緩釋組合物、其製備方法及其應用的製作方法

2023-05-18 03:03:16 2

專利名稱：緩釋組合物、其製備方法及其應用的製作方法
專利說明緩釋組合物、其製備方法及其應用 本發明涉及生物活性物質的緩釋組合物及其製備方法。日本特許公開號97334/1995公開了一種含有生物活性肽或其鹽和具有一個末端游離羧基的生物可降解聚合物的緩釋製劑，以及它的製備方法。
專利文獻GB2209937、GB2234169、GB2234896、GB2257909和EP626170A2中公開了以生物可降解聚合物為基質含有單獨製備的非水溶性鹽(如肽或蛋白質的雙羥萘酸鹽)的組合物或其製備方法。
專利文獻WO 95/15767公開了西曲瑞利克斯(LH-RH拮抗劑)的雙羥萘酸鹽(pamoate)及其製備方法，還指出甚至當此雙羥萘酸鹽包含在生物可降解聚合物中時仍然能夠保持如同單獨使用時所具有的肽釋肽性能。本發明是為了提供新的以高含量含有生物活性物質且能夠控制其釋放速率的組合物。[解決問題的方法]經過大量為解決上述問題所做的研究後，本發明人發現，當在組合物形成過程中在生物活性物質與羥萘甲酸的共存下將該生物活性物質以高含量摻入到組合物中時，並且當上述兩者同時存在於生物可降解聚合物中時，所述生物活性物質的速率釋放不同於由生物可降解聚合物不存在下製備的生物活性物質和羥萘甲酸的相應組合物的釋放速率，通過選擇適當類型的生物可降解聚合物可以調控該釋放速率。本發明人在此發現的基礎上作了進一步的研究，並且開發出本發明。
所以，本發明提供了
(1)含有生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽的緩釋組合物；(2)按照(1)所述的緩釋組合物，其中所述生物活性物質是生物活性肽；(3)按照(2)所述的緩釋組合物，其中所述生物活性肽是LH-RH衍生物；(4)按照(1)所述的緩釋組合物，其中所述羥萘甲酸是3-羥基-2-萘甲酸；(5)按照(1)所述的緩釋組合物，其中所述生物可降解聚合物是α-羥基羧酸聚合物；(6)按照(5)所述的緩釋組合物，其中所述α-羥基羧酸聚合物是乳酸-羥基乙酸聚合物；(7)按照(6)所述的緩釋組合物，其中乳酸和羥基乙酸的含量比例是100/0-40/60mol％；(8)按照(7)所述的緩釋組合物，其中乳酸和羥基乙酸的含量比例是100/0mol％；(9)按照(6)所述的緩釋組合物，其中所述聚合物的重均分子量是約3,000-約100,000；(10)按照(9)所述的緩釋組合物，其中所述聚合物的重均分子量是約20,000-約50,000；(11)按照(3)所述的緩釋組合物，其中所述LH-RH衍生物是下式表示的肽5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z其中Y表示Dleu、DAla、DTrp、DSer(tBu)、D2Nal或DHis(ImBzl)；Z表示NH-C2H5或Gly-NH2；(12)按照(6)所述的緩釋組合物，其中所述聚合物的末端羧基的含量是50-90微摩爾/單位質量(g)的聚合物；(13)按照(3)所述的緩釋組合物，其中所述羥萘甲酸或其鹽和LH-RH衍生物或其鹽的摩爾比例是3∶4-4∶3；
(14)按照(13)所述的緩釋組合物，其中含有14％(w/w)-24％(w/w)的所述LH-RH衍生物或其鹽。
(15)按照(1)所述的緩釋組合物，其中所述生物活性物質或其鹽極微溶於水或可溶於水中；(16)按照(1)所述的緩釋組合物，其用於注射。
(17)一種製備上述(1)所述緩釋組合物的方法，該方法包括從生物活性物質或其鹽、生物可降解聚合物或其鹽和羥萘甲酸或其鹽的混合物中除去溶劑；(18)按照(17)所述的緩釋組合物的製備方法，其中包括將生物活性物質混合併分散在含有生物可降解聚合物或其鹽和羥萘甲酸或其鹽的有機溶劑中，並且隨後除去該有機溶劑；(19)按照(18)所述的緩釋組合物的製備方法，其中所述生物活性物質或其鹽是水溶液形式；(20)按照(17)所述的製備方法，其中所述生物活性物質的鹽是與游離鹼或酸形成的鹽；(21)含有上述(1)所述的緩釋組合物的藥物；(22)一種用於預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、青春期早熟、痛經或乳腺癌或用於避孕的藥劑，其中含有上述(3)所述的緩釋組合物；(23)含有生物活性物質的羥萘甲酸鹽和生物可降解聚合物或其鹽的緩釋組合物；(24)一種用於抑制生物活性物質從緩釋組合物初始急劇釋放的方法，該方法包括採用羥萘甲酸或其鹽；(25)一種用於提高緩釋組合物中生物活性物質包合效率的方法，其中包括採用羥萘甲酸或其鹽；(26)生物活性肽的羥萘甲酸鹽；(27)按照(26)所述的生物活性肽的羥萘甲酸鹽，其可溶於水或極微溶於水；和(28)含有生物活性肽的羥萘甲酸鹽的緩釋組合物。
本發明還提供(29)按照(28)所述的緩釋組合物，其中羥萘甲酸或其鹽的含量是約1-約7mol/mol生物活性肽或其鹽，優選約1mol-約2mol/mol；(30)按照(17)所述的緩釋組合物的製備方法，該方法包括用含有生物活性物質或其鹽的溶液作為內部水相併用含有生物可降解聚合物和羥萘甲酸或其鹽的溶液作為油相來製備油包水(W/O)乳劑，並且隨後除去溶劑；(31)按照(17)所述的緩釋組合物的製備方法，該方法包括用含有羥萘甲酸或其鹽的溶液作為內部水相併且用含有生物活性物質或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽的溶液作為油相來製備油包水(W/O)乳劑，並且隨後除去溶劑；(32)按照(28)所述的緩釋組合物的製備方法，該方法包括混合併溶解生物活性肽或其鹽和羥萘甲酸或其鹽，並且隨後除去溶劑；和(33)按照(30)-(32)任一所述的緩釋組合物的製備方法，其中所述除溶劑方法是含水乾燥(water-in drying)法。
儘管對本發明中所用的生物活性物質沒有限制，但它應在藥理學上有用，並且可以是非肽類物質或是肽類物質。所述非肽物質包括激動劑、拮抗劑和具有酶抑制活性的物質。所述肽類物質包括如生物活性肽，並且特別是那些分子量為約300-約40,000，優選約400-約30,000，並且更優選約500-約20,000的生物活性肽。
所述生物活性肽包括，例如，促黃體素釋放激素(LH-RH)、胰島素、促生長素抑制素、生長激素、生長激素釋放激素(GH-RH)、催乳素、紅細胞生成素、促腎上腺皮質激素、促黑素細胞激素、甲狀腺激素釋放激素、促甲狀腺素、促黃體素、促濾泡激素、血管升壓素、催產素、降鈣素、胃泌素、促胰液素、促胰酶素、縮膽囊肽、血管緊張肽、人胎盤生乳素、人類絨毛膜促性腺激素、腦啡肽、內啡肽、kyotorphin、吞噬作用激素、胸腺生成素、胸腺素、噻莫目林(thymostimulin)、胸腺體液因子、血胸腺因子、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、胃動素、daynorphin、鈴蟾肽、神經降壓肽、雨蛙肽、緩激肽、心房鈉尿增加素(atrial natriuresis increasing factor)、神經生長因子、細胞生長因子、神經營養因子、內皮素拮抗肽、其衍生物、這些肽的片段以及所述片段的衍生物。
本發明中所採用的生物活性肽可以成為或是藥學上可接受的鹽。
當生物活性肽具有鹼性基團如氨基時，所述鹽包括與無機酸(也稱作無機游離酸)(例如碳酸、酸式碳酸、鹽酸、硫酸、硝酸、硼酸)、有機酸(也可以稱作有機游離酸)(例如琥珀酸、醋酸、丙酸、三氟乙酸)等形成的鹽。
當生物活性肽具有酸性基團如羧基時，所述鹽包括與無機鹼(也可以稱作無機游離鹼)(例如，鹼金屬如鈉和鉀，鹼土金屬如鈣和鎂)、有機鹼(也可以稱作有機游離鹼)(例如有機胺如三乙胺，鹼性胺基酸如精氨酸)等生成的鹽。所述生物活性肽可以形成金屬絡合化合物(例如銅絡合物、鋅絡合物)。
上述生物活性肽中的優選實例是可以有效對抗性激素依賴性疾病如前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、青春期早熟及乳腺癌和可以有效避孕的LH-RH衍生物或其鹽。
LH-RH衍生物或其鹽的實例包括，例如，公開在《採用GnRH類似物的治療法探討和遠景》(The Parthenon Pulishing Group led.，1996年出版)、日本特許公報號503165/1991、日本特許公開號101695/1991、97334/1995和259460/1996等中的肽類。
LH-RH衍生物可以是LH-RH激動劑或LH-RH拮抗劑；有效的LH-RH拮抗劑包括，例如，通式[I]表示的生物活性肽或其鹽X-D2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-A-B-Leu-C-Pro-DalaNH2[X表示N(4H2-呋喃甲醯基)Gly或NAc；A表示選自NMeTyr、Tyr、Aph(Atz)和NMeAph(Atz)的殘基；B表示選自DLys(Nic)、DCit、Dlys(AzaglyNic)、DLys(AzaglyFur)、DhArg(Et2)、DAph(Atz)和DhCi的殘基；C表示Lys(Nisp)、Arg或hArg(Et2)]。
