產腈水解酶的酵母菌株選育及其在腈類化合物生物轉化中的應用的製作方法

2023-08-10 20:24:36 2

本發明屬於工業生物技術領域，特別涉及一種腈水解酶產生酵母菌的篩選方法及其在腈類化合物生物轉化製備3-羥基丙酸中的應用。

背景技術：

腈水解酶能將腈類底物中的腈基轉化為羧基從而製備得到有機酸、胺基酸等化合物，在大宗化學品、食品添加劑和醫藥中間體等領域具有重要應用。自1964年robinson等人首次從土壤中分離到一株產蓖麻鹼腈水解酶的假單胞菌屬pseudomonas菌株以來，不同來源的腈水解酶已經得到廣泛研究，日本學者採用紅球菌rhodococcusrhodochrousj1產腈水解酶，可水解多種腈類化合物製備得到有機酸。自此，不同來源的腈水解酶產生菌逐漸見諸報導，包括紅球菌屬rhodococcus，諾卡氏菌屬nocardia，不動桿菌屬acinetobacter，產鹼桿菌屬alcaligenes，假單胞菌屬pseudomonas，短根瘤菌屬bradyrhizobium，叢毛單胞菌屬comamonas，芽胞桿菌屬bacillus，火球菌屬pyrococcus，鹽單胞菌halomonas，節桿菌屬arthrobacter，嗜熱芽胞菌geobacillus，棒狀桿菌corynebacterium等各種不同來源的細菌；鐮刀菌fusarium，麴黴aspergillus和青黴菌penicillium等來源的真菌。這些文獻報導的利用腈水解酶獲得的化合物包括煙酸、扁桃酸、丙烯酸、羥基乙酸、亞氨基二乙酸以及多種非天然胺基酸等。這些報導中，以細菌來源的腈水解酶為主，而真菌腈水解酶則相對報導較少，尤其是來源於酵母菌的腈水解酶更是鮮有報導。

3-羥基丙酸，是一種三碳無手性化合物，具有羥基和羧基兩個官能團，與乳酸互為同分異構體，是很多光學活性物質的前體；作為一種重要平臺化合物，被用於眾多醫藥化工產品的生產中，是合成大分子化合物和聚合物的重要單體。2004年美國能源部將3-羥基丙酸列為當今世界12種最具開發潛力的化工產品之一，具有重要的開發價值，近年來也逐步受到關注。3-羥基丙酸的傳統生產方法主要通過化學法進行。一般利用氰化鉀與鄰滷代醇反應，生成3-羥基丙腈，再通過reformatsky反應生成3-羥基丙酸；在高溫下，丙烯酸可發生水合反應合成3-羥基丙酸；此外，也可利用鉑金和一種固體酸催化劑zsm5zeolite分別催化3-羥基丙醛和丙烯酸生成3-羥基丙酸；總結來看，化學法合成步驟相對複雜，對設備要求高，且產品分離純化流程繁瑣，生產成本相應較高。

近年來發展的生物法中利用微生物發酵生產3-羥基丙酸，則可有效避免化學合成法所帶來的不利因素，且具有原料來源豐富，綠色環保，生產成本低等優勢。結合基因工程手段可以較好實現3-羥基丙酸的生產。利用基因工程菌株生產3-羥基丙酸的方法按照底物的不同主要包括兩類：一類是以穀物類碳水化合物葡萄糖為底物；一類是以三碳化合物甘油為底物。而在野生菌生產3-羥基丙酸的研究中，如1，3-丙二醇、丙酸、丙烯酸、3-氨基丙酸等作為底物均有報導。但生物發酵法需要輔酶參與，並且產率和產物純度不高，同時菌體對高濃度底物耐受能力偏低。利用腈水解酶一步催化腈類物質3-羥基丙腈製備3-羥基丙酸是一種可替代性技術，該方法步驟簡單，避免了中間產物的影響，而且該工藝具有反應條件溫和、能耗低、環境友好等技術優勢。迄今為止，尚未見酵母屬菌株，尤其是季也蒙畢赤酵母meyerozymaguilliermondii產腈水解酶用於3-羥基丙酸合成的報導。

技術實現要素：

本發明的發明人從土樣中分離篩選獲得一株產3-羥基丙酸的季也蒙畢赤酵母3h2-2，並對這株菌進行了發酵研究。本發明提供的菌株是從化工廠取得土樣分離篩選獲得一株酵母菌，根據形態特徵，以及18s和its基因測序，該菌株屬於季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3h2-2，現保藏在位於北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.12935，保藏日期為2016年9月5日。

