重組禽副粘病毒疫苗及其製備和使用方法

2023-05-18 18:44:41

專利名稱：重組禽副粘病毒疫苗及其製備和使用方法
技術領域：
本發明涉及禽副粘病毒(APMV)和APMV序列。本發明涉及用於插入和表達外源基因以用作保護免受多種病原體侵害的安全免疫媒介物的病毒載體。其涉及在反向遺傳學體系中用於產生活減毒疫苗的載體疫苗。其還涉及可用於在體外表達載體中產生亞單位或用作待被整合入病毒或質粒類型體內表達載體的序列的多核苷酸。本發明涉及未修飾的和經修飾的APMV病毒，其製備和使用方法以及某些DNA和蛋白質序列。更具體地，本發明涉及其中病毒的天然基因組已被改變的APMV病毒(「APMV突變體「或「重組APMV」 )和涉及製備及使用此類APMV變體或重組APMV的方法。
背景技術：
病毒載體疫苗代表疫苗開發的最快速成長領域之一。主要的全球感染性疾病HIV、 肺結核(tuberculosis)和瘧疾的許多處於臨床開發中的疫苗是基於病毒載體。動物的病毒載體疫苗已上市，例如用於陪伴動物(companion animal)和家禽的禽痘病毒疫苗、用於家禽的禽皰疹病毒載體疫苗和用於野生動物的痘苗病毒載體疫苗。但其它家畜類載體疫苗處於開發中。病毒載體疫苗的有利方面是它們可被安全地施用，這是由於使用已被大大減毒並且其本身在動物中不引發疾病的載體主鏈所致。目前使用的病毒載體的不利方面是母傳抗體或因以往感染而獲得的抗體的存在。此類抗體將中和載體病毒，從而減少載體疫苗的成功。載體疫苗開發的一個主要動力是最先在亞洲、隨後在歐洲和非洲發生的高致病性流感病毒H5W的出現。已開發了幾種載體疫苗候選物，包括禽痘病毒(Taylor等人， 1988)、痘苗病毒(Chambers等人，1988)、勞氏肉瘤病毒(Hunt等人，1988)、腺病毒(Tang等人，2002，Gao等人，2006)，委內瑞拉馬腦炎病毒Gchultz-Cherry等人、2000)、新城疫病毒 (US6, 719，979，Veit s 等人，2006，Swayne 等人，2002，Park 等人，2006)、傳染性喉氣管炎的皰疹病毒(Veits等人2003)，火雞的皰疹病毒(Darteil等人，19%)以及基於腺病毒的載體疫苗(Hoelscher等人，2008，Toro等人，2007)。已在首次用於實驗的鳥中測試了這些載體疫苗的功效，但到目前為止還沒有公布關於這些載體疫苗在對所述病毒載體和/或由所述插入物編碼的蛋白質有預存免疫的鳥類中的功效的報導。副粘液病毒科包括人(麻疹，腮腺炎，副流感和呼吸道合胞病毒)和動物病原體 (新城疫病毒和牛瘟病毒)，所述病毒對公共衛生以及全球經濟造成重大影響(Lamb等人， 2007)。該病毒科的成員定義為具有單組分(monopartite)反義單鏈RNA基因組。副粘液病毒科由兩個亞科即副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)和肺炎病毒亞科(Pneumovirinae) 組成。根據最近的重新分類，副粘病毒亞科包括5個屬即麻疹病毒屬(Morbillivirus)、亨尼波病毒屬(Henipavirus)、Rubulavirus、呼吸系病毒屬(Respirovirus)禾口 Avulavirus， 而月市炎病毒亞科包括月市炎病毒屬(Pneumovirus)和偏月市病毒屬(Metapneumovirus) (Mayo,2002)。禽副粘病毒(APMV)被分類在腮腺炎病毒屬中，包括已使用血凝抑制(HI)試驗 (Alexander, 1988)確定的9個抗原上不同的血清型。在這9個血清型中，屬於APMV-I亞型的分離株可引起商業家禽的災難性疾病，並且被分類為速髮型新城疫病毒(NDV)。NDV 的更溫和形式被稱為中髮型和緩髮型分離株，其中後一種形式在家禽中大多無症狀。屬於 APMV-2、3、6和7的分離株也與家禽的疾病相關。具體地，APMV-2和3的分離株引起的感染可引發輕度呼吸性疾病和蛋質量和數量上的問題(Bankows ki等人，1981 ；Redmann等人， 1991 ；Tumova等人，1979 ；Zhang等人，2007)。已知APMV-6和7的分離株感染火雞、鴨和候鳥並且可誘導呼吸性疾病，所述疾病可牽涉繼發感染(Saif等人，1997 ；Shortridge等人， 1980)。在另一方面，已從鴨、水禽和其它野生鳥類分離了 APMV-4、5、8和9的分離株，但所述鳥類在病毒感染後極少顯示臨床症狀(Alexander等人，1983 ；Capua等人，2004 ；Gough 等人，1984 ；Maldonado 等人，1995 ；Shortridge 等人，1980)。幾個NDV分離株的完整基因組序列已被確定並且用於闡釋NDV毒力的各種決定簇(de Leeuw 等人，1999 ;Krishnamurthy 等人，1998 ;Zou 等人，2005)。在最近兩年中， 除APMVl外的幾種APMV序列已被公布，例如APMV-2的GenBank登錄號EU338414、APMV-3 的 EU403085、APMV-4 的 FJ177514、APMV-6 的 EU622637、APMV-7 的 FJ231524、APMV-8 的 FJ215863、FJ215864和FJ619036、APMV-9的EU910942。除了序列信息外，關於致病因子知之甚少。APMV 2-9的分離株大部分是從候鳥分離的。有趣地，鮮見用此類分離株對雞進行實驗性感染的報導(Saif等人，1997)。由於這些APMV在野生鳥類中廣泛傳播，並且在某些情況下已從有時引起它們死亡(Saif等人，1997 ；Shihmanter等人，1998 ；Shihmanter等人，1998)的商業鳥群中(aiang等人，2007)分離到所述APMV，因此需要了解關於它們在禽類中的毒力的知識。大多數APMV分離株引起相對輕度的疾病，所述疾病在伴隨細菌或病毒感染存在時可惡化，這可能導致經濟影響。具體地，APMV-2最早在1956年作為二級病原體從南加利福尼亞的受急性喉氣管炎影響的雞中分離到(Bankowski等人，1960)。由於該血清型的許多株已從幾個鳥類物種分離到，這表明APMV-2在世界上被廣泛傳播(Andral等人，1984 ； Bradshaw 等人，1979 ；Fleury 等人，1979 ；Goodman 等人，1988 ；Lang 等人，1975 ；Lipkind 等人，1982 ；Lipkind等人，1979 ；Zhang等人，2006)。Bankowski等人報導了產蛋雌火雞對APMV-2的自然以及人工暴露造成了孵化率和家禽產率(poultry yield)的顯著下降 (Bankowski等人，1981)。APMV-4分離的最初實例是從美國密西西比候鳥遷棲所經路徑上的獵人殺死的野生鴨(Webster等人，1976)以及在家禽的流行性感冒監測分析(influenza surveillance programs of poultry)期間在香港從雞、鴨和鵝(Alexander 等人，1979)分離至IJ。除了來自患有出血性腸炎的環頸鴨的分離株(Gough等人，1984)外，所有其它分離株在家禽中似乎是非致病性的，並且發現它們在全世界的水禽中具有廣泛分布(Manislawek 等人，2002 ；Tumova等人，1989 ；Yamane等人，1982)。Gough等人報導在用來自環頸鴨的分離株鼻內接種1周齡小鴨子和2周齡雞後未獲得臨床體徵，並且HI滴度極低(1 :8或更低) (Gough等人，1984)。類似地，作為流感監測項目的結果，APMV-6的第一個分離株也是來自香港的家禽，並且據報導在雞中是非致病性的(基於來自實驗性感染的雞的低HI滴度) (Shortridge等人，1980)。然而，已報導了導致輕度呼吸性疾病和產蛋問題的火雞APMV-6 感染(Alexander，2003)。