適用的LH-RH激動劑包括，例如，通式[II]表示的生物活性肽或其鹽5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z[Y表示選自DLeu、DAla、DTrp、DSer(tBu)、D2Nal和DHis(1mBzl)的殘基；Z表示NH2-C2H5、Gly-NH2]。特別優選其中Y是Dleu並且Z是NH-C2H5的肽(即式5-氧代-Pro-His-Trp-S er-Tyr-DLeu-Arg-Pro-NH-C2H5所示的肽)。
這些肽類可以通過上述參考文獻或專利公開中所述的方法或基於這些方法來製備。
本文所用的縮寫具有以下含義縮寫N(4H2-呋喃甲醯基)GlyN-四氫呋喃甲醯基甘氨酸殘基NAcN-乙醯基D2NalD-3-(2-萘基)丙氨酸殘基D4ClPheD-3-(4-氯)苯基丙氨酸殘基D3PalD-3-(3-吡啶基)丙氨酸殘基NMeTyrN-甲基酪氨酸殘基Aph(Atz)N-[5』-(3』-氨基-1』H-1』，2』，4』-三唑基)]苯基丙氨酸殘基NMeAph(Atz)N-甲基-[5』-(3』-氨基-1』H-1』，2』，4』-三唑基)]苯基丙氨酸殘基Dlys(Nic)D-(e-N-煙醯基)賴氨酸殘基DcitD-瓜氨酸殘基DLys(AzaglyNic)D-(氮雜甘氨醯基煙醯基)賴氨酸殘基Dlys(AzaglyFur)D-(氮雜甘氨醯基呋喃基)賴氨酸殘基DhArg(Et2)D-(N，N』-二乙基)高精氨酸殘基DAph(Atz)D-N-[5』-(3』-氨基-1』H-1』，2』，4』-三唑基)]苯基丙氨酸殘基DhCiD-高瓜氨酸殘基Lys(Nisp)(e-N-異丙基)賴氨酸殘基
hArg(Et2)(N，N』-二甲基)高精氨酸殘基上述胺基酸的縮寫基於IUPAC-IUB委員會對生物化學命名法[《歐洲生物化學雜誌》第138卷，9-37頁(1984)]具體規定的縮寫或所屬技術領域常用的縮寫。當胺基酸存在旋光異構體時，除非另有說明，其為L構型。
本發明的羥萘甲酸是由萘環和1個羥基和1個羧基構成，羥基和羧基鍵合在環的不同碳上。所以，相對於位於萘環1位和2位上的羧基來說，由於羥基位於不同的位置總共存在14個異構體。可以使用任一上述異構體，可以採用其任意比例的混合物。如下文所述，優選該酸具有較高的酸離解常數，或pKa(pKa＝-log10Ka，Ka表示酸解離常數)較小。也優選那些極微溶於水的異構體。
優選可溶於醇(例如乙醇、甲醇)中的異構體。此處所用的術語「可溶於醇」是指，例如，在甲醇中的溶解度不小於10g/L。
對於上述羥萘甲酸異構體的pKa值，僅已知3-羥基-2-萘甲酸的該值(pKa＝2.708，Kagaju Binran Kisohen II，日本化學協會，公開於1969年11月25日)；但是通過比較羥基苯甲酸的三個異構體的pKa值可以獲得有用的信息。具體而言，間-羥基苯甲酸和對-羥基苯甲酸的pKa值不小於4，而鄰-羥基苯甲酸(水楊酸)的pKa值(2.754)極小。所以，在上述14個異構體中，優選那些由萘環和鍵合在萘環鄰接碳原子上的羧基和羥基組成的那些羥萘甲酸，即3-羥基-2-萘甲酸、1-羥基-2-萘甲酸和2-羥基-1-萘甲酸。此外，更優選3-羥基-2-萘甲酸，該酸是由萘環和一個鍵合在環的3位上的羥基及鍵合在環的2位上的一個羧基構成。
所述羥萘甲酸可以是鹽。鹽包括，諸如，與無機鹼(例如鹼金屬如鈉和鉀，鹼土金屬如鈣和鎂)、有機鹼(例如，有機胺如三乙胺，鹼性胺基酸如精氨酸)形成的鹽，以及和過渡金屬(如鋅、鐵、銅)形成的鹽和複合鹽。
本發明所述生物活性物質的羥萘甲酸鹽的一個製備方法實例如下所述
(1)使羥萘甲酸的水合有機溶劑溶液通過弱鹼性的離子交換柱以吸收酸且使該交換柱飽和。隨後將過量部分的羥萘甲酸通過水合有機溶劑除去，此後使生物活性物質或其鹽的水合有機溶劑溶液流經該柱進行離子交換；從所得洗脫液中除去溶劑。適用於所述水合有機溶劑中的有機溶劑包括醇(例如甲醇、乙醇)、乙腈、四氫呋喃和二甲基甲醯胺。利用或基於已知的常規方法除去溶劑使鹽沉澱。這些方法的實例包括，在用旋轉蒸發器等調控真空度的條件下蒸發溶劑的方法。
(2)生物活性物質或其鹽的水合有機溶劑溶液在通過預先離子交換為氫氧根離子的弱鹼性離子交換柱後，其鹼性基團轉化為氫氧根型。以不超過摩爾當量的量將羥萘甲酸加入到回收的洗脫液中並且溶解，隨後濃縮；根據需要用水洗滌沉澱的鹽，並且乾燥。
生物活性物質的羥萘甲酸鹽極其微溶於水，但這也取決於所用的生物活性物質。因為生物活性肽的這種鹽具有緩釋潛能，因此生物活性物質的羥萘甲酸鹽可用於生物活性物質的緩釋製劑，並且也可用於製備緩釋組合物。
本發明中所採用的生物可降解聚合物包括，例如由一種或多種選自α-羥基一羧酸(例如羥基乙酸、乳酸)、羥基二羧酸(例如蘋果酸)、羥基三羧酸(例如檸檬酸)等合成得到的含有游離羧基的聚合物或共聚物、或它們的混合物；聚-α-氰基丙烯酸酯；聚胺基酸(例如聚-g-苄基-L-穀氨酸)；和馬來酸酐共聚物(例如，苯乙烯-馬來酸共聚物)。
單體結合的方式可以是隨機、嵌段或接枝。當上述α-羥基一羧酸、α-羥基二羧酸和α-羥基三羧酸在其分子結構內具有旋光活性中心，它們可以是D-、L-或DL-構型。其中有乳酸-羥基乙酸聚合物[此後也稱作聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(乳酸-共聚-羥基乙酸)或乳酸-羥基乙酸共聚物；其統指乳酸-羥基乙酸均聚物和共聚物，除非另有具體說明；乳酸均聚物也稱作乳酸聚合物、聚乳酸、聚丙交酯等，羥基乙酸均聚物稱作羥基乙酸聚合物、聚羥基乙酸、聚乙交酯等]，優選聚(α-氰基丙烯酸酯)等。更優選乳酸-羥基乙酸聚合物。特別優選在一個末端具有游離羧基的乳酸-羥基乙酸聚合物。
所述生物可降解聚合物可以是鹽。鹽包括，諸如，與無機鹼(例如鹼金屬如鈉和鉀，鹼土金屬如鈣和鎂)、有機鹼(例如，有機胺如三乙胺，鹼性胺基酸如精氨酸)形成的鹽，以及和過渡金屬(如鋅、鐵、銅)形成的鹽和複合鹽。
當所用生物可降解聚合物是乳酸-羥基乙酸聚合物時，其含量比例(mol％)優選為約100/0-約40/60，更優選100/0-約50/50。也優選採用含量比例為100/0的乳酸均聚物。
作為乳酸-羥基乙酸聚合物的最小重複單元之一，乳酸旋光異構體的比例優選為約75/25-約25/75，以D-構型/L-構型的比例(mol/mol％)計。一般採用D-構型/L-構型比例(mol/mol％)約60/40-約30/70的乳酸-羥基乙酸聚合物。
所述乳酸-羥基乙酸聚合物的重均分子量通常是約3,000-約100,000，優選約3,000-約60,000，更優選約3,000-約50,000，並且特別優選約20,000-約50,000。
分散度(重均分子量/數均分子量)一般為約1.2-約4.0，更優選約1.5-3.5。
所述乳酸-羥基乙酸聚合物的游離羧基含量優選為約20-約1,000μmol，更優選約40-約1,000μmol/單位質量(克)的聚合物。
在此定義的重均分子量、數均分子量和分散度是基於聚苯乙烯的分子量和分散度，它們是通過凝膠滲透色譜法(GPC)用重均分子量分別為1,110,000、707,000、455,645、354,000、189,000、156,055、98,900、66,437、37,200、17,100、9,830、5,870、2,500、1,303和504的15種聚苯乙烯作為參照物來測定。測量時採用了高速GPC儀(Toso製造，HLC-8120GPC，檢測折射率)和GPC柱KF804Lx2(Showa Denko製造)，用氯仿作為流動相。
在此所用術語「游離羧基含量」是指通過標記法獲得(此後稱作「標記法測定的羧基含量」)。用於測定聚乳酸中此含量的具體方法如下所述。首先，將W mg的聚乳酸溶解在2ml 5N鹽酸/乙腈(v/v＝4/96)混合物中；加入2ml的0.01M鄰-硝基苯基肼鹽酸鹽(ONPH)(5N鹽酸/乙腈/乙醇＝1.02/35/15)溶液和2ml 0.15M的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽溶液(吡啶/乙醇＝4v/96v)，隨後在40℃下反應30分鐘，此後除去溶劑。用水洗滌(4次)後，將殘餘物溶解在2ml乙腈中；加入1ml 0.5mol/l的氫氧化鉀的乙醇溶液，隨後在60℃下反應30分鐘。將反應混合物稀釋在1.5N氫氧化鈉水溶液中至Y ml；在544nm下測定吸光度a(/cm)，用1.5N氫氧化鈉水溶液作為空白對照。另外，用DL-乳酸的水溶液作為參照物，其游離羧基的含量C mol/l通過鹼滴定法測定。將通過ONPH標記法製備的DL-乳醯肼在544nm下的吸光度作為B(/cm)，每單位質量(克)聚合物中的游離羧基的摩爾含量可以採用以下公式計算[COOH](mol/g)＝(AYC)/(WB)雖然通過將生物可降解聚合物溶解在甲苯-丙酮-甲醇混合溶劑中，並以酚酞作為指示劑用氫氧化鉀的醇溶液滴定此溶液的羧基，也可以獲得該羧基含量(利用此方法獲得的值此後稱作「鹼滴定法測定的羧基含量」)，但採用上述標記法來定量測定較理想，因為滴定過程中聚酯主鏈水解反應的競爭可導致滴定終點不清楚。
