睫狀神經營養性因子的製作方法

2023-05-18 09:51:01 1

專利名稱：睫狀神經營養性因子的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼睫狀神經營養性因子(CNTF)的重組DNA分子，及其衍生的肽和蛋白質。該CNTF和按本發明生產的有關分子均可用於治療各種神經性病症。
神經營養性因子的生物學已鑑定的許多因子均影響神經系統的生長和發育。可以相信，在成熟及未成熟神經系統中這些因子對維持神經種群的生存起著重要作用。
在許多神經種群的正常發育過程中，有一個確定的細胞死亡期，在此期間，原始種群的許多成員死亡(Hamburger and Levi-Montalcini，1949，J，EXP，Zool.Ⅲ457-501;Hamburger，1958，Amer.J.Anat.102365410;Hamburger，1975，J.Comp.Neurol.160535-546;Cowan and Wenger，1968，Z，EXP.Zool.，168105-124;Rogers and Cowan，1973，J，Comp.Neurol.147291-320;Clarke and Cowan，1976，J.Comp.Neurol.167143-164;Clarke et al.，1976，J.Comp.Neurol.167125-142;Hollyday and Hamburger，1976，J.Comp.Neurol.170311-320;Varon and Bunge，1978，Annu.Rev.Neurosci.1327-362;Cowan et al.，1984，Science 2251258-1265)。已證明神經元的存活與神經支配區域大小成比例;給定的神經種群的靶區域越小，在細胞死亡期存活的神經元數目減少。這表明，靶區域中存在的神經營養性因子的量與神經元的存活有關。
神經生長因子(NGF)是這些神經營養性分子中得到最充分表徵的，體外和體內試驗均表明，在小雞和大鼠早期發育過程中，NGF對交感神經和神經
衍生的感覺神經元的生存是必不可少的(levi-Montalcini and Angeletti，1963，Develop.Biol.7653-659;levi-Montalcini et al.，1968，Physicl.Rev.48524-569)。現已發現，將已純化的NGF注入正在發育的小雞胚胎中，可引起脊髓感覺神經元和交感神經元的大量增生和過度生長(Levi-Montal-cini and Booker，1960，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46373-384;Hamburger et al.，1981，J.Neurosci.160-71)。相反，通過在新生鼠中每日注射抗-NGF抗體，而去除或分離內生NGF的同時可有效破壞交感神經系統(Levi-Montalcini and Booker，Proc.Natl.Acad..Sci.U.S.A.46384-391;Levi-Montalcini and Angeletti，1966，Pharmacol.Rev.18619-628)。試驗表明，通過子宮內注射抗體或通過母體抗體經胎盤的被動轉移，而在發育早期暴露於NGF抗體，結果也會明顯損傷神經脊衍生的感覺神經元，如脊髓的和背中線的三叉感覺神經元(Goedert et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.811580-1584;Gorin and Johnson，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.765382-5386)。直到最近，幾乎所有對NGF的研究均集中在其對外周神經系統的作用，然而現在看來，在中樞神經系統中NGF也會影響神經元的特定種群的發育和生存(Thoenen et al.，1987，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.109145-178;Whittemore and Seiger，1987，Brain Res.Rev.12439-464)。
還未象NGF那樣表徵的神經營養性因子包括腦衍生的神經營養性因子(BDNF)和睫狀神經營養性因子(CNTF)。
睫狀神經營養性因子這些睫狀神經營養性因子(CNTFs)是小雞胚睫狀節神經元在體外生存特異性需要的蛋白質(Manthorpe et al.，1980，J.Neurochem.3469-75)。解剖學上將該睫狀神經節定位於眶腔內，處於外側直肌和視神經鞘之間;它接收來自動眼神經的副交感神經纖維，該動眼神經支配睫狀肌和瞳孔括約肌，還支配存在在眼脈絡層中的平滑肌。
現已發現，睫狀節神經元是具有確定細胞死亡期的神經元種群之一種。在小雞的睫狀神經節中，已觀測到在第8天的胚胎(E8)中有一半神經元，在E14以前死亡(Landmesser and Pilar，1974，J.Physoil.241737-749)。在這相同的時間期間，生成了睫狀節神經元，它與其靶組織(即眼的睫狀體和脈絡層)有關。Landmesser and Pilar(1974，J.Physiol.241715-736)觀測到在細胞死亡期以前切除一隻眼，結果幾乎完全喪失同側神經節中的睫狀節神經元。相反，Narayanan和Narayanan(1978，J.Embryol.Ex.Morphol.4453-70)觀測到，植入另外一隻眼原基，從而增加有用靶組織的量，可減少睫狀節神經元細胞的死亡。這些結果與作用於睫狀節神經元的神經營養性因子的存在相一致。
現已發現，在培養時睫狀節(CG)神經元的存活需要一種或多種因子。睫狀神經營養性因子(CNTF)的活性已在如下培養基中鑑定在小雞肌細胞限制性培養基中(Bennett and Nurcombe，1979，Brain Res.173543-548;Nishi and Berg，1979，Nature 277232-234;Varon et al.，1979，Brain Res.17329-45)，在肌肉浸提液中(Mclennan and Hendry，1978，Neurosci.Lett.10269-273;Bonhady et al.，1980，Neurosci.Lett.18197-201)，在小雞胚胎提取液中(Varon et al.，1979，Brain Res.17329-45;Tuttle et al.，1980，Brain Res.183161-180)，以及在心臟細胞限制的培養基中(Helfand et al.，1976，Dev.Biol.50541-547;Helfand et ai.，1978，Exp.Cell Res.11339-45;為便於討論，還可參見Adler et al.，1979，Science 2041434-1436和Barbin et al.，1984，J.Neurochem.431468-1478)。
Adler等人(1979，Science 2041434-1436)採用基於CG神經元微孔培養物的分析體系，表明在CG神經元支配的眼內靶組織中存在豐富的CNTF源。8000多個營養單位(TU)存在在12天的胚胎中，已發現2500個TU存在眼組織中;看來活性只限於含有睫狀體和脈絡層的部分，具有的比活性比完整的胚胎提取液中的比活性約高20倍。
其後，Barbin等人(1984，J.Neurochem.431468-1478)報導了從小雞胚胎眼組織中純化CNTF的方法。還發現CNTF活性與非-CG組織(包括鼠坐骨神經)有關(Williams等人，1984，Int.J.Develop.Neurosci.218460-470)。Manthorpe等人(1986，Brain Res.367282-286)報導用分餾方法(類似於從小雞眼中分離CNTF活性所用的方法)從成年鼠坐骨神經提取液中純化哺乳動物CNTF活性。此外，Watters和Hendry(1987，J.Neurochem.49705-713)描述了一種用肝素親和色譜法在非變性條件下從牛心組織中使CNTF活性純化約20000倍的方法。在已損傷的腦組織中也已鑑定CNTF活性(Manthorpe et al.，1983，Brain Res.26747-56;Nieto-Sampedro et al.，1983，J.Neurosci.32219-2229)。
Carnow等人(1985，J.Neurosci.51965-1971)和Rudge等人，(1987，Develop.Brain Res.32103-110)描述了一種從組織提取液中鑑定CNTF活性的方法，包括將細胞提取液經電泳分離後，影印到硝酸纖維膜濾紙上(Western吸印試驗)，然後用CG神經元接種該硝化纖維素膜，識別含有CNTF活性的蛋白質帶。用活體染色鑑定細胞存活的面積。這些方法可用於測定粗提取液中活性多肽的表觀分子量。用該方法，Carnow等人(1985，J.Neurosci.51965-1971)觀測到成年鼠坐骨神經和腦衍生的CNTF活性與小雞CNTF(20.4kd)相比顯示具有不同的大小(24kd)。
