤的減 慢、延緩或阻止。(A)示出手術前兔脊柱的MRI放射圖片；(B)示出手術後八(8)周兔脊柱 的MRI放射圖片，其中(i)使L2/3盤損傷並注射細胞培養基DMEM，(ii)脊柱部位L3/4處 無穿刺和無治療，為對照組，和(iii)使L4/5盤損傷並注射預處理的軟骨細胞；箭頭指向 L2/3和L4/5盤區。(C)示出上面(A)中描述的兔的X射線放射圖片，其用於獲得椎間盤的 盤高度指數從而測量它的形態、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射 線放射圖片，其用於獲得椎間盤的盤高度指數。
實施例V
人軟骨細胞來源
原始人軟骨細胞是從軟骨組織中生長的，該軟骨組織是從1歲女性人供體的多指 手指的手術切除物中獲得。多指組織是在手術室中取出的。在生物安全櫃中進行下面程序， 以分離出軟骨細胞。用酒精擦拭含有軟骨組織的塑料瓶，並利用移液管用無菌PBS (IX)清 洗該軟骨組織。通過將7mg膠原酶(Gibco BRL)溶解在IOmLDMEM(含有10% FBS)中並通 過0.2μπι注射器式過濾器(Corning)過濾製備膠原酶溶液。在37°C的震蕩培養箱中用該 膠原酶溶液處理清洗過的軟骨組織17 18小時。第二天，用酒精給該瓶子消毒。用吸管 吹打(pipetted up and down)經膠原酶處理的材料數次，從而從該組織塊中分離出鬆散的 細胞。用吸管吹打之後，將上清液通過70 μ m尼龍細胞過濾器(Falcon)過濾。失去完整性 (例如，鬆散的細胞)的經膠原酶處理的組織可以通過該過濾器。將該細胞濾液收集在50mL 管子(Falcon)中，並然後在1，500rpm下離心5分鐘。丟棄三分之二的上清液，用IOml無 菌PBS(IX)清洗顆粒。再次將該重懸的細胞在l，500rpm下離心5分鐘，並在除去三分之二 的上清液之後，用IOml無菌PBS (IX)清洗。再次將該細胞在1，500rpm下離心5分鐘，並然 後將其重懸在DMEM(含有10% FBQ中。然後，將該重懸的細胞轉移到四個未包被的25cm2 培養瓶中，並在37°C，5% CO2下培養4天。然後將該細胞轉移到兩個未包被的185cm2培養 瓶中。培養該細胞2周，然後收集、清洗並重懸在5 4 1比例的DMEM、FBS和DMSO的冷 凍儲存培養基中。將該細胞等份放入含有ImL 4X IO5ceIlsAiL的細胞懸浮物的冷凍管中。 將該細胞保存在氣相液氮存儲器中。
權利要求
1.一種阻止或延緩椎間盤缺損部位的椎間盤退化的方法，包括將哺乳動物結締組織 細胞注射到所述椎間盤缺損部位。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述結締組織細胞是相對所述哺乳動物的同種異 體型。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞是軟骨細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述軟骨細胞為非盤軟骨細胞或幼年軟骨細胞。
5.根據權利要求3所述的方法，其中所述軟骨細胞為預處理的軟骨細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
7.—種阻止或延緩哺乳動物椎間盤缺損部位的椎間盤退化的方法，包括a)將編碼具有椎間盤再生功能的蛋白質的基因插入到哺 乳動物細胞中，和b)將所述哺乳動物結締組織細胞移植到所述椎間盤缺損 部位。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述基因屬於TGF-β超家族。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述基因編碼TGF-β1。
10.根據權利要求7所述的方法，其中所述結締組織細胞是相對所述哺乳動物的同種 異體型。
11.根據權利要求7所述的方法，其中所述結締組織細胞是軟骨細胞。
12.根據權利要求7所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
13.一種阻止或延緩哺乳動物椎間盤缺損部位的椎間盤退化的方法，包括a)將編碼具有椎間盤再生功能的蛋白質的基因插入到第一哺乳動物結締組織細胞中，和b)將a)中所述哺乳動物結締組織細胞和未經修飾的第二哺乳動物結締組織細胞的混 合物移植到椎間盤缺損部位。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述基因屬於TGF-β超家族。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述第一和第二哺乳動物結締組織細胞是軟骨 細胞。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述軟骨細胞是非盤軟骨細胞或幼年軟骨細胞。
17.根據權利要求13所述的方法，其中所述第二哺乳動物結締組織的所述軟骨細胞是 預處理的軟骨細胞。
18.根據權利要求13所述的方法，其中所述第一或第二結締組織細胞是相對所述哺乳 動物的同種異體型。
19.一種治療患者退化或損傷的椎間盤的方法，包括對需要其的受試者採用根據權利 要求1所述的方法。
20.一種治療患者退化或損傷的椎間盤的方法，包括對需要其的受試者採用根據權利 要求7所述的方法。
21.一種治療患者退化或損傷的椎間盤的方法，包括對需要其的受試者採用根據權利 要求13所述的方法。
全文摘要
本發明公開了一種阻止或延緩椎間盤缺損部位的椎間盤退化的方法，其包括將哺乳動物結締組織細胞注射到所述椎間盤缺損部位。
文檔編號A61K45/00GK102036685SQ200980118119
公開日2011年4月27日 申請日期2009年3月23日 優先權日2008年3月21日
發明者盧文鍾, 康誠佑, 李寬熙, 裵賢友 申請人:組織基因公司