生物可降解聚合物的分解/消除速率差異很大，這取決於共聚物的組成、分子量或游離羧基含量。然而，在乳酸-羥基乙酸聚合物的情況下，通過減少羥基乙酸的比例或增加分子量和降低游離羧基的含量可以延長藥物釋放的時間，這是因為分解/消除作用常常隨羥基乙酸比例的降低而延遲。因為游離羧基的含量會影響混合在製劑中的生物活性物質的釋放速率，但它必須達到指定水平。鑑於此原因，為了得到適用於長效型緩釋製劑(例如6個月或更長時間)的生物可降解聚合物，優選在乳酸-羥基乙酸聚合物的情況中採用如下的聚乳酸(例如D-乳酸、L-乳酸、DL-乳酸，優選DL-乳酸等)，該聚乳酸如上所述的重均分子量和游離羧基含量分別是約20,000-約50,000和約30-約95μmol/g，優選約40-約95μmol/g，更優選約50-約90μmol/g。
所述「乳酸-羥基乙酸聚合物」可以，例如，通過無催化劑脫水聚合縮合法(日本特許公開號28521/1986)由乳酸和羥基乙酸製備，或通過開環聚合反應由交酯和環狀二酯化合物如乙交酯開始利用催化劑來製備(《生物材料學和生物工程學全書》A部材料學，第2卷，MarcelDekker，Inc.，1995)。雖然通過上述已知的開環聚合法製得的聚合物不一定在一個末端含有游離羧基，但通過EP-A-0839525所述的水解反應，可以將聚合物改性為每單位量的聚合物中含有一定量的羧基，可以採用所得改性聚合物。
毋庸置疑，上述「在一個末端具有游離羧基的乳酸-羥基乙酸聚合物」可以通過已知的常規方法(例如無催化劑脫水聚合縮合法，日本特許公開號28521/1986)或下列方法來製備。
(1)首先，在具有保護羧基的羥基一羧酸衍生物(例如D-乳酸叔丁酯、L-乳酸苄酯)或具有保護羧基的羥基二羧酸衍生物(例如丙醇二酸二苄酯、2-羥乙基丙二酸二叔丁酯)的存在下，利用聚合催化劑使環酯化合物發生聚合反應。
上述「具有保護羧基的羥基一羧酸衍生物」或「具有保護羧基的羥基二羧酸衍生物」例如是其羧基(-COOH)被醯胺化(-CONH2)或酯化(-COOR)的羥基羧酸衍生物，並且優選其羧基(-COOH)被酯化(-COOR)的羥基羧酸衍生物等。
此處，酯的R例如是C1-6烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基和叔丁基；C3-8環烷基，如環戊基和環己基；C6-12芳基，如苯基和α-萘基；和C7-14芳烷基，如苯基-C1-2烷基，如苄基和苯乙基；和α-萘基-C1-2烷基，如α-萘甲基。在這些基團中，優選叔丁基、苄基等基團。
所述「環酯化合物」是指環內至少具有一個酯鍵的環狀化合物。具體而言，該化合物包括環狀一酯化合物(內酯)或環狀二酯化合物(交酯)。
所述「環狀一酯化合物」例如是4元環內酯(β-丙醇酸內酯、β-丁內酯、β-異戊內酯、β-己內酯、β-異己內酯、β-甲基-β-戊內酯等)、5元環內酯(γ-丁內酯、γ-戊內酯等)、6元環內酯(δ-戊內酯等)、7元環內酯(ε-己內酯等)、對-二噁烷酮和1，5-二氧雜庚環-2-酮。所述「環狀二酯化合物」例如是下式所示的化合物 其中R1和R2相同或不同，表示氫原子或C1-6烷基(如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基或叔丁基)，優選R1為氫原子且R2為甲基的交酯或R1和R2同時為氫原子的交酯等。
具體而言，此類化合物包括乙交酯、L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、內消旋丙交酯和3-甲基-1，4-二氧六環-2，5-二酮(包括旋光性構型)。
所述「聚合催化劑」例如是有機錫催化劑(例如辛酸錫、二月桂酸二丁基錫、四苯基錫)、鋁催化劑(例如三乙基鋁)和鋅催化劑(例如二乙基鋅)。
考慮到易於在反應後除去，優選採用鋁催化劑和鋅催化劑；就保存安全性的而言，優選鋅催化劑。
適用於聚合催化劑的溶劑包括苯、己烷和甲苯，優選己烷、甲苯等。
對於「聚合的方法」，所述本體聚合物法是指在熔融態的反應物中進行聚合，或溶液聚合法是指將反應物溶解在適當溶劑(例如苯、甲苯、二甲苯、十氫萘、二甲基甲醯胺)中進行聚合。儘管對聚合溫度沒有限制，但對於本體聚合反應，聚合溫度應不低於反應物在反應開始時變為熔融狀態時的溫度，通常為100-300℃，而溶液聚合法一般是在室溫至150℃下進行；如果反應溫度超過反應溶液的沸點，該反應是在使用冷凝器回流下或在耐壓反應釜中進行。考慮聚合溫度、其它反應條件、目標聚合物的物理性質等作出判斷，聚合反應的時間例如為10分鐘-72小時。當反應完全後。用酸(例如鹽酸、乙酸酐、三氟乙酸)終止該反應，並且如果需要將該反應混合物溶解在適當溶劑(例如丙酮、二氯甲烷、氯仿)中，隨後將該混合物混合在對所需產物不溶解的溶劑(例如醇、水、醚、異丙醚)中或用其它方法沉澱，此後分離出在ω-末端具有保護羧基的聚合物。
本申請所述的聚合方法採用了具有保護羧基的羥基羧酸衍生物(例如D-乳酸叔丁酯、L-乳酸苄酯)或具有保護羧基的羥基二羧酸衍生物(例如丙醇二酸二苄酯、L-2-羥乙基丙二酸二叔丁酯)代替常規的質子鏈轉移劑，如甲醇。
採用具有保護羧基的羥基羧酸衍生物(例如D-乳酸叔丁酯、L-乳酸苄酯)或具有保護羧基的羥基二羧酸衍生物(例如丙醇二酸二苄酯、L-2-羥乙基丙二酸二叔丁酯)作為質子鏈轉移劑，可以(1)通過起始原料的組成來調控分子量；和(2)通過聚合後的脫保護反應，釋放出所得生物可降解聚合物ω-末端的羧基。
(2)其次，令通過上述階段(1)聚合反應所得的具有ω-末端保護羧基的聚合物進行脫保護反應，可以得到所需的具有ω-末端游離羧基的生物可降解聚合物。
通過常規已知方法可以脫除所述保護基。此類方法包括所有能夠脫除保護基但不影響聚(羥基羧酸)酯鍵的方法，具體例如是還原法和酸分解法。
所述還原方法包括，例如，用催化劑(例如鈀炭、鈀黑、氧化鈀)催化還原，在液氨中用鈉還原，和用二硫蘇糖醇還原；當催化還原具有ω-末端保護羧基的聚合物時，通過向溶於乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或類似溶劑中的聚合物溶液內加入鈀炭，並且在室溫和劇烈攪拌的條件下通入約20分鐘-約4小時的氫氣可以脫去保護基。
所述酸分解的方法包括，例如，用無機酸(例如氟化氫、溴化氫、氯化氫)、有機酸(例如三氟乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸)或它們的混合物進行酸分解。另外，若需要，可適當地加入陽離子清除劑(例如苯甲醚、苯酚、苯硫基甲烷)。例如，當具有叔丁基保護的ω-末端羧基的聚合物被酸分解時，通過將適量三氟乙酸加入到溶於二氯甲烷、二甲苯、甲苯或類似溶劑中的聚合物溶液內，或將聚合物溶解在三氟乙酸中，並且在室溫下攪拌約1小時可以脫保護。
優選該酸分解反應在聚合反應之後進行；在這種情況中，它可以充當聚合反應的終止反應。
此外，將由上述脫保護反應獲得的聚合物進一步根據需要進行酸水解反應，可以按照目的調控該聚合物的重均分子量、數均分子量或末端羧基含量。具體而言，這可以通過或基於例如EP-A-0839525中所述的方法來實現。
由上述方法得到的生物可降解聚合物可以用作製備緩釋製劑的基質。
而且，利用已知製備方法(例如參見專利申請WO 94/15587)可以製得一個末端具有指定游離羧基的聚合物。
另外，開環聚合後經過化學處理所得的具有一個末端游離羧基的乳酸-羥基乙酸聚合物可以是例如Boehringer Ingelheim KG.的市售產品。
所述生物可降解聚合物可以是鹽(生物可降解聚合物的鹽包括，例如，上述鹽)。有效的鹽製備方法包括，例如，(a)將上述含羧基的生物可降解聚合物在有機溶劑中的溶液和含有無機鹼(例如鹼金屬如鈉和鉀，鹼土金屬如鈣和鎂)或有機鹼(例如有機胺如三乙胺，鹼性胺基酸如精氨酸)的離子的水溶液混合在一起引發離子交換反應，該反應後，分離出已成為鹽形式的聚合物；(b)將(a)中所列舉的鹼的弱酸鹽(例如乙酸鹽、羥基乙酸鹽)溶解在上述含羧基聚合物在有機溶劑中的溶液內，隨後分離出已成為鹽形式的聚合物；和(c)將過渡金屬(例如鋅、鐵、銅)的弱酸鹽(例如乙酸鹽、羥基乙酸鹽)或氧化物混合在上述含羧基生物可降解聚合物在有機溶劑中的溶液內，此後分離出現已成為鹽形式的聚合物。
作為適用於長效型緩釋製劑(例如6個月或更長時間)的生物可降解聚合物，優選通過上述方法製備的「一個末端具有游離羧基的乳酸-羥基乙酸聚合物」。
