補骨脂提取物、含有它的藥物組合物及其製備方法和用途的製作方法

2023-05-19 01:15:11 2

專利名稱：：補骨脂提取物、含有它的藥物組合物及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種植物提取物、含有它的藥物組合物及其製備方法和用途。具體地說，本發明涉及補骨脂提取物、含有它的藥物組合物及其製備方法和用途。
背景技術：
：補骨脂為豆科植物補骨脂(屍^^"/e"L.)的乾燥成熟果實，性溫，味辛，具補腎助陽、固精縮尿、溫脾止瀉、納氣平喘之功效。主治腎虛陽痿、腰膝冷痛，滑精、遺尿、尿頻，五更洩瀉，虛寒咳嗽；外用治白癜風。現代研究表明，補骨脂具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、升壓、誘導黑素細胞遷移、雌性激素樣作用等生理活性。中國專利申請200610027643.0《補骨脂酚類化合物的應用》還介紹了補骨質酚類化合物在製備治療精神性疾病或神經性疾病藥物中的應用。因為其廣泛的藥理活性，藥物學家積極開發補骨脂新型製劑，中國專利申請200510051550.7《包含補骨脂酚的用於治療婦女骨質疏柏^症的醫藥組合物》和中國專利申請200510051551.1《包含補骨脂酚的用於治療婦女乳癌的醫藥組合物》，驗證了補骨脂酚具有治療骨質疏鬆和乳癌作用，要求保護含有5%-95%補骨脂酚，且實質上不含補骨脂素和異補骨脂素的藥物組合物，並提供了製備方法，其工藝釆取有機溶劑萃取純化補骨脂酴的方法，不適合工業化生產。中國專利申請200680024989.3《補骨脂酚的組合物及其製備方法》提供了使用聚苯乙烯系大孔吸附樹脂純化補骨脂酚的方法，通過其比較發現CG-161cd樹脂可以達到純化補骨脂酚的效果，但是仍存在很多問題，如需要用石油醚提取藥材成本高且安全和汙染問題嚴重，另一方面樹脂需使用甲醇作為洗脫溶劑，不能在藥廠推廣使用，有機溶劑汙染嚴重。雌激素在不同疾病中或同一疾病不同的組織和細胞中發揮著不同的生物學效應。這是由於雌激素及其受體效應分子機制的複雜性，決定了不同的組織/細胞對雌激素應答的特異性。雌激素的效應主要由兩種受體一ERa和ERp介導，而這兩種受體在配體結合結構域和轉錄激活結構域序列上的不同使它們在與配體結合的性質、轉錄活性等方面存在著很大的差異。研究表明激活ERa可促進乳腺癌細胞增殖，而ERP的激活則對腫瘤細胞生長起抑制作用，因此對ERP選擇性激活的藥物被認為是長期使用雌激素的更安全的替代品，也是藥物學家努力的方向。
發明內容本發明的發明人令人意外地發現，含有補骨脂酚和補骨脂黃酮類成分的組合物對ERP的選擇性激活作用增強，這使得該組合物在發揮擬雌激素作用的同時，降低了促進乳腺癌細胞增殖的風險，適合於長期使用。基於上述發現，完成了本發明。本發明的目的是提供一種同時含有補骨脂酚和補骨脂黃酮類成分的補骨脂提取物、含有它的藥物組合物及其製備方法和在醫藥領域中的用途。一方面，本發明涉及一種補骨脂提取物，該補骨脂提取物包含40~90%的補骨脂酚和2~10%的補骨脂黃酮類成分，並且不包含補骨脂素和異補骨脂素。在一個實施方案中，本發明的補骨脂提取物包含60~75%的補骨脂酚和3~5%的補骨脂黃酮類成分，並且不包含補骨脂素和異補骨脂素。另一方面，本發明涉及一種藥物組合物，它包含本發明的補骨脂提取物，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑。在該方面的一個可替代方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包含40~90%的補骨脂酴和2~10%的補骨脂黃酮類成分，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑。