與一種精子區帶結合蛋白的自身抗原性抗原決定基相對應的精子抗原的製作方法

2023-05-18 19:10:46

專利名稱：與一種精子區帶結合蛋白的自身抗原性抗原決定基相對應的精子抗原的製作方法
技術領域：
本發明是在國家健康研究中心授權號No.U54 HD29009的政府資助下完成的。政府對本發明具有確定的權利。
本發明涉及的領域本發明涉及一類抗原，以及用這類抗原進行治療和診斷的方法。這些抗原相關於精子的透明區結合蛋白上的自身抗原性抗原決定基。
本發明的背景自身抗原是一個生物體的組織成分，生物體可以針對這種組織成分產生免疫應答。由這種自身引導的免疫應答產生的疾病就是自身免疫病(或「自身變態反應」)已知精子上的蛋白是有效力的自身抗原，對這些蛋白質的自身免疫已被確信是引起不育症的一個重要原因。
R.Shabanowita和MO』Rand，Ann.NY Acad.Sci 541,621-632(1988)，在圖7中描述了各種對人透明區有親和性的人蛋白質。
M.O』Rand和E.Widgren，U.S.Patent No.5,175,148，公開了一種相關於兔精上膜自身抗原(RSA)的一種自身抗原性表位的精子抗原。RSA現已知是一個蛋白家族，有4種低分子量糖蛋白(RSA-1，2，3，414K，16K，17K，18K)，其功能是充當高親和性區結合蛋白。對兔RSA3(也稱「Sp17」)的克隆化在R.Richardson and M.O』Rand，Mol.Biol.Cell.3，15a(1992)中有描述。
本發明的概述本發明的一個方面是分離的編碼人Sp17蛋白或抗原性肽的片段的DNA，選自由下列物質組成的組中(a)能編碼人Sp17蛋白的DNA分離物(如SEQ ID No1的DNA)此Sp17蛋白具有本文給出的SEQ ID No2的胺基酸序列；(b)能與上面(a)中的DNA分離物雜交，並能編碼一種人Sp17蛋白的DNA分離物；(c)由於遺傳密碼的簡併性而在核苷酸序列上不同於上述(a)和(b)的DNA分離物，且它編碼一種人Sp17蛋白；(d)前述的能編碼抗原性肽的片段(即能與可結合人Sp17蛋白的抗體結合的肽，正如下面將描述的，典型的這種肽長6至25個胺基酸)。這些蛋白和肽有時在下文中就稱作「抗原」，它們都可用作免疫避孕製劑和/或用於診斷自身免疫性不育症，就如下文所要討論的。
本發明的第二個方面是一個重組DNA序列，它包括載體DNA和一個上述的DNA，本發明的第三個方面是一種宿主細胞，它包含上文給出的一個重組DNA序列，並能表達由此DNA序列編碼的Sp17蛋白及其抗原性肽片段。
本發明的第四個方面是抗原性肽(下文也稱作「抗原」或「多種抗原」)，可用作免疫避孕試劑或用於診斷自身免疫性不育。這種肽選自由下列物質組成的組中(1)哺乳動物Sp17蛋白的長為6至25個胺基酸的抗原性片段；(2)其抗原性等同物，所說的抗原性等同物是(a)一個修飾過的片段，包含經過在其序列上取代一或多個胺基酸而修飾得到的所說的抗原性片段，或(b)插入上述抗原性片段的序列中的一個更長的肽，它具有(i)多達4個另外的胺基酸殘基附著在上述序列的C-末端，(ii)多達4個另外的胺基酸殘基附著在上述序列的N-末端，或(iii)多達4個另外的胺基酸殘基附著在上述序列的C-末端並同時有多達4個胺基酸殘基附著在上述序列的N-末端，其中所說的抗原性等同物與結合哺乳動物Sp17蛋白所說的抗原性片段的抗體相結合。哺乳動物Sp17蛋白的抗原性片段選自由下列物質組成的組中(i)胺基酸4到胺基酸28片段，(ii)胺基酸34到胺基酸49片段，(iii)胺基酸55到胺基酸82片段，(iv)胺基酸117到胺基酸137片段，(v)在(i)至(iv)的片段中長至少有6個胺基酸的片段。
本發明的第五個方面是一種免疫避孕法，它包含給一個受試者(例如，一個女性受試者)服用有效劑量的上述抗原，以減少該受試者的生育力。
本發明的第六個方面是一種免疫避孕疫苗組合物，包含上面所提到的使受試者減少生育力的有效劑量的抗原與一個藥用上可接受的載體的組合。
本發明的第七個方面是檢查受試者(例如，一個男性受試者)的自身免疫不孕症的方法，包括檢測該受試者體內能結合上文提到的抗原的抗體的存在，而這種抗體的存在表明該受試者患有自免疫不孕症。
本發明的第八個方面是一種無毒宿主細胞(例如，一種微生物宿主細胞)，它包含一個能編碼上文提到的抗原的重組DNA序列，它還能表達這種編碼抗原。
本發明的第九個方面是一種免疫避孕疫苗配方，包含減少受試者的生育力有效量的上述無毒宿主細胞與一種藥用上可接受的載體的組合。
前述文中一個較優選的實施方案中，無毒微生物缺乏能編碼β-天門冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的一種天然功能性染色體基因，卻包含能編碼一種功能性asd多肽的重組基因。此重組基因與上文提到的編碼一個或多個抗原的一個或多個基因相連。此無毒微生物可能還包括一個突變的cya基因，使這種微生物事實上不能產生功能性腺苷酸壞化酶；而且/或者此微生物還有一個突變的Crp基因，使它事實上不能產生功能性環AMP受體蛋白。
在本文附圖和下文提供的說明書中更詳細地解釋本發明。
附圖的簡單描述

圖1顯示了來自注射了其自身精子的雄兔的抗血清，與具有本文公開的SEQ ID NO3到SEQ ID NO49的胺基酸序列的兔Sp17系列十肽的結合。在此圖中，每個十肽的SEQ ID NO數均提示在其左和/或右側。
圖2顯示了來自4例有高滴度抗精子抗體的切除輸精管的男性的血清庫，用圖1所用的兔Sp17系列十肽進行測試的結合情況。圖中所有峰值表示人自身抗原性，B細胞抗原決定基。
圖3顯示了圖1所述的系列十肽與來自用兔Sp17重組抗原免疫的雌兔的免疫血清的結合情況。
圖4顯示了圖1所術的系列十肽與用合成肽G22C免疫的雄兔體內提取的免疫血清的結合情況。
圖5顯示了圖1所示的系列十肽與用合成肽G22C免疫的雌兔體內提取的免疫血清的結合。
圖6描繪了用重組Sp17(融合蛋白)免疫小鼠對生育力的影響。六隻小鼠接受了人Sp17。佐劑對照(例數為12)只接受了TITERMAXTM佐劑(由Sigma co.，St.Louis提供)。還有6隻小鼠未接受注射。可見經人Sp17重組蛋白免疫的小鼠，其懷孕率下降了42％。
圖7給出了兔(RABSP17)，小鼠(MUSSP17)，和人(HUMSP17)的Sp17蛋白序列的序列對比。抗原性片段以黑框表示。數字編序是在人的序列編數的基礎上從N-未端偏到C-末端，在另外幾種哺乳動物的序列中有中斷處，是為了使黑框中顯示自身抗原性片段的序列對比最大，編數時跳過了這些中斷處，使幾種物種之間的自身抗原性片段的編數在黑框中有相關性。