生物活性物質在本發明組合物中的重量比例隨生物活性物質的種類、預期的藥理學作用、作用時間和其它因素而改變。在含有三種組分(生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽)的緩釋組合物的情況中，生物活性肽或其鹽的重量比例例如是約0.001-約50％(重量)，優選約0.02-約40％(重量)，更優選約0.1-30％(重量)，並且首選約14-24％(重量)，相對於三種組分之和計。在非肽生物活性物質或其鹽的情況中，該比例是約0.01-80％(重量)，優選約0.1-50％(重量)。當含有生物活性物質的羥萘甲酸時，可以採用類似的重量比例。在含有生物活性肽(稱作(A))與羥萘甲酸(稱作(B))的鹽的緩釋組合物情況中，(A)的重量比例一般是約5-約90％(重量)，優選約10-約80％(重量)，並且更優選約30-約80％(重量)，相對於(A)與(B)鹽的總重計。
在含有三種組分(生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽)的緩釋組合物的情況中，以每1mol生物活性物質或其鹽計，羥萘甲酸或其鹽的配製用量優選為約1/2-約2mol，更優選約3/4-約4/3mol，並且特別優選約4/5-約6/5mol。
本發明設計的組合物此後描述為含有三種組分的緩釋組合物鹼性生物活性物質、羥萘甲酸和生物可降解聚合物。在此情況中，作為鹼的生物活性物質和作為酸的羥萘甲酸同時存在於該組合物中；無論它們是以游離形式還是鹽的形式配製在組合物中的，在組合物製備期間的某點各組分存在解離平衡，或當存在痕量水時以水合狀態存在。由於與任何羥萘甲酸形成的鹽都極微溶於水，所以可以假定生物活性物質極微溶於水，儘管溶解度也取決於該生物活性物質的特性，其解離平衡向形成極微溶於水的鹽的方向移動。
在具有高含量鹼性生物活性物質的組合物的製備中，希望將絕大部分的生物活性物質質子化成為上述極微溶於水的鹽，這可根據上述解離平衡來判斷。鑑於此目的，羥萘甲酸或其鹽的用量應至少近似於生物活性物質或其鹽的當量。
其次，組合物中所含生物活性物質的釋放機理如下所述。在上述配方組合物中，生物活性物質幾乎全被質子化並且與抗衡離子共存。所述抗衡離子主要是羥萘甲酸(優選羥萘甲酸)。該組合物對生物體給藥後，由於所述生物可降解聚合物發生分解，其低聚物和單體開始隨時間產生。當該聚合物為乳酸-羥基乙酸聚合物時，所得低聚物(乳酸-羥基乙酸低聚物)和單體(乳酸或羥基乙酸)總是具有一個羧基，也可以作為生物活性物質的抗衡離子。所述生物活性物質在電荷不轉移的條件下釋放，或以與抗衡離子形成鹽的形式釋放；可轉移的抗衡離子包括羥萘甲酸、乳酸-羥基乙酸低聚物(其分子量適於轉移)和單體(乳酸或羥基乙酸)。
當有多種酸共存時，儘管產物也取決於其含量比例，但通常優先生成強酸的鹽。關於羥基萘甲酸的pKa值，已知3-羥基-2-萘甲酸的pKa值是2.078(Kagaku Binran Kisohen II，日本化學協會，1969年9月25日公布)。而乳酸-羥基乙酸低聚物的羧基的pKa值是未知的，但可以基於乳酸或羥基乙酸的pKa值(＝3.86或3.83)計算，計算根據的原理是「因引入取代基導致的自由能水平的變化可以採用加合規則估算」。取代基對解離常數的影響業已測定並且可以用於此目的(表4.1中「有機酸和鹼的pKa的推測」，D.D.Perrin，B.Demsey，E.P.Serjeant，1981)。下列數據適用於羥基和酯鍵ΔpKa(OH)＝-0.90ΔpKa(酯鍵)＝-1.7鑑於最接近解離基團的酯鍵的貢獻，乳酸-羥基乙酸低聚物的羧基的pKa值計算如下pKa＝pKa(乳酸或羥基乙酸)-ΔpKa(OH)+ΔpKa(酯鍵)＝3.06或3.03由於羥萘甲酸是比乳酸(pKa＝3.86)、羥基乙酸(pKa＝3.83)和乳酸-羥基乙酸低聚物更強的酸，所以可以假定生物活性物質的羥萘甲酸鹽在上述組合物中優先生成，可以推斷出該鹽的特性主要決定了生物活性物質自組合物緩釋的性質。所述生物活性物質例如是上述例舉的生物活性物質。
在此，羥萘甲酸和生物活性物質形成的鹽極微溶於水，而不是不溶於水這一點，對緩釋機理起有利影響。換言之，在上述對酸解離常數的討論中已證實，羥萘甲酸(比上述乳酸-羥基乙酸低聚物更強的酸)在釋放的初始階段佔主導地位；通過羥萘甲酸的含量比例可以調節藥物的初始釋放模式，因為鹽的溶解度和其在機體組織中的分布形式對生物活性物質的釋放速率起決定作用。因此，當因羥萘甲酸減少和生物可降解聚合物的水解導致的低聚物和單體增多時，含有低聚物和單體作為抗衡離子的生物活性物質的釋放機制逐漸佔優勢；即使羥萘甲酸在該「組合物」中基本消失，生物活性物質也可以獲得穩定釋放。緩釋組合物製備中生物活性物質摻入效率的提高以及抑制所述生物活性物質在給藥後初期急劇釋放的可能性也都得以解釋。
羥萘甲酸在含有生物活性肽的羥萘甲酸鹽的緩釋組合物中的作用也可以用上述機理解釋。
在此所用術語「不溶於水」是指，當該物質在不高於40℃下在蒸餾水中攪拌4小時後，該物質溶解在1L溶液中的質量不超過25mg。
在此所用術語「極微溶於水」是指上述溶解質量不低於25mg且不超過5g。當該物質是生物活性物質的鹽時，上述定義適用於在上述操作中被溶解的生物活性物質的質量。
儘管本發明的緩釋組合物不限於某種形式，但優選微粒形式，更優選微球(在含有生物可降解聚合物的緩釋組合物的情況中也稱作微囊)。在此所用術語「微球」是指可分散在溶液中的可注射球體。其形狀可以通過例如掃描顯微鏡來確證。[本發明的實施方式]用於製備本發明的含有生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽的緩釋組合物的方法舉例如下。(I)含水乾燥法(i)O/W法在此法中，製備羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽的有機溶劑溶液。
所述有機溶劑例如是滷代烴(例如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳)、醚(如乙醚、異丙醚)、脂肪酸酯(例如乙酸乙酯、乙酸丁酯)、芳香烴(例如苯、甲苯、二甲苯)、醇(例如乙醇、甲醇)和乙腈。其中，二氯甲烷是生物可降解聚合物或其鹽的優選有機溶劑。醇是羥萘甲酸或其鹽的優選有機溶劑。可以使用上述溶劑的適當比例的混合物。在這些溶劑中，優選滷代烴和醇的混合物，更優選二氯甲烷和乙醇的混合物。
當採用二氯甲烷和乙醇的混合物作為有機溶劑時，其濃度比例選自約0.01-約50％(v/v)，優選約0.05-約40％(v/v)，並且更優選約0.1-約30％(v/v)。
生物可降解聚合物在有機溶劑溶液中的濃度依賴於生物可降解聚合物的分子量和有機溶劑的種類而改變。例如，當採用二氯甲烷作為有機溶劑時，生物可降解聚合物的濃度一般選自約0.5-約70％(重量)，優選約1-約60％(重量)，更優選約2-約50％(重量)。
羥萘甲酸或其鹽在有機溶劑溶液中的濃度一般選自如約0.01-約10％(重量)，優選約0.1-約5％(重量)，更優選約0.5-約3％(重量)。
將生物活性物質或其鹽加入到由此所得的含有羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物的有機溶劑溶液中，並且溶解或分散。
此後，將所得的含有生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物的有機溶液溶液加入到水相中形成O(油相)/W(水相)乳劑，隨後，蒸發掉油相中的溶劑得到微球。對於此操作，水相體積一般選擇範圍為油相體積的約1倍-約10000倍，優選約5倍-約50000倍，更優選約10倍-約2000倍。
上述外部水相中可以加入乳化劑。所述乳化劑可以是任一能夠形成穩定O/W乳劑的乳化劑。所述乳化劑包括，例如，陰離子表面活性劑(例如油酸鈉、硬脂酸鈉、十二烷基硫酸鈉)、非離子表面活性劑[例如聚氧化乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯(吐溫80、吐溫60，Atlas PowderCompany)、聚氧化乙烯蓖麻油衍生物(例如HCO-60，HCO-50，NikkoChemicals公司)]、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠和透明質酸。這些乳化劑可以單獨使用或聯合使用。對於濃度，適宜的乳化劑用量是約0.01％-10％(重量)，優選約0.05％-約5％(重量)。
上述外部水相中也可以加入滲透壓調節劑。所述滲透壓調節劑可以是任一能夠在製備成水溶液時具有一定滲透壓的物質。
所述滲透壓調節劑例如是多元醇、一元醇、單糖、二糖、低聚糖、胺基酸和它們的衍生物。
適用的多元醇包括，例如，二元醇，如甘油；五元醇，如阿糖醇、木糖醇和阿東糖醇；和六元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇和半乳糖醇。在這些醇中，優選六元醇，更優選甘露糖醇。
適用的一元醇包括，例如，甲醇、乙醇和異丙醇，更優選乙醇。
適用的單糖包括，例如，戊糖如阿拉伯糖、木糖、核糖和脫氧核糖，和己糖如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖和巖藻糖，優選戊糖。
適用的低聚糖包括，例如，三糖如麥芽三糖和棉子糖；四糖如水蘇糖；優選三糖。