本發明提供的菌株季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)的生理形態特徵及分子鑑定如下：

菌株在固體發酵培養基平板上劃線接種，長出菌落呈圓形、水滴狀，乳白色奶油狀，菌體表面較溼潤、有光澤，易挑取。在30℃恆溫箱中培養24h後，直徑1mm左右；48h後單菌落直徑達到2mm左右；培養6d後，直徑可達9mm左右。菌落中心及周邊部分無其他顏色。在顯微鏡下觀察，細胞多呈橢圓形，多成簇生長。在電子顯微鏡下，菌體之間大小差異較大，長度在1.5-5μm之間，呈現橢球形或橄欖球形，可見明顯出芽痕和誕生痕，證明其可進行芽殖。

利用真菌通用引物對季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)的18s和its基因序列進行pcr擴增，分別得到1677bp和610bp大小的片段。通過在ncbi網站應用blast軟體與資料庫中的已有序列進行相似性比較分析，得出該菌株的18srdna序列與meyerozyma屬(kj126853.2、kc178873等)的相關序列存在99％以上同源性，同時與pichia屬(eu784644.1)及candida屬(ay227715.1、ay518523.1)的相關菌株序列同源性也在99％左右，最終將其歸為meyerozyma屬菌株。由該菌株的its序列分析得出，菌株3h2-2與m.guilliermondiigk8存在最高同源性。結合形態特徵和生理生化特性，將其鑑定為季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)。

本發明還提供了一種3-羥基丙酸生產菌的篩選方法，其特徵如下：

初篩，採集土樣，在具有3-羥基丙腈作為單一氮源的篩選培養基分離能夠利用底物的菌株；復篩，首先進行種子培養，以3％的接種量接入發酵培養基，培養結束後取發酵液對3-羥基丙腈進行轉化實驗，採用苯酚-次氯酸鈉法檢測其酶活。

所述土樣來源於生產腈類化合物廠房周圍的土樣及其下水道汙泥。

所述初篩方法如下：

取1g土樣及汙泥樣品，溶入10ml的0.9％生理鹽水中，於30℃條件下充分震蕩30min，靜置；取1ml土壤懸浮液，接入含篩選培養基的三角瓶中(50ml/250ml)於30℃溫度下在120rpm往復式搖床中培養；48h後，取100μl渾濁培養液塗布於固體篩選培養基平板上，將平板置於恆溫培養箱倒置培養，30℃培養48h；挑取篩選培養基平板上長出的大而壯的單菌落，轉接至新鮮的篩選培養基劃線分離，轉接3～5代。

所述篩選培養基的組成成分為：

葡萄糖5-10g/l；kh2po40.5-4g/l；mgso40.05-0.4g/l；feso40.01-0.1g/l；cacl20.01-0.1g/l；nacl0.5-4g/l；3-羥基丙腈0.5-4g/l。

所述固體篩選培養基的組成成分為：

葡萄糖5-10g/l；kh2po40.5-4g/l；mgso40.05-0.4g/l；feso40.01-0.1g/l；cacl20.01-0.1g/l；nacl0.5-4g/l；3-羥基丙腈0.5-4g/l；瓊脂粉15～20g/l。

所述復篩方法如下：

發酵培養基組成為(g/l)：

酵母粉5-15g/l，蛋白腖5-20g/l，nacl0.5-4g/l，kh2po41-5g/l，k2hpo41-5g/l，甘油5-15g/l，3-羥基丙腈0.5-4g/l，ph5.0-8.0。培養方法為：250ml三角瓶裝液量25-50ml，接種量為1-10％，在轉速為100-250r/min的搖床中於25-40℃培養20-60h；發酵液處理方法為：將發酵液在8000-15000rpm條件下離心2～10min，收集經培養獲得的菌體，用0.01-0.5m，ph6.0-8.0的磷酸鹽緩衝液洗滌菌體2～4次；離心，棄上清，於4℃條件下保藏菌體備用檢測酶活。

所述季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3h2-2檢測酶活的方法如下：

採用苯酚-次氯酸鈉法測定酶活。用100mm、ph7.2的磷酸鈉緩衝液重懸適量上述菌體至反應體積為0.9ml，將該體系在30℃下溫浴5min，隨後加入0.1ml0.5m的3-羥基丙腈，製備成底物終濃度為50mm，總體積為1ml的酶反應體系；本實驗中測量篩選到的每株菌對底物的轉化情況，各組做三個平行實驗，於30℃的搖床轉化反應10min，反應結束後12000×g離心10min終止反應，取10μl反應液上清，用除氨水定容至1ml，然後依次加入1ml苯酚鈉溶液、1.5ml亞硝基鐵氰化鈉溶液、1.5ml次氯酸鈉溶液，在27℃水浴中培養15min後，檢測od630nm。