APMV-8(鵝/德拉瓦/1053/76)最早在美國從獵人殺死的加拿大鵝(黑額黑雁 (Brantacanadensis))分離而來(Rosenberger等人，1974)。南西班牙的獵鳥的血清學研究(1990至199 顯示，APMV-8抗體在達到43 %的測試血清中大量存在(Maldonado等人，1995)。就APMV感染測定紐西蘭的活的健康馴化野鴨的狀態的另一個血清學研究顯示， APMV-8抗體在56%的測試血清中存在Gtanislawek等人，200 。Warke等人Q008)描述了 16%至31%的被研究雞血清可能本來具有APMV-8抗體。但因現有的抗APMVl的高滴度， 假陽性HI測試的可能性也可能存在，因為血清在HI測定中不能非常特異性地反應。除當就禽流感病毒研究群體時分離的APMV-8的少數水禽分離株外(Stallknecht等人，1991)， 一直缺乏關於該病毒的流行和致病性的信息。用於NDV的負鏈RNA基因組的反向遺傳學體系的開發使得可能將外源基因序列插入基因組，從而使得可能產生用於接種和基因治療的重組NDV載體(Krishnamurthy等人， 2000 ；Peeters等人，1999 ；Roemer-Oberdoerfer等人，1999)。已報導了表達外源病毒蛋白例如流感病毒A型的Hl亞型的HA蛋白(Nakaya等人，2001)、傳染性腔上囊病病毒的VP2 蛋白(IBDV) (Huang 等人，2004)、H5 亞型(Veits 等人，2006 ；Ge 等人，2007)和亞型 H7 (Park 等人，2006)的禽流感染病毒血凝素的重組NDV載體。然而，僅在SPF禽中證明了大多數此類疫苗的功效。NDV在家禽中引起災難性疾病，導致家禽工業的嚴重經濟損失。因此在世界上大多數國家常規地給商業雞接種抗NDV的疫苗。因此，來自已免疫的親代群體的雞具有高水平的母傳抗體。常規活NDV疫苗即使在這些抗體存在的情況下也提供保護作用。然而，重組NDV疫苗(具有外源基因插入)與活NDV疫苗相比較通常更加減毒，它們的功效在 NDV母傳抗體存在的情況下可被削弱。因此，存在對可為用於表達異源抗原的安全疫苗提供基礎的載體疫苗平臺的需要。理想地，重組疫苗可誘導強體液免疫反應，可適用於大量施用，並且廉價。發明概述本發明涉及包含⑴重組APMV和(ii)藥用或獸醫學可接受的載體的疫苗或組合物。本發明包括用於修飾APMV的基因組以產生重組APMV病毒或APMV病毒載體的方法；通過此類方法製備的經修飾的APMV ；DNA和蛋白質序列；以及利用此類重組APMV感染細胞和宿主動物以引起所述細胞和宿主動物擴增外源DNA和由該外源DNA編碼的蛋白質(包括抗原性蛋白質)的方法。本發明的一個方面涉及APMV病毒、參與製備經修飾的或重組的病毒的DNA和蛋白質序列。本發明的一個實施方案涉及APMV-2、4、6或8的基因組和蛋白質序列。本發明的另一個方面涉及經修飾的重組APMV病毒(所述病毒具有增強的安全性、 強體液免疫反應)以及製備此類重組病毒的方法。本發明的另一個方面涉及與已知的APMV或其它重組疫苗相比具有升高的安全水平的重組APMV病毒疫苗或組合物。在另一個方面，本發明提供了用於在宿主中表達基因產物的未修飾的和經修飾的 APMV病毒載體。本發明的另一個方面涉及通過將來自任何來源的DNA插入APMV基因組的基因間區域或非必需區域而修飾的重組APMV病毒。根據本發明使用具有編碼和表達抗原的異源基因的合成地修飾的APMV病毒重組體來產生新型組合物或疫苗，
本發明的另一個方面涉及提供反向遺傳學體系的APMV病毒載體，其中所述載體可在不同的宿主動物中用作主鏈用於重組疫苗或組合物。在一個方面，本發明涉及用於在以組合物或疫苗接種的宿主動物中誘導免疫反應的藥物組合物或疫苗，所述組合物或疫苗包括藥用可接受的載體和經修飾的APMV重組病毒或病毒載體。在本發明的另一個方面，所述重組APMV病毒或病毒載體在病毒基因組的非必需區域內包括編碼來源於病原體的抗原性蛋白質的異源DNA，其中當給宿主施用時，所述組合物或疫苗能夠誘導特異於由所述病原體編碼的蛋白質的免疫反應。本發明的另一個方面涉及用於在動物中誘導對抗原的免疫反應的方法，所述方法包括用含有經修飾的重組APMV病毒或病毒載體(所述載體包含和表達所述動物的病原體的抗原決定簇)的疫苗或藥物組合物接種動物。本發明的另一個方面涉及在初免-加強方案中誘導動物的對抗原的免疫反應的方法。本發明的另一個方面涉及通過向細胞引入經修飾的重組APMV病毒來在體外細胞培養物中表達基因產物的方法，其中所述基因可以是來源於病原體的抗原性蛋白。附圖概述可結合附圖理解通過舉例給出的下列詳細描述，這些實例並不意在將本發明限定於所描述的具體實施方案，其中

圖1是顯示在用APMV_2、4、6於含胚雞蛋中進行實驗性感染後從雞的幾個器官進行的病毒分離列表。圖2是顯示在用APMV_2、4、6進行實驗性感染後雞的幾個器官的組織學結果列表。圖3描述了利用APMV-2、4或6實驗性接種的SPF雞中的HI抗體滴度。對感染後第2、4、7、14和25天收穫的雞血清樣品進行HI測試以分析HI抗體的存在情況。圖4顯示利用APMV-8實驗性感染的SPF雞和鴨內的HI抗體滴度。利用劑量為 IO6EID50的APMV-8鼻感染雞和鴨。在感染後第2、4、7、14和觀天收集血清樣品，利用APMV-8 抗原通過HI測試分析所述樣品。HI血清滴度(以log2表示)示於左軸上。圖5顯示在利用APMV-8的初免/加強接種方案過程中SPF雞中HI抗體滴度的發展情況。在第1天(初免)和第14天(加強)利用劑量為IO6EID5tl的APMV-8感染1日齡 SPF雞。在第一次感染後第7天和第14天獲得血清樣品，在第二次感染後第7天和第14天獲得血清樣品。對血清進行HI測試。HI血清滴度(以log2表示)示於左軸上。圖6顯示通過瓊脂糖凝膠電泳分析RT-PCR產物。在感染後第2天從非感染的鴨 (C1-C5)和APMV-8感染的鴨(11-15)獲取氣管組織。將組織勻漿，製備RNA以用於RT-PCR。 平行製備水對照(W)。在1.5%瓊脂糖凝膠上分離反應產物。通過使用IOObp分子量梯度 (New Eng 1 andBiolabs)作為片段大小的對照。DNA片段的大小顯示於右邊。圖7是顯示來自用APMV-8實驗性感染的雞和鴨的病毒分離列表。在含胚雞蛋中進行雞組織的病毒分離，通過RT-PCR檢測來自鴨組織的病毒RNA。圖8是顯示在用APMV-8感染雞和北京鴨後幾個器官的組織學檢查結果的列表。圖9顯示在用不同劑量的APMV-8感染後在SPF雞中HI抗體滴度的發展情況。在第1天用不同感染劑量(ID)的APMV-8感染或用病毒轉運液(VTM)模擬感染1日齡SPF雞。 在感染後第7天和第14天獲取血液，通過HI測試分析獲得的血清樣品。HI血清滴度(以 log2表示)示於左軸上。血清樣品的幾何平均滴度(GMT)示於最底行。