睫狀神經營養性因子的功能性現已認為許多生物效應是由CNTF引起的，儘管這些活性分子性質尚不清楚。如上所述，最初將CNTF描述成一種活性物，該活性物可維持E8小雞睫狀神經元的生存，它是副交感神經系統的一種成分。含有CNTF活性的已知製劑的其它生物性質描述如下Saadat等人(1989，J.Cell Biol.1081807-1816)觀測到鼠坐骨神經CNTF的高純製劑能誘導培養液中新生鼠上頸節神經元的膽鹼能分化。Hoffman(1988，J.Neurochem.51109-113)也發現由小雞眼衍生的CNTF活性可增加視網膜單層細胞培養物中膽鹼-O-乙醯轉移酶的活性程度。
Hughes等人(1988，Nature 33570-73)對產期鼠視神經和腦中的兩種潛力神經膠質祖先細胞的種群進行了研究;認為該細胞種群首先產生少突神經膠質細胞，然後，再產生2型星形膠質細胞。研究表明，在缺少任何特定生長因子時從少突神經膠質細胞-2型-星形膠質細胞(O-2A)祖先細胞中可發生少突神經膠質細胞分化，而2型星形膠質細胞分化顯然需要有特異誘導蛋白質存在。Hughes等人觀測到2型星形膠質細胞誘導蛋白質與CNTF相類似或相同(也參見Anderson，1989，Trends Neurosci.1283-85)。
Heymanns和Unsicker(1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.847758-7762)觀測到成神經細胞瘤細胞浸提液的高速上清液可產生類似於由小雞眼或鼠坐骨神經衍生的CNTF活性的效應;這說明存在的蛋白質與CNTF(分子量)相類似但不相同。
Ebendal(1987，J.Neurosci.Res.1719-24)在各種鼠和雞組織中尋找CNTF活性。他們在鼠組織而不是在雞組織中觀測到很寬範圍的睫狀神經存活促進活性;且發現鼠肝、脾臟T細胞和下頜腺細胞具有低的CG存活促進活性。在試驗的組織中觀測到鼠腎臟的CNTF活性最高。
雖然上述研究已經表明，許多組織和細胞提取液具有與CNTF性質類似的活性(例如，在組織培養液生物檢定中它們能維持E8小雞睫狀節神經元的生存)，但它不能推斷單一或相同蛋白質是產生這些活性的主要原因。正如成纖維細胞生長因子(FGFs)類所示，在單一生物檢定中，許多特殊多肽或蛋白質具有相同的生物活性。
最初發現小雞眼和鼠坐骨神經CNTF的神經元特異性與對NGF應答的神經元種群相一致。但是在研究CNTF和NGF對正發育的神經元種群的作用時CNTF和NGF之間的區別特徵極為明顯。Skaper和Varon(1986，Brain Res.38939-46)研究了在6.5天(E6.5)和E15的胚胎期間小雞後根神經節(DRG)神經元存活條件。這些DRG神經元最初只對NGF響應，後來觀測到也對CNTF應答，最後似乎與這二種因子越來越不反應。除了在發育過程所起作用不同之外，CNTF與NGF的差別還包括分子量、等電離點、不能用NGF的抗體使之失活，以及CNTF能維持NGF不響應的CG神經元在體外生存(Barbin等人.，1984，J.Neurochem.431468-1478)。
本發明涉及編碼睫狀神經營養性因子(CNTF)的核酸序列、蛋白質、肽及其生成的衍生物。在本發明的各種實施方案中，本發明的核酸序列、蛋白質和肽均可用於治療各種神經性疾病和神經錯亂，包括(但不限於)早老性痴呆病和帕金森氏病。
在另一些實施方案中，本發明的CNTF核酸、蛋白質和肽可用於治療運動神經疾病，包括(但不限於)肌萎縮的外側硬化(Lou Gehrig氏病)。在本發明的一個特定實施方案中，可用CNTF恢復貝耳氏(Bell′s)麻痺的面神經功能。在本發明的另一個特定的實施方案中，CNTF可用於幫助脊髓神經元的生長，從而為外傷、梗死、感染、營養不良或有毒試劑引起的脊髓損傷提供了治療方法。
而且，本發明提供了化學方法生產純CNTF的新方法。
本發明還涉及含有效量CNTF基因產物的藥物組合物，該組合物可用於診斷和治療各種神經性疾病和失調。
本發明涉及CNTF的克隆、序列分析和表達，並首次提供了利用人體CNTF編碼核酸序列生產人CNTF的方法。而且，本發明的CNTF核酸序列可用於識別各種物種和組織中的編碼CNTF或CNTF-同源分子的核酸序列。在本發明另一種特定的實施方案中，已鑑定了具有CNTF活性的肽片段，並生產了中和CNTF活性的CNTF肽的抗體。
縮寫詞BRCN 溴化氫CG 睫狀神經節CNTF 睫狀神經營養性因子DRG 後根神經節E8、E9、etc 8天或9天胚胎，等GFAP 膠質原纖維酸性蛋白質NGF 神經生長因子TU 營養單位，每毫升一個營養單位等於每毫升培養介質中維持半數最大神經元生存所需的CNTF活性的量。


圖1.(a)表示CDNA克隆，(b)表示鼠CNTF的核苷酸順序及由它推導出的胺基酸順序，(c)表示用作引物的寡聚核苷酸及該引物在(b)中所處的位置。在(b)中劃線的胺基酸對應於CNTF的胰蛋白酶解片段(T1-T8)以及BRCN(溴化氰)解片段(CB1-4)的多肽序列。以核苷酸水平表示，對應於編碼區的順序用黑體字印刷，並在多聚腺苷酸化信號順序下劃線。(d)表示由純化的CNTF得到的CNTF的胺基酸組成及由CNTF CDNA推導出的結果。
圖2.(a)表示用DEAE離子交換層析和SDS-聚丙烯醯胺凝膠製備電泳純化後，CNTF的二維凝膠電泳分析;(b)表示先用DEAE離子交換層析、SDS-聚丙烯醯胺凝膠製備電泳純化，再用Bakerbond Gold C4Widepore柱層析進一步純化後，CNTF的二維凝膠電泳分析。
圖3.表示在有轉染的Hela細胞上清液和提取物存在時，培養的E8雞睫狀神經元的存活狀況8天的胚胎睫狀神經元在Hela細胞的上清液(a)中及提取物(b)中生長，該Hela-細胞用下列質粒轉染，即無插入(△)的質粒及在正意義定向(O)和反意義(■)定向中含有鼠CNTFCDNA克隆E的質粒。
圖4中(a)表示成年鼠組織中CNTF-mRNA的Northern印跡分析(所用的縮寫為BR，腦;LIV，肝臟;KID，腎臟;MC，肌肉;SK，皮膚;SCI，坐骨神經;SP，脊髓);(b)表示從新生幼鼠(PO)，生長4天的幼鼠(P4)以及生長13天幼鼠的坐骨神經中得到的RNA。
圖5表示在三種不同的大腸桿菌(E.coli)菌株中重組的rCNTF。M道表示標準蛋白質標記物;圖中註明了三種蛋白質的分子量。1-3道分別表示從大腸桿菌W3110qF-、HB101和MC1061中提取的總蛋白質，這三個菌中都含有pCP-rCNTF-C-1，按上述方法製備蛋白質提取物，並在8-25%聚丙烯醯胺梯度凝膠中進行分析(見Panayotatos，N.和Fontaine，A.，1988，J.Boil.Chem.2603173-3177)。
圖6(a)表示用PCR方法產生的人CNTF探針與經ECOR1消化的人和鼠基因組DNA的Southern印跡雜交。(b)表示放射性活性鼠CNTF探針與經ECOR1消化的人和鼠基因組DNA的Southern印跡雜交。
圖7表示用PCR方法擴增的人基因組DNA中得到的部分CNTF編碼序列與已知鼠CNTF編碼順序相比較。用(＊)表示推斷出的人和鼠的胺基酸順序之間的差別，用不等號(≠)表示二者的DNA序列的差別。
圖8表示人的CNTF序列。(a)為人的CNTF的核酸序列和胺基酸序列;(b)是人和鼠CNTF的胺基酸序列的比較;(c)為人和鼠CNTF的核苷酸序列的比較;(d)為人基因組CNTF序列的整個內切酶圖譜。
圖9表明，根據CNTF(C-端區)順序合成的肽(14個胺基酸-ISALESHYGAKDKQ)的抗體在免疫沉澱反應中能抑制純化的鼠CNTF的生物活性。
圖10說明一個含28個胺基酸的合成CNTF肽片段的神經營養活性。
圖11.表示間接免疫螢光分析結果，該分析中用抗具有生物活性的28個胺基酸CNTF肽的兔抗體與固著的鼠坐骨神經結合，然後再用若丹明(rhodamine)標記的抗兔IgG反應。大箭頭表示周圍軸突的染色情況;小箭頭表示標記的中軸結構。
圖12表示在含有聚鳥氨酸底物的培養基中生長72小時得到的E14鼠中脊髓細胞的分離培養物的相襯光顯微照片，培養是在下列情況下A.對照培養基B.培養基中補充有鼠神經生長因子(NGF);或C.培養基中補充有大腸桿菌產生的重組鼠睫狀神經營養性因子(CNTF)。
注意觀測存在CNTF時，外延神經元的存活以及軸突的過度生長，標尺＝100μm。
圖13表示單側面神經受損的新生鼠的面神經細胞核中運動神經元和膠質細胞發生的變化。含有明膠海綿的BSA產生的單側神經損傷植入，(A)位於損傷面的面部細胞核的尼氏染色的運動神經元;(B)非損傷面的面部細胞核中的尼氏染色運動神經元(對照);(C)用抗-GFAP抗體染色損傷面的面部細胞核;以及(D)用抗-GFAP抗體染色的非損傷面的面部細胞核。
圖14表示單側面神經損傷的新生鼠面神經細胞核中運動神經元及膠質細胞的變化。具有含明膠海綿的CNTF的單側神經損傷植入，(A)受損面面部細胞核中尼氏染色的運動神經元;(B)未損傷面的面部細胞核中尼氏染色的運動神經元(對照);(C)用抗-GFAP抗體著色的受損面的面部細胞核;(D)用抗-GFAP抗體著色的未受損面的面部細胞核。
圖15為計算機作圖，它表示鼠(a)和人(b)CNTF的親水性、表面特性、柔曲性、抗原性、兩性螺旋、兩性摺疊以及它們的二級結構。