在一個實施方案中，本發明的藥物組合物包含60~75%的補骨脂酚和3~5%的補骨脂黃酮類成分，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑。本文中所述的補骨脂黃酮類成分是指異補骨脂查耳酮、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚、CorylifolA和異補骨脂查耳酮中的一種、多種或全部。另一方面，本發明涉及一種製備同時含有補骨脂酚和補骨脂黃酮類成分的補骨脂提取物的方法，該方法包括如下步驟用60~95%的乙醇提取補骨脂藥材；將合併的提取液濃縮回收乙醇後，加入鹼的水溶液使濃縮物溶解；以及將所得鹼性溶液裝入大孔吸附樹脂，先用去離子水，再依次用30%乙醇和95%乙醇洗脫進行純化，得到本發明的補骨脂提取物。在一個實施方案中，本發明涉及一種製備同時含有補骨脂酚和補骨脂黃酮類成分的補骨脂提取物的方法，該方法包括如下步驟用60~95%的乙醇提取補骨脂藥材；將合併的提取液濃縮回收乙醇後，加入鹼的水溶液至溶解；將所得溶液過濾，並且用酸的水溶液將濾液的pH值調節至8~9;將所得溶液過濾，並且用鹼的水溶液將所得固體溶解；以及將所得鹼性溶液裝入大孔吸附樹脂，先用去離子水，再依次用30%乙醇和95%乙醇洗脫進行純化，得到本發明的補骨脂提取物。在另一個實施方案中，本發明涉及一種製備同時含有補骨脂酚和補骨脂黃酮類成分的補骨脂提取物的方法，該方法包括如下步驟用60~95%的乙醇提取補骨脂藥材；將合併的提取液濃縮回收乙醇後，加入氫氧化鈉水溶液，例如3%氫氧化鈉水溶液至溶解；將所得溶液過濾，並且用鹽酸水溶液，例如10%鹽酸水溶液將濾液的pH值調節至8~9;將所得溶液過濾，並且用氫氧化鈉水溶液，例如3%氫氧化鈉水溶液將所得固體溶解；以及將所得鹼性溶液裝入大孔吸附樹脂，先用去離子水，再依次用30%乙醇和95%乙醇洗脫進行純化，得到本發明的補骨脂提取物。本發明方法中可用的鹼的水溶液可以選自任何適用於製藥領域的中或強鹼的水溶液，例如氨水、氬氧化鈉水溶液和碳酸鈉水溶液等。本發明方法中可用的酸的水溶液可以選自任何適用於製藥領域的酸的水溶液，只要它能實現所述目的即可。可以選擇的酸例如鹽酸、硫酸、磷酸和乙酸等。本發明方法中所用的大孔吸附樹脂可以選自D101、AB-8和HPD-400等本領域內常用的苯乙烯骨架樹脂。為了增加選擇性，可以將樹脂增加一定的相應基團，這些變化方案都在本發明的範圍之內。可採用製劑領域中的常規技術，將補骨脂酚和補骨脂黃酮類成分或者同時含有補骨脂酚和補骨脂黃酮類成分的本發明補骨脂提取物與一種或多種藥學上可接受的賦形劑混合，並形成所需的劑型，來製備本發明的藥物組合物。本發明藥物組合物中可用的"藥學上可接受的賦形劑，，可以是藥物製劑領域中任何常規的賦形劑。特定賦形劑的選擇將取決於用於治療特定患者的給藥方式或疾病類型和狀態。用於特定給藥模式的合適藥物組合物的製備方法完全在藥物領域技術人員的知識範圍內。例如，可以作為藥學上可接受的賦形劑包括藥學領域常規的稀釋劑、載體、填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附栽體和潤滑劑等。必要時，還可以在藥物組合物中加入香味劑、防腐劑和甜味劑等。本發明的藥物組合物可以製成片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、骨劑、霜劑、注射乳劑(注射用無菌粉針)等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。經研究表明，本發明的補骨脂提取物或含有它的藥物組合物具有擬雌激素作用，對雌激素p受體的結合作用更強。