本發明的詳細描述本文公開的胺基酸序列是從左至右按氨基端到羧基端的方向顯示的。但序列中沒有顯示氨基和羧基的基團。本文中核苷酸序列只以單鏈形式，按5』-3』方向，從左至右顯示。本文中核苷酸和胺基酸，是按IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議的方法，或(對胺基酸)是按三字母密碼來描述的，與37CFRξ1.822和已建立的用法相一致。例如見Patent In User Manual，99-102(Nov.1990)(U.S.Patent and Trddemark Office，Office of theAssistant Commissioner for Patents，Washington，D.C.，20231)；U.S.Patent No.4,871,670 to Hudson et al.at Col.3 lines 20-43(申請人特別指明，本文以參考文獻的形式引用這個所有其他專利說明書以供參考)A、分子生物學編碼人Sp17蛋白的DNA，不管是cDNA還是基因組DNA，都能編碼一種以高親和力，通過結合硫酸化的複合碳水化合物而結合到人透明區的，分子量約17kd(千道爾頓)的蛋白質。這個定義包括了該DNA天然的等位基因變異。
那些能與本文公開的編碼人Sp17蛋白的DNA雜交的編碼Sp17蛋白的DNA，可能來自任一生物種，包括鼠類(小鼠，大鼠)，兔，貓，豬，人，猴，或狒狒，但優選編碼哺乳動物來源的一種Sp17蛋白最優選編碼人Sp17蛋白。合成型DNA可依照已知技術製備。
允許其他編碼有關Sp17蛋白的表達的DNA序列與本文提到的DNA序列進行雜交的雜交條件，一般是高度嚴格條件。例如，在一個標準的原位雜交試驗中，這種序列與本文公開的DNA(如SEQ ID No1)的雜交在由0.3M氯化鈉，0.03M枸櫞酸鈉，0.1％ SDS於60℃或甚至70℃下的洗滌嚴格性提供的條件下進行(見J.Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Ld Ed.1989)(Cold Spring Harbor Laboratory))。
通常，編碼Sp17蛋白，並能與本文所示編碼人Sp17蛋白的DNA序列雜交的DNA序列，至少與本文所公開的編碼人Sp17蛋白的DNA序列有70％，75％，80％，85％，90％，或甚至95％或更多的同源性。
一般說來，編碼人Sp17蛋白，並能與本文所公開的編碼人Sp17蛋白的DNA雜交的DNA序列，與本文所公開的編碼人Sp17蛋白的DNA序列有93％，94％，95％，96％，或甚至97％或更多的同源性。
而且，編碼與前述序列編碼的Sp17蛋白完全相同，但又因遺傳密碼子的簡併性而產生不同的密碼子序列的這種DNA序列，也是本發明的一個方面。這種遺傳密碼子的簡併性(能允許不同核苷酸序列編碼同一種蛋白或肽)在文獻中是熟知的。例如見U.S.Patent No.4,757,006 to Toole et al.，at Col.2，Table 1.
用遺傳工程來生產克隆化的基因，重組DNA，載體，轉化的宿主細胞，蛋白和蛋白片段已是眾所周知。例如見U.S.Patent No.4,761,371 to Bell et al.et Col. 6 line 3 to Col.9 line 65；U.S.PatentNo.4,877,729 to Clark et al.，at Col.4 line 38 to Col.7 line 6；U.S.Patent No.4,912,038 to Schilling at Col.3 line 26 to Col.14 line 12；and U.S.Patent No.4,879,224 to Waallner at Col.6 line 8 to Col.8line 59.
載體是一種可複製的DNA結構。載體在本文中既用來擴增本文提到的編碼Sp17蛋白的DNA，也用來表達本文所給的編碼Sp17蛋白質的DNA。表達載體是這樣一種可複製的DNA結構其中的編碼一個Sp17蛋白的DNA序列有效地連接到一個適當的控制序列上，該控制序列能影響該DNA序列在合適的宿主中的表達。對這種控制序列的要求根據所選擇的宿主和所選用的轉化方法不同而不同。通常情況下，控制序列包括一個轉錄啟動子，一個控制轉錄的可任選的操縱子序列，一段編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列，以及控制轉錄和翻譯終止的各種序列。典型的載體包括(但不局限於)質粒，病毒，噬菌體，及可整合的DNA片段(即能經重組整合進宿主基因組的片段)。
DNA區在功能上互相相關時，以可操作的方式連接或以可操作的方式相關聯。例如如果某個啟動子控制編碼序列的轉錄，就把它有效地連到這個編碼序列上，如果一個核糖體結合位點的位置使其得以翻譯，就把這個位點有效連接到編碼序列上。
轉化的宿主細胞是那些用包含有本文所公開的一段DNA序列，並以重組DNA技術構建的載體進行了轉化或轉染的細胞。轉化的宿主細胞通常表達相應受體，但那些轉化目的是為了克隆或擴增受體DNA的宿主細胞就不必表達受體。
合適的宿主細胞有原核生物，酵母或高等真核生物的細胞(如哺乳動物細胞和昆蟲細胞)。來自多細胞生物體的細胞是重組Sp17蛋白合成的特別合適的宿主，而哺乳動物細胞又是特別優選的。這些細胞在細胞培養中的繁殖已成為一個常規的程序(TissueCulture，Academic Press，Kruse and Patterson，editors(1973))。有用的宿主細胞系的例子有VEDRO和Hela細胞，及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。用於這些細胞的表達載體一般包括(若是必需)一個複製起點，一個位於編碼所需表達的Sp17蛋白的DNA上遊並有效相聯的啟動子，還有一個核糖體結合位點，一個RNA剪位點(如果用的是含內含子的基因組DNA)，一個多聚腺苷酸化的位點，和一個轉錄終止序列。
轉化脊椎動物細胞所用的表達載體上的轉錄和翻譯控制序列往往是病毒來源的。例如，最常用的啟動子就是來自多形瘤，腺病毒2，和猴病毒40(SV40)。例如見U.S.Patent No.4,599,308。
複製起點既可以通過構建包括外源性起點，諸如來自SV40或其他病毒(例如多形瘤，腺病毒，VSV或BPV)的起始點來提供也可以由宿主細胞染色體複製機制提供。如果載體整合到宿主細胞染色體上，那麼後續步驟就往往是有效的。
除了使用含病毒性複製起點的載體外，可使用用選擇性標記和受體DNA共轉化的方法轉化哺乳動物細胞。適合的可選擇標記的例子有二氫葉酸還原酶(DHFR)或胸腺嘧啶脫氧核苷酸激酶。此方法在U.S.Pat.No.4,399,216中有進一步的描述。
在實施本發明時，可使用象昆蟲細胞(例如，培養的草地貪夜蛾細胞)這樣的宿主細胞，和象杆狀病毒表達載體這樣的載體。就象U.S.Patents Nos.4,745,051 and 4,879,236 to Smith et al所描述的那樣。