圖10顯示在用不同劑量的APMV-8感染後北京鴨中HI抗體滴度的發展情況。在第1天用不同感染劑量(ID)的APMV-8感染或用病毒轉運液(VTM)模擬感染1日齡SPF北京鴨。在感染後第7天和第14天獲取血液，通過HI測試分析獲得的血清樣品。HI血清滴度(以log2表示)示於左軸上。血清樣品的幾何平均滴度(GMT)示於最底行。圖11是顯示相應DNA和蛋白質序列的SEQ ID NO的列表。圖12描述了 APMV-8株(APMV-8 =SCffDS ID :MA_7，從野鴨分離的)的全長基因組序列和全長APMV-8基因組的遺傳圖譜。圖12描述了編碼APMV-8核蛋白(NP)的DNA序列(SEQ ID NO 2)和NP蛋白序列 (SEQ ID NO :3)。圖13描述了編碼APMV-8磷蛋白(P)的DNA序列(SEQ ID NO 4)和P蛋白序列 (SEQ ID NO :5)。圖14描述了編碼APMV-8基質蛋白(M)的DNA序列(SEQ ID NO 6)和M蛋白序列 (SEQ ID NO :7)。圖15描述了編碼APMV-8融合蛋白(F)的DNA序列(SEQ ID NO 8)和F蛋白序列 (SEQ ID NO 9)。圖16描述了編碼APMV-8血凝素/神經氨酸苷酶(HN)的DNA序列(SEQ ID NO 10)和 HN 蛋白序列(SEQ ID N0:11)。圖17描述了編碼APMV-8聚合酶(L)的DNA序列(SEQ ID NO 12)禾口 L蛋白序列 (SEQ ID N0:13)。該 APMV_8L(1)蛋白是從位於 SEQ I D NO 1 的位置 8273-8275 處的 ATG 密碼子翻譯的。圖18描述了 APMV-8聚合酶(L)的蛋白質序列(2) (SEQ ID NO 14)。該APMV_8L(2) 蛋白是從位於SEQ ID NO :1的位置8297-8299處的ATG密碼子翻譯的。SEQ ID N0:14不包含SEQ ID NO 13的前8個胺基酸。圖19A是APMV-8反向遺傳學體系的流程圖。圖19B描述了 APMV-8病毒在MDCK 細胞中的複製結果。圖20描述了在APMV-8接種2周後商業肉雞的HI測試結果。圖21描述了在APMV-8接種4周後商業肉雞的HI測試結果。圖22顯示在卵內接種(in ovo vaccination)後第18天HI測試的結果(研究 1)。圖23描述了在卵內接種後第19天HI測試的結果(研究2)。圖M顯示了在卵內接種後第18天HI測試的結果(研究3)。圖25描述了 5，-全長基因組(5，-FLG)和3，-全長基因組(3，-FLG)序列，包括側翼序列。圖 26 描述了 pcNDA-NP，pcNDA-P，pcDNA-L 和 pcDNA3_T7 的質粒圖譜。圖 27 描述了 pUC18-MG-APMV-8 和 pCITE4A_EGFP 的質粒圖譜。圖 28 描述了 pUC57-FL-APMV-8 的質粒圖譜。圖四描述了微型基因組APMV-8序列。圖30顯示NP蛋白質序列比對以及DNA和蛋白質水平上的序列同一性。圖31顯示P蛋白序列比對以及DNA和蛋白質水平上的序列同一性。
圖32顯示M蛋白序列比對以及DNA和蛋白質水平上的序列同一性。圖33顯示F蛋白序列比對以及DNA和蛋白質水平上的序列同一性。圖34顯示HN蛋白序列比對及DNA和蛋白質水平上的序列同一性。圖35顯示L蛋白序列比對以及DNA和蛋白質水平上的序列同一性，發明詳述應理解在本公開內容，特別是在權利要求中，術語例如「包含」、「包括」、「含有」等可具有美國專利法中所賦予的意義；例如，它們可意指「包括」、「包含」、「含有」等；並且術
語例如「基本上由......組成」和「基本上由......構成」具有美國專利法中所賦予的意
義，例如，它們允許有未明確記載的要素，但排除在現有技術中發現的或影響本發明的基本或新特徵的要素。除非另外指出，否則按照常規慣用法使用技術術語。分子生物學中的常見術語的定義可見於 Benjamin Lewin 的 Genes V,由 Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)出版；Kendrew等人(eds. )，The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.，1994 (ISBN 0-632-02182-9)出版；和 Robert A. Meyers (ed.)， Molecular Biology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference, 由 VCH Publishers, Inc. ,1995 (ISBN 1-56081-569-8)出版。除非另外明確地指出，否則單數「一種/個(a)」、「一種/個(an)」、「該/所述 (the)」包括所指物的複數形式。類似地，除非另外明確地指出，單詞「或」意指包括「和」。 單詞「或」意指特定列表的任一個成員，並且還包括該列表的成員的任何組合。應指出，在本公開內容和所述權利要求和/或段落中，術語「禽副粘病毒」或 「APMV」 可互換使用，意指和包括 APMV-l、APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-5、APMV-6、APMV-7、 APMV-8 及 APMV-9。術語「動物」在本文中包括所有哺乳動物、鳥類和魚。本文中使用的動物可選自馬科動物(例如，馬)、犬科動物(例如，狗、狼、狐狸、叢林狼(coyote)、豺(jackal))、貓科動物(例如，獅子、老虎、家貓、野貓、其它大型貓科動物以及其它貓科動物包括獵豹和山貓)、 牛類動物(例如，牛)、豬類(例如，豬)、羊類(例如，綿羊、山羊、美洲駝、野牛)、禽類(例如，雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、雉、鸚鵡、雀、鷹、鴉、鴕鳥、食火鳥(emu)和食火雞)、靈長類動物 (例如，原猴、跗猴、猴、長臂猿、猿)、人和魚。術語「動物」還包括處於所有發育階段(包括胚胎期和胎兒期)中的個體動物。術語「多肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，意指連續胺基酸殘基的聚合物。術語「核酸」、「核苷酸」和「多核苷酸」可互換使用，是指RNA、DNA、cDNA(互補DNA) 或cRNA(互補RNA)及其衍生物，例如包含經修飾主鏈的形式。應理解，本發明提供了包含與本文中描述的序列互補的序列的多核苷酸。本發明中涉及的「多核苷酸」包括正向鏈(5』 至3』 )和反向互補鏈(3』至5』)。根據本發明的多核苷酸可以以不同的方式製備(例如， 通過化學合成，通過基因克隆等)並且可採取不同形式(例如，線性或分支的，單鏈或雙鏈的，或其雜交體、引物、探針等)。術語「基因組DNA」或「基因組」可互換使用，是指宿主生物的可遺傳的遺傳信息。 基因組DNA包括細胞核的DNA (也指染色體DNA)，而且還包括質體(例如，葉綠體)和其它細胞器(例如，線粒體)的DNA。本發明中涉及的基因組DNA或基因組也指病毒的RNA。所述RNA可以是正鏈或負鏈RNA。本文中涉及的術語「基因組DNA」包括包含與本文中描述的序列互補的序列的基因組DNA。術語「基因組DNA」也指信使RNA(mRNA)、互補DNA(cDNA) 和互補RNA (cRNA)。本文中使用的術語「基因組RA (核酸)」包括RNA、mRNA、cRNA、DNA禾口 cDNA,術語「基因」被廣泛地用於指與生物學功能相關的任何多核苷酸區段。因此，基因或多核苷酸包括內含子和外顯子(如在基因組序列中)或只是編碼序列(如在cDNA中)， 例如開放閱讀框(ORF)，其始於起始密碼子(甲硫氨酸密碼子)、終於終止信號(終止密碼子)。基因和多核苷酸還可包括調節它們的表達(例如轉錄起始、翻譯和轉錄終止)的區域。因此，還包括的是啟動子和核糖體結合區(一般地，這類調控元件位於編碼序列或基因的起始密碼子上遊約60至250個核苷酸；Doree SM等人.；Pandher K等人.；ChungJY等人)、轉錄終止子(一般地，終止子位於編碼序列或基因的終止密碼子的下遊約50個核苷酸內；Ward C K等人)。基因或多核苷酸還指表達mRNA或功能RNA、或者編碼特定蛋白質以及包括調控序列的核酸片段。本文中使用的術語「異源DNA 」是指來源於不同生物體例如與受者不同的細胞類型或不同的物種的DNA。該術語還指宿主DNA的相同基因組上的DNA或其片段，其中將所述異源DNA插入基因組內與其原始位置不同的區域。如本文中所使用的，術語「抗原」或「免疫原」意指誘導宿主動物的特定免疫反應的物質。抗原可包括殺死的、減毒的或活的完整生物體；生物體的亞單位或部分；包含具有免疫原性性質的插入物的重組載體；能夠在呈遞至宿主動物後誘導免疫反應的一段DNA或 DNA片段；多肽、表位、半抗原或其任何組合。可選擇地，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒
ο本文中使用的術語「免疫原性蛋白質或肽」包括具有免疫活性的多肽，其意義是所述多肽在當給宿主施用時其能夠引發針對該蛋白質的體液和/或細胞類型的免疫反應。優選所述蛋白質片段是這樣的片段，所述片段具有與完整蛋白質大體上相同的免疫活性。因此，根據本發明的蛋白質片段包含至少一個表位或抗原決定簇或基本上由或由其組成。「免疫原性」蛋白質或多肽，如本文中所使用的，包括該蛋白質的全長序列、其類似物或其免疫原性片段。「免疫原性片段」意指包括一個或多個表位，從而引發上述免疫反應的蛋白質片段。可使用本領域內公知的許多表位作圖技術鑑定此類片段。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第 66 卷(Glenn Ε. Morris,Ed.，1996)。例如，線性表位可通過例如在固體支持物上同時合成大量肽(所述肽對應於蛋白質分子的部分)，將所述肽與抗體反應(同時肽仍然連接於支持物上)來確定。此類技術在本領域內是已知的，並且描述於例如美國專利No. 4，708, 871 ；Geysen等人，1984 ；Geysen等人，1986。 類似地，構象表位可通過例如利用諸如χ射線晶體學和2維核磁共振測定胺基酸的空間構象來容易地鑑定。參見，例如，Epitope Mapping Protocol s，同上。術語「免疫原性蛋白質或肽」還涉及對序列的缺失、添加和置換，只要所述多肽能夠產生如本文中定義的免疫反應即可。術語「保守性改變」意指用另一個生物學上相似的殘基對胺基酸殘基的置換，或核酸序列中核苷酸的置換從而所編碼的胺基酸殘基不改變或為另一個生物學上相似的殘基)。在這方面，特別優選的置換通常在性質上是保守的，即在胺基酸的家族內發生的置換。例如，胺基酸通常被分成4個家族(1)酸性-天冬氨酸和穀氨酸；( 鹼性-賴氨酸、精氨酸、組氨酸；C3)非極性一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性-甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時分類為芳香族胺基酸。保守性改變的實例包括一個疏水殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸對另一個疏水殘基的置換，或一個極性殘基對另一個極性殘基的置換，例如精氨酸對賴氨酸的置換、穀氨酸對天冬氨酸的置換或穀氨醯胺對天冬醯胺的置換等；或用結構上相關的、對生物活性不具有重大影響的胺基酸對胺基酸的類似保守替換。因此，與參照分子具有大體上相同的胺基酸序列但具有最少胺基酸置換、基本上不影響蛋白質的免疫原性的蛋白質在所述參照多肽的定義內。通過這些修飾產生的所有多肽包括在本文中。術語「保守性改變」還包括使用取代的胺基酸替代未取代的親代胺基酸，只要針對該取代的多肽產生的抗體也與該未被取代的多肽免疫反應即可。「宿主細胞」表示已被遺傳改變或能夠通過施用外源多核苷酸例如重組質粒或載體而被遺傳改變的原核或真核細胞。當指遺傳改變的細胞時，該術語是指原始改變的細胞和其後代。可將包含期望的序列的多核苷酸插入適當的克隆或表達載體，然後可將所述載體引入適當的宿主細胞以進行複製和擴增。可利用本領域已知的任何方法將多核苷酸引入宿主細胞。可利用許多適當方法中的任何方法將包含目的多核苷酸的載體引入宿主細胞，所述方法包括直接攝入、胞吞、轉染、交配、電穿孔、利用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、 DEAE-葡聚糖或其它物質進行的轉染；微粒轟擊；脂轉染；以及感染(其中載體是感染性的，例如逆轉錄病毒載體)。引入載體或多核苷酸的選擇通常取決於宿主細胞的特徵。對組合物或疫苗的「免疫反應」是在宿主中產生針對目的組合物或疫苗的細胞/ 或抗體介導的免疫反應。通常，「免疫反應」包括但不限於下列效應中的一種或多種特異於包含在目的組合物或疫苗中的(一種或多種)抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞和/或細胞毒性T細胞的產生。優選，宿主將顯示治療性或保護性免疫反應，從而對新型感染的抗性得到增強和/或減輕疾病的臨床嚴重度。這樣的保護作用可通過由被感染的宿主通常顯示的症狀的減輕或不存在、被感染宿主的更快的恢復時間和/或更低的病毒滴度來證明。本發明的一個實施方案提供了 APMV-8的基因組DNA序列和編碼的蛋白質序列。本發明的APMV-8株的互補基因組DNA(cDNA)序列具有SEQID NO 1中所示的多核苷酸序列。 APMV-8 基因組 cDNA 序列(SEQ ID NO 1)與 APMV-1 基因組 DNA(SEQ ID NO 15)具有 48% 的序列同一性，與APMV-2基因組DNA(SEQ ID NO 16)具有61 %的序列同一性，與APMV-3基因組 DNA(SEQ ID NO :17)具有 47. 2%的序列同一性，與 APMV-4 基因組 DNA(SEQID NO :18) 具有47. 6%的序列同一性，與APMV-6基因組DNA(SEQ ID NO :19)具有52%的序列同一性， 與APMV-7基因組DNA (SEQ ID NO 20)具有53%的序列同一性，與APMV-8基因組DNA (SEQ ID NO: 37)具有 99. 的序列同一性，與 APMV-8 基因組 DNA (SEQ ID NO :38)具有 96. 5% 的序列同一性，與APMV-8基因組DNA (SEQ ID NO 39)具有96. 4%的序列同一性，與APMV-9 基因組DNA(SEQ ID NO :40)具有48%的序列同一性。在另一個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID N0:l、2、4、6、8、10或12所示序列的多核苷酸及其變體或片段。本發明還包括與本文中描述的多核苷酸互補的鏈。在另一個實施方案中，本發明提供了具有SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13或14中所示序列的多肽及其變體或片段。此外，來自APMV例如APMV-8、APMV-2、APMV-4、APMV-6株的多核苷酸或多肽的同源物意欲包括在本發明的範圍內。如本文中所使用的，術語「同源物」包括直向同源物、類似物和旁系同源物。