因此，可以預期本發明的補骨脂提取物或含有它的藥物組合物可以用於治療更年期症候群、乳腺癌和/或心腦血管疾病。或者，本發明的補骨脂提取物或含有它的藥物組合物可用於製備藥物，該藥物用於治療更年期症候群、乳腺癌和/或心腦血管疾病。具體實施方式下述實施例中所用的實驗材料和方法，如無特別說明，均為常規材料和方法。實施例l、本發明補骨脂提取物的製備將1千克補骨脂藥材(購自河南信陽藥材公司)粉碎成粗粉(不加篩網)，加入10升95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，傾出提取液，藥渣再加入10升95%乙醇回流提取2小時，提取液合併後過濾，將濾液回收乙醇至盡，不斷攪拌下加入3%的氫氧化鈉水溶液至完全溶解，溶液過濾後攪拌下向濾液中加入10%的鹽酸至pH值8-9，靜置過夜後過濾，所得固體用3%氫氧化鈉水溶液完全溶解後上預處理好的大孔吸附樹脂(D101)(天津南開大學化工廠)，流速2h/BV(BV:樹脂床體積=1000毫升)，上柱完畢用3BV去離子水衝洗，然後用3BV30。/。乙醇衝洗樹脂，最後用4BV95。/。乙醇洗脫，洗脫液濃縮回收乙醇至盡得油狀本發明補骨脂提取物82.7克，批號BGZ-1。實施例2、本發明補骨脂提取物的製備將1千克補骨脂藥材(購自河南信陽藥材公司)粉碎成粗粉(不加篩網)，加入10升80%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，傾出提取液，藥渣再加入10升80%乙醇回流提取2小時，提取液合併後過濾，將濾液回收乙醇至盡，不斷攪拌下加入3%的氫氧化鈉水溶液至完全溶解，溶液過濾後攪拌下向濾液中加入10%的鹽酸至pH值8-9，靜置過夜後過濾，所得固體用3%氫氧化鈉水溶液完全溶解後上預處理好的大孔吸附樹脂(D101)(天津南開大學化工廠)，流速2h/BV(BV:樹脂床體積-1000毫升)，上柱完畢用3BV去離子水沖洗，然後用3BV30。/o乙醇沖洗樹脂，最後用4BV95。/o乙醇洗脫，洗脫液濃縮回收乙醇至盡即得油狀本發明補骨脂提取物92.4克，批號BGZ-2。實施例3、本發明補骨脂提取物的製備將1千克補骨脂藥材(購自河南信陽藥材公司)粉碎成粗粉(不加篩網)，加入10升80%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，傾出提取液，藥渣再加入10升80%乙醇回流提取2小時，提取液合併後過濾，將濾液回收乙醇至盡，不斷攪拌下加入3%的氫氧化鈉水溶液至完全溶解，溶液過濾後攪拌下向濾液中加入10%的鹽酸至pH值8-9，靜置過夜後過濾，所得固體用3%氫氧化鈉水溶液完全溶解後上預處理好的大孔吸附樹脂(AB-8)(天津南開大學化工廠)，流速2h/BV(BV:樹脂床體積-1000毫升)，上柱完畢用3BV去離子水沖洗，然後用3BV30。/。乙醇沖洗樹脂，最後用4BV95。/o乙醇洗脫，洗脫液濃縮回收乙醇至盡即得油狀本發明補骨脂提取物108.3克，批號BGZ-3。實施例4、本發明補骨脂提取物的製備將1千克補骨脂藥材(購自河南信陽藥材爿>司)粉碎成粗粉(不加篩網)，加入10升60%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，傾出提取液，藥渣再加入10升60%乙醇回流提取2小時，提取液合併後過濾，將濾液回收乙醇至盡，不斷攪拌下加入3%的氫氧化鈉水溶液至完全溶解，溶液過濾後攪拌下向濾液中加入10%的鹽酸至pH值8-9，靜置過夜後過濾，所得固體用3%氫氧化鈉水溶液完全溶解後上預處理好的大孔吸附樹脂(D101)(天津南開大學化工廠)，流速2h/BV(BV:樹脂床體積=1000毫升)，上柱完畢用2BV去離子水沖洗，然後用4BV30y。乙醇沖洗樹脂，最後用4BV95。/。