原核生物宿主細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性的生物體，例如大腸桿菌(E.coli)或芽胞桿菌。
真核微生物如酵母菌培養物也可以被帶有本文所公開的分離的DNA的載體所轉化。例如見U.S.Patent No.4,745,057。在較低等的真核宿主微生物中，最常用的是啤酒糖酵母菌，儘管一般可得到很多其它的菌株。B、肽本發明作為實例的抗原性片段中的一組(如本文圖1所描述)是選自由具有本文所給出的胺基酸序列的肽組成的組中SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO34，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQID NO43，和其長度至少是6個胺基酸的片段。其中，尤其優選的是選自由含有本文以下給出的胺基酸序列的肽組成的組中的抗原性片段SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ.ID NO16，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQID NO27，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ IDNO43，和其長度也至少有6個胺基酸的片段。
本發明抗原性片段的另一組實例(如本文圖2所描述)，是選自由有本文以下所給出的胺基酸序列的肽組成的組中SEQID NO3，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ IDNO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ IDNO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO43，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，和其至少有6個胺基酸長的片段。其中，尤其優選的抗原性片段選自由含本文以下所給出的胺基酸序列的肽組成的組中SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO14，SEQ IDNO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO34，SEQ ID NO40，SEQ ID NO43，和其至少有6個胺基酸長的片段。
一般來說，較長的肽優選包括上述抗原性肽的序列，較長的肽使抗原性序列在分子上處於暴露的位置，而不是埋在分子內部使不能結合。較長的肽也最好是在其抗原的N末端和C末端都只附帶不超過4個的附加胺基酸，因為這樣長度的序列一般不會在較長的肽上提供一個額外的表位，從而也就不會有害於抗原的活性。
實施本發明所用到的肽包括它的類似物。本文中所用的類似物都是化合物，它們不具備與上述肽相同的胺基酸序列，但有相似的三維結構。在與受體相互作用的蛋白分子中，蛋白與受體的相互作用可能在一個穩定的三維分子上的表面易接近部位發生。通過將關鍵性結合位點的殘基安排成一種恰當的構象，這樣就根據現有技術設計和合成出了摹仿本發明中肽的基本表面特徵的肽。測定肽和它的類似物的三維結構的方法已知，有時這些方法又稱作「合理藥物設計技術」。例如見U.S.Patent No.4,833,092,to Geysen；U.S.Patent No.4,859,765 to Nestor；U.S.Patent No.4,853,871 to Pantoliano；U.S.Panent No.4,863,857 to Blalock；(申請人特別指出本文所引證的所有美國專利文獻，以其全文編入本文以供參考)。也見Waldrop，Science，247，28029(1990)；Rossmann，Nature，333，392-393(1988)；Weis et al.，Nature，333，426-431(1988)。構建並篩選肽序列庫，以鑑定出能與所給蛋白特異性結合的肽的技術是已知的。Scott and Smith，Science，249，386-390(1990)；Devlin et al.，Science，249，404-406(1990)。而且，本領域的技術人員可預料到在不對其活性造成過度不利的影響的情況下，可以對本發明中肽的胺基酸序列進行輕微的缺失和替換。因此，包含這種缺失或替換的肽是本發明的另一方面。
在有胺基酸缺失或替換的肽中，一個或更多肽序列中的胺基酸可能會被一個或更多的不影響序列抗原性的其他胺基酸所取代。這種轉變可以由已知的胺基酸之間在物質特徵諸如電荷密定，疏水性/親水性，大小和構型上的相似性來指導完成，從而使胺基酸可被有基本上相同的功能特性的其他胺基酸所替代。例如丙氨酸可被纈氨酸或絲氨酸取代；
纈氨酸可被丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或異亮氨酸取代，優選是丙氨酸或亮氨酸；亮氨酸可被丙氨酸、纈氨酸或異亮氨酸取代，最好是纈氨酸或異亮氨酸；甘氨酸可被脯氨酸或半胱氨酸取代，最好是脯氨酸；脯氨酸可被甘氨酸，半胱氨酸，絲氨酸或甲硫氨酸取代，首選甘氨酸，半胱氨酸或絲氨酸；半胱氨酸可被甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或甲硫氨酸取代，優選脯氨酸或甲硫氨酸；甲硫氨酸可被脯氨酸或半胱氨酸取代的，優選半胱氨酸；組氨酸可被苯丙氨酸或穀氨醯胺取代，優選苯丙氨酸；苯丙氨酸可被組氨酸，酷氨酸或色氨酸取代，優選組氨酸或酷氨酸；酷氨酸可被組氨酸，苯丙氨酸或色氨酸取代，首選苯丙氨酸或色氨酸；色氨酸可被苯丙氨酸或酷氨酸取代，首選酷氨酸；天冬醯胺可被穀氨醯氨或絲氨酸所取代，優選穀氨醯胺；穀氨醯胺可被組氨酸，賴氨酸，穀氨酸、天冬醯胺或絲氨酸取代，首選天冬醯胺或絲氨酸；或絲氨酸可被穀氨醯胺，蘇氨酸，脯氨酸、半胱氨酸或丙氨酸取代；蘇氨酸可被穀氨醯胺或絲氨酸取代，首選絲氨酸；賴氨酸可被穀氨醯胺或精氨酸取代；精氨酸可被賴氨酸、天冬氨酸或穀氨酸取代，首選賴氨酸或天冬氨酸；天冬氨酸可被賴氨酸、精氨酸或穀氨酸取代，首選精氨酸或穀氨酸；穀氨酸可被精氨酸或天冬氨酸取代，首選天冬氨酸。
取代一旦完成，就可以按常規篩選變異體來測定這種取代對與可結合該抗原的抗體的抗原性的影響。
本文用到的「抗原性等同物」這個術語，是指與相應抗體結合的蛋白或肽，此抗體與蛋白或肽的結合用於尋找建立的等同物。用於選擇這類抗原性等同物的抗體在本文中稱作「選擇抗體」。抗原性等同物可以經修飾天然序列中的反應部位而形成，也可以經修飾N-末端氨基和/或C-末端羧基形成。這類等同物包括由酸和/或鹼形成的各種鹽，(特別是生理學上可接受的無機或有機酸和鹼)。其他等同物包括抗原上已修飾過的羧基和/或氨基，以產生酯或醯胺，或是胺基酸保護基團如N-叔-丁氧基羰基。