術語「類似物」是指具有相同或相似功能、但在不相關生物中分別進化的兩種多核苷酸或多肽。術語「直向同源物」是指來自不同物種、但通過物種形成從共同祖先基因進化而來的兩種多核苷酸或多肽。通常，直向同源物編碼具有相同或相似功能的多肽。術語「旁系同源物」是指通過在基因組內複製而關聯的兩種多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但這些功能可以是相關的。野生型APMV多肽的類似物、直向同源物和旁系同源物可以通過翻譯後修飾、因胺基酸序列差異或兩者而與野生型APMV多肽不同。具體地，本發明的同源物通常與APMV-8的多核苷酸或多肽序列的全部或部分展示至少 80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，並且展示相似的功能。在另一個方面，本發明提供了具有SEQ ID NO :1中所示序列的APMV-8基因組 cDNA。在另一個實施方案中，所述多核苷酸是具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸的反向互補鏈。在另一個實施方案中，所述多核苷酸或本發明多核苷酸的反向互補鏈與具有 SEQ ID NO :1中所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一個實施方案中，本發明提供了編碼AMPV-8多肽的多核苷酸的片段，所述多核苷酸例如編碼具有SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13或14所示序列的多肽的多核苷酸。在另一個方面，本發明提供了編碼多肽或保守變體、等位基因變體、同源物或包含這類多肽之一的至少8個或至少10個連續胺基酸的免疫原性片段或這類多肽的組合的多核苷酸，所述多肽與具有SEQ ID NO :3，5，7，9，11，13或14所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，在另一個方面，本發明提供了具有SEQ ID N0:l、2、4、6、8、10或12所示核苷酸序列的多核苷酸或其變體。在另一個實施方案中，所述多核苷酸是具有SEQ ID N0:1所示序列的多核苷酸的反向互補鏈。在另一個方面，本發明提供了與SEQ ID N0:l、2、4、6、8、10或 12所示序列的多核苷酸之一具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95^^96%,97^^98%或99%的序列同一性的多核苷酸或其反向互補鏈，或其變體。在另一個方面，本發明提供了與具有SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13或14所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、 98%或99%的序列同一性的多肽。在另一個方面，本發明提供上文中鑑定的APMV多肽(SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13或14)的片段和變體，其可由本領域技術人員使用公知的分子生物學技術來容易地製備。變體是具有與SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13或14所示胺基酸序列有至少75 %、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列的同源多肽。變體包括等位基因變體。術語「等位基因變體」是指包含多態性的多核苷酸或多肽，所述多態性導致蛋白質的胺基酸序列改變並且存在於天然群體(例如，病毒種類或變種)中。此類天然等位基因變異通常可導致多核苷酸或多肽內1-5%的差異。等位基因變體可通過對許多不同物種的目的核酸序列進行測序來鑑定，這可通過使用雜交探針鑑定這些物種內相同基因座來容易地進行。任何和所有此類核酸變異以及因天然等位基因變異而產生的並且不改變目的基因功能活性的所得胺基酸多態性或變異意欲包括在本發明的範圍內。關於序列的術語「同一性」可以是指例如相同核苷酸或胺基酸的位置數目除以兩個序列中更短序列的核苷酸或胺基酸數目，其中可按照Wilbur和Lipman算法(Wilbur和 Lipman)測定這兩個序列的比對。兩個胺基酸序列的序列同一性或序列相似性，或兩個核苷酸序列之間的序列同一性可使用Vector NTI軟體包Qnvitrogen, 1600Faraday Ave., Carlsbad, CA)來測定。當RNA序列被稱為與DNA序列相似，或具有一定程度的序列同一性或同源性時，DNA序列中的胸苷(T)被認為與RNA序列中的尿苷(U)等同。因此，RNA序列在本發明的範圍內並且可以從DNA序列衍生而來，其中DNA序列中的胸苷(T)被視為與RNA 序列中的尿苷(U)等同。在一個方面，本發明涉及用於在用疫苗或組合物接種的宿主動物中誘導免疫反應的藥物組合物或疫苗，所述疫苗或組合物包含藥用可接受載體和經修飾的APMV重組病毒或病毒載體。在本發明的另一個方面，所述重組APMV病毒或病毒載體在病毒基因組的非必需區域內包括異源DNA序列，所述異源DNA序列編碼來源於病原體的抗原性蛋白質，其中所述組合物或疫苗當給宿主施用時能夠誘導特異於由該病原體編碼的所述蛋白質的免疫反應。「載體」是指包含待被體外或體內遞送至靶細胞的異源多核苷酸的重組DNA或RNA 質粒、噬菌體或病毒。所述異源多核苷酸可包括用於預防或治療目的的目的序列，並且任選地可以以表達盒的形式存在。如本文中所使用的，載體不一定能夠在最終的靶細胞或受試者中複製。該術語包括用於克隆的載體以及病毒載體。術語「工程改造的」或「重組的」意指非天然存在的或以非天然發現的排列方式與另一個多核苷酸相連接的半合成或合成來源的多核苷酸。術語「非必需區域」是指病毒基因的區域，所述區域不是病毒在組織培養中複製和增殖所必需的，並且其缺失或失活可降低在多種動物系統中的毒力。任何非必需區域或其部分可從APMV基因缺失，或可將外源序列插入其中，由缺失或插入而引起的重組APMV的活力和穩定性可用於確定缺失的區域或其部分是否確實是非必需的。在一個實施方案中， APMV基因組的非必需區域是APMV-2、4、6或8基因組上的不編碼聚合酶(L)的任何區域。 在另一個實施方案中，非必需區域包括編碼非必需蛋白質的開放閱讀框。在這方面，開放閱讀框選自核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)和血凝素/神經氨酸苷酶 (HN)。在一個實施方案中，非必需區域位於NP基因的上遊。在另一個實施方案中，非必需區域位於L基因的下遊。在另一個實施方案中，非必需區域是非編碼區或基因間區域。在這方面，非編碼或基因間區域可以是APMV-2、4、6或8基因組上的NP與P基因之間、P與 M基因之間、M與F基因之間或F與HN基因之間的區域。在另一個實施方案中，非必需區域可在 SEQ ID NO 1 的核苷酸位點 1-140、1526-1692、四10-3085、4195-4498、6130-6382、 8116-8272,8116-8289 或 15013-15342 的區域中。在另一個方面，本發明包括APMV嵌合體，其中APMV載體的一個部分或完整的基因或者幾個部分或完整的基因被來自其它病毒(特別是屬於副粘液病毒科的病毒)的相似基因替代。