乙醇洗脫，洗脫液濃縮回收乙醇至盡得油狀本發明補骨脂提取物98.4克，批號BGZ-4。實施例5、本發明補骨脂提取物的製備將1千克補骨脂藥材(購自河南信陽藥材公司)粉碎成粗粉(不加篩網)，加入10升95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，傾出提取液，藥渣再加入10升95%乙醇回流提取2小時，提取液合併後過濾，將濾液回收乙醇至盡，不斷攪拌下加入3%的氫氧化鈉水溶液至完全溶解，溶液過濾後攪拌下向濾液中加入10%的鹽酸至pH值8-9，靜置過夜後過濾，所得固體用3%氫氧化鈉水溶液完全溶解後上預處理好的大孔吸附樹脂(HPD-400)(滄州寶恩化工有限公司)，流速2h/BV(BV:樹脂床體積-1000毫升)，上柱完畢用3BV去離子水沖洗，然後用3BV30r。乙醇沖洗樹脂，最後用4BV95。/o乙醇洗脫，洗脫液濃縮回收乙醇至盡得油狀本發明補骨脂提取物69.9克，批號BGZ-5。實施例6、補骨脂酚的製備將500克補骨脂藥材加入5000毫升石油醚提取兩次，回收石油醚至盡拌矽膠後上矽膠柱層析，以正己烷乙酸乙酯不同比例洗脫，用補骨脂酚對照品薄層鑑別跟蹤，收集補骨脂酚含量高的部分再次上矽膠柱，最終得油狀補骨脂酚純品，批號BGZF-1。實施例7、有關成分的結構確證發明人對補骨脂酚、異補骨脂查耳酮、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮、CorylifolA和異補骨脂查耳酮，以及對補骨脂素和異補骨脂素進行了結構確認(委託天津大學分析測試中心檢測，500MHz核磁)。分析結果顯示它們的結構與文獻報導的結構一致。補骨脂素，無色針晶。力醒R(CDCl3，500MHz):".38(1H，d，J-9.6,H-3)，6.83(1H，d，J=2.2，H國4，)，7.48(1H，s，H-5)，7.69(1H，S，H-8)，7.70(1H，d，J=2.2，H國5，)，7.80(1H,d，J=9.6，H-4)。異補骨脂素，無色針晶。iH匪R(CDCl3，500MHz):37.83(1H，d，J=9.5),7.71(1H,d,J=2.2)，7.46(1H,dd，J-8.6,0.9)，7.40(1H,d,J=8.6)，7.15(1H,dd，J=2.2，0.9)，6.40(1H，d，J=9.5)。異補骨脂查耳酮，黃色粉末。iHNMR(CD30D,500MHz):67.84(1H，d，J=8.9)，7.79(1H,d，J=15.3)，7.63(2H，dd，J=6.8，1.9)，7.62(1H，d,J=15.3)，6.84(2H，dd，J=6.8,1.9)，6.43(1H，d，J=8.9)，5.23(1H，m)，3.32(2H，m)，1.78，1.66(各3H，s)。補骨脂二氫黃酮，無色結晶。1HNMR(CD3OD，500MHz):87.55(1H，s，H-5)，7.32(2H，d，J=11.2Hz，H-2，，H-6，)，6.81(2H，d，J=11.2Hz，H國3，，H畫5，)，6.35(1H，s，H-8)，5,36(1H，dd,J=13.2，2.9Hz，H-2)，5.33(1H,m，H畫2')，3.22(2H，d，J=7.4Hz，H畫l，)，3.03(1H,dd,J=16.9，13.2Hz，H-3)，2.67(1H,dd，J=16.9，2.9Hz，H國3),1.76(3H，s),1.70(3H，s)。新補骨脂異黃酮，白色粉末。iHNMR(CD3OD，500MHz):S8.11(1H,s)，8.07(1H，d,J=8.8Hz)，7.23(1H，d，J=2.1Hz)，7.17(1H，dd，J=8.2，2.2Hz),6.95(1H,dd，J=8.8，2.2Hz)，6.86(1H，d，J=2.2Hz)，6.83(1H，d，J=8.2Hz)，5.3(1H，m)，3.33(IH，m)，1.75(6H，s)。