較優選的修飾是那些提供更穩定，更有活性，更不易在體內被酶降解的肽的修飾。C、免疫避孕方法正如前面提到的，本發明提供了一種免疫避孕方法，它包括對受試動物施用上文描述的抗原，使用的劑量足以使該受試動物減少生育力。生育力的部分下降(即反映在一個受試群體中生育力減少的效應)都可包括在本發明的範圍內。
不管是鳥類還是哺乳類動物都可用本發明的免疫避孕法處理。哺乳動物的例子包括小鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬和人。優選哺乳動物受試者。受試者可以是雄性或雌性。抗原可以以任一適當的方式施用給受試者。例如肌肉注射，皮下注射，靜脈注射，腹膜內注射，口服和鼻噴霧。
施用抗原的量取決於諸如用藥途徑、物種、和應用加強劑量這樣的因素。通常用每磅受試體重約0.1到約100μg的劑量，尤其是每磅約1μg。
本發明的免疫避孕法打算在人和獸醫中推廣，因而本發明的抗原將製備成人和獸醫疫苗組合物。本發明的疫苗組合物包括存在於藥用上可接受的載體中的抗原。此抗原在載體中有足夠有效的量而使處理的受試者減少生育力。藥用上可接受的載體最好是液體，尤其是水性的載體，如磷酸鈉緩衝的鹽水。疫苗配製品可保存在無菌玻璃容器內，用橡皮塞封口，以便用注射器注入液體或抽出配製品。
本發明的疫苗組合物可任選地含有一種或多種佐劑。任何適合佐劑均可使用。例如氫氧化鋁，磷酸鋁，植物油和動物油，及類似質，佐劑的使用量取決於所使用的某種佐劑的特性。此外，疫苗組合物可能還包含一種或多種穩定劑，例如糖類(諸如山梨醇、甘露醇、澱粉、蔗糖、糊精和葡萄糖)，蛋白質(如白蛋白或酪蛋白)，和緩衝液(如鹼金屬磷酸鹽和類似物)。D、診斷方法本發明的診斷方法中提供了一種診斷男性和女性受試者的自身免疫性不育症的方法。「自身免疫」這個術語在此是一般意義上的用法，即女性受試者的免疫是針對外來的精子。
任何檢測抗體的常規程序均可用於實施本發明的診斷試驗，包括凝集和沉澱反應，放射免疫分析，酶免疫分析(例如U.S.Pat.No.3,654,090)諸如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，多相螢光免疫分析(例如U.S.Pat.Nos.4,201,763；4,171,311；and 3,992,631)和同質(不需分離)免疫分析。一般見Basic and ClinicalImmunology，364-73(J.Fudenberg et al.，eds.3d Ed.1980)，優選ELISA。
在一個優選的實施方案中，將來自人的待測血清與上述抗原相接觸，使血清中的抗體能在溶液中與抗原反應。優選抗原結合在一個固相支持物上，但如果是用同質(不經分離)免疫分析法檢測抗體，就不需固相支持物。
從一個人身上獲取血清常常是用刺手指的辦法，這樣獲得的是全血(血清是其中一個成分)。然而，可處理血液以獲得全血中的單純血清或血漿部分，然後使血清與結合在固相上的抗原接觸。從病人那獲取血清或血漿的任何方法均可使用，只要其中所含抗體保持與抗原結合的活性。
抗原可用已知技術結合到固相支持物上。如，可用一個雙功能有機分子將抗原附著到固相支持物上。固相可由這樣的材料製備諸如塑料(例如微滴板上孔的底面)，玻璃纖維，醋酸纖維素和硝酸纖維(例如圓片)。抗原附著或吸附到固相支持物上之後，如果需要，抗原可交叉聯接。
只有完成可檢測的抗體與固相載體的接觸這一步，才能使可測的抗體與固著在固相載體上的抗原相互作用。可測的抗體是能與病人血清中結合純化抗原的抗體再結合的抗體，且它又是可以檢測的。更具體地說，這種可測抗體可以是一種抗人免疫球蛋白，它能偶聯一個酶分子這樣的基團，當有底物存在時就可檢測出。優選經親親和純化的酶聯山羊或兔抗人抗體。通常，偶聯到可測的抗體上的可測基團可以是任何一種酶，或是其他為免疫試驗形成的可檢測的種類。例如，酶，螢光素基團，放射活性基團和其他可用的基團。特別優選的酶是過氧化酶，當過氧化酶作為可測基團偶聯上可測抗體時，可使用象3.3』，5.5』-四甲基聯苯胺或O-苯二胺這樣的物質作底物來檢測可測的抗體。
檢測與人抗體反應的可測抗體的步驟包括對偶聯在可測抗體上的可測基團進行處理，從而測定它的存在。例如，如果一個象過氧化酶這樣的酶分子偶聯在抗體上，檢測步驟就可包括加一種過氧化酶的底物到結合的抗體上，再觀察顏色變化，即過氧化酶催化底物轉變成一種有顏色的物質。至於其他酶，如鹼性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶，可用其他底物。所用的底物應該這樣選擇在酶催化底物化學轉變形成一種產物之後，能出現實驗者可觀察到的變化，這樣的底物才能用。象3.3』，5.5』-四甲苯聯苯胺，P-硝基苯磷酸或3.3』-二氨基-聯苯胺這樣的物質就可作為底物。其他可檢測的基團也可以偶聯到抗體上。
可以裝配一個試劑盒，它包含要完成檢測血清抗體的診斷試驗所需要的各種成分。此盒包括一個包裝，內有包被在象微滴板小孔底部或硝酸纖維素或醋酸纖維素圓片這樣的固相支持物上的純化抗原；還有一個容器，內有一種可檢測的抗體結合物，它能結合來自病人血清中的抗體，而後者又能結合到抗原上。最優選的試劑盒是一種ELISA試驗，因為它有助於較易檢陽性或陰性診斷。這樣一來，試劑盒還應收藏一個容器，其中有能與結合在可測抗體上的酶反應的底物，當此底物與酶反應後就可以很容易地檢測出來。診斷試劑盒中所用的抗原優選基本上或必須不含其它蛋白質。E、無毒性載體細胞如上所說，本發明用到象微生物這樣的無毒性載體細胞來施用抗原。這個方法尤其合適，因為適當的載體微生物能刺激針對它們所表達的抗原的SIgA的產生。適合的無毒性載體細胞包括植物載體細胞和微生物戴體細胞，其描述見R.Curtiss，VaccinesObtained from Antigenic Gene Products of Recombinant Genes，U.S.Patent No.4,888,170，R.Curtiss and G.Cardinean，OralImmuvization by Transgenic Plants，PCT Application WO90/02484，及R.Curtiss，Recombinant Avirulent SalmonellaAntifertility Vaccines，PCT Application WO 92/09684，本文引用其說明書以供參考。
通常情況下，帶有一個或多個配子特異性抗原的基因的重組質粒可以被導入數個無毒性細菌菌株之一。這種細菌帶有基因突變，使它在靶宿主內能長期存活。有用的無毒性微生物包括(但不局限於)沙門氏菌，大腸桿菌與沙門氏菌雜交種的突變衍生物。較優選的微生物是沙門氏菌屬中的成員，象鼠傷寒沙門氏菌，傷寒桿菌，副傷寒桿菌，雞沙門氏菌，雞瘟沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌，亞利桑那沙門氏菌或都柏林沙門氏菌。鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的無毒性衍生種在很多宿主中廣泛應用。雞沙門氏菌、雞瘟沙門氏菌和亞利桑那沙門氏菌的無毒性衍生種特別用於免疫鳥類生物，而鼠傷寒沙門氏菌，傷寒桿菌和副傷寒桿菌常是人類應用的優選菌。豬霍亂沙門氏菌較優選用於免疫豬，而都柏林沙門氏菌用於牛。