在本發明的一個實施方案中，所述疫苗或藥物組合物包括抗原，所述抗原選自禽病原體，包括、但不限於鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、雞產蛋下降症候群病毒(EDQ或傳染性腔上囊病病毒(IBDV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、禽腺病毒、馬雷克病病毒(MDV)、禽痘病毒、鴨腸炎病毒(DEV)、鴨細小病毒、禽流感病毒、APMV例如 APMV-I等，及其組合。在另一個實施方案中，所述疫苗或藥物組合物包括抗原，所述抗原選自貓科動物病原體，例如但不限於貓皰疹病毒(FHV)、貓杯狀病毒(FCV)、貓白血病病毒O^eLV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、貓科動物細小病毒(FPV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、狂犬病病毒等，及其組合。在另一個實施方案中，本發明的疫苗或藥物組合物包括抗原，所述抗原選自犬病原體，包括但不限於狂犬病病毒、犬皰疹病毒(CHV)、犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、 犬副流感病毒2 (CPI2)、犬冠狀病毒、犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、出血性黃疸鉤端螺旋體(L印tospiraicterohaemorragiae)、感冒傷寒性鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)、■{白氏疏電累旋體(Borrelia burgdorferi)、支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)等，及其組合。在另一個實施方案中，所述疫苗或藥物組合物包括抗原，所述抗原選自馬科動物病原體，例如馬皰疹病毒(1型或4型)、馬流感病毒、破傷風病毒、西尼羅病毒、馬動脈病毒等，或其組合。在另一個實施方案中，所述疫苗或藥物組合物包括抗原，所述抗原選自牛、綿羊或山羊病原體，例如狂犬病病毒、牛輪狀病毒、牛副流感病毒3型(bPIV-3)、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛瘟病毒(RPV)、小反芻動物瘟疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus) (PPRV)、惡性卡他熱病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBR)、大腸桿菌、多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德 lif (Pasteurellahaemolytica) ，1 !^^^在另一個實施方案中，所述疫苗或藥物組合物包括抗原，所述抗原選自豬病原體，例如但不限於豬流感病毒(SIV)、豬環狀病毒2型(PCV-2)、豬繁殖呼吸障礙症候群病毒(PRRS)、假性狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、FMDV、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、紅丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopa thiae)、多殺巴斯德菌 (Pasteurella multocida)、支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchis印tica)、大腸桿菌等，及其組合。重組病毒的構建在本領域是公知的，如描述於例如美國專利No. 4，769，330、 4，722, 848,4, 603，112,5, 174，993 和 5，756，103、6，719，979 中。具體地，可在兩個步驟中構建重組APMV病毒。首先，將待插入病毒的目的基因(例如來自APMV-I (NDV)或禽流感病毒或其它生物體的抗原的開放閱讀框)置於大腸桿菌(E. coli)質粒構建體中，該質粒構建體中插入有與APMV的cDNA的一部分同源的cDNA。分開地，待插入的cDNA基因序列之前有啟動子區(基因起始區)，之後有特異於APMV載體的基因末端區域。該基因起始/外源抗原/基因末端DNA片段側翼連接含有獨特限制性內切酶切割位點的與APMV-8cDNA同源的 cDNA片段。隨後通過在大腸桿菌細菌中生長來擴增所得的質粒構建體，分離質粒構建體。 然後將重組質粒用於限制性內切酶消化以切出側翼連接有與APMV-8cDNA同源的cDNA的所述基因起始/外源抗原/基因末端DNA片段，將該片段連接至適當切割的APMV-8全長構建體中。將含有目的基因的全長構建體與含有用於表達APMV核蛋白(NP)、APMV磷蛋白(P) 和APMV RNA聚合酶(L)以及T7RNA聚合酶的多核苷酸的質粒一起轉染入細胞。所有APMV cDNA構建體處於T7聚合酶啟動子的控制之下。如Riimer-Oberdiirf er等人，1999中所述和如圖19A中所示進行感染性病毒的拯救。可通過不同的方法(包括包含T7RNA聚合酶的表達盒的質粒DNA、表達T7RNA聚合酶的重組病毒(例如雞痘或金絲雀痘病毒)的轉染) 或在表達T7RNA聚合酶的細胞中獲得T7RNA聚合酶在轉染細胞中的表達。在另一個方面， 用於表達APMV核蛋白(NP)、APMV磷蛋白(P)以及APMV RNA聚合酶(L)和全長病毒cRNA 的多核苷酸處於人巨細胞病毒的立即早期啟動子的控制之下。如^10皿K，等人，2003中所述進行病毒的拯救。通過修飾的感染性病毒成功地表達插入的目的cDNA (外源cDNA或異源cDNA)需要兩個條件。首先，為使所述經修飾的病毒保持存活，必須將插入物引入病毒的基因組的區域。插入cDNA表達的第二個條件是存在允許所述基因在病毒背景中表達的調控序列(例如基因起始區、基因終止區、啟動子、增強子、多聚腺苷酸化信號、基因間和非翻譯區域)。一般而言，利用在真核細胞中具有功能的強啟動子是有利的。在一個實施方案中， 用於通過病毒RNA聚合酶轉錄病毒mRNA的啟動子是「基因起始序列」。「基因起始序列」是 L蛋白結合併且將下遊定位的病毒RNA轉錄成病毒mRNA的結合位點。在一個實施方案中，本發明提供了施用治療有效量的APMV疫苗以將抗原、表位或免疫原遞送入靶細胞並且表達。治療有效量的確定對於本領域技術人員來說是常規實驗。 在一個實施方案中，APMV疫苗製劑包含含有多核苷酸的表達載體以及藥用或獸醫學可接受的載體、媒介物或賦形劑，所述多核苷酸編碼抗原、表位或免疫原。在另一個實施方案中，所述藥用或獸醫學可接受的載體、媒介物或賦形劑有利於轉染和/或促進載體或蛋白質的保存。所述藥用或獸醫學可接受的載體或媒介物或賦形劑對於本領域技術人員來說是公知的。例如，藥用或獸醫學可接受載體或媒介物或賦形劑可以為0. 9% NaCl (例如，鹽水) 溶液或磷酸緩衝液。可用於本發明的方法的其它藥用或獸醫學可接受載體或媒介物或賦形劑包括但不限於聚-(L-穀氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。藥用或獸醫學可接受載體或媒介物或賦形劑可以是有利於所述載體(或從本發明的載體體外表達的蛋白質)的施用，或有利於所述載體(或蛋白質)的轉染和/或改善其保存的任何化合物或化合物的組合。