適用的單糖、二糖和低聚糖的衍生物包括，例如，葡糖胺、半乳糖胺、葡糖醛酸和半乳糖醛酸。
適用的胺基酸包括，例如，甘氨酸、亮氨酸和精氨酸，並且優選L-精氨酸。
這些滲透壓調節劑可以單獨使用或聯合使用。
上述滲透壓調節劑所採用的濃度一般是使該外部水相的滲透壓是生理鹽水滲透壓的約1/50倍-約5倍，優選約1/25倍-約3倍。
利用或基於常規方法可以除去上述有機溶劑。此類方法包括，例如，在正常或遞減的壓力下在螺旋攪拌器、電磁攪拌器或類似儀器的攪拌下蒸發有機溶劑的方法，或在用旋轉蒸發器或類似裝置調節的真空度下蒸發有機溶劑的方法。
將所得微球離心或過濾分離，此後用蒸餾水洗滌數次以除去粘著在微球表面上的游離生物活性物質、羥萘甲酸、藥物載體、乳化劑等，隨後再分散在蒸餾水等中並冷凍乾燥。
為了防止顆粒在製備過程中相互聚集，可加入抗凝劑。所述抗凝劑例如是水溶性多糖，如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖和澱粉(例如玉米澱粉)；胺基酸，如甘氨酸；和蛋白質，例如血纖蛋白和膠原。這些物質中，優選甘露糖醇。
如果需要，冷凍乾燥之後可以在減壓下加熱，在不引起微球相互粘著的條件下除去微球中的水和有機溶劑。優選的微球加熱溫度為略高於生物可降解聚合物的中間玻璃化點，可以利用差示掃描量熱計在10-20℃/分鐘的升溫速率下測定。更優選的微球加熱溫度是生物可降解聚合物的中間玻璃化點質高於玻璃化轉變溫度約30℃的溫度。當用乳酸-羥基乙酸聚合物用作生物可降解聚合物時，優選在中間玻璃化點至高於玻璃化轉變溫度10℃的溫度範圍內加熱該微球，更優選中間玻璃化點至高於玻璃化轉變溫度5℃的溫度範圍。
當微球達到指定溫度後，儘管加熱時間依賴於微球的量及其它因素變化，但加熱時間一般為約12小時-約168小時，優選約24小時-約120小時，更優選約48小時-約96小時。
可以採用任何能夠均勻加熱微球聚集體的加熱方法。
適用的熱乾燥法包括，例如，在恆溫室、流化床室、移動室或烘乾爐中進行的熱乾燥方法，和用微波熱乾燥的方法。在這些方法中，優選在恆溫室內進行的熱乾燥法。(ii)W/O/W法(1)首先，製備含有生物可降解聚合物或其鹽的有機溶劑溶液。
有機溶劑和生物可降解聚合物及其鹽的濃度如同上述段落(I)(i)所述。
當採用兩種以上的溶劑時，這些溶劑的比例與段落(I)(i)中所述的那些相同。將生物活性物質或其鹽加入到由此製得的有機溶劑溶液中，隨後溶解且分散。
然後，向生物活性物質和生物可降解聚合物的有機溶劑溶液(油相)中加入羥萘甲酸或其鹽的溶液[此溶劑例如為水、醇(如甲醇、乙醇)、吡啶溶液、二甲基乙醯胺溶液等]。通過已知方法例如均化法或超聲法將該混合物乳化成為W/O乳劑。
隨後，將由此所得的含有生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽的W/O乳劑加入到水相中形成W(內部水相)/O(油相)/W(外部水相)溶劑，進而蒸發除去油相中的溶劑得到微球。對於此操作，外部水相的體積一般是油相體積的約1倍-約10,000倍，優選約5倍-約50,000倍，更優選約10倍-約2,000倍。
外部水相中可以加入上述乳化劑和滲透壓調節劑，隨後的處理如同段落(I)(i)所述。(ii)W/O/W法(2)首先，製備含有羥萘甲酸和生物可降解聚合物的有機溶劑溶液。由此所得的有機溶劑溶液稱作油相。製備方法如同段落(I)(i)所述。
另外，可單獨製備含有羥萘甲酸的有機溶劑溶液和含有生物可降解聚合物的有機溶劑溶液，將它們混合在一起製成油相。
生物可降解聚合物在有機溶劑溶液中的濃度依賴於生物可降解聚合物的分子量和有機溶劑的種類而改變。例如，當採用二氯甲烷作為有機溶劑時，生物可降解聚合物的濃度一般選自約0.5-約70％(重量)，優選約1-約60％(重量)，更優選約2-約50％(重量)。
然後，製備含有生物活性物質或其鹽的溶液[此溶劑例如是水、醇(如甲醇、乙醇)]。由此所得的溶液稱作外部水相。生物活性物質的濃度一般是0.001mg/ml-10g/ml，優選0.1mg/ml-5g/ml，更優選10mg/ml-3g/ml。油相和內部水相可以通過已知方法如均化法和超聲法乳化，形成W/O乳劑。
對於此操作，油相的體積一般是內部水相體積的約1倍-約1,000倍，優選約2倍-約100倍，並且更優選約3倍-約10倍。
該W/O乳劑的粘度一般選自約10-約1,000cp，優選約100-約5,000cp，更優選約500-2,000cp。
隨後，將所得的含有生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物的W/O/乳劑加入到水相中形成W(內部水相)/O(油相)/W(外部水相)乳劑，此後蒸發掉油相的溶劑，生成微球。對於此操作，外部水相的體積一般是內部水相體積的約1倍-約10,000倍，優選約2倍-約100倍，並且更優選約3倍-約10倍。
外部水相中可以加入上述乳化劑和滲透壓調節劑，隨後的處理如同段落(I)(i)所述。(II)相分離法為了通過此方法製備微球，在攪拌下，少量多次地將凝聚劑加入到上述含水乾燥法(I)中所述的有機溶劑溶液中，該溶液中含有由生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽組成的組合物，沉澱且固化微球。該凝聚劑的加入量(體積)是油相體積的約0.01-100倍，優選約0.05倍-500倍，並且更優選約0.1-200倍。
該凝聚劑可以是任一能夠與所述有機溶劑混溶的但不溶解生物活性物質、羥萘甲酸和生物相容性聚合物的鹽複合物的聚合物、礦物油或植物油類化合物。具體而言，適用的凝聚劑包括，例如，矽油、芝麻油、豆油、玉米油、棉籽油、椰油、亞麻子油、礦物油、正己烷和正庚烷。它們可以聯合使用。
收集所得的微球。隨後用庚烷等反覆洗滌，除去除生物活性物質、羥萘甲酸和生物可降解聚合物以外的凝聚劑等，此後減壓乾燥。此外，微球的洗滌按照與含水乾燥法段落(I)(i)中所述相同的方式，此後冷凍乾燥並熱乾燥。(III)噴霧乾燥法為了利用此方法製備微球，將上述含水乾燥法(I)中所述的有機溶劑溶液經噴嘴噴霧到噴霧乾燥器的乾燥室中，以使細液滴中的有機溶劑在很短時間內揮發，生成微球，所述有機溶劑溶液中含有由生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽組成的組合物。所述噴嘴例如是雙液噴嘴、壓力噴嘴和轉盤噴嘴。在按照與含水乾燥法段落(I)所述的相同方法洗滌後，根據需要將微球冷凍乾燥並熱乾燥。
對於除了上述微球以外的劑型，將含水乾燥法段落(I)中所述的有機溶劑溶液乾燥蒸發掉有機溶劑和水，同時用旋轉蒸發器或類似儀器調節真空度，該有機溶劑溶液中含有由生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽組成的組合物，此後用噴射磨或類似設備研磨，生成微球。
此後按照與含水乾燥法段落(I)所述的相同方法洗滌後將研磨微粒冷凍乾燥並熱乾燥。
所得微球或微粒能夠以相應於所用生物可降解聚合物或乳酸-羥基乙酸聚合物分解的速率釋放出藥物。(IV)兩步法將生物活性物質或其鹽以符合上述生物活性物質含量範圍的重量比例加入到羥萘甲酸或其鹽在有機溶劑中的溶液內，生成生物活性物質的羥萘甲酸的有機溶劑溶液。
所述有機溶劑與段落(I)(i)所述的相同。當採用兩種以上的有機溶劑作為混合溶劑時，混合物的比例與段落(I)(i)中所述的相同。
通過或基於已知方法可以除去有機溶劑以沉澱出生物活性物質的羥萘甲酸複合物。所述方法包括，例如，在用旋轉蒸發器或類似儀器調節真空度的同時蒸發掉有機溶劑的方法。
可以將由此所得的生物活性物質的羥萘甲酸複合物再次溶解在有機溶劑中，生成緩釋組合物(微球或微粒)。
所述有機溶劑例如是滷代烴(例如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳)、醚(如乙醚、異丙醚)、脂肪酸酯(例如乙酸乙酯、乙酸丁酯)和芳香烴(例如苯、甲苯、二甲苯)。可以採用這些溶劑的適當比例的混合物。在上述溶劑中，優選滷代烴，更優選二氯甲烷。
將含有生物活性物質的羥萘甲酸的有機溶劑溶液加入到水相中生成O(油相)/W(水相)乳劑，此後蒸發掉油相中的溶劑生成微球。對於此操作，水相的體積一般是油相體積的約1倍-約10,000倍，優選約5倍-約5,000倍，更優選約10倍-約2,000倍。
乳化劑、滲透壓調節劑和後繼步驟均與段落(I)(i)所述的相同。
通過或基於已知方法可以除去有機溶劑。此類方法包括，例如，在正常或遞減的壓力下在螺旋攪拌器、電磁攪拌器或類似儀器的攪拌下蒸發有機溶劑的方法，或在用旋轉蒸發器或類似裝置調節的真空度下蒸發有機溶劑的方法。
將所得微球離心或過濾分離，此後用蒸餾水洗滌數次以除去粘著在微球表面上的游離生物活性物質、羥萘甲酸、藥物載體、乳化劑等，隨後再分散在蒸餾水等中並冷凍乾燥。