特殊的應用是用Cya，Crp和asd突變中的一個，兩個或全部三個，它們在宿主中不能產生相關的功能性蛋白，從而使生長受挫。不過，本發明中也使用了其他無毒性微生物。它們包括aroA，aroB，galE，phoP，cdt，omoR和htrA突變株。如果用的是Asd突變，那麼所感興趣的抗原是用一個既能編碼此抗原，又能編碼asd的載體轉到載體微生物中去的。這樣一來，只有那些包含所希望的配子特異性抗原的載體微生物能存活，並被選擇出來作進一步應用。編碼所期望的抗原的重組基因的表達取決於連接asd基因的控制序列。這種連接可能是在載體中對兩個基因的定向作用所致，以使兩個基因都處在同一控制因素的控制之下，即有相同的啟動子和操縱子。
cya突變株和/或crp突變株可被進一步突變，優選經缺失而突變，位置在crp基因鄰近的主管沙門氏菌毒力的一個基因中。這個cdt基因的突變，減小了細菌在深部組織如脾臟中有效繁殖的能力。當一個帶crp+基因的質粒被放入Δ(crp-cdt)的菌株中時，它將保持其無毒性和免疫原性，因而具有與cya和crp突變株相似的類型。有Δ(crp-cdt)突變並在質粒上帶有crp+基因的突變株保持了在腸道和GALT中繁殖的正常能力，但在更深部組織中繁殖的能力減弱。
為刺激更好的免疫應答，優選將微生物或基因產物直接等入消化道或支氣管，如經口服，鼻內用藥，胃插管或氣霧劑形式，以及氣本接種(只用於鳥)，和氣管內接種。其他合適的方法包括經結膜至副淚腺途徑的用藥和乳房內接種。使用疫苗的其他方法，諸如靜脈內，肌肉內，或皮下注射也是可能的，並主要用於刺激再次免疫應答，就象下文要進一步描述的那樣。
一般情況下，當表達抗原的載體微生物用於人或其他哺乳動物時，它們應存在於一個藥用上可接受的載體上。如，載體微生物可以是包有腸溶衣的，也可以是用適當的明膠樣物質包裹的，就如本領域所熟知的那樣(Cryzand Glück，1990，in G.Woodrow and Mr.Leuine，New generation Vaccines，MarcelDekker，New York，pp.921-932)一旦載體微生物出現在動物體內，抗原對動物的免疫系統應變得可得到。這可以通過載體微生物的死亡導致抗原分子的釋放來完成。當然，使無毒性突變株發生「滲漏」而釋放胞質中的成分，但並不裂解細胞，這也是有可能的，作為選擇，可選擇一個基因來控制抗原的產生，使載體細胞能在它死亡之前就有效地產生抗原到胞外環境中。
抗原也可能以氣霧劑形式或經鼻內使用。用於受試病人的鼻內組合物常含有載體，使它既不刺激鼻黏膜，又不會明顯幹擾纖毛的功能。本發明中也採用稀釋劑，如水，鹽水或其他已知物質。鼻用組合物還要包括保存劑，如氯丁醇和苯甲烴銨氯化物，但不限於此。其中可能還有表面活性劑，來增強上述蛋白對鼻黏膜的吸附。
以前的口服、鼻內、胃或氣霧劑免疫還可與配子特異的抗原注射相結合。一旦這種對配子特異性基因產物的分泌性免疫系統被表達配子特異性基因產物的載體微生物的免疫所引發，則這類非腸道免疫可作為一種加強劑增強分泌性免疫應答的表達。這種增強的應答即所謂的次級應答，加強應答或免疫回憶應答，它可導致延長宿主的免疫保護。可以重複多次加強劑量的免疫以產生有利的結果。
當疫苗被製備作注射用時，例如對於加強劑，它們既可以製成液體溶液或懸液；注射前存在於以液體為媒介物的溶液中或懸浮液中的適當的固態形式也是允許的。該製品還可以乳化，或將活性成分包在脂質體媒介中。活性免疫成分常與含有藥用上可接受的，且與活性成分相配伍的賦形劑的載體混合。例如合適的載體是，水、鹽水、葡聚糖、甘油、乙醇、或類似的物質，及其組合。此外，若是有要求，載體可以含有小量的輔助物質，如溼劑或乳化劑，pH緩衝劑，或能增強疫苗效力的佐劑。佐劑包括諸如胞壁醯二肽，avridine，氫氧化鋁，油，皂素和其它本領域已知的物質。這種劑量形式製備的實際方法對本領域的技術人員而言是已知的或顯而易見的。例如見Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Pubishing c ompany，Easton，PA，15th ed.，1975。無論怎樣，所施用的組合物或配製品含有足以在受治療的病人體內達到預期的免疫狀態劑量的蛋白質。
抗原的用量取決於接受治療的病人，其免疫系統合成抗體的能力，以及預期達到的保護程度。有效劑量可由本領域的普通技術人員通過建立劑量反應曲線的常規試驗易於確立。病人用某一特殊抗原，或其片段，或其類似物至少免疫一次。使用載體微生物時，典型的劑量大約是1×106-1×1010重組無毒性細菌/每個免疫的病人。對受試病人可能會增加用藥量或採用多劑量免疫，以達到所要求的對配子特異性抗原的免疫狀態的維持。
同時或連續施用不止一種抗原也是可取的。要完成它，可以是施用一種無毒性載體，而其基因可編碼不止一種的配子特異性抗原，也可以是施用不同的載體生物。
在以下非限制性實施例中對本發明作了解釋。
實施例1對人類精子區帶結合蛋白Sp17的克隆和測序我們以前已報導了兔Sp17的克隆和測序資料(Richardsnand Rand，Mol.Biol.Cell 3，15a(1992))。這種蛋白已知是兔睪丸/精子自身抗原中兔精子抗原(RSA)家族的一員，而且在小鼠中也表達。對人類中這種蛋白相似物的進一步研究是始於用兔Sp17基因的蛋白編碼區作為探針來篩選一個人類睪丸cDNA文庫。有一個克隆有1287個鹼基對(1287bp)其中在核苷酸水平上與兔Sp17基因有71％完全相同，包括一個455bp的開放性閱讀框架，另還有本文給出的SEQ ID No1序列。此克隆能編碼一個有151個胺基酸的蛋白，具有本文所給的SEQ ID NO2序列，其蛋白分子量約17，534 Da，與兔Sp17有76.7％相同，與小鼠Sp17蛋白序列有76.8％相同。尤其是開始44個胺基酸在小鼠、兔和人的序列中完全相同，並與依賴人睪丸cAMP的IIα型蛋白激酶調節亞單位二聚體相互作用位點有43％同一性。有趣的是，將兔、鼠、人的胺基酸序列進行比較顯示出人Sp17在其分子中心部位缺失一個半胱氨酸殘基，而其他兩類的序列都有這個基因。對鼠、狒狒和人組織的系列作Northen印跡分析顯示出睪丸內的基因表達有一個高度限制模式。此外，Northern分析還揭示出在人類睪丸中有大小約1.3kb和0.9kb的兩個完全不同的轉錄本。針對Sp17重組蛋白(rSp17)的抗血清已產生，並用於人精子細胞溶解產物的Western印跡中，以顯示29KDa的非主要免疫反應性蛋白。此抗原用抗-rSp17經免疫螢光在人精子上進行了定位。在ELISA中，rSp17顯示出對巖藻多糖的結合有飽和的動力。來自有抗精子抗體滴度的切除輸精管的男性的血清也顯示對rSp17有反應性，這暗示人sp17是一種人精子自身抗原。