CorylifolA，白色粉末。1HNMR(CD3OD，500MHz):88.08(IH，s)，8.03(IH，d，J=8.7Hz)，6.96(2H，dd，J=2.1,8.7Hz)，6.85(IH，d,J=2.2)，7.32(1H，d,J=1.8),6.88(IH，d，J=8.3Hz)，7.25(2H，dd,J=1.8，8.3Hz)，3.34(1H,d,J=7.0Hz)，5.40(IH，t畫like，J=7.0Hz)，2.02(1H，m)，2.09(IH，m)，5.08(1H，t國like，J=6.9Hz)，1.55(3H，s)，1.57(3H,s)，1.72(3H，s)。補骨脂酚，淡黃色油狀物。iHNMR(CDC13，500MHz):37.25(1H，d，J=7.55Hz)，6.80(1H，d，J=7.55Hz)，6.80(1H，d，J=16.27Hz)，6.30(1H，d,J=16.27Hz),6.17(H，d,J=16.27Hz)，5.90(IH，d，J=10.85Hz)，5.82(1H，d，J=10.85)，5.1(2H，dd，Jl=1.47J2=19.20Hz)，1.92(2H，dd，Jl=19.20J2=7.48Hz)，1.65(3H，s)，1.62(3H，s)，1.20(3H，s)。補骨脂二氫黃酮甲醚購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號061010。實施例8、本發明補骨脂提取物的成分分析及其含量測定使用高效液相色語法對本發明補骨脂提取物中的成分進行了分析和含量測定。所用的色語條件如下色語柱(ODS，5nm,4.6mm*250mm)檢測波長246nm柱溫20。C，流速lml/min，液相AglentllOO流動相乙腈0.1%甲酸溶液表l.梯度洗脫流動相比例tableseeoriginaldocumentpage12混合對照品的製備精密稱取補骨脂酚5.79毫克、新補骨脂異黃酮3.21毫克、補骨脂二氫黃酮甲醚4.78毫克、CorylifolA3.25毫克、補骨脂素16.35毫克和異補骨脂素10.30毫克，置5毫升容量瓶中，加甲醇至刻度，溶解。取溶液l毫升至25毫升容量瓶中，加甲醇定容，搖勻得混合標準品溶液。樣品溶液的製備分別精密稱取樣品BGZ-1、BGZ-2、BGZ-3、BGZ-4、BGZ-5、BGZF-1，置50ml容量瓶中，加入甲醇溶解並定容至刻度。對照品和樣品分別進樣10fil，結果見下表2:表2.本發明補骨脂提取物的成分的含量測定結果tableseeoriginaldocumentpage13上表2中的數據表明，本發明的補骨脂提取物含有補骨脂酚、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮曱醚和CorylifolA，不包含補骨脂素和異補骨脂素。實施例9、補骨脂酚和本發明藥物組合物對雌激素受體的激活作用採用細胞轉染的方法觀察補骨脂酚和補骨脂黃酮對雌激素受體的選擇性激活。實際上，雌激素正是通過調節雌激素反應基因轉錄來顯示其生物活性。將帶有報告基因的ERa或ER卩DNA片段分別轉染於無ER表達的Hela細胞，在細胞培養液中加入被測物後，通過對報告基因轉錄激活的檢測觀察被測物是否可通過ERa或ER(5發揮雌激素樣作用。補骨脂酚樣品液的配製精密稱取補骨脂酚1.28mg，用500nL的DMSO溶解。精密吸取50nL稀釋至500nL得ImM補骨脂酚溶液；精密吸取ImM補骨脂酚溶液50jiL稀釋至500nL得O.lmM補骨脂酚溶液；精密吸取O.lmM補骨脂酚溶液50fiL稀釋至500nL得O.OlmM補骨脂酚溶液；分別取lmM、O.lmM和O.OlmM補骨脂酚溶液用含1%CS-FBS的無酚紅高糖DMEM稀釋1000倍，對應得補骨脂酚樣品液高劑量組(lnM)、中劑量組(0.lnM)和低劑量組(O.OlnM)。