為了防止顆粒在製備過程中相互聚集，加入抗凝劑。所述抗凝劑例如是水溶性多糖，如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖和澱粉(例如玉米澱粉)；胺基酸，如甘氨酸；和蛋白質，例如血纖蛋白和膠原。在這些物質中，優選甘露糖醇。
如果需要，冷凍乾燥之後可以在減壓下加熱，在不引起微球相互粘著的條件下進一步除去微球中的水和有機溶劑。
當微球達到指定溫度後，儘管加熱時間依賴於微球的量及其它因素變化，但加熱時間一般為約12小時-約168小時，優選約24小時-約120小時，更優選約48小時-約96小時。
可以採用任何能夠均勻加熱微球聚集體的加熱方法。
適用的熱乾燥法包括，例如，在恆溫室、流化床室、移動室或烘乾爐中進行的熱乾燥方法，和用微波熱乾燥的方法。在這些方法中，優選在恆溫室內進行的熱乾燥法。所得微球是相對均勻的球體並且在注射過程中能夠阻力很小，因此針頭不會發生堵塞。另外，可以採用薄注射針頭來減輕注射時患者的疼痛感。(V)一步法將生物活性物質或其鹽以符合上述生物活性物質含量範圍內的重量比例加入到羥萘甲酸或其鹽在有機溶劑中的溶液內，生成生物活性物質的羥萘甲酸的有機溶劑溶液，此後製備緩釋製劑(微球或微粒)。
所述有機溶劑與段落(I)(i)所述的相同。當採用兩種以上的有機溶劑作為混合溶劑時，混合物的比例與段落(I)(i)中所述的相同。
將含有生物活性物質的羥萘甲酸的有機溶劑溶液加入到水相中生成O(油相)/W(水相)乳劑，此後蒸發掉油相中的溶劑，生成微球。對於此操作，水相的體積一般是油相體積的約1倍-約10,000倍，優選約5倍-約5,000倍，並且更優選約10倍-約2,000倍。
可以在外部水相中加入上述乳化劑和滲透壓調節劑，並且後繼處理和上述段落(IV)所述的相同。
本發明的緩釋組合物本身可以用於給藥，或用其作為起始原料製備成不同的製劑形式，具體如經肌內、皮下、內臟給藥的和其它注射製劑或植入劑，經鼻、直腸、子宮給藥的和其它透皮製劑，口服製劑[例如固體製劑，例如膠囊(如硬膠囊、軟膠囊)，顆粒劑和粉劑；液體，例如糖漿劑，乳劑和混懸液]等。
例如，作為注射製劑，本發明的緩釋組合物的製備可以通過採用分散劑(例如表面活性劑如吐溫80和HCO-60，多糖如透明質酸鈉、羧甲基纖維素和藻酸鈉)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、等滲劑(例如氯化鈉、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、脯氨酸)等懸浮在水中生成水懸浮液，或通過分散在植物油如蓖麻油或玉米油中生成油懸浮液，由此得到適用的緩釋注射製劑。
當本發明的緩釋組合物以可注射懸浮液的形式使用時，其粒徑應選擇在滿足分散度和穿過針頭所需必要條件的範圍內。例如，平均粒徑一般為約0.1-300μm，優選約0.5-150μm，更優選1-100μm。
本發明的緩釋組合物可以製成為無菌製劑，所用方法是利用整個製備過程為無菌操作的方法，該方法採用γ射線滅菌；或利用加入防腐劑的方法；但不局限於這些方法。
由於毒性低，本發明的緩釋組合物可以在哺乳動物(例如人體、牛、豬、狗、貓、小鼠、大鼠、兔子)中安全地用作藥物等。
儘管活性組分生物活性物質的種類、含量和劑型、生物活性物質的釋放時間、靶向疾病、被治療動物的種屬以及其它因素可能極其不同，但可以將緩釋組合物的劑量設定在任何水平，條件是使生物活性物質有效。在一個月緩釋製劑給藥的情況中，活性組分-生物活性物質的給藥劑量優選選自約0.01mg-10mg/kg體重/次/個成年人，更優選約0.05mg-5mg/kg體重/次/個成年人的範圍。
所述緩釋組合物的每次給藥劑量優選選自約0.05mg-50mg/kg體重/成年人，更優選約0.1mg/kg-30mg/kg體重/成年人。
給藥次數可以根據活性組分生物活性物質的種類、含量和劑型、生物活性物質的釋放時間、靶向疾病、被治療動物的種屬以及其它因素作適當選自，例如數周1次，每1個月1次或數月1次(例如3個月、4個月、6個月)。
本發明的緩釋組合物根據所含生物活性物質的不同可以作為用於治療或預防多種疾病的有效藥物。當生物活性物質是LH-RH衍生物時，本發明的緩釋組合物可以作為治療或預防激素依賴性疾病的有效藥物，特別是性激素依賴性疾病，如性激素依賴性癌症(如前列腺癌、子宮癌、乳腺癌、垂體瘤等)、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、青春期早熟、痛經、經閉、經前症候群、多室性卵巢症候群。本發明的緩釋組合物也適合作為避孕藥，當用藥後出現反彈作用時，本發明的緩釋組合物是適合用於治療或預防不育的藥物。此外，本發明的緩釋組合物適合用作治療或預防非性激素依賴性但對LH-RH敏感的良性或惡性腫瘤。本發明此後通過下列實施例更詳細地進行描述，這些實施例不起限定作用。實施例1將3429.6mg N-(S)-四氫呋喃-2-甲醯基-Gly-D2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-Dlys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2(此後稱作肽A)(肽A的化學式) 和685.2mg的3-羥基-2-萘甲酸溶解在15ml乙醇中。利用旋轉蒸發器將該溶液逐漸蒸餾，蒸除有機溶劑。再將殘餘物溶解在5.5ml二氯甲烷中並傾入400ml預先調至18℃的0.1％(w/w)的聚乙烯醇(EG-40，由Nippon Synthetic Chemical Industry生產)的水溶液中；用渦輪型均勻混合器在8000rpm下攪拌該溶液，生成O/W乳劑。將此O/W乳劑在室溫下攪拌3小時以使二氯甲烷揮發並且固化油相，隨後用離心機(O5PR-22，Hitachi，Ltd.)在2000rpm下收集微球。將所得微球重新分散在蒸餾水中，離心，洗滌出遊離藥物等。將收集的微球再次分散在少量蒸餾水中，隨後冷凍乾燥，得到粉末。回收率為65％，微球中肽A的含量和3-羥基-2-萘甲酸/肽A的摩爾比例分別為75.4％和1.94。實施例2將1785.1mg肽A的乙酸鹽和1370.4mg 3-羥基-2-萘甲酸溶解在15ml乙醇中。用旋轉蒸發器逐漸蒸餾該溶液以蒸除有機溶劑。將該殘餘物重新溶解在10ml二氯甲烷中且傾入1000ml預先調至18℃的0.1％(w/w)的聚乙烯醇水溶液中；按照與實施例1所述的相同方法得到微球。收率為58％，微球中肽A的含量和3-羥基-2-萘甲酸/肽A的摩爾比例分別為54.3％和6.15。實施例3將1800mg肽A的乙酸鹽、173mg 3-羥基-2-萘甲酸和2g乳酸-羥基乙酸共聚物(乳酸/羥基乙酸＝50/50(mol％)，重均分子量為10100，數均分子量為5670，通過端基定量法測出的數均分子量為3720，Wakp Pure Chemical Industries生產)溶解在6ml二氯甲烷和0.2ml乙醇的混合液中。將該溶液傾入900ml預先調至18℃的0.1％(w/w)的聚乙烯醇水溶液中並且用渦輪型均勻混合器在7000rpm下攪拌。將此O/W乳劑在室溫下攪拌3小時以使二氯甲烷揮發並且固化油相，隨後用離心機在2000rpm下收集微球。將所得微球重新分散在蒸餾水中，離心，洗滌出遊離藥物等。再將收集的微球分散在250mg甘露糖醇和少量蒸餾水中，隨後冷凍乾燥，得到粉末。收率為76％，微球中肽A的包合率為84.6％，並且微球中肽A的含量和3-羥基-2-萘甲酸/肽A的摩爾比例分別為34.7％和1.19。實施例4將1900mg肽A的乙酸鹽、182mg 3-羥基-2-萘甲酸和1.9g乳酸-羥基乙酸共聚物(與實施例3中的相同)溶解在6ml二氯甲烷和0.2ml乙醇的混合液中。將該溶液傾入900ml預先調至18℃的含有5％甘露糖醇和0.05％L-精氨酸的0.1％(w/w)的聚乙烯醇水溶液中；按照與實施例3所述的相同方法得到微球。收率為85％，微球中肽A的包合率為88.9％，並且微球中肽A的含量和3-羥基-2-萘甲酸/肽A的摩爾比例分別為38.6％和0.83。實施例5除了用乳酸/羥基乙酸含量比例為75/25(mol％)、重均分子量為10700且數均分子量為6100，通過端基定量法測定的數均分子量為3770的乳酸-羥基乙酸共聚物代替實施例4中的乳酸-羥基乙酸共聚物並且將二氯甲烷的用量變化為6.5ml以外，按照與實施例4相同的方式製得微球。收率為87％，微球中肽A的包合率為88.3％，並且微球中肽A的含量和3-羥基-2-萘甲酸/肽A的摩爾比例分別為38.3％和0.92。實施例6向溶於7.2ml二氯甲烷中的1800mg肽A乙酸鹽和1.8g乳酸-羥基乙酸共聚物(乳酸/羥基乙酸＝50/50(mol％)，重均分子量為12700，數均分子量為7090，通過端基定量法測出的數均分子量為4780，Wakp Pure Chemical Industries生產)溶液中，加入溶於2.3ml水中的196mg 3-羥基-2-萘甲酸鈉鹽的溶液，隨後用均勻混合器乳化，得到W/O乳劑。將該乳劑傾入800ml預先調至18℃的含有5％甘露糖醇的0.1％(w/w)的聚乙烯醇水溶液中，並且用渦輪型均勻混合器在7000rpm下攪拌，生成W/O/W乳劑。按照與實施例3所述的相同方法得到微球。收率為79％，微球中肽A的包合率為81.2％，並且微球中肽A的含量和3-羥基-2-萘甲酸/肽A的摩爾比例分別為32.8％和0.91。試驗實施例1將約40mg實施例1和2分別製得的微球，或約60mg實施例3-5分別製得的微球分散在0.5ml分散劑(含有0.25mg羧甲基纖維素、0.5mg聚山梨酸酯80和25mg甘露糖醇的蒸餾水，全部溶解)中，並且用22G注射針頭皮下給藥至8-10周齡的雄性SD大鼠背部。給藥後，處死各大鼠，採集殘留在給藥部位的微球並且分析肽A的含量。結果如表1所示。表1第1天第1周第2周第3周第4周實施例1 73％ 30％ 11％ 6％ 6％實施例2 85％ 37％ 9％ 1％實施例3 70％ 31％ 14％ 9％實施例4 77％ 29％ 11％ 10％ 6％實施例5 81％ 44％ 25％ 17％ 13％