實施例2系列十肽的產生和免疫分析程序一個系列的47個N-末端乙醯化的系列十肽，(是相關於兔Sp17蛋白片段的)，已依照已知技術合成出來了；本文以SEQ IDNo3到SEQ ID No49公開了這些十肽。
依照已知程序(例如見MO』Rard et al.Dev.Biol.129，231(1988))根據廠家的說明書改成MULTIPINTM系統進行了酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，(Chiron Mimotopes Pty.Ltd.，Clayton，Victoria，3168 Australia)。在下文顯示的ELISA數據中，已按標準技術從實驗組O.D值中減去了來自正常對照組受試者的IgG的對照O.D.值。
實施例3針對肽G22C的抗體的生產肽G22C，是相關於兔Sp17從胺基酸61到胺基酸82的片段(並有GAKVDDRFYNNHAFQEHESEKC序列)，它已在SalkInstitute按與NIH的合同N01-HD-O-2906，根據標準技術合成出來了。
雄兔和雌兔用其C-末端半胱氨酸上偶聯了鑰孔血藍素
(KLH)的G22C肽進行免疫。偶聯是用Ellman’s試劑，得自Pieree Scientific的5，5』-二硫-二-〔2-硝基苯甲酸〕以IMJECT免疫原偶聯試劑盒的形式進行的。每隻兔子接受300μg溶於完全福氏佐劑的連接物的皮下注射，3周後再注射200μg溶於不守全福氏佐劑的連接物，再過3周，最後注射100μg溶於不完全福氏佐劑中的連接物。連接物是在100μl水中用佐劑作1∶1稀釋而成的。
實施例4兔自身免疫性血清對兔Sp17系列十肽的結合一隻雄兔用它自己的精子注射，使它產生自身免疫性抗血清。具體地說，2mg精子用PBS洗三次，重新懸浮於0.5ml PBS，用福氏完全佐劑按體積比作1∶1稀釋，再進行皮下注射。一個月後加強注射一次，再過兩周作第二次加強注射，再過兩周第三次加強注射，此後三個月後第四次加強注射。免疫血清用上述ELISA方法，以上述系列十肽進行篩選。結果如圖1所示。請注意一組潛在性自身抗原性表位。
實施例5混合人自身免疫血清對兔Sp17系列十肽的結合圖2顯示了來自4個切除輸精管的男性的血清等體積混合後的結合，如上文所述，經ELISA測試其中針對連續十肽的抗精子抗體滴度很高。請注意圖2中所有的峰均代表人自身抗原性B細胞表位。
實施例6用Sp17免疫過的兔血清對兔Sp17連續十肽的結合來自一個經重組兔Sp17融合蛋白免疫的雌兔血清對系列十肽的結合，如圖3所示。
這個重組融合蛋白是用以下引物經PCR產生的正鏈是5』-CGCGGATCCATGTCGATTCCATTTTCC-3』，內有Bam HI位點，負鏈是5』-CGGGGTACCGCCAGTGCC-CTCAATTGT-3，內有KpnI位點。PCR產物直接克隆進PQE-30的多接頭區，測序以證實插入部分的完整，並按Oiagen Inc.(Chatsworth，CA)提供的程序進行細菌性表達。應用這個系統，重組兔Sp17蛋白就可表達，但它去掉了N-末端的頭11個胺基酸沒有表達，卻在N-末端帶上一個精氨酸-甘氨酸-絲氨酸序列，後面再跟6個組氨酸和1個甘氨酸，這全都位於Sp17的胺基酸之前。融合蛋白是細菌性溶胞產物以金屬螯合物吸附劑nickel-NTA-agarose(Qiagen，Inc.)經親和層析純化而得。此融合蛋白用8M尿素，0.1M磷酸鈉(-元鹼)，0.01M Tris洗脫pH調至5.9，在PBS中透析三次。皮下注射時用的是200μg蛋白溶於0.5mlPBS，再加入1mg ADJUPRIMETM佐劑的混合物(PierceChemical Co.，Rockford，Illinois，USA)。3周後同樣體積裡的200μg蛋白用於第一次加強注射。
實施例7G22C免疫的兔血清對兔Sp17連續十肽的結合用實施例3所描述的合成肽G22C免疫的雄兔取其免疫血清與上述十肽用上述ELISA法結合，結果如圖4所示。取自G22C合成肽(實施例3)免疫的雌兔的免疫血清與十肽的結合如圖5所示。
實施例8人Sp17兔免疫血清對兔Sp17連續十肽的結合圖7表明了小鼠經重組人Sp17(融合蛋白)免疫接種後對其生育力產生的影響。6隻小鼠只接受了鼠Sp17的免疫接種，另6隻先接受了鼠的，右又接受了兔Sp17，還有6隻只接受了人Sp17。佐劑對照組(例數為12)只接受了TITERMAXTM佐劑(由Sigma公司提供，St.Louis)。最後還有6隻鼠未接種任何上述物質。受人Sp17重組蛋白免疫的鼠顯示受孕率下降了42％。
重組人Sp17是作為一種融合蛋白製備出的，製備方法與上述重組兔Sp17的基本相同，只是終產物中並未去掉N-末端的胺基酸。約5μg的融合蛋白溶於水中，用福氏完全佐劑1∶1稀釋後，去免疫Balb/c小鼠。4周後，每隔兩周加強注射一次溶於不完全福氏佐劑中的融合蛋白。
實施例9哺乳動物的各種Sp17的序列對比圖7給出了兔(RABSP17)，鼠(MUSSP17)，和人(HUMSP17)Sp17蛋白序列的序列對比。自身抗原性片段都在黑框中表示。數字編號是從N末端到C末端，是基於人的序列的編號，其中其他哺乳動物的序列中有中斷；那是為了使在黑框中顯示的自身抗原片段的對比序列最多，編號時數字跳過了這些中斷處，從而使幾個物種間在黑框中顯示的自身抗原片段相對應。
實施例10重組Sp17對人透明區的結合在ELISA中顯示生物素標記的人重組Sp17可與人透明區結合。這是首次證實任何重組哺乳動物Sp17與任意哺乳動物透明區的結合。
前面的實施例是用以說明本發明的，並不構成對其範圍的限制。本發明以下列權利要求進行限定，這些權利要求的等價物也包含在其範圍內。
序列表(1)一般資料(i)申請人O′Rand.Michael G.
Widgren，Esther E.
Richardson，Richard TLea，Isabel(ii)發明的題目與一種精子區帶結合蛋白的自身抗原性抗原決定基相對應的精子抗原(iii)序列數49(iv)通訊地址(A)收信人Kenneth D.Sibley(B)街P.O.Box 34009(C)城市Charlotte(D)洲North Carolina(E)國家USA(F)郵編28234(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC compatible(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)最近申請資料
(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)代理人/代理商資料(A)名稱Sibley，Kenneth D.