本發明補骨脂提取物(BGZ-1)樣品的配製精密稱取本發明補骨脂提取物(BGZ-1)樣品2.31mg，用500nL的DMSO溶解。精密吸取50nL稀釋至500nL得補骨脂提取物溶液(含補骨脂酚ImM);精密吸取補骨脂提取物溶液50nL稀釋至500nL得補骨脂提取物溶液(含補骨脂酚O.lmM);精密吸取補骨脂提取物溶液(含補骨脂酚O.lmM)50nL稀釋至500nL得O.OlmM補骨脂提取物溶液(含補骨脂酴O.OlmM);分別取上述三個濃度的補骨脂提取物溶液用含1%CS-FBS的無酚紅高糖DMEM稀釋IOOO倍，對應得補骨脂提取物樣品高劑量組(含補骨脂酚1HM)、中劑量組(含補骨脂酚O.lnM)和低劑量組(含補骨脂酚O.OlnM)。在37。C，5。/。C02的條件下，在細胞培養箱中使用含有10%小牛血清的無酚紅高糖DMEM培養液培養Hela細胞，至細胞密度90%左右時將細胞按60%密度鋪於96孔板中，每孔中加入含10%血清的無酚紅DMEM培養液150ul，培養過夜。按96孔板每孔lOOul無血清DMEM培養基，0.4ng質粒(ptk-ERE-luc2ng,tk-Renilalpg,ERa或ERj3ljig)進行轉染。轉染6個小時後，每孔加入150ul無血清無酚紅DMEM培養液。選取每組三個孔，加入10-8M雌二醇E2，以及不同濃度的受試物15ul/孔(樣品BGZ-1高、中、低三個濃度組)，37°C，5%<:02條件下繼續培養24小時。24小時後每孔加入80ji1細胞裂解液，並凍融細胞一次以使其充分裂解。對每孔的細胞裂解液分別測定其對螢火蟲螢光素酶及Renila螢光素酶的活性。每孔均用螢火蟲螢光素酶/Renila螢光素酶值作為結果，分別以各組中未加雌激素處理的孔作為對照，計算加雌激素或被測物組相對於對照組的比值，每組三個孔取平均值。結果見表3:表3:補骨脂酚和本發明藥物組合物對雌激素受體的激活作用tableseeoriginaldocumentpage15*p<0.05,**p<0.01研究結果顯示，本發明藥物組合物(含補骨脂酚0.01，0.1，lnM)可濃度依賴性地激活ERP，高濃度的本發明藥物組合物(1jiM)可激活ERa,且對ERp的激活作用強於ERa;含相同濃度補骨脂酚(0.01，0.1，lnM)可達到相似的效果；結果提示更為有意義的是，與補骨脂酚相比本發明藥物組合物ER|5/ERa比值增大，說明本發明藥物組合物對ER(5的選擇性激活作用增強，這就使本發明藥物組合物在起到擬雌激素作用的同時，降低了促進乳腺癌細胞增殖的風險，適合於長期使用。實施例10、本發明補骨脂提取物對骨質疏鬆大鼠的影響1試驗目的釆用去卵巢大鼠作為更年期症候群以及骨質疏鬆動物模型，研究補骨脂提取物對更年期症候群大鼠內分泌和骨質疏鬆的影響，探究其是否具有改善更年期症候群的作用。2試驗材料2.1試驗藥物補骨脂提取物BGZ-1(根據實施例1的方法製得)，每克提取物相當於補骨脂生藥12克。用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成混懸液。己烯雌酚片天津力生製藥股份有限公司，0.5mg/片，使用時研磨成細粉。2.2試驗試劑戊巴比妥鈉，上海化學試劑採購供應站分裝廠；雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)放免試劑盒由天津九鼎醫學生物工程公司提供。2.3試驗動物雌性SD大鼠，3月齡，未交配，體重180士10g。購於北京維通利華動物實驗中心，動物許可證編號SCXK(京)2002-0003,分籠飼養，每籠5隻，食水自由攝取。