圖16表示表達質粒的主要特性，圖中註明了啟動子(LacUV5)核糖體結合位點(rbs 1)、CNTF、amp R和Kan R基因以及Cop 1(O)和Kan 1(O)突變，如正文所述，在構建質粒的過程中用AseⅠ、EagⅠ、NdeⅠ和Pvu1限制性位點。
圖17表示人CNTF的序列以及克隆中所用的PCR引物。蛋白質編碼區域的DNA序列以黑體字印刷，並在它的上方註明了推導出的胺基酸順序。實心箭頭( )表示外顯子1的最後一個核苷酸和外顯子2的第一個核苷酸;箭頭上方的括號表示5′和3′端的內含子的順序。箭頭表示選用的寡聚脫氧核糖核苷酸引物的定位以及它的5′到3′的極性。星號表示錯配處。寡聚脫氧核苷酸引物序列(5′到3′)如下CNTF. 23:GCTTTCACAGAGCATTCACCG；CNTF. 21:AGGCCCTGATGCTTCACATAGGATTCCGTAAGAG；CNTF. 22:CTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCATCAGGGCCT；CNTF. 24:GAGACGGCCGTAACTGTTACATTTTCTTGTTGTTAG；CNTF. 10:CCAAGCTTCTAGAATTCGCAGGCATCCCATCAGCCT；CNTF. 11:GACTCGAGTCGACATCGGAGATGACTGAGGCAGA。
圖18為用不同的載體表達人和鼠CNTF的比較，圖中註明的各種菌株的總蛋白質在8-25%的聚丙烯醯胺凝膠上進行分析並用考馬斯亮蘭染色。(M)表示標記物的分子量(×100)，圖中還註明了人CNTF、鼠CNTF、ampR以及Kan R蛋白質的帶的位置。
圖19表示純化的CNTF。(A)鼠CNTF;(B)人CNTF。溶胞物細胞總蛋白質;8M GuHCl已透析的提取物;0.5，5，10和50經DEAE-Sephacel或Fast-S處理後加到每道上的蛋白質的微克數。
圖20表示睫狀神經元對天然的和重組的鼠CNTF的劑量反應。按12.7部分所述方法測得在鼠CNTF量增加時，離體的E8雞睫狀神經元的存活情況。
圖21為E10雞胚後根神經節(DRG)的外植體培養物(A，B)和離體的E8雞胚睫狀神經節(CG)的富含神經元的培養物(C，D，E)的顯微照相。A、B是對照(A)和CNTF處理的(B;5ng/ml)DRG外植體在培養48小時後的暗視野顯微照相。C，D，E是對照(C)、CNTF處理過的(D，100pg/ml;E，5ng/ml)睫狀神經節神經元的離體培養物的相襯顯微照相，標尺＝400μm(A，B)和50μm(C，D，E)。
圖22為CNTF蛋白質的線狀序列。圖中顯示了人(hu)、鼠(rt)以及兔(rb)的CNTF的胺基酸順序，在右邊表示編碼這些分子的表達載體。在組(A)中，點(·)表示與野生型的人CNTF順序相同的殘基。在組(B)中，點(·)表示與相同物種的野生型順序相同的殘基。與野生型不同的殘基以大寫字母表示，融合成為外源肽的部分的額外殘基用小寫的斜體字表示。
圖23表示培養六天以後的腹脊髓細胞的相襯顯微照相。以密度為0.5×106個細胞/35mm培養皿培養細胞，並保持在F12MEMHS5FCS5·20×中。
圖24表示在腹脊髓神經元培養物中神經纖絲(NF)的水平。在平板培養的當天，用CNTF(10ng/ml)或NGF(50ng/ml)處理培養物，然後在第7天分析NF的水平，用NF-抗體(RT97)檢測NF蛋白質，用OPD作底物觀測反應產物，並在490nm，n＝3測定OD(mean±SEM)的值。
圖25表示CNTF對含Ach E神經元存活的作用，使腹脊髓神經元在培養物中生長7天，然後處理、分析Ach E組織化學性。在32×鏡下對染色的細胞計數，表示為每35mm培養皿中的總數，n＝3。
圖26中A.表示在腹脊髓培養物中生長因子對乙醯膽鹼轉移酶(CAT)活性的影響。在培養物平板培養的當天，用FGF(50ng/ml)、CNTF(10ng/ml)、NGF(50ng/ml)或PBS/BSA(0.5mg/ml)處理。然後在第七天進行收集並測試CAT水平。CAT用CPM/35mm培養皿(平均SEM)表示，n＝3。B.為CNTF劑量增加時對CAT活性的影響，在平板培養的當天，用不同劑量的CNTF(ng/ml)處理腹角質細胞。在第7天，收集該培養物並測定CAT活性(以pmole/小時/35mm培養皿表示，平均值±SEM)，各劑量n＝3。
圖27表示後期加入CNTF對CAT活性的影響。分別在第0，2或6天將CNTF10ng/ml加入培養物中，並分別於第7，9和13天收穫細胞以測定CAT活性。CAT用CPM/μg蛋白質/35mm培養皿(平均±SEM)表示，n＝3。
圖28表示CNTF(10ng/ml)對減少了神經膠質的腹脊髓培養物中CAT活性的影響。在第2天將AraC(0.5μM)加入培養物中，在第7天收穫細胞並分析CAT活性(以CPM/35mm培養皿表示，平均值±SEM)，n＝3。
圖29表示CNTF(10ng/ml)和NGF(50ng/ml)對甲泛影醯胺(metrizamide)梯度純化的腹脊髓神經元的CAT活性的影響。CAT(平均±SEM)以pmole/小時/16mm、孔表示，n＝3。
圖30表示在CNTF處理過的海馬狀突起培養物中吸收的高親和GABA隨時間而增加的過程。海馬狀突起神經元在培養基中生長，在存在或缺少CNTF(10mg/ml)的情況下保持不同時間期間，然後測定吸收的GABA(A)，並測定神經絲蛋白質的含量(B)。結果表示與未經處理的對照培養物相比，經處理的培養物中活性百分數。
圖31為海馬神經元對CNTF的劑量響應曲線。在含有或不含有不同濃度CNTF(0.001～10ng/ml)的情況下，培養海馬狀突起神經元8天，在培養期末，測定高親和GABA的吸收(A)，神經絲蛋白質含量(B)，以及GAD酶活性(C)。
圖32為CNTF對NSE-，GAD-和Calbindin-陽性細胞數目的影響。在含有或不含有CNTF(10ng/ml)的培養基中培養海馬狀突起神經元8天，對NSE、GAD和Calbindin進行免疫染色如在A和B中所示。
圖33CNTF對GABA-、AchE-免疫陽性神經元數目的劑量依賴性響應。在含有不同濃度的CNTF(0.001～10ng/ml)培養基中生長海馬狀突起神經元，對GABA和AchE進行免疫染色，如A和B所示。
圖34表示延緩加入CNTF對CNTF誘導的高親和GABA吸收量增加的影響。A.將海馬狀突起細胞放入培養物中後延遲0、1、2、3或4天加入CNTF(10ng/ml)。在培養的第8天檢測所吸收的高親和性GABA。B.延後0或3天，將CNTF(10ng/ml)加入到海馬狀突起細胞培養物中，在培養的第11天檢測所吸收的高親和性GABA。
圖35為延後加入CNTF對CNTF誘導的神經絲蛋白質水平增加的影響。A.在將海馬狀突起細胞放入培養物中後的不同時間(0、1、2或3天)內加入CNTF(10ng/ml)，在第8天檢測神經絲蛋白質水平。B.延後0或3天，將CNTF(10ng/ml)加到海馬細胞培養物中，在第11天測定神經絲蛋白質水平。
圖36表示在富含神經元的培養物中CNTF的影響。使海馬狀突起培養物在含有或不含有不同濃度的CNTF(0.001-10ng/ml)中生長8天，在海馬狀突起培養物中加入阿拉伯糖胞苷(0.3μM)24小時以減少神經膠質量。在第8天測定培養物所吸收的高親和性Gaba。
圖37表示CNTF誘導的GABA吸收增加以及神經絲蛋白質水平的增加與密度的依賴關係。海馬狀細胞以71400細胞/cm2濃度平板培養。該細胞在含有或不含有CNTF(10ng/ml)的培養基中生長8天後測定所吸收的GABA(A)以及神經絲蛋白質水平(B)。
圖38表示CNTF對海馬狀突起培養物中穀氨酸誘導的毒性的保護作用。海馬狀突起神經元在含有或不含CNTF(10ng/ml)的培養基中生長7天，加入各種濃度(100-1000μM)的穀氨酸15分鐘後，將該細胞在無穀氨酸和CNTF的培養基中生長20小時。基於活細胞可使MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)轉變為紫色產物的MTT分析法，檢測培養期末存活的細胞。加入的MTT染料的最終濃度為0.5mg/ml，活細胞所攝取的染料可通過加入在異丙醇中的0.08N HCl以後5小時，使其溶解，然後測定O、D(570-650nm)。
圖39表示鼠CNTF濃度增加對鼠海馬狀星形膠質細胞有絲分裂的影響。將星形膠質細胞在指定濃度的CNTF中培養24小時，在培養的最後2小時用3H-胸腺嘧啶(1mc/孔/150μl)標記。
圖40表示CNTF的雙抗體夾心試驗。
用50μl/孔的4μg/ml的山羊抗鼠IgG 2b(GaM-IgG2b，Caltag)覆蓋ELISA(酶聯免疫吸附試驗)標板(Falcon 3915 Probind)。將酶標板在4℃保溫過夜，衝洗，並用50mM碳酸氫鹽緩衝液(PH為9.6)，在室溫下阻止2小時，衝洗後加入50μl/孔的捕獲抗體RP3-12(雜交瘤培養物上清液的1∶5稀釋液)，並在室溫下保溫1小時，衝洗後再加入系列稀釋(10ng/ml-7pg/ml)的標準人CNTF或加入一系列測試樣品的稀釋液，在室溫下保持1小時，接著衝洗，加入50μl/孔的顯示抗體RP12-2(培養物上清液的1∶5稀釋液)，在室溫下保溫1小時，衝洗後每孔加入50μl的鹼性磷酸酶標記的山羊抗鼠IgG1(GaMIgG1，Galtag)試劑的1∶1000稀釋液。將酶標板在室溫下保溫1小時，接著衝洗，用pNPP顯色，並在ELISA讀數計(Molecular Devices Thermo Max)中記錄405nM處的值。