(B)登記號31,655(C)參考號/卷號5470/73(ix)電信資料(A)電話919-881-3140(B)傳真919-881-3175(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度854bp(B)型別核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬否(iv)反義否(ix)特徵
(A)名稱/關鍵詞CDS(B)定位32...487(xi)序列描述SEQ ID NO1GGAGGTTCCA TAGGCAGTTC TTACCAAGAA G ATG TCG ATT CCA TTC TCC AAC52Met Ser Ile Pro Phe Ser Asn1 5ACC CAC TAC CGA ATT CCA CAA GGA TTT GGG AAT CTT CTT GAA GGG CTG 100Thr His Tyr Arg Ile Pro Gln Gly Phe Gly Asn Leu Leu Glu Gly Leu10 15 20ACA CGC GAG ATT CTG AGA GAG CAA CCG GAC AAT ATA CCA GCT TTT GCA 148Thr Arg Glu Ile Leu Arg Glu Gln Pro Asp Asn Ile Pro Ala Phe Ala25 30 35GCA GCC TAT TTT GAG AGC CTT CTA GAG AAA AGA GAG AAA ACC AAC TTT 196Ala Ala Tyr Phe Glu Ser Leu Leu Glu Lys Arg Glu Lys Thr Asn Phe40 45 50 55GAT CCA GCA GAA TGG GGG AGT AAG GTA GAA GAC CGC TTC TAT AAC AAT 244Asp Pro Ala Glu Trp Gly Ser Lys Val Glu Asp Arg Phe Tyr Asn Asn60 65 70CAT GCA TTC GAG GAG CAA GAA CCA CCT GAG AAA AGT GAT CCT AAA CAA 292His Ala Phe Glu Glu Gln Glu Pro Pro Glu Lys Ser Asp Pro Lys Gln75 80 85GAA GAG TCT CAG ATA TCT GGG AAG GAG GAA GAG ACA TCA GTC ACC ATC 340Glu Glu Ser Gln Ile Ser Gly Lys Glu Glu Glu Thr Ser Val Thr Ile90 95 100TTA GAC TCT TCT GAG GAA GAT AAG GAA AAA GAA GAG GTT GCT GCT GTC 388Leu Asp Ser Ser Glu Glu Asp Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Ala Val105 110 115AAA ATC CAA GCT GCC TTC CGG GGA CAC ATA GCC AGA GAG GAG GCA AAG 436Lys Ile Gln Ala Ala Phe Arg Gly His Ile Ala Arg Glu Glu Ala Lys120 125 130 135AAA ATG AAA ACA AAT AGT CTT CAA AAT GAG GAA AAA GAG GAA AAC AAG 484Lys Met Lys Thr Asn Ser Leu Gln Asn Glu Glu Lys Glu Glu Asn Lys140 145 150TGAGGACACT GGTTTTACCT CCAGGAAACA TGAAAAATAA TCCAAATCCA TCCATCAACC544TTCTTATTAA TGTCATTTCT CCTTGAGGAA GGAAGATTTG ATGTTGTGAA ATAACATTCG 604TTACTGTTGT GAAAATCTGT CATGAGCATT TGTTTAATAA GCATACCATT GAAACATGCC 664ACTTGAAGAT TTCTCTGAGA TCATGAGTTT GTTTACACTT GTCTCAAGCC TATCTATAGA 724GACCCTTGGA TTTAGAATTA TAGAACTAAA GTATCTGAGA TTACAGAGAT CTCAGAGGTT 784ATGTGTTCTA ACTATTATCA AATGAATAAA TCCTCTCTAT CACATCCCCC AAAAAAAAAA 844AAAAAAAAAA854(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度151胺基酸(B)型別胺基酸(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Ile Pro Phe Ser Asn Thr His Tyr Arg Ile Pro Gln Gly Phe1 5 10 15Gly Asn Leu Leu Glu Gly Leu Thr Arg Glu Ile Leu Arg Glu Gln Pro20 25 30Asp Asn Ile Pro Ala Phe Ala Ala Ala Tyr Phe Glu Ser Leu Leu Glu35 40 45Lys Arg Glu Lys Thr Asn Phe Asp Pro Ala Glu Trp Gly Ser Lys Val50 55 60Glu Asp Arg Phe Tyr Asn Asn His Ala Phe Glu Glu Gln Glu Pro Pro65 70 75 80Glu Lys Ser Asp Pro Lys Gln Glu Glu Ser Gln Ile Ser Gly Lys Glu85 90 95Glu Glu Thr Ser Val Thr Ile Leu Asp Ser Ser Glu Glu Asp Lys Glu100 105 110Lys Glu Glu Val Ala Ala Val Lys Ile Gln Ala Ala Phe Arg Gly His115120 125Ile Ala Arg Glu Glu Ala Lys Lys Met Lys Thr Asn Ser Leu Gln Asn130 135 140Glu Glu Lys Glu Glu Asn Lys145 150(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬否(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ser Ile Pro Phe Ser Asn Thr His Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬否(xi)序列描述SEQ ID NO4Pro Phe Ser Asn Thr His Tyr Arg Ile Pro1 5 10(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬否(xi)序列描述SEQ ID NO5Asn Thr His Tyr Arg Ile Pro Gln Gly Phe1 5 10(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特徵
(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬否(xi)序列描述SEQ ID NO6Tyr Arg Ile Pro Gln Gly Phe Gly Asn Leu1 5 10(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬否(xi)序列描述SEQ ID NO7Pro Gln Gly Phe Gly Asn Leu Leu Glu Gly1 5 10(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特徵
(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Phe Gly Asn Leu Leu Glu Gly Leu Thr Arg1 5 10(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Leu Leu Glu Gly Leu Thr Arg Glu Ile Leu1 5 10(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Gly Leu Thr Arg Glu Ile Leu Arg Glu Gln1 5 10(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Arg Glu Ile Leu Arg Glu Gln Pro Asp Asn1 5 10(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Leu Arg Glu Gln Pro Asp Asn Ile Pro Ala1 5 10(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Gln Pro Asp Asn Ile Pro Ala Phe Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Asn Ile Pro Ala Phe Ala Ala Ala Tyr Phe1 5 10(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Phe Ala Ala Ala Tyr Phe Glu Asn Leu1 5 10(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Ala Ala Tyr Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys1 5 10(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO17Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Arg Glu Lys1 5 10(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO18Leu Leu Glu Lys Arg Glu Lys Thr Asn Phe1 5 10(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特徵