3試驗方法3.1去勢大鼠模型的製作採用雙側卵巢切除術，用40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹位固定，在最末肋骨下，腋中線和距脊柱外側約2cm交叉處，剪毛，切開皮膚和背肌約1.5~2cm，在切口視野中可見一乳白色發亮的脂肪團，卵巢即包埋其中，以小鑷子輕輕夾住脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到粉紅色的卵巢。先將卵巢下輸卵管(包括脂肪)用絲線結紮，再摘除卵巢，術後將子宮角送回腹腔中，依次縫合肌肉和皮膚。同法摘除另一側卵巢。假手術組同上法打開腹腔，暴露卵巢，但不摘除卵巢。術後連續三天腹腔注射青黴素鈉4000IU.kg-l，預防感染。3.2大鼠分組和給藥摘卵巢手術2周後將大鼠按體重隨機分為5組，包括假手術組、模型組、本發明補骨脂提取物高、低劑量組(劑量分別是24mg/kg、12mg/kg)，並設己烯雌酚組0.05mg/kg作為陽性藥對照組。每組10隻。灌胃給藥，每日一次，己烯雌酚組隔日給藥一次。連續給藥3個月。每周稱體重一次並按新體重調整給藥體積。3.3觀察指標3.3.1對去卵巢大鼠內分泌激素及血脂水平的影響給藥3個月時，所有大鼠分別剪尾釆血約1.5ml，分離血清，用放射免疫法測定血清內分泌激素雌二醇(E2)以及促卵泡激素(FSH)的含量。3.3.2對去卵巢大鼠骨質疏鬆相關指標的骨密度的影響取大鼠第二腰推，去除表面附著的肌肉及軟組織，分離右側股骨，小心剔淨肌肉，放置於溼潤生理鹽水的乾淨紗布上，置-4。C水箱保存，用雙能X線骨密度儀，小動物軟體檢測第二腰推及右側股骨的骨密度。單位為g/cm2,表示大鼠掃描所取區域每平方釐米所含的骨礦物質量。3.4數據統計處理方法所有計量資料數據均用均數士平均數表示，用SPSS11.5軟體進行方差分析和組間t檢驗。4結果4.1本發明補骨脂提取物對去勢大鼠血清激素水平的影響模型組血清E2較假手術組有顯著降低(P<0.01)，FSH升高更顯著(P<0.01)。本發明補骨脂提取物24mg/kg、12mg/kg劑量組E2較模型組有顯著升高(P<0.01);本發明補骨脂提取物兩劑量組的FSH與模型組比較顯著降低(P<0.01)。己烯雌酚組E2較模型組有顯著升高，FSH較模型組顯著下降。結果見表4。表4.本發明補骨脂提取物對血清激素水平的影響tableseeoriginaldocumentpage18注與假手術組比較糾P〈0.01;與模型組相比，*P<0.05，"P<0.014.2本發明補骨脂提取物對去勢大鼠腰推及股骨骨密度的影響實驗末期，去勢大鼠腰推體骨密度、股骨骨密度較假手術組有明顯丟失(P<0.05，P<0.01);本發明補骨脂提取物大劑量和己烯雌酚組大鼠腰椎體骨密度、股骨骨密度均較模型組有顯著提高。結果見表5。表5.本發明補骨脂提取物對去卵巢大鼠腰椎和股骨骨密度的影響tableseeoriginaldocumentpage18注與假手術組比較胖P〈0.01;與模型組相比，*P<0.05，**P<0.015.結論本發明補骨脂提取物對去卵巢大鼠內分泌失調具有一定的改善作用，長期應用對去卵巢引起的E2水平降低有升高的作用，對FSH的升高具有顯著的降低作用。本發明補骨脂提取物對大鼠去卵巢引起的骨質疏鬆具有明顯的改善作用，主要體現在它能增加腰稚體和股骨的骨密度，改善去卵巢引起的骨質疏鬆作用。實施例11、含本發明補骨脂提取物的膠嚢的製備處方本發明補骨脂提取物(BGZ-1)285克乳糖105克1000粒按處方量準確稱取樣品BGZ-l,加入藥用乙醇溶解，均勻噴灑到80。C烘乾並過80目篩的處方量乳糖中，混勻，檢測含量，合格後裝入1號膠嚢即得。權利要求1.一種補骨脂提取物，它包含40～90％的補骨脂酚和2～10％的補骨脂黃酮類成分，並且不包含補骨脂素和異補骨脂素。