圖41表示雙抗體夾心分析人CNTF的結果。在圖40所述反應中，用單克隆抗體RP3-12和RP12-2分析重組人CNTF的增加量。
圖42用若丹明異硫氰酸酯反標記雞胚脊髓運動神經元。培養5小時後的細胞用4%的甲醛固定。(A)為相襯照片;(B)為同一視野的螢光照片，標尺＝25μm。注意，右方較小的細胞沒有標記。
圖43為在存在(閉環)或不存在(開環)重組鼠CNTF(5ng/ml)時，雞胚脊髓運動神經元存活的時間曲線。
圖44為在不含(A)或含有(B)1ng/ml重組鼠CNTF的培養基中，生長6天的雞胚脊髓運動神經元。標尺＝100μm。
圖45中(A)為培養基中重組鼠CNTF處理的雞胚脊髓運動神經元的存活活性以及對CNTF(B)和FGFS(C)的濃度效應曲線。存活活性在培養3天後測定。在B中，為避免由於肝素過多而引起細胞分離，只在開始24小時加入肝素(1μg/ml)，而酸性FGF在生長的3天中存在。
本發明涉及編碼睫狀神經營養性因子(CNTF)的核酸順序以及CNTF蛋白質、多肽片段及其產生的大量衍生物。此外，本發明還涉及藥物組合物和睫狀神經營養性因子在治療和診斷中的應用。
為便於清楚敘述起見(但不是想限制本發明)，將本發明分成如下八部分加以說明(ⅰ)CNTF的純化(ⅱ)CNTF的生物檢定(ⅲ)CNTF的序列分析(ⅳ)編碼CNTF的DNA的克隆(ⅴ)CNTF基因的表達(ⅵ)CNTF基因和蛋白質
(ⅶ)抗CNTF抗體的產生(ⅷ)本發明的應用(ⅰ)睫狀神經營養性因子的純化用現有技術中公知的方法可以任何合適的源包括(但不限於)小雞胚眼、坐骨神經和心肌中純化CNTF。
例如(但不是為了加以限制)，按Barbin等人(1984，J.Neurochem.431468-1478，已全文列入本文參考文獻)所述方法，從雞胚眼中製備CNTF。簡單地說，按Manthorpe等人(1980，J.Neurochem.3469-75)所述方法，從15天雞胚眼中解剖得到脈絡膜，虹膜睫狀體和粘附色素上皮(統稱為CIPE)，並將它收集在平衡用的鹽溶液中。最好，從大約300隻胚眼中得到提取液，用聚四氟乙烯玻璃勻漿器，使該提取液勻混在約76ml的冷水中，在約4℃，在105×g離心1小時。然後收集上清液，配製在PH為7的NaH2PO4中，濃度為0.01M，再加到離子交換柱(即用磷酸鹽緩衝液中平衡過的Whatman DE52纖維素)中。分別用含有20ml濃度為0.07、0.25和0.5M NaCl的磷酸鹽緩衝液，以大約30ml/小時的流速洗該柱。再將0.25M的NaCl洗出液通過超濾〔例如，用50ml Amicon細胞和PM10(10000dalton cutoff)超濾膜〕濃縮到約2ml體積。收集剩餘物，與二份0.5ml含0.25M NaCl緩衝液的細胞洗出液混合，再濃縮到0.4ml(例如用3ml Amicon cell和PM10濾膜)。使已純化的提取液在蔗糖梯度溶液中分層(例如，200μl提取液加在4.6ml5-20%線性蔗糖梯度溶液中)，然後離心(例如，用SW65轉頭，以65000rpm的轉速，在4℃離心15小時)。在5個管中收集4.8ml的梯度溶液;管1為2ml，管2為0.3ml，管3為1.2ml，管4為0.3ml，管5為1.0ml。將管3的溶液配製在Triton X-100中，得到濃度為0.1%，然後用上述的超濾方法濃縮到0.2ml。
用15%解析平板和4.5%堆積平板SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行分析凝膠電泳，分析已純化的CNTF。電泳已純化的CNTF或分子量標準物，而將凝膠切出，並進行如下處理在將凝膠浸泡在0.25M KCl的過程中，通過沉澱與蛋白質結合的SDS觀測沒有固著的多肽，記錄標準分子量和CNTF帶的位置。然後使帶固定，用考馬斯亮蘭染色。將其它帶切成薄片，用Triton X-100保溫洗提，然後測定洗出物的CNTF活性。
用純化雞眼CNTF(上文所述)的相同方法(DEAE離子交換層析，蔗糖密度梯度離心和製備SDS-PAGE)分離坐骨神經提取物，所不同的是，最好對上述方法作如下三點變更(1)將神經提取物裝入DEAE離子交換柱以後，直接用0.15M NaCl分批洗脫交換柱(而不是用0.07M NaCl衝洗和用0.25M NaCl洗脫);(ⅱ)從製備SDS凝膠的24kd區(而不是20kd區)切出薄切片;(ⅲ)通過將各凝膠薄片混勻在0.1% Triton X-100去汙劑中，再在4℃保溫過夜(而不是通過尿素凝膠電泳洗提過夜)而洗提CNTF活性。然後在4℃，用100μl Extractagel(Pierce chemicals Rockford IL)串珠的懸浮液與上清液一起保溫2小時以除去Triton X-100去汙劑，然後按現有技術中任何公知方法測定蛋白質的濃度。
優選的是，將上述方法再作如下修改從製備的SDS-PAGE凝膠上洗脫出以後，用FPLC或HPLC柱(在惰性柱內含有生物適合流動性體系)通過反相色譜分析，將CNTF純化到同質和移走SDS;在一個最佳實施方案中，FPLC柱是一個Bakerbond Gold C4Widepore柱(填有金的7.75mm×10cm柱，能在含水流動相中以1.0ml/分流速，在反壓為200-250磅/英寸2的條件下操作)用0-60%乙腈梯度溶液洗脫。可觀測到在50-55%乙腈中CNTF以單峰洗出(見下文第6部分)。用高速真空方法(用惰性氣體如氬氣將空氣徹底除去)濃縮含有CNTF的單峰洗出液。該惰性氣體對防止由於一種或多種蛋氨酸殘餘物氧化而引起CNTF活性損失是極為重要的。當CNTF不再在溶液中時，它顯然最不容易氧化。
而且，按Watters和Hendry所述方法(1987，J.Neurochem.49705-713，已全文列入本文參考文獻中)用肝素親和層析法可從心組織中製備睫狀神經元存活促進活性物。
(ⅱ)睫狀神經營養性因子的生物檢測用現有技術中公知的CNTF敏感的體內或體外試驗體系可測定睫狀神經營養性因子的活性。例如(但不限於)已研製的體外檢測體系，通過測定單層培養物中E8雞胚睫狀神經節(CG)神經元生存24小時的數目，從而測定CNTF活性。
例如，從E8雞胚中收集睫狀神經節，使其解離(每個神經節約產生20000個細胞)，然後按Varon等人所述方法(1979，Brain Res.17329-45)用含20%馬血清的HEBM介質稀釋。再將含1000個神經元(2000個細胞的)大約50μl的細胞懸浮液接種在微滴板培養皿中，加入預定的CNTF活性物。然後將培養平板在5%CO2，37℃時保溫24小時，加入200μl溶於HEBM介質中的2%戊二醛以使該培養物固定，再在相襯顯微鏡下用肉眼直接計數以確定存活的神經元數目。
(ⅲ)睫狀神經營養性因子蛋白質的序列CNTF蛋白質可直接進行序列分析，或先用蛋白酶或現有技術中公知的其它化合物，包括(但不限於)金黃色葡萄球菌V8，胰蛋白酶和溴化氰使其分裂。按Hewick等人(1981，J.Biol.Chem.2567990-7997和Hunkapillar等人(1983，Methods Enzy mol.91399-417)的方法，在氣相微序列分析儀上通過自動埃德曼降解對多肽進行序列分析。再按Lottspeich(1985，Chromatography 326321-327)方法進行乙內醯苯硫脲胺基酸的檢測。測定重疊片段的胺基酸順序，並用以推導出更長的連續延伸順序。
(ⅳ)編碼睫狀神經營養性因子的DNA的克隆從鼠坐骨神經中純化出能進行微序列分析的合適量的CNTF蛋白質以能進行CNTF CDNA的克隆。用來進行這種克隆的經典方法是根據已知胺基酸順序的片段，生產一個互補的寡聚核苷酸探針，用該探針篩選由假定能合成編碼CNTF的mRNA的組織產生的cDNA文庫，但是由於mRNA量相對比較低，這種方法存在問題，因為用微序列分析(圖1)測定CNTF多肽的實際順序(圖1)需要在低核苷酸探針中，在各種情況下均有不良的高度簡併性，以便為特殊的胺基酸殘基提供所有可能選擇的密碼子。本發明通過cDNA的合成，為基因的克隆提供一對低核苷酸引物的衍生物，基於CNTF多肽的微序列分析，用這些引物去擴增CNTF編碼順序的片段，用第三個簡併低核苷酸確定擴增片段的同一性，測定該片段的精確核苷酸順序，合成並使用精確低核苷酸引物擴增剩餘的CNTF基因。在本發明方法中，最好的擴增方法是利用聚合酶連鎖反應(PCR)(Saiki et al.，1985，Science 2301350-1354)擴增組織核酸序列。優選方法的詳細說明如下首先將由純化CNTF蛋白質得到的胺基酸序列用於推斷在PCR中使用的低核苷酸引物。由於遺傳密碼的簡併性，數個三聯體可特異性地對應相同的胺基酸，合成數個低核苷酸用於給定的胺基酸順序，以便提供多種可能的核苷酸序列聯合體;所得到的低核苷酸被稱為簡併引物。