(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO19Lys Arg Glu Lys Thr Asn Phe Asp Pro Ala1 5 10(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Lys Thr Asn Phe Asp Pro Ala Glu Trp Gly1 5 10(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO21Phe Asp Pro Ala Glu Trp Gly Ala Lys Val1 5 10(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Ala Glu Trp Gly Ala Lys Val Asp Asp Arg1 5 10(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Gly Ala Lys Val Asp Asp Arg Phe Tyr Asn1 5 10(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO24Val Asp Asp Arg Phe Tyr Asn Asn His Ala1 5 10(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO25Arg Phe Tyr Asn Asn His Ala Phe Gln Glu1 5 10(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO26Asn Asn His Ala Phe Gln Glu His Glu Ser1 5 10(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO27Ala Phe Gln Glu His Glu Ser Glu Lys Cys1 5 10(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO28Glu His Glu Ser Glu Lys Cys Glu Ala Glu1 5 10(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO29Ser Glu Lys Cys Glu Ala Glu Glu Lys Ser1 5 10(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO30Cys Glu Ala Glu Glu Lys Ser Gln Ser Val1 5 10(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO31Glu Glu Lys Ser Gln Ser Val Thr Glu Glu1 5 10(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO32Ser Gln Ser Val Thr Glu Glu Glu Thr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO33Val Thr Glu Glu Glu Thr Pro Val Leu Thr1 5 10(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO34Glu Glu Thr Pro Val Leu Thr Ile Asp Ser1 5 10(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO35Pro Val Leu Thr Ile Asp Ser Glu Asp Asp1 5 10(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO36Thr Ile Asp Ser Glu Asp Asp Lys Asp Lys1 5 10(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO37Ser Glu Asp Asp Lys Asp Lys Glu Glu Met1 5 10(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO38Asp Lys Asp Lys Glu Glu Met Ala Ala Leu1 5 10(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO39Lys Glu Glu Met Ala Ala Leu Lys Ile Gln1 5 10(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO40Met Ala Ala Leu Lys Ile Gln Ala Ala Phe1 5 10(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO41Leu Lys Ile Gln Ala Ala Phe Arg Gly His1 5 10(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO42Gln Ala Ala Phe Arg Gly His Leu Ala Arg1 5 10(2)SEQ ID NO43的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO43Phe Arg Gly His Leu Ala Arg Glu Asp Val1 5 10(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO44His Leu Ala Arg Glu Asp Val Lys Lys Ile1 5 10(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO45Arg Glu Asp Val Lys Lys Ile Arg Thr Asn1 5 10(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO46Val Lys Lys Ile Arg Thr Asn Lys Ala Glu1 5 10(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO47Ile Arg Thr Asn Lys Ala Glu Glu Glu Thr1 5 10(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO48Asn Lys Ala Glu Glu Glu Thr Glu Glu Asn1 5 10(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)型別胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO49Lys Ala Glu Glu Glu Thr Glu Glu Asn Asn1 5 10
權利要求
1.編碼一種Sp17蛋白的分離的DNA選自由以下物質組成的組中(a)分離的DNA基本上由編碼具有本文以SEQ ID NO2給出的胺基酸序列的人Sp17蛋白的DNA組成；(b)分離的DNA，在0.3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉和0.1％ SDS在60℃的嚴格洗滌的條件下可與上面(a)中分離的DNA雜交，並能編碼一種人Sp17蛋白；(c)分離的DNA，因遺傳密碼的簡併性而在核苷酸序列上不同於上述(a)和(b)的分離的DNA，並能編碼一種人Sp17蛋白；(d)前面的能編碼抗原性肽的片段，該抗原性肽能與可結合人Sp17蛋白的抗體結合。
2.根據權利要求1分離的DNA，基本上由編碼本文以SEQ IDNO2給出的人Sp17蛋白的DNA組成。
3.根據權利要求1分離的DNA，基本上由具有本文以SEQ IDNO1給出的序列的分離的DNA組成。
4.一種重組DNA序列，包括載體DNA和根據權利要求1的一段DNA。
5.一種宿主細胞，包含一個如權利要求4的重組DNA序列並能表達編碼的蛋白或肽。
6.一種免疫避孕的方法，包括給受試者施用有效量的由根據權利要求1的DNA編碼的蛋白或肽以減少該受試者的生育力。
7.根據權利要求6的一種免疫避孕方法如，其中該受試者為一個女性受試者。
8.一種免疫避孕疫苗配方，包括減小受試者的生育力有效劑量的由根據權利要求1的DNA編碼的蛋白或肽，與一個藥用上可接受的載體的組合。
9.一種檢查受試病人的自身免疫性不育症的方法，包括檢測所說的的受試病人中結合由根據權利要求1的DNA編碼的蛋白或肽的抗體的存在，所說的抗體的存在指示該病人患有自身免疫不育症。
10.根據權利要求9的方法，其中所說的受試病人為男性。
11.根據權利要求9的方法，其中所說的檢測步驟包括檢測所說的受試病人體內能結合具有本文以SEQ ID NO2給出的序列的蛋白的抗體的存在。
12.一種無毒性宿主細胞，包含根據權利要求4的重組DNA序列，並能表達它所編碼的蛋白或肽。
13.根據權利要求12的無毒性宿主細胞，其中這個宿主細胞是一種微生物主細胞。
14.一種免疫避孕疫苗配方包括減少受試者生育力有效量的根據權利要求12的無毒性宿主細胞，與藥用上可接受的載體的組合。
15.一種抗原性肽，對作為一種免疫避孕試劑或在診斷自身免疫不育症中有用，它選自由下列物質組成的組中有6到25個胺基酸長的，哺乳動物Sp17蛋白的抗原性片段及其抗原性等價物。所說的抗原性等價物是(a)一個修飾過的片段，包含對所說的抗原性片段經取代其序列上的一個或多個胺基酸修飾而成；或是(b)一段更長的肽，它插入了所說的十肽的序列或所說的修飾過的十肽的序列，並具有(i)多達4個額外的胺基酸殘基附著在該序列的C末端，(ii)多達4個額外的胺基酸殘基附著在該序列的N末端，或(iii)多達4個額外的胺基酸殘基附著在所說序列的C末端並且多達4個額外的胺基酸殘基附於該序列的N末端；其中所說的抗原性等價物與抗體結合，該抗體與結合了，哺乳動物Sp17蛋白的所說的抗原性片段的抗體結合；且其中哺乳動物Sp17蛋白的所說的抗原性片段選自由下列物質組成的組中(i)第4號胺基酸到第28號胺基酸的片段，(ii)第39號胺基酸到第49號胺基酸的片段，(iii)第55號胺基酸到第82號胺基酸的片段，(iv)第117號胺基酸到第137號胺基酸的片段，(v)從片段(i)到片段(iv)的片段，它至少有6個胺基酸長。
16.根據權利要求15的抗原性肽，其中所說的哺乳動物Sp17蛋白選自由兔、鼠、人、狒狒和猴的Sp17蛋白組成的組中。
17.根據權利要求15的抗原性肽，其中所說的原性片段選自由具有本文所給的如下胺基酸序列的肽組成的組中SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO34，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ1D NO43，還有它的至少有6個胺基酸長的片段。
18.根據權利要求15的抗原性肽，其中所說的原性片段選自由具有本文所給的如下胺基酸序列的肽組成的組中SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQID NO27，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ IDNO43，還有它的至少長6個胺基酸的片段。
19.根據權利要求15的抗原性肽，其中所說的抗原性片段選自由具有本文所給出的以下胺基酸序列的肽組成的組中SEQ ID NO3，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ IDNO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ IDNO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO43，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，還有它的至少長6個胺基酸的片段。
20.根據權利要求15的抗原性肽，其中所說的抗原性片段選自由具有本文所給的如下胺基酸序列的肽組成的組中SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO14，SEQ IDNO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO34，SEQ ID NO40，SEQ ID NO43，還有它的至少長6個胺基酸的片段。
21.一種免疫避孕方法，包括給受試者服用有效量的根據權利要求12的肽以減小所說的受試者的生育力。
22.根據權利要求21的免疫避孕方法，其中所說的受試者是一個女性受試者。
23.一種免疫避孕疫苗配方，包括減少受試者的生育力有效量的根據權利要求15的肽與藥用上可接受的載體的組合。
24.一種檢查受試者自身免疫性不育症的方法，包括檢測在所說的受試者體內能結合根據權利要求15的肽的抗體的存在，該抗體的存在指示該受試者患有自身免疫不育症。
25.根據權利要求24的方法，其中所說的受試者是一個男性受試者。
26.一種無毒性宿主細胞，含有能表達根據權利要求15的肽的重組DNA序列。
27.根據權利要求26的無毒性宿主細胞，該宿主細胞是一種微生物宿主細胞。
28.一種免疫避孕疫苗配方，包含減小受試者的生育力有效量的根據權利要求26的無毒性宿主細胞與一種藥用上可接受的載體的組合。
全文摘要
本發明涉及編碼一種哺乳動物Sp17蛋白，特別是人類Sp17蛋白，或其抗原性肽鏈片段的DNA，以及所說的抗原性片段。這些蛋白和肽鏈作為免疫避孕試劑和(或)用於診斷自身免疫性不孕症有用。此外，本發明還公開了一種能表達抗原性蛋白或肽鏈，並能作為免疫避孕試劑來使用的無毒性宿主細胞。
文檔編號A61K35/66GK1136778SQ94194409
公開日1996年11月27日 申請日期1994年11月17日 優先權日1993年12月10日
發明者M·G·奧蘭德, E·E·威德格雷恩, R·T·理查森, I·A·利 申請人:查珀爾希爾北卡羅來納大學