實施例1和2的試驗結果證明，在含有雙組份，即肽A和3-羥基-2-萘甲酸的微球中肽A的釋放速率隨兩種組份的比例的不同而改變；當3-羥基-2-萘甲酸的含量增高時，肽A釋放速率增快。另外，實施例3、4和5的試驗結果證實，由三種組份，即上述兩種組份和乳酸-羥基乙酸共聚物組成的微球顯示出不同於由兩種組份組成的微球的釋放性能。另外還表明，通過組合不同的乳酸-羥基乙酸共聚物組成和重均分子量可以調控微球的釋放行為。實施例7和參照實施例1的結果證明，3-羥基-2-萘甲酸提高了微球中肽B的含量。實施例7將溶於0.8ml蒸餾水中的0.8g 5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5(此後稱作肽B)的溶液與溶於由5ml二氯甲烷和0.3ml乙醇組成的混合有機溶劑中的3.08g DL-乳酸聚合物(重均分子量36000，數均分子量18000，基於標記定量法測定的羧基含量為70.4μmol/g)和0.12g 3-羥基-2-萘甲酸的溶液混合，並且在均勻混合器中乳化該混合物生成W/O乳劑。將該W/O乳劑注入800ml預先調至18℃的0.1％(w/w)的聚乙烯醇(EG-40，The Nippon SyntheticChemical Industry生產)的水溶液中，並且用渦輪型均勻混合器在7000rpm下攪拌，生成W/O/W乳劑。在室溫下將該W/O/W乳劑攪拌3小時以揮發或擴散外部水相中的二氯甲烷和乙醇，從而固化油相，此後將油相通過75μm孔徑的篩子過篩，此後在離心機(05PR-22，Hitachi，Ltd.)中在2000rpm下離心5分鐘以沉降出微囊，收集所得微囊。再將該微囊分散在蒸餾水中，離心，洗滌掉游離藥物等，並且收集微囊。再將微囊分散在少量加入的蒸餾水中，進而冷凍乾燥。微囊的收率為46％，微囊的肽B含量和3-羥基-2-萘甲酸含量分別為21.3％和2.96％。肽B和3-羥基-2-萘甲酸的包合效率(由其實際含量除以各自的加入量來計算)分別為106.6％和98.6％。實施例8
將1.2g肽B乙酸鹽溶於1.2ml蒸餾水中的溶液與溶於由7.5ml二氯甲烷和0.45ml乙醇組成的混合有機溶劑中的4.62g DL-乳酸聚合物(重均分子量25200，數均分子量12800，基於標記定量法測定的羧基含量為62.5μmol/g)和0.18g 3-羥基-2-萘甲酸的溶液相混合，並且在均勻混合器中乳化該混合物，生成W/O乳劑。將該W/O乳劑注入1200ml預先調至15℃的0.1％(w/w)的聚乙烯醇(EG-40，TheNippon Synthetic Chemical Industry生產)的水溶液中，並且用渦輪型均勻混合器在7000rpm下攪拌，生成W/O/W乳劑。在室溫下將該W/O/W乳劑攪拌3小時以揮發或擴散外部水相中的二氯甲烷和乙醇，從而固化油相，此後將油相通過75μm孔徑的篩子過篩，此後在離心機(05PR-22，Hitachi，Ltd.)中在2000rpm下離心5分鐘以沉降出微囊，收集所得微囊。再將該微囊分散在蒸餾水中，離心，洗滌掉游離藥物等，並且收集微囊。再將微囊分散在少量蒸餾水中，加入0.3g甘露糖醇且溶解，進而冷凍乾燥得到粉末。通過減去所加甘露糖醇的量測定出微囊的收率為55.2％，微囊的肽B含量和3-羥基-2-萘甲酸含量分別為21.3％和2.96％。肽B和3-羥基-2-萘甲酸的包合效率(由其實際含量除以各自的加入量來計算)分別為99.7％和102.2％。實施例9除了用另一種DL-乳酸聚合物(重均分子量為28800，數均分子量為14500，基於標記定量法測定的羧基含量為78.1μmol/g)代替實施例8中的DL-乳酸聚合物以外，按照與實施例8相同的方式製得微囊粉末。通過減去所加甘露糖醇的量測定出微囊的收率為50.2％，微囊的肽B含量和3-羥基-2-萘甲酸含量分別為20.8％和2.78％。肽B和3-羥基-2-萘甲酸的包合效率(由其實際含量除以各自的加入量來計算)分別為103.4％和92.7％。對比實施例1
將1.2g肽B乙酸鹽溶於1.2ml蒸餾水中的溶液與溶於由7.8ml二氯甲烷中的4.8g實施例9所述相同的DL-乳酸聚合物的溶液混合，並且將該混合物注入1200ml預先調至15℃的0.1％(w/w)的聚乙烯醇(EG-40，The Nippon Synthetic Chemical Industry生產)的水溶液中，並且用渦輪型均勻混合器在7000rpm下攪拌，生成W/O/W乳劑。按照與實施例8相同的方式處理該W/O/W乳劑生成微囊粉末。通過減去所加甘露糖醇的量測定出微囊的收率為53.6％，微囊的肽B含量為12.1％。肽B的包合效率(由其實際含量除以加入量來計算)為60.6％，該包合效率比實施例9的小得多。所以顯然，通過加入3-羥基-2-萘甲酸可以提高肽B的包合效率。實施例10將1.00g肽B乙酸鹽溶於1.00ml蒸餾水中的溶液與溶於由7.5ml二氯甲烷和0.4ml乙醇組成的混合有機溶劑中的3.85g DL-乳酸聚合物(重均分子量49500，數均分子量17500，基於標記定量法測定的羧基含量為45.9μmol/g)和0.15g 3-羥基-2-萘甲酸的溶液相混合，並且在均勻混合器中乳化該混合物，生成W/O乳劑。除了將0.1％(w/w)的聚乙烯醇的水溶液的用量和甘露糖醇的加入量分別改變為1000ml和0.257g以外，按照與實施例8中的相同方式處理該W/O乳劑，得到微囊粉末。通過減去所加甘露糖醇的量測定出微囊的收率為53.8％，微囊的肽B含量和3-羥基-2-萘甲酸含量分別為18.02％和2.70％。肽B和3-羥基-2-萘甲酸的包合效率(由其實際含量除以各自的加入量來計算)分別為90.1％和90.1％。實施例11將1.202g肽B乙酸鹽溶於1.20ml蒸餾水中的溶液與溶於由7.5ml二氯甲烷和0.45ml乙醇組成的混合有機溶劑中的4.619g DL-乳酸聚合物(重均分子量19900，數均分子量10700，基於標記定量法測定的羧基含量為104.6μmol/g)和0.179g 3-羥基-2-萘甲酸的溶液相混合，並且在均勻混合器中乳化該混合物，生成W/O乳劑。除了將甘露糖醇的加入量改變為0.303g以外，按照與實施例8中的相同方式處理該W/O乳劑，得到微囊粉末。通過減去所加甘露糖醇的量測定出微囊的收率為61.4％，微囊的肽B含量和3-羥基-2-萘甲酸含量分別為15.88％和2.23％。肽B和3-羥基-2-萘甲酸的包合效率(由其實際含量除以各自的加入量來計算)分別為77.75％和75.05％。實施例12將1.00g肽B乙酸鹽溶於1.00ml蒸餾水中的溶液與溶於由5.5ml二氯甲烷和0.35ml乙醇組成的混合有機溶劑中的3.85g DL-乳酸聚合物(重均分子量25900，數均分子量7100，基於標記定量法測定的羧基含量為98.2μmol/g)和0.15g 3-羥基-2-萘甲酸的溶液相混合，並且在均勻混合器中乳化該混合物，生成W/O乳劑。按照與實施例7中的相同方式處理該W/O乳劑，得到微囊粉末。微囊的收率為48.8％，微囊的肽B含量和3-羥基-2-萘甲酸含量分別為21.31％和2.96％。肽B和3-羥基-2-萘甲酸的包合效率(由其實際含量除以各自的加入量來計算)分別為106.5％和98.7％。對比實施例2將1.00g肽B乙酸鹽溶於1.00ml蒸餾水中的溶液與溶於由5ml二氯甲烷中4.00g與實施例12所述相同的DL-乳酸聚合物的溶液混合，並且在均勻混合器中乳化該混合物生成W/O乳劑。按照與實施例7相同的方式處理該W/O乳劑生成微囊粉末。微囊的收率為48.7％，微囊的肽B含量為11.41％。肽B的包合效率(由其實際含量除以各自的加入量來計算)為57.1％，該包合效率比實施例12的低得多。顯然，通過加入3-羥基-2-萘甲酸可以提高肽B的包合效率。實施例13將溶於115.3g二氯甲烷中的89.2g DL-乳酸聚合物(重均分子量30600，數均分子量14400，基於標記定量法測定的羧基含量為63.0μmol/g)的溶液與3.45g溶於由38.8g二氯甲烷和6.27g乙醇組成的混合有機溶劑中的溶液相混合，並且將該混合物調至28.5℃。