PCR需要有意義鏈及反意義鏈引物。因此，可用對應於CNTF胺基酸序列的一部分的簡併低核苷酸引物作一條DNA鏈(如有意義鏈)的引物。用對應CNTF胺基酸順序的第二部分的另一個簡併低核苷酸引物作第二條DNA鏈(如反意義鏈)的引物。
最好根據已知胺基酸順序的鄰近延伸方法來選擇這些引物。結果在PCR中使用這些引物而得到的相關DNA反應產物為預定大小〔即，產物的長度、鹼基對數目等於二個引物加三倍對應於二個引物的片段所束縛的蛋白質片段的胺基酸殘基數目的總長度〕。然後將這些引物用於具有假定含有CNTF編碼序列的核苷酸模板的PCR中。CNTF編碼序列是如，基因組DNA或最好從推斷能合成CNTF的組織或細胞中收集到的mRNA中製備的cDNA。然後通過電泳分析DNA反應產物以確定DNA反應產物的分子大小是否與預定值相同。用已標記的探針通過雜交進一步分析該DNA反應產物，該標記探針是由相應於PCR所用的二個引物部分之間的胺基酸順序的簡併低核苷酸製備的。將預定大小DNA反應產物的順序分析結果與確定的胺基酸順序相比以證實擴增的核酸順序事實上是編碼CNTF肽片段。雖然可用現有技術中公知的任何核酸順序分析方法，但是最好用二脫氧核苷酸鏈終止方法(Sanger等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723918-3921)。用凝膠純化的，最好用克隆的DNA反應產物進行順序分析，可將用於選擇限制性核酸內切酶的含已知靶順序的「尾」整合到用於PCR的每個低核苷酸的5′端，以利於DNA反應產物的克隆。
然後用DNA反應產物的順序設計對應於確切的編碼CNTF的順序的低核苷酸引物。再將該引物與PCR中的第二個引物一起用來擴增編碼CNTF的順序量使其超出最初測定的精確順序的片段。例如(但不限於)，用「cDNA端的快速擴增」(RACE)(M.A.Frohman，M.K.Dush，G.R.Martin，1988，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.858998-9002)方法將已知確切的順序區域內多個片段分別克隆到cDNA分子的5′和3′端。因此，為得到擴增到3′端的克隆，使有意義鏈引物對應於確切的CNTF核苷酸順序，而反義鏈引物同源於所要分析的序列片段下遊存在的已知順序片段，例如，mRNA的3′多聚腺苷尾，用於cDNA的逆轉錄中;在此情況下，該引物包括低聚-dT延伸區。必須用類似的方法重新得到所要分析的序列;例如，反義鏈引物對應於確切的CNTF核苷酸順序，有義鏈引物同源於進行序列分析片段的上遊區域，例如，用末端脫氧核苷酸轉移酶在cDNA的5′端加上5′多聚鳥苷尾部(在此情況下，該引物包括低聚-dC延伸段)。
然後對擴增的片段進行序列分析，或最好將該片段克隆，然後序列分析。在測定cDNA5′和3′端的確切低聚核苷酸以後，該確定的核苷酸用於PCR反應中以得到所插入的核酸的順序，然後克隆PCR反應產物。
用現有技術中公知的方法可克隆DNA反應產物。可用現有技術中公知的許多載體寄主體系。適用的載體包括(但不限於)Cosmid、質粒或經修飾的病毒，但該載體體系與所用寄主細胞必須是親和的。這些載體包括(但不限於)細菌噬菌體如入衍生物，或質粒如，PBR322，PUC，或BLUESCRIPT(層聚基因)質粒衍生物，可通過轉化、轉染、感染、電擊穿等將重組分子引入寄主細胞中。
將CNTF基因插入克隆載體中，該載體可用於轉化、轉染、或感染合適的寄主細胞，從而產生許多該基因順序的拷貝。這可通過將DNA片段連接到具有互補粘性末端的克隆載體而實現。但是，若克隆載體中不存在DNA片段上含有的互補限制性位點，則可用酶修飾該DNA分子的末端。結果證明，在用於聚合酶鏈反應的低聚核苷酸引物中摻入限制性核酸內切酶切割位點有利於插入載體。另一方面，在DNA末端連接核苷酸順序(連接物)，可得到所要的任何位點。這些接入的連接物含有特定化學合成的編碼限制性核酸內切酶識別順序的低聚核苷酸。在另一種方法中，用均聚嵌入部分修飾已切開的載體和CNTF基因。
在具體實施方案中，用摻入離體的CNTF基因、cDNA或合成的DNA順序的重組DNA分子轉化寄主細胞能產生基因的多個拷貝。因此，通過生長轉化體，從轉化體中分離重組DNA分子，若必要時，可從分離的重組DNA中重新得到插入的基因，從而可得到大量的基因。
按本發明的優選實施方案，一旦產生編碼CNTF的cDNA衍生的克隆，即可用現有技術中公知的一般方法分離編碼CNTF的基因組克隆。例如，從CNTF克隆中產生標記的核酸探針，並用Benton和Davis所述的(1977，Science 196180)關於細菌噬菌體文庫的方法以及Grunstein和Hogness(1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723961-3965)關於質粒文庫的方法通過核酸雜交，用該探針篩選基因組DNA庫。然後按現有技術中眾所周知的方法用限制性片段圖譜和順序分析技術對重新得到的克隆進行分析。
此外，用本發明得到的序列可從cDNA庫中鑑定其它的cDNA克隆。
(ⅴ)睫狀神經營養性因子基因的表達編碼CNTF蛋白質的核苷酸順序或其一部分可插入合適的表達載體中，該載體含有該插入的編碼蛋白質的順序的轉錄和轉譯所用的必要要素。必要的轉錄和轉譯信號也能由天然的CNTF基因和/或它的側面區域供給。許多寄主-載體系統均可用來表達該蛋白質編碼序列。這些體系包括(但不限於)用病毒(如牛痘病毒，腺病毒等)感染的哺乳動物細胞體系;用病毒(如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞體系;微生物如，含酵母載體的酵母，或用噬菌體DNA、質粒DNA或Cosmid DNA轉化的細菌。這些載體的表達要素其強度和特徵會發生變化，這取決於所用的寄主-載體體系，可用許多合適轉錄和轉譯要素之任一種。
上述將DNA片段插入載體的方法可用於構建含嵌合基因的表達載體，該嵌合基因由合適的轉錄/轉譯控制信號和蛋白質編碼順序組成。這些方法包括體外重組DNA和合成技術以及體內重組(遺傳重組)。編碼CNTF蛋白質或肽片段的核酸順序的表達可通過第二個核酸順序加以調節以使CNTF蛋白質或肽在用重組DNA分子轉化的寄主中表達。例如，用現有技術中已知的啟動子/加強子控制CNTF的表達。能用於控制CNTF表達的啟動子包括(但不限於)SV40早期啟動子區域(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290304-310)，勞氏肉瘤病毒3′長末端重複區域所含的啟動子(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22787-797)，皰疹胸苷激酶啟動子(wagner et.al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78144-1445)，金屬硫堇基因的調節順序(Brinster et al.，1982，Nature 29639-42);原核表達載體如，B-乳胺酶(Lactamase)啟動子(villa-Kamaroff，et.al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)，或tac啟動子(DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)，還可參見「得自重組細菌的有用蛋白質」(in Scientific American，1980，24274-94);含有咽脂鹼(nopaline)合成酶啟動子區的植物表達載體(Herrera-Estrella et al.，Nature 303209-213)或花椰菜嵌合病毒35SRNA啟動子(Gardner，et al.，1981，Nucl.Acids.Res.92871)，以及用於光合酶核酮糖二磷酸鹽羧基酶的啟動子(Herrera-Estrella et al.，1984，Nature 310115-120);來自酵母或其它真菌的啟動子元素如Gal 4啟動子，ADC(乙醇脫氫酶)啟動子，PGK(磷酸甘油激酶)啟動子，鹼性磷酸酶啟動子和下列動物轉錄控制區，該控制區具有組織特性，已用於轉基因的動物彈性蛋白酶Ⅰ基因控制區，它在胰腺的腺泡細胞中有活性(Swift et al.，1984，Cell 38639-646;ornitz et al.，1986，Cold spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409;MacDonald，1987，Hepatology 7425-515);胰島素基因控制區，它在胰腺的β細胞中有活性(Hanahan，1985，Nature 315115-122)，免疫球蛋白基因控制區，它在淋巴樣細胞中有活性(Grosschedl et al.，1984，Cell 38647-658;Adames et al.，1985，Nature 318533-538;Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)，鼠乳房腫瘤病毒控制區，它在睪丸、胸、淋巴和肥大細胞中有活性(Leder et al.