劑量和劑量體積在本文綜述部分有論述，並且可由本領域技術人員結合本領域知識通過閱讀本公開內容來確定，而不需要任何過度實驗。在另一個實施方案中，藥用或獸醫學可接受的載體、賦形劑或媒介物可以是油包水乳劑。適當的油包水乳劑的實例包括在4°C下穩定並且為流體的基於油的油包水疫苗乳齊U，其包含；6至50V/V%的含抗原水相，12至25V/V%、50至94V/V%的全部或部分含有不可代謝的油(例如，礦物油例如石蠟油)和/或可代謝的油(例如，植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)的油相，0. 2至20p/v%的表面活性劑，3至8p/v%的後者全部或部分為聚甘油酯，或存在於聚甘油酯的混合物中，所述聚甘油酯為聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻油或其它氫化聚氧乙烯蓖麻油。可用於油包水乳劑中的表面活性劑的實例包括乙氧基化脫水山梨糖醇酯(例如，可從AppliChem，he.，Cheshire，CT獲得的聚氧乙烯Q0)脫水山梨糖醇單油酸酯(TWEEN80 )和可從Sigma Aldrich, St. Louis, MO獲得的脫水山梨糖醇酯(例如，脫水山梨糖醇單油酸酯(SPAN80 ))。此外，關於油包水乳劑，也參見美國專利No. 6，919，084。在某些實施方案中，含抗原水相包括含有一種或多種緩衝劑的鹽水溶液。 適當的緩衝溶液的實例為磷酸緩衝鹽溶液。在一個實施方案中，油包水乳劑可以為水/油 /水(ff/0/ff)三重乳劑(參見，例如，美國專利No. 6，358，500)。其它適當的乳劑的實例描述於美國專利No. 7，371,395中。根據本發明的藥物組合物和疫苗可包括一種或多種佐劑或基本上由其組成。用於本發明實施的適當的佐劑為(1)丙烯酸或甲基丙烯酸、順丁烯二酸酐的聚合物和烯基衍生共聚物，(2)免疫刺激序列(I SS)，例如具有一個或多個非甲基化CpG單位的寡脫氧核糖核苷酸序列(Klinman等人，1996 ；W098/16247)，(3)水包油乳劑，例如由M. Powe 11,M. Newman, Plenum Press (1995)出版的"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach，，中第147頁上描述的SPT乳劑，和相同著作中第183頁上描述的乳劑MF59，(4)包含季銨鹽的陽離子脂質，例如DDA，(5)細胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁，(7)皂苷或⑶通過引用併入本申請中的任何文獻中論述的其它佐劑，或(9)其任何組合或混合物。特別適合於病毒載體的水包油乳乳劑(3)可基於液態石蠟(歐洲藥典型類型)、 類異戊二烯油例如角鯊烷、角鯊烯、由烯烴例如異丁烯或癸烯的寡聚化而產生的油、酸或具有直鏈烷基的醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯或分支的脂肪醇或酸的酯，特別地異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合用於形成乳劑。乳化劑可以是非離子型表面活性劑，例如(一方面)脫水山梨糖醇、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇與(另一方面)油酸、異硬脂酸、蓖麻酸或羥硬脂酸的酯，所述酯任選地被乙氧基化，或為聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物嵌段，例如Pluronic，例如L121。在(1)型佐劑聚合物中，優選交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸 (特別是通過糖或多元醇的聚鏈烯基醚(polyalkenyl ether)交聯的)的聚合物。此類化合物稱為卡波姆(Pharmeuropa，第8卷，no. 2，June 1996)。本領域技術人員也可參考美國專利No. 2，909，462，其提供了此類通過具有至少3個羥基(優選不超過8個這樣的基團)的多羥基化合物交聯的丙烯酸聚合物，至少3個羥基的氫原子被具有至少兩個碳原子的不飽和脂肪族基團取代。優選基團為包含2至4個碳原子的基團，例如乙烯基、烯丙基和其它乙烯系不飽和基團。不飽和基團還可包含其它取代基，例如甲基。以名稱Carbopol (BTOoodrich， Ohio, USA)銷售的產物是特別適合的。它們通過烯丙基蔗糖或通過烯丙基季戊四醇交聯。 在它們當中，可提及的有卡波姆974P、934P和971P。關於順丁烯二酸酐-烯基衍生物共聚物，優選EMA (Monsanto)，其為直鏈或交聯的乙烯-順丁烯二酸酐共聚物，它們例如通過二乙烯醚交聯。也可參考J. Fields等人，1960。關於結構，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA優選由具有下式的基本單位形成
權利要求
1.一種組合物或疫苗，其包含(i)重組APMV病毒載體和(i i)藥用或獸醫學上可接受的載體。
2.權利要求1的組合物或疫苗,其中所述APMV為APMV-8、APMV-2、APMV-4或APMV-6。
3.權利要求1或2的組合物或疫苗，其中所述APMV病毒載體包含與具有SEQID NO 1 中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID N0:1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸。
4.權利要求1-3中任一項的組合物或疫苗，其中所述APMV病毒載體還包含編碼抗原的分離的多核苷酸，並且其中所述多核苷酸被插入在APMV基因組的非必需區域內。
5.權利要求3的組合物或疫苗，其中所述非必需區域選自下述區域位於NP開放閱讀框上遊的非翻譯區、APMV基因組的兩個開放閱讀框之間的基因間區域和位於L開放閱讀框下遊的非翻譯區。
6.用於產生重組APMV病毒載體的方法，其中所述方法包括將分離的多核苷酸在APMV 基因組的非必需區域內引入所述APMV基因組。
7.權利要求6的方法，其中所述APMV為APMV-8、APMV-2、APMV-4或APMV-6。
8.權利要求6或7的方法，其中所述APMV包含與具有SEQID NO=I中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸。
9.權利要求6至8中任一項的方法，其中所述非必需區域選自下述區域位於NP開放閱讀框上遊的非翻譯區、APMV基因組的兩個開放閱讀框之間的基因間區域和位於L開放閱讀框下遊的非翻譯區。
10.權利要求6-9中任一項的方法，其中所述方法包括步驟a)製備表達NP、P和L基因的表達質粒；b)製備在全長APMV基因組的非必需區域中包含分離的多核苷酸的轉錄質粒；c)將所述表達質粒和轉錄質粒轉染入宿主細胞；d)從所述宿主細胞拯救/回收感染性APMV病毒。
11.權利要求6-9中任一項的方法，其中所述方法包括步驟a)製備表達NP、P和L基因的表達質粒；b)製備在全長APMV基因組的非必需區域中包含分離的多核苷酸的轉錄質粒；c)製備表達T7聚合酶的表達質粒；d)將所述表達質粒和轉錄質粒轉染入宿主細胞；e)從所述宿主細胞拯救/回收感染性APMV病毒。