從該有機溶劑溶液中稱出224g並與22.3g肽B乙酸鹽溶於20ml蒸餾水中的預熱至44.9℃的水溶液相混合，生成粗品乳劑，隨後在均勻混合器中在10000rpm下乳化5分鐘生成W/O乳劑。將該乳劑冷卻至16.3℃，並且在5分鐘內注入到20L預先調至15℃的0.1％(w/w)聚乙烯醇(EG-40，The Nippon Synthetic Chemical Industry生產)的水溶液中，用HOMOMIC LINE FLOW(Tokushu Kika生產)在7000rpm下攪拌，生產W/O/W乳劑。在15℃下將該W/O/W乳劑攪拌3小時以揮發或擴散外部水相中的二氯甲烷和乙醇，從而固化油相，此後將油相通過75μm孔徑的篩子過篩，此後在離心機(H-600S，Kokusan Enshinke生產)中在2000rpm下離心以連續沉降出微囊，收集所得微囊。再將所得微囊分散在少量蒸餾水中，隨後通過90μm孔徑的篩子，冷凍乾燥，生成粉末。通過減去所加甘露糖醇的量測定出微囊的收率為66.5％，微囊的肽B含量和3-羥基-2-萘甲酸含量分別為22.3％和2.99％。肽B和3-羥基-2-萘甲酸的包合效率(由其實際含量除以各自的加入量來計算)分別為104.5％和102.1％。實驗實施例2將存在於0.3ml分散劑(含有0.15mg羧甲基纖維素、0.3mg聚山梨酸酯80和15mg甘露糖醇的蒸餾水，全部溶解)中的約45mg實施例8所述微囊的分散體用22G注射針頭皮下給藥至7周齡的雄性SD大鼠的背部。在指定的時間間隔後處死大鼠，採集殘留在給藥部位的微球並且定量分析肽B和3-羥基-2-萘甲酸。通過將分析數據除以各自的初始含量計算出保留率，所用DL-乳酸聚合物的性能如表2所示。表2實施例8所述微囊DL-乳酸聚合物的特徵Mw(Da) 25200[COOH](μmol/g聚合物)62.5保留率肽B 3-羥基-2-萘甲酸1天 93.1％ 91.0％2周 84.2％ 54.1％4周 75.7％ 34.5％8周 63.0％ 5.1％12周46.9％ 0.0％16周31.7％ 0.0％20周24.0％ 0.0％如表2所示，儘管生物活性物質的含量很高，但給藥後1天時，實施例8所述微囊的生物活性物質的保留率不小於90％。因此表明，3-羥基-2-萘甲酸不但有效地使生物活性物質能夠以高含量混合在緩釋製劑內，而且還可以很好地抑制了生物活性物質的初始急劇釋放。這種微囊能夠在很長的時間內以恆定速率釋放出生物活性物質。此外，雖然微囊內的3-羥基-2-萘甲酸在12周後被全部消除，但生物活性物質仍能保持相同的釋放速率，這證明了緩釋製劑的功效。實驗實施例3按照與實驗實施例2相同的方式將實施例7和實施例9-12及對比實施例1所得的微囊給藥且回收，對其中的肽B定量。通過將測定結果除以各自的初始含量計算出保留率，DL-乳酸聚合物的性能如表3所示。表3DL-乳酸聚合物的特徵實施例7 實施例9 實施例10 實施例11 實施例12 對比實施例1Mw(Da)3600028800 49500 19900 25900 28800[COOH](μmol/g聚合物)70.4 78.1 45.9 104.6 98.2 78.1保留率1天92.9％ 94.6％93.0％ 92.3％89.4％83.1％2周82.2％ 82.2％80.4％ 37.5％34.3％73.0％4周69.6％ 69.2％58.3％ 30.7％29.7％65.3％8周62.1％ 56.0％36.6％ 24.6％20.8％12周 47.9％ 39.4％30.8％ 18.6％16周 32.2％ 28.0％20周 (未測定)22.9％24周 11.6％28周 4.1％如表2和3所示，與對比實施例1比較，給藥後1天時，實施例7-12中所述微囊表現出較高的等於或大於約90％的保留率。3-羥基-2-萘甲酸不但有效地使生物活性物質能夠以高含量混合在緩釋製劑內，而且還可以很好地抑制生物活性物質的初始急劇釋放。選用了實施例7-9所示微囊的實驗具體證明，當採用的DL-乳酸具有重均分子量約20000-約50000並且羧基含量約50-90μmol/g(通過標記定量發測定)時，能夠使生物活性物質在很長時間內以恆定速率釋放。實驗實施例4利用實驗實施例2所述方法將實施例7所得的微囊皮下給藥給大鼠，收集血樣，並且測定血清中肽B和睪酮的濃度。結果如表4所示。表412周16周24周26周28周肽B(ng/ml) 1.101.651.462.731.30睪酮(ng/ml)0.180.450.680.410.71如表4所示，給藥後生物活性物質的血液濃度在28周內保持在恆定水平，這意味著生物活性物質在28周內持續由微囊中釋放出來。在此期間，藥理學活性的睪酮濃度始終被抑制在正常水平以下，甚至當製劑中含有3-羥基-2-萘甲酸時，生物活性物質在很長時間內在不喪失其活性的條件下穩定存在於微囊內且由該微囊釋放出來。
向該鹽中加入0.5ml水，隨後在室溫下攪拌4小時，經0.2μm濾紙過濾該液體且通過HPLC定量。肽B和3-羥基-2-萘甲酸的濃度分別為2.37g/l和0.751g/l。在攪拌後仍有部分鹽未溶解；上述數值被假設為表示肽B的3-羥基-2-萘甲酸鹽在水中的溶解度，該溶解度比肽B乙酸鹽在水中的溶解度(不小於1000g/l)低，不超過其1/100。這證明了肽B的3-羥基-2-萘甲酸鹽可以用作肽B的緩釋製劑。本發明的緩釋組合物含有高含量的生物活性物質，並且能夠控制其釋放速率。
權利要求
1.含有生物活性物質或其鹽、羥萘甲酸或其鹽和生物可降解聚合物或其鹽的緩釋組合物。
2.根據權利要求1所述的緩釋組合物，其中所述生物活性物質是生物活性肽。
3.根據權利要求2所述的緩釋組合物，其中所述生物活性物質是LH-RH衍生物。
4.根據權利要求1所述的緩釋組合物，其中所述羥萘甲酸是3-羥基-2-萘甲酸。
5.根據權利要求1所述的緩釋組合物，其中所述生物可降解聚合物是α-羥基羧酸聚合物。
6.根據權利要求5所述的緩釋組合物，其中所述α-羥基羧酸聚合物是乳酸-羥基乙酸聚合物。
7.根據權利要求6所述的緩釋組合物，其中乳酸和羥基乙酸的含量比例是100/0-40/60mol％。
8.根據權利要求7所述的緩釋組合物，其中乳酸和羥基乙酸的含量比例是100/0mol％。
9.根據權利要求6所述的緩釋組合物，其中所述聚合物的重均分子量是約3,000-約100,000。
10.根據權利要求9所述的緩釋組合物，其中所述聚合物的重均分子量是約20,000-約50,000。
11.根據權利要求3所述的緩釋組合物，其中所述LH-RH衍生物是下式表示的肽5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z其中Y表示Dleu、DAla、DTrp、DSer(tBu)、D2Nal或DHis(ImBzl)；Z表示NH-C2H5或Gly-NH2。
12.根據權利要求6所述的緩釋組合物，其中所述聚合物的末端羧基含量是50-90μmol/單位質量(g)的聚合物。
13.根據權利要求3所述的緩釋組合物，其中所述羥萘甲酸或其鹽和LH-RH衍生物或其鹽的摩爾比例是3∶4-4∶3。
14.根據權利要求13所述的緩釋組合物，其中所述LH-RH衍生物或其鹽的含量是14％(w/w)-24％(w/w)。
15.根據權利要求1所述的緩釋組合物，其中所述生物活性物質或其鹽極微溶於水或可溶於水。
16.根據權利要求1所述的緩釋組合物，其用於注射。
17.一種用於製備權利要求1所述緩釋組合物的方法，該方法包括從生物活性物質或其鹽、生物可降解聚合物或其鹽和羥萘甲酸或其鹽的混合物中除去溶劑。
18.根據權利要求17所述的緩釋組合物的製備方法，該方法包括將生物活性物質或其鹽混合且分散在含有生物可降解聚合物或其鹽和羥萘甲酸或其鹽的有機溶劑中，隨後除去有機溶劑。
19.根據權利要求18所述的緩釋組合物的製備方法，其中所述生物活性物質為其水溶液形式。
20.根據權利要求17所述的製備方法，其中所述生物活性物質的鹽是與游離鹼或酸形成的鹽。
21.一種含有權利要求1所述緩釋組合物的藥物。
22.用於預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、青春期早熟、痛經或避孕的藥劑，其中含有如權利要求3所述的緩釋組合物。
23.含有生物活性物質的羥萘甲酸鹽和生物可降解聚合物或其鹽的緩釋組合物。
24.一種抑制生物活性物質從緩釋組合物初始急劇釋放的方法，該方法包括利用羥萘甲酸或其鹽。
25.抑制提高緩釋組合物內生物活性物質包合效率的方法，該方法包括採用羥萘甲酸或其鹽。
26.生物活性肽的羥萘甲酸鹽。
27.根據權利要求26所述的生物活性肽的羥萘甲酸鹽，其可溶於或極微溶於水。
28.含有生物活性肽的羥萘甲酸鹽的緩釋組合物。
全文摘要
本發明涉及含有生物活性物質的羥萘甲酸鹽和生物可降解聚合物的緩釋組合物、其製備方法和含有該緩釋組合物的藥物組合物。
文檔編號A61K47/48GK1288387SQ9980211
公開日2001年3月21日 申請日期1999年1月13日 優先權日1998年1月16日
發明者犀川彰, 豬狩康孝, 畑善夫, 山本一路 申請人:武田藥品工業株式會社