，1986，Cell 45485-495)，白蛋白基因控制區，它在肝中有活性(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1268-276)，α-胎蛋白基因控制區，它在肝中有活性(Krumlauf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648;Hammer et al.，1987，Science 23553-58);α1-抗胰蛋白酶基因控制區，它在肝中有活性(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1161-171)，β-球蛋白基因控制區，它在髓樣細胞中有活性(Mogram et al.，1985，Nature 315338-340;Kollias et al.，1986，Cell 4689-94);髓磷脂鹼性蛋白質基因控制區，它在腦中的少突神經膠質細胞中有活性(Readhead et al.，1987，Cell 48703-712)，肌球蛋白輕鏈2-基因控制區，它在骨骼肌中有活性(Sani，1985，Nature 314283-286)，以及促性腺釋放激素基因控制區，它在丘腦下部中有活性(Mason et al.，1986，Science 2341372-1378)。
用下列三種一般的方法可鑑定含CNTF基因插入物的表達載體(a)DNA-DNA雜交，(b)存在或缺少「標記」基因功能，(c)插入順序的表達。在第一種方法中，用含有與插入的CNTF基因同源順序的探針，通過DNA-DNA雜交檢測在表達載體中存在的外源基因插入。在第二種方法中，根據某種「標記」基因功能(例如，胸苷激酶活性，抗菌素抗性，轉化表型，在杆狀病毒中形成吸留體等)的存在或缺少，可鑑定和篩選重組載體/寄主體系，該功能是由於在載體中插入外源基因而產生的。例如，若在載體的標記基因順序內插入CNTF基因，通過標記基因功能的缺少，可鑑定含CNTF插入物的重組體。在第三種方法中，通過分析重組體表達的外源基因產物可鑑定重組表達載體。這類分析是基於如上文(ⅱ部分)所述的在生物檢定體系中CNTF基因產物的物理或功能性質。
在鑑定和分離特定的重組DNA分子以後，可用現有技術中公知的一些方法使其繁殖。一旦確定了合適的寄主體系和生長條件，就能大量繁殖和製備重組表達載體。如上所述，所用的表達載體包括(但不限於)下列載體或其衍生物人或動物病毒如牛痘病毒或腺病毒;昆蟲病毒如杆狀病毒;酵母載體;噬菌體載體(如，lambda)，質粒和粘粒(Cosmid)DNA載體，僅列舉這幾種。
此外，選擇寄主細胞菌株，以調節插入順序的表達，或修飾和加工處理基因產物以達到所要的特定形式。在存在某種誘導物的情況下可提高某些啟動子的表達;這樣可控制遺傳工程CNTF蛋白質的表達。而且，對於轉譯和轉譯後蛋白質的處理以及修飾(如糖基化作用，切割)不同寄主細胞具有其特徵和特異機制。選出合適的細胞系或寄主體系以確保表達出的外源蛋白質按所要的方式修飾和加工。例如，在細菌體系中表達能用於產生未糖基化的核心蛋白質產物。
在酵母中的表達將產生糖基化產物。在哺乳動物細胞中表達能用於確保異源CNTF蛋白質的「自然」糖基化。而且，不同載體/寄主的表達體系影響加工處理反應，如不同程度的蛋白水解分裂。
在本發明的具體實施方案中，使編碼CNTF的DNA克隆到pCMV質粒，擴增，並用DEAE-葡聚糖方法使其用於轉化Hela細胞;然後從細胞提取物中收集CNTF活性物(參見下文第6部分的實施例)。
在本發明另一個特定實施方案中，使編碼CNTF的DNA整合到合適表達載體中，並用於轉化大腸桿菌(E.coli)，得到生物活性CNTF(參見下文第7部分的實施例)。
在本發明的特殊實施方案中，在大腸桿菌中CNTF的表達最好用含有下列之一的載體進行一個lac UV5啟動子，它能用乳糖操縱子阻遏物控制;強核蛋白體結合位點如，噬菌體T7的核蛋白體結合位點;在質粒複製控制區中突變，它可增加複製拷貝數;或限制抗菌素抗性蛋白質表達的突變。在本發明優選的具體實施方案中，用載體pRPN12進行CNTF的表達，結果相對於其它載體來說，CNTF的表達可增加30-50倍(下文第12部分)。在本發明另一個優選實施方案中，表達載體pRPN38可用於在大腸桿菌中生產CNTF。在本發明的另一個優選實施方案中，用載體pRPN40可在大腸桿菌中表達人CNTF。本發明還提供了多種分子，該分子功能與質粒pRPN12、pRPN38、pRPN39和pPRN40相同，這些質粒含有相同的要素(啟動子、核旦白體結合位點等)，其產生相當水平的CNTF的表達。
表達基因產物的鑑定和純化在鑑定出表達CNTF基因的重組體以後，分析該基因產物。根據該產物的物理或功能性質來完成這種分析。
在鑑定CNTF蛋白質以後，則可用普通方法包括層析法(例如，離子交換，親和性，不同大小的柱的層析)、離心，溶解度差異測定，或用於純化蛋白質的其它一般方法使其分離和純化。用對已知的CNTF的分析包括(但不限於)雞胚睫狀節神經元試樣可估測其功能性質。
值得注意的是，由於存在殘餘的SDS，從坐骨神經組織中製備CNTF所用的方法(因為它們包括作為最終步驟的製備凝膠電泳)所產生的CNTF不十分活潑。相反，本發明提供的純化CNTF的方法，所得到的CNTF具有最佳生物活性，它適用於用FPLC柱進行蛋白質順序分析;本發明還分離出由重組核酸分子或化學合成中產生的重組CNTF，該分離物中無SDS且很活潑。
ⅵ睫狀神經營養性因子基因和蛋白質用上述方法和下文實施例部分6和8，測定下列核酸順序，推導出相應胺基酸順序。測定鼠CNTF cDNA順序，如圖1所示。測定人基因組CNTF順序，如圖8所示。按本發明，這些順序的任一種或其功能等價物都可使用。此外，本發明涉及從豬、羊、牛、貓、鳥、馬或狗以及靈長類動物源或存在CNTF活性的任何其它物種中分離的CNTF基因和蛋白質。本發明還涉及至少含有10個核苷酸的CNTF核酸亞順序，這些亞順序含有CNTF順序的雜交部分，該部分已用於如核酸雜交分析，Southern和Northern印跡分析等。本發明還提供了具有圖1和8中所示的胺基酸順序的CNTF蛋白質、片段及其衍生物或它們的功能等價物。本發明還提供了含有抗原決定族或具有功能活性的CNTF蛋白質片段或衍生物。本文所用的功能活性意思是指在已知CNTF功能物如雞胚睫狀神經節分析中具有陽性活性。
例如，圖1和8中所示的核酸順序可通過取代、疊加或缺失而改變從而提供功能等價的分子。由於核苷酸編碼順序的簡併，在實施本發明時還可用圖1和8中所示的實質上編碼相同胺基酸順序的其它DNA順序。這些順序包括(但不限於)含有圖1和8中所示的所有或部分CNTF基因的核苷酸序列，這些基因可通過編碼順序內功能等價的胺基酸殘基的不同密碼子的取代而使其變化，結果產生靜止變化。而且，本發明的CNTF蛋白質或片段及其衍生物包括(但不限於)那些含有，作為原始胺基酸順序的基本上如圖1和7所示的所有或部分胺基酸順序，包括已用功能等價胺基酸殘基代替順序內殘基而發生靜止變化的已改變的順序。例如，順序內的一個或多個胺基酸殘基能用極性類似的起功能等價物作用的另一個胺基酸代替，結果發生靜止變化。用作替代順序內胺基酸的替代物選自屬於胺基酸類的其他成員。例如，非極性(疏水的)胺基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺。正電荷(鹼性的)胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。負電荷(酸性的)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。包括在本發明範圍內的還有轉譯過程或轉譯以後經特異性修飾的CNTF蛋白質或片段或其衍生物，這種修飾如通過糖基化作用、蛋白水解分裂，鍵合一個抗體分子或其它細胞配體等，下文第8部分舉例說明了在大腸桿菌中表達生物活性重組CNTF，從而表明非一糖基化CNTF具有生物活性。
此外，本發明編碼重組CNTF的核酸順序可被設計用於修飾處理或表達CNTF。例如(並不限於)，將信號順序插入CNTF編碼順序上遊，以便分泌CNTF，從而有利於收穫或生物利用。
另外，可在體外或體內使給定的CNTF突變以產生和/或破壞轉譯起始和/或終止順序，或使編碼區發生變化，和/或生成新的限制性核酸內切酶位點或使預先存在的位點破壞，以有利於在體外的進一步修飾。可用現有技術中公知的誘變技術，包括(但不限於)體外位點定向誘變(Hutchin Son，et al.，1978，J.Biol.Chem.2536551)，TAB銜接物(pharmacia)的使用等。
(ⅲ)抗睫狀神經營養性因子抗體的生產按本發明，可用CNTF蛋白質，或其片段或衍生物作免疫原生產抗一CNTF的抗體。用合成蛋白質的重組技術(基於本發明的CNTF核酸順序)。可提供比較大量的CNTF蛋白質產品，能解決CNTF量有限的問題。
為進一步提高產生抗-CNTF免疫應答的可能性，可分析CNTF的胺基酸順序以便鑑定與免疫原性增加有關的部分分子。例如，用計算機分析該胺基酸順序，以鑑定表面抗原決定基，如圖15(a)和(b)所示，分別得到鼠和人CNTF的親水性、表面特性、柔曲性、抗原性、兩性螺旋、兩性摺疊及＝級結構的由計算機產生的曲線圖譜。另外，比較由不同物種導引的CNTF胺基酸順序，鑑定相對的非同源區域;這些非同源區更可能是交叉各種物種的免疫源。