顯色液配製方法為：顯色液1，7.8ml4mmnaoh加2.5g苯酚配得的苯酚鈉溶液；顯色液2，0.1mg·ml-1亞硝基鐵氰化鈉液；顯色液3，0.02m次氯酸鈉溶液。

氨標準曲線繪製方法為：製備10μg·ml-1的氨標準液；分別取0、100、200、300、400、500、600、700、800μl氨標準液於9隻10ml離心管中，按次序先後添加1.0ml苯酚鈉溶液、1.5ml亞硝基鐵氰化鈉和1.5ml次氯酸鈉溶液，並用除氨水定容至5ml，混勻，並於27℃水浴鍋中反應15min；取200μl反應液置於96孔板中，在酶標儀上檢測其吸收值od630nm。

酶活計算方法如下：

酶活(1u)定義：在標準生物轉化反應條件下，每1min形成1μm氨所對應的酶量，測定均重複3次。

本發明還提供一種cgmccno.12935的應用方法，其特徵如下：

將cgmccno.12935接入發酵培養基，獲得高活性高生物量的發酵液；在8000-15000rpm條件下離心2～10min，收集經培養獲得的菌體，用0.01-0.5m，ph6.0-8.0的磷酸鹽緩衝液洗滌菌體2～4次；菌體重懸於緩衝液中，並與底物溶液混勻，添加0.5％-10％終濃度的葡萄糖，反應溫度保持在20-60℃，攪拌轉速保持在50-250r/min，反應時間10～150h。採用高效液相色譜法檢測轉化後上清液中生成的3-羥基丙酸濃度以及殘餘的底物濃度。轉化液處理方法為：將轉化液12000rpm離心10min，上清液經0.22μm濾膜過濾後用於3-羥基丙酸含量檢測。

所述轉化液中3-羥基丙酸採用高效液相色譜法檢測，色譜條件為：dionex3000型高效液相色譜儀，色譜柱為waters公司的xbridgedc18柱(5.0μm，250mm×4.6mm)，柱溫30℃，流速為0.8ml·min-1，紫外檢測波長210nm，流動相為甲醇/0.05％磷酸(5/95)等度洗脫。

本發明的優點和有益效果：

首次發現一株產腈水解酶的季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)能利用腈水解反應催化3-羥基丙腈一步生成3-羥基丙酸，季也蒙畢赤酵母cgmcc12935具有生命力強、腈轉化能力突出等特點，為3-羥基丙酸的合成建立了一種新工藝；本工藝具有反應條件溫和、能耗低、環境友好等特點。本工藝在轉化過程中添加0.5％-10％的葡萄糖，大幅提升了產物3-羥基丙酸的積累量；本工藝還具有反應條件溫和，產率高，生產成本低，對環境友好等特點。

附圖說明

圖1cgmccno.12935在300mm、400mm和500mm底物濃度下以及添加不同濃度葡萄糖後產3-羥基丙酸變化曲線。

具體實施方式

實施例1

⑴菌株的富集篩選過程

採集腈類化合物廠房周圍的土樣，採集土樣時，先用小鏟子鏟去表層土，採集5～15cm深度處的土樣。取1g採集到的土樣及汙泥樣品，溶入10ml的0.9％生理鹽水中，於30℃條件下充分震蕩30min，靜置；取1ml土壤懸浮液，接入含篩選培養基的三角瓶中(50ml/250ml)於30℃溫度下在120rpm往復式搖床中培養；48h後，取100μl渾濁培養液塗布於固體篩選培養基平板上，將平板置於恆溫培養箱倒置培養，30℃培養48h；挑取篩選培養基平板上長出的大而壯的單菌落，轉接至新鮮的篩選培養基劃線分離，轉接3～5代。

再進行復篩，挑取88株純化好的菌株進行種子培養，以3％的接種量接入發酵培養基，於30℃溫度下120rpm往復式搖床中培養36h，取該培養液12000rpm離心5min收集菌體，採用苯酚-次氯酸鈉法檢測菌株對底物3-羥基丙腈的酶活。得到酶活相對最好的一株菌株，編號為3h2-2。

所述篩選培養基的組成為(g/l)：葡萄糖5；kh2po41；mgso40.1；feso40.02；cacl20.02；nacl1，3-羥基丙腈1。

所述固體篩選培養基的組成為(g/l)：葡萄糖5；kh2po41；mgso40.1；feso40.02；cacl20.02；nacl1，3-羥基丙腈1；瓊脂粉20。