2.根據權利要求1的補骨脂提取物，它包含60~75%的補骨脂酚和3~5%的補骨脂黃酮類成分，並且不包含補骨脂素和異補骨脂素。3.根據權利要求1或2的補骨脂提取物，其中所述補骨脂黃酮類成分是異補骨脂查耳酮、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚、CorylifolA和異補骨脂查耳酮中的一種、多種或全部。4.一種藥物組合物，它包含權利要求1至3任意一項的補骨脂提取物，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑。5.—種藥物組合物，它包含40~90%的補骨脂酚和2~10%的補骨脂黃酮類成分，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑。6.根據權利要求5的藥物組合物，其包含60~75%的補骨脂酴和3~5%的補骨脂黃酮類成分，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑。7.根據權利要求5或6的藥物組合物，其中所迷補骨脂黃酮類成分是異補骨脂查耳酮、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚、CorylifolA和異補骨脂查耳酮中的一種、多種或全部。8.製備權利要求1至3任意一項的補骨脂提取物的方法，該方法包括如下步驟用60~95%的乙醇提取補骨脂藥材；將合併的提取液濃縮回收乙醇後，加入中或強鹼的水溶液使所得濃縮物溶解；以及將所得鹼性溶液裝入大孔吸附樹脂，先用去離子水，再依次用30%乙醇和95%乙醇洗脫進行純化，得到本發明的補骨脂提取物。9.製備權利要求1至3任意一項的補骨脂提取物的方法，該方法包括如下步驟用60~95%的乙醇提取補骨脂藥材；將合併的提取液濃縮回收乙醇後，加入中或強鹼的水溶液使所得濃縮物溶解；將所得溶液過濾，並且用酸的水溶液將濾液的pH值調節至8~9;將所得溶液過濾，並且用中或強鹼的水溶液將所得固體溶解；以及將所得鹼性溶液裝入大孔吸附樹脂，先用去離子水，再依次用30%乙醇和95%乙醇洗脫進行純化，得到本發明的補骨脂提取物。10.製備權利要求1至3任意一項的補骨脂提取物的方法，該方法包括如下步驟用60~95%的乙醇提取補骨脂藥材；將合併的提取液濃縮回收乙醇後，加入3%氫氧化鈉水溶液使所得濃縮物溶解；將所得溶液過濾，並且用10%鹽酸水溶液將濾液的pH值調節至8~9;將所得溶液過濾，並且加入3%氫氧化鈉水溶液將所得固體溶解；以及將所得鹼性溶液裝入大孔吸附樹脂，先用去離子水，再依次用30%乙醇和95%乙醇洗脫進行純化，得到本發明的補骨脂提取物。11.根據權利要求8至IO任意一項的方法，其中所述的大孔吸附樹脂為苯乙烯骨架樹脂。12.根據權利要求8至10任意一項的方法，其中所述的大孔吸附樹脂為DlOl、AB-8或HPD-400。13.權利要求1至3任一項的補骨脂提取物或者權利要求4至7任一項的藥物組合物在製備用於治療更年期症候群、乳腺癌和/或心腦血管疾病的藥物中的用途。全文摘要本發明涉及補骨脂提取物、含有它的藥物組合物及其製備方法和用途。本發明的補骨脂提取物包含40～90％的補骨脂酚和2～10％的補骨脂黃酮類成分，並且不包含補骨脂素和異補骨脂素。實驗表明，本發明的補骨脂提取物及含有它的藥物組合物對雌激素β受體的結合作用更強，顯示出較好的協同效應，因此預期它可用於治療更年期症候群、乳腺癌和/或心腦血管疾病。文檔編號A61K36/487GK101406513SQ20081018271公開日2009年4月15日申請日期2008年12月3日優先權日2008年12月3日發明者劉二偉,張伯禮,靜楊,樊官偉,怡王,虹王,王躍飛,蘇豔芳,丹辛,高秀梅申請人:天津中醫藥大學