為製備直接抗CNTF的單克隆抗體，可用培養延伸的細胞系生產抗體分子的方法。例如，最初由Kohler and Milstein研製的雜交瘤技術(1975，Nature 256495-497)以及trioma技術，人β-細胞雜交瘤技術(Kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole et al.，1985，in「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，」Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)以及類似方法都屬於本發明範圍內。
治療中使用的單克隆抗體可以是人單克隆抗體或嵌合的人-鼠(或其它物種)的單克隆抗體。用現有技術中公知的許多方法可生產人單克隆抗體(如Teng et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.807308-7312;Kozbor et al.，1983，Immunology Today 472-79;Olsson et al.，1982，Meth.Enzymol.923-16)。可製備含鼠抗原結合區以及人不變區的嵌合抗體分子(Morrison et al.1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851，Takeda et al.，1985，Nature 314452)。
現有技術中公知的各種方法均能用於生產CNTF抗原決定基的多克隆抗體。為生產抗體，可通過注射CNTF蛋白質或片段或其衍生物，免疫接種各種寄主動物，這些寄主動物包括(但不限於)兔、小鼠、大鼠等。可根據寄主種類利用各種佐劑增加免疫應答。該佐劑包括(但不限於)弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂，普盧蘭尼克多羥基化合物，聚陰離子，多肽，油乳膠，鑰孔
屬血蘭蛋白，二硝基苯酚，可能用的有效的人佐劑如BCG(Bacille Calmette-Guerin)和棒狀桿菌。
用公知方法可製備CNTF抗原決定基抗體的分子克隆。重組DNA方法(參見，Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)可用於構建編碼單克隆抗體分子或其抗原結合區的核酸順序。
用公知技術，如免疫吸附或免疫親和層析，色譜法如HPLC(高效液相色譜)或聯合使用上述方法等可純化抗體分子。
用公知技術能生產含個體遺傳型分子的抗體片段。例如，這些片段包括(但不限於)用胃蛋白酶消化的抗體分子產生的F(ab′)2片段;通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵而產生的Fab′片段;用木瓜蛋白酶和一種還原劑處理該抗體而產生的2Fab和Fab片段。
實施例部分9敘述抗CNTF蛋白質的14個胺基酸肽片段的多克隆抗血清的製備。
實施例部分17敘述本發明提供的4個抗CNTF單克隆抗體，即RP3-12、RP12-1、RP12-2、和RP12-9。
(ⅷ)本發明的應用本發明涉及CNTF的核酸順序、基本上純的蛋白質、肽片段或由它們生產的衍生物。CNTF蛋白質、多肽和衍生物、抗CNTF的抗體、以及CNTF核酸探針均可用於診斷和治療用途中。對大多數情況而言，最好用來自相同種的CNTF基因或基因產物進行診斷或治療，雖然在本發明特定的實施方案中用了交叉種類的CNTF。
診斷用途本發明所涉及的編碼CNTF的核酸和蛋白質、肽片段或由它們產生的衍生物，以及直接抗CNTF蛋白質、多肽或衍生物的抗體均可用於診斷與CNTF表達方式變化有關的神經系統的疾病和錯亂。
在本發明的各種實施方案中，CNTF基因和相關的核酸順序和亞順序，包括互補順序可用於診斷雜交分析。CNTF核酸順序或其至少含有約10個核苷酸次級順序可用作雜交探針。雜交測定可用於檢測、預測、診斷或監控病狀、錯亂或與CNTF表達變化有關的疾病狀態，包括，特別是對CNTF反應的已知神經元造成損傷和變性的情況，例如副交感神經系神經元、膽鹼能神經元、脊髓神經元、成神經細胞瘤細胞及腎上腺髓質細胞。這些疾病和病狀包括(但不限於)CNS創傷、梗塞、感染、變性神經疾病、惡性腫瘤或手術後病變，包括(但不限於)早老性痴呆病、帕金森氏病、享特頓氏午蹈病和肌萎縮性脊髓側索硬化。例如可測定病人組織樣品中的總RNA以鑑定CNTF mRNA的存在，其中CNTF mRNA量的減少表示神經元變性。
在本發明的另一個實施方案中，抗CNTF蛋白質、肽片段或衍生物的抗體能用於診斷神經系統的疾病和錯亂，包括，特別是，神經元種群和臨床病症及上文所述的那些疾病。本發明的抗CNTF蛋白質的抗體能用於例如，需要進行測定的病人組織切片或活體解剖的CNTF活性的免疫組織化學鑑定。在另一個實施例中，本發明的抗體能用於ELISA方法中以檢測和/或測定在組織或液體樣品中存在的CNTF量;同樣，本發明的抗體能用在Western印跡分析中以檢測和/或測定組織或液體樣品中存在的CNTF。在下文第11部分敘述了結合和免疫沉澱CNTF的本發明的一種抗體。
在本發明的另一個實施方案中，可用CNTF蛋白質、肽片段或衍生物診斷神經系統的疾病和錯亂。在一個具體實施方案(但不是為了加以限制)中，可用標記的CNTF蛋白質或肽片段鑑定表達CNTF受體的組織或細胞，以便鑑定CNTF受體表達的迷亂，從而鑑定與CNTF反應的組織或細胞中可能出現的反常。
本發明還提供了測定液體樣品中的CNTF量的免疫測定方法即雙抗體夾心分析法，該方法包括使第一個抗CNTF抗體與一個固體載體相結合，然後在允許第一個抗體結合到CNTF的條件下將結合的第一個抗體置於一種含有CNTF的溶液中，然後使與第一個抗體結合的CNTF與第二個抗CNTF的抗體接觸，這第二個抗體是對抗不同於第一個抗CNTF抗體的CNTF抗原決定基的，這是在允許CNTF與第二個抗體相結合的條件下進行，然後用現有技術中公知的技術檢測第二個抗體與CNTF的結合，包括(但不限於)結合有指示劑的抗免疫球蛋白抗體相結合的第二個抗體，該指示劑如螢光化合物或含放射性同位素的化合物，或一種酶，或在比色測定中能產生信號的物質。在本發明的優選實施方案中，單克隆抗體RP3-12和RP12-2能用於人CNTF的雙抗體夾心分析中(見下文第17部分)。該方法可作為靈敏測試方法以測定CNTF的水平，也可用於與CNTF表達異常有關的神經性錯亂的診斷。
治療診斷與本發明有關的編碼CNTF的核酸、蛋白質、肽片段、或由它們產生的衍生物，以及抗CNTF蛋白質、多肽或衍生物的抗體均可用於治療與CNTF表達方式改變有關的或對CNTF或抗CNTF抗體的加入有效的神經系統疾病和錯亂。
在本發明的各種實施方案中，可將CNTF蛋白質、肽片段或衍生物施藥給神經系統受到損傷的病人，這種損傷包括創傷、外科損傷、局部缺血、感染(例如骨髓灰質炎或A.I.D.S.)，代謝性疾病、營養缺乏、惡性腫瘤、有毒試劑或不知道病因的變性疾病。在本發明的各種特定實施方案中，將CNTF施用於已受損傷的脊髓神經元，例如，創傷、梗塞、感染、變性疾病或外科損傷;實施例10說明使用CNTF可促進脊髓神經元的生存。
本發明的CNTF核酸、肽和衍生物可用於治療運動神經元疾病。實施例11說明CNTF對促進離體的面神經中運動神經元的生存有明顯效果。因此，在本發明的特定實施方案中，CNTF或肽或其衍生物可用於治療面癱(貝耳氏麻卑)或其它麻卑(包括面神經麻卑)以及其它運動系統的疾病(運動神經元疾病)，包括(但不限於)肌萎縮脊髓側索硬化，進行性脊柱肌萎縮，進行性延髓的麻卑，初期側索硬化，以及脊柱肌萎縮(韋-霍二氏麻卑型病和Kugelberg-Welander病)和後-脊髓灰質炎綜合症。在肌萎縮脊髓側索硬化(ALS;Lou Gehrig′s病)，脊髓損傷和有關的疾病中，脊髓前側角中運動神經元變性和死亡是病理生理學過程的主要方面。下文第10和14部分的實驗結果表明，在這些疾病的治療中，可用CNTF延長其存活期並促進脊髓運動神經元中膽鹼能的表達。
此外，下文第18部分的實施例數據表明，含有鹼性成纖維細胞生長因子或最好是CNTF和鹼性成纖維細胞生長因子的harmaceutical組合物可用於促進運動神經元的生存並用於治療上述運動神經元疾病。
本發明還能用於例如，促進糖尿病性神經病(如單神經病加劇或陽萎)患者的康復。在本發明另一個實施方案中，可用CNTF蛋白質或肽片段或由它們產生的衍生物治療先天性或神經變性病症，包括(但不限於)早老痴呆病，衰老，外周神經病，帕金森疾病，Huntington′s午蹈病以及運動神經元疾病和錯亂;特別是，本發明能用於治療與膽鹼能神經元機能障礙有關的先天或神經變性病症。試驗表明，早老痴呆病包括在基前腦中膽鹼能神經元的選擇性損失，試驗表明，約35%的帕金森氏病患者患有早老痴呆型痴呆;按本發明生產的CNTF成為治療這類綜合病症的有效單一試劑。同樣，用本發明製得的CNTF可治療與Down′氏綜合症並發的早老痴呆。本發明製得的CNTF還可用於治療各種痴呆以及先天性學習障礙。