12.用於在動物中誘導針對抗原的免疫反應的方法，包括用包含重組APMV病毒載體的組合物或疫苗接種所述動物，其中所述重組APMV病毒載體包含和表達所述動物的病原體的抗原。
13.權利要求12的方法，其中以初免-加強方案誘導動物的對所述抗原的免疫反應。
14.權利要求12的方法，其中所述動物是禽類、馬科動物、犬科動物、貓科動物、豬類、 牛類、羊類或人。
15.包含選自下列序列的多核苷酸的未修飾或經修飾的APMV病毒a)與具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；b)與編碼具有SEQID NO :3中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :2中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :2中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；c)與編碼具有SEQID NO :5中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :4中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :4中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；d)與編碼具有SEQID NO :7中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :6中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :6中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；e)與編碼具有SEQID NO :9中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :8中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :8中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；f)與編碼具有SEQID NO :11中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :10中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO 10中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；和g)與編碼具有SEQID NO :13中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與編碼具有SEQ ID NO :14中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ IDNO 12中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO 12中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸。
16.權利要求15的經修飾的APMV病毒，其還包含插入在APMV基因組的非必需區域中的分離的多核苷酸。
17.一種分離的多核苷酸，其選自a)與具有SEQID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸， 或與同具有SEQ ID NO :1中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；b)與編碼具有SEQID NO :3中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :2中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :2中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；c)與編碼具有SEQID NO :5所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :4中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :4中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；d)與編碼具有SEQID NO :7中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :6中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :6中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；e)與編碼具有SEQID NO :9中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :8中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :8中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；f)與編碼具有SEQID NO :11所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ ID NO :10中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :10中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸；和g)與編碼具有SEQID NO :13中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與編碼具有SEQ ID NO :14中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，與具有SEQ IDNO 12中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸，或與同具有SEQ ID NO :12中所示序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補的多核苷酸。
全文摘要
本發明包括工程化APMV組合物或疫苗。所述疫苗或組合物可以是重組APMV組合物或疫苗。本發明包括用於修飾APMV的基因組以產生重組APMV的方法；利用此類方法製備的經修飾的APMV；DNA和蛋白質序列；以及利用這樣的重組APMV感染細胞和宿主動物的方法。
文檔編號C07K14/115GK102573901SQ201080045564
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月20日 優先權日2009年8月21日
發明者E·蒙德特, J·普利特查德, M·巴布洛特, T·梅巴特森 申請人:喬治亞州大學研究基金會, 梅裡亞有限公司