所述發酵培養基(g/l)為：酵母粉7.5，蛋白腖15，nacl1，kh2po42，k2hpo42，甘油15，3-羥基丙腈1，ph7.2。

⑵菌株的形態

季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii3h2-2，cgmccno.12935)菌株在篩選培養基平板上採用劃線接種，長出菌落呈圓形、水滴狀，乳白色奶油狀，菌體表面較溼潤、有光澤，易挑取。在30℃恆溫箱中培養24h後，直徑1mm左右；48h後單菌落直徑達到2mm左右；培養6d後，直徑可達9mm左右。菌落中心及周邊部分無其他顏色。在顯微鏡下觀察，細胞多呈橢圓形，多成簇生長。在電子顯微鏡下，菌體之間大小差異較大，長度在1.5-5μm之間，呈現橢球形或橄欖球形，可見明顯出芽痕和誕生痕，證明其可進行芽殖。

⑶菌株的分子鑑定

收集在液體發酵培養基中生長的菌體，經低溫液氮研磨後，用真菌基因組dna提取試劑盒提取總dna。擴增引物分別為18s的通用引物和its序列的通用引物。

pcr反應採用50μl反應體系，

pcr擴增條件：95℃預變性5min，95℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸90s，共30個循環，最後72℃終延伸10min。pcr擴增產物的純化按上海生工生物技術公司的小量膠回收pcr產物純化試劑盒說明進行，測序由上海睿迪生物科技有限公司完成。

經測序後獲得的18s和its基因序列在genbank中進行blast比對確定其種屬。最終將其命名為季也蒙畢赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3h2-2，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號cgmccno.12935。

實施例2

本實例說明對cgmccno.12935接入發酵培養基進行了培養獲得高活性高生物量的菌體，以及生物轉化3-羥基丙腈生產3-羥基丙酸的方法。

發酵培養基組成(g/l)為：酵母粉7.5g，蛋白腖15g，nacl1g，kh2po42g，k2hpo42g，甘油15g，3-羥基丙腈1g，ph7.2；

將cgmccno.12935以3％接種量接入培養基中，30℃，120rpm往復式搖床培養36h，12000rpm離心5min收集培養好的菌體，用100mm、ph7.2的磷酸鈉緩衝液洗滌菌體2～3次，並將菌體重懸於該緩衝液中。

將底物溶液與菌懸液混勻，並使底物終濃度為300mm，控制培養條件在30℃，120rpm往復式搖床中進行轉化反應，30h後底物轉化完全，16h處檢測到的3-羥基丙酸最高累積濃度為45.63mm。

實施例3

通過離心從培養液中收集菌體，用100mm、ph7.2的磷酸鈉緩衝液洗滌菌體2～3次，重新懸浮製成菌懸液，將底物溶液與菌懸液混勻，並使底物終濃度為400mm，控制培養條件在30℃，120rpm往復式搖床中進行轉化反應，41h後底物完全轉化，在21.5h時檢測到的3-羥基丙酸累積濃度最高，為52.90mm。

實施例4

通過離心從培養液中收集菌體，用100mm、ph7.2的磷酸鈉緩衝液洗滌菌體2～3次，重新懸浮製成菌懸液，將底物溶液與菌懸液混勻，並使底物終濃度為500mm，控制培養條件在30℃，120rpm往復式搖床中進行轉化反應，47.5h後底物完全轉化，30h時檢測到的3-羥基丙酸累積濃度最高，為64.68mm。

實施例5

將cgmccno.12935通過離心從培養液中收集菌體，用100mmol·l-1、ph7.2的磷酸鈉緩衝液洗滌菌體2～3次，重新懸浮製成菌懸液，將底物溶液與菌懸液混勻，並使底物終濃度為300mm，同時在該轉化體系中添加3％的葡萄糖，控制培養條件在30℃，120rpm往復式搖床中進行轉化反應，78.5h後底物完全轉化，此時檢測到的3-羥基丙酸最高累積濃度為158.2mm。

實施例6

將cgmccno.12935通過離心從培養液中收集菌體，用100mm、ph7.2的磷酸鈉緩衝液洗滌菌體2～3次，重新懸浮製成菌懸液，將底物溶液與菌懸液混勻，並使底物終濃度為400mm，同時在該轉化體系中添加3％的葡萄糖，控制培養條件在30℃，120rpm往復式搖床中進行轉化反應，100h後底物轉化完全，此時檢測到的3-羥基丙酸最高累積濃度為191.5mm。

實施例7

將cgmccno.12935通過離心從培養液中收集菌體，用100mm、ph7.2的磷酸鈉緩衝液洗滌菌體2～3次，重新懸浮製成菌懸液，將底物溶液與菌懸液混勻，並使底物終濃度為500mm，同時在該轉化體系中添加3％的葡萄糖，控制培養條件在30℃，120rpm往復式搖床中進行轉化反應，100h後底物轉化完全，此時檢測到的3-羥基丙酸最高累積濃度為216.3mm。