如下文第15和16部分實施例所述，已測得CNTF在海馬狀突起細胞中具有很高活性，包括GABA吸收增加，提高神經絲蛋白質和GAD酶的表達，GABAergic神經元的存活數增加，海馬狀突起神經元的存活數增加，海馬狀突起的星形膠質細胞存活數增加。因此，在本發明的各種實施方案中，CNTF可使這些活性在體外或體內的海馬狀突起細胞中產生影響，並用於治療海馬狀突起的各種神經病，包括(但不限於)早老痴呆病、梗塞和毒性損傷。
本發明的CNTF、CNTF肽、抗體或衍生物還可用於治療神經系統組織產生的腫瘤，包括成膠質細胞瘤和黑素瘤(由神經胚衍生的黑素細胞產生)。
最好使與CNTF有關的肽或CNTF蛋白質吸附在一種膜上(例如，矽橡膠膜，凝膠或能植入到受損神經附近的海綿狀物)，然後給藥。在本發明的特定實施方案中，在治療早老痴呆病，肌萎縮性脊髓側索硬化和其它運動神經元疾病(包括如，韋-霍二氏麻卑病)和帕金森氏病時，可將CNTF蛋白質、肽片段或衍生物與組織的外科移植或其它持續釋放組合物(包括微球、微膠囊或合成的植入物)一起給藥。
在本發明的另一個實施方案中，可將CNTF蛋白質、片段或衍生物與其它胞質分裂物一起使用以達到所要的神經營養效果。例如(但不限於)，按本發明，將CNTF與NGF一起使用以達到促進神經元生長和生存的效果。可以預見，CNTF與其它CNS-衍生的肽因子(尚未完全定性)對於中樞和外周神經元系統的神經元次級種群的wide array的生長、發育和生存具有協同作用。
根據CNTF分子的所有特性，還可預見，研製新型的CNTF的肽片段、衍生物或突變體可用作某些興奮劑或拮抗物或所有具有CNTF生物功能的製劑。
在本發明的另一個實施方案中，可將抗CNTF蛋白質、或肽片段或其衍生物的抗體施給患有各種神經性錯亂和疾病而需要進行治療的病人。例如，患有過多產生CNTF的病人需要進行這種治療。抗-CNTF的抗體能用於預防感覺神經元的異常再生(如手術後)或治療慢性病痛綜合症。
藥用組合物本發明的活性組合物含有所有或部分CNTF基因產物包括蛋白質、肽片段或由它們產生的衍生物，或直接抗CNTF蛋白質、肽片段或衍生物的抗體(或抗體片段)，或CNTF和第二種試劑的結合物，例如在無菌的合適的生物藥用載體，包括(但不限於)鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖和水中施用的NGF。
CNTF蛋白質、肽片段或衍生物含有實質上如圖1(鼠)或圖8(人順序)中所示的胺基酸順序或亞順序。CNTF可從相應於合適物種包括(但不限於)人、豬、鼠、雞、牛、狗、羊、山羊、貓、兔等的CNTF基因的順序中得到。
對治療特定病症或症狀有效的CNTF蛋白質、肽片段、衍生物或抗體的量取決於該病症或症狀的性質，且可用標準的臨床技術進行測定)。若可能的話，最好測定劑量-反應曲線，將本發明的藥物組合物在人體中試驗前，首先在如上述的CNTF生物檢定體系進行體外試驗，然後在有效的動物模擬體系中試驗。在本發明的特定實施方案中，根據體外試驗數據，能有效促進睫狀節神經元生存的藥物組合物能提供定於患處的CNTF蛋白質濃度約2μg/ml。在本發明的另一個特定實施方案中，能有效促進膽鹼能神經元生長和生存的藥物組合物所具有的定於患處的CNTF蛋白質濃度約為40營養單位/ml。
引入的方法包括(但不限於)皮內、肌肉、腹膜內、靜脈內、皮下、口內和鼻內引入。最好用合適的方法，包括心室內和鞘內注射將本發明的藥物組合物引入中樞神經系統;用心室內導管，例如，連接一個貯器(如ommaya貯器)可方便地進行心室內注射。
而且，最好將本發明的藥物組合物定位地施用到需要治療的區域;這可通過下列方法完成，例如(但不限於)在外科治療過程中通過輸液、注射、藉助導管或藉助一個植入物，所說植入物是有孔、無孔或膠質材料，包括膜，如sialastic膜或纖維。
本發明還提供藉助脂質體、微球、小膠囊而施用的含CNTF蛋白質、肽片段或衍生物的藥物組合物。在本發明的各種實施方案中，可用這些組合物有效地使CNTF和與CNTF有關的產物持續釋放。
可以預見，在需要增加或減少CNTF濃度的區域中引入產生CNTF，與CNTF有關的順序、CNTF拮抗物或CNTF-興奮劑，抗-CNTF的抗體的活性細胞是可能的。
用本發明分子探針鑑定新型的CNTF同源分子在不同物種和組織中已鑑定出具有類CNTF活性，但分子量與CNTF不同的分子，該組織包括雞胚眼、鼠坐骨神經、已損傷的腦組織、心細胞、成神經細胞瘤細胞上清液(Heymanns and Unsicker，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.847758-7762)和腎上腺髓質細胞(Unsicker et al.，1985，Neurosci.Lett.60127-132)。這些分子中有多少與本文所述的CNTF相同或不同還不知道。可能會發現CNTF的其他的來源和種類。本發明的重組DNA分子，抗本發明的CNTF蛋白質，或肽片段的抗體可用於表徵新型的CNTF同源分子。
例如(但不限於)，編碼CNTF的重組DNA分子可用作探針以鑑定與圖1和8中所示的CNTF分子同源但不相同的新型分子。這些同源分子可具有或不具有CNTF活性，它們由圖1和8所示的分子相關的相同或不同基因組順序產生。最好用圖1和8所示的部分編碼CNTF的順序作PCR反應中的低聚核苷酸引物，用得自能表達CNTF同系物的細胞的基因組DNA或RNA作模板來鑑定這些新型的分子。而且，可用抗-CNTF抗體沉澱多核蛋白體合成的CNTF同源蛋白質;然後用本發明的低聚核苷酸引物對收集到的RNA進行PCR擴增。用這種技術，可鑑定和克隆許多與CNTF有關的分子。
6.實施例鼠睫狀神經營養性因子(CNTF)的分子克隆表達和區域分布6.1材料和方法6.1.1 CNTF的純化和切割按上述方法(Saadat，et al.，1989，J.Cell Boil，1081807-1816)純化CNTF而且從製備聚丙烯醯胺凝膠中電泳洗提CNTF以後，將它加到7.75×100mm的Bakerbond Gold C4widepore柱上，用0.1%三氟乙酸和0-60%乙腈梯度溶液洗脫。在50-55%乙腈的一個峰中洗出具有生物活性的蛋白質。在4μg已純化的CNTF的2D-凝膠分析中，第一級包括等電點聚焦在PH為3.5-10.0的梯度，第二級由12%SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳組成，該分析顯示這種蛋白質以單點遷移(Saadat et al.，1989，J.Cell Biol.1081807-1816)(圖2)。同時進行沒有在Bakerbond Gold C4widepore柱中進行附加純化步驟的CNTF的2D-凝膠分析。
在高速真空器(其中的空氣已用氬氣趕出)中濃縮含有CNTF的單峰。已發現氬對防止由於一種或多種蛋氨酸殘基氧化而引起的CNTF活性損失極為重要。為進行BRCN分裂，將甲酸(最終濃度為70%V/V)和BRCN(10%V/V)加到30μg已純化的CNTF中。在室溫下放置3小時以後，加入500μl H2O，將該材料濃縮到50μl，立即加到Bakerbond Gold C4widepore柱中。為進行胰蛋白酶分裂，將30μg經色譜分析純化的CNTF乾燥，重新溶解在含10mM CaCl2和3μg經TPK處理的胰蛋白酶鈉(sigma)的50μl 0.1M TRIC/HCL(PH為8.0)中。在37℃保溫過夜。將所得到的片段裝在Bakerbond Gold C4widepore柱內，在相同情況下進行洗提(以1ml/分的流速，用0-60%乙腈梯度溶液洗60分鐘，在214nm處監測)。人工收集各峰。用自動運用的生物系統順序分析器測定該肽的胺基酸順序(Eckerskorn et al.，1988，Electrophoresis，9830-838)。
通過5μg CNTF的水解和用水合茚三酮衍生測定已純化的CNTF的胺基酸組成(Tsugita et al.，1987，Biochem.，1021593-1597)。
6.1.2.cDNA CNTF克隆的繁殖用低聚引物5(圖1c所示低聚核苷酸引物)和逆轉錄酶(Bethesda Research.Laboratories)由培養的鼠星形細胞的總RNA來合成CDNA(Okayama et al.，1987，Methods Enzymol.1543-29)。CDNA的第一條鏈作為使用PCR增殖CNTF特異片段的模板(Saiki et al.，1988，Science，239487-491)。克隆A是利用退化的引物-低聚物1和2繁殖的，該PCR產物是用低聚物11進行鑑定，之後亞克隆，再進行序列分析。按所描述的方法(Frohmann et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858998-9002)，這種部分克隆的序列可用於合成在cDNA末端擴增(RACE)中所用的引物3和4。將所得到的cDNAs亞克隆到Bluescript SK+載體，並進行序列分析(克隆B和C)。低聚核苷酸7是由基因組克隆順序產生的(Carroll unpublished results)。利用用於克隆C的相同的RACE步驟，將該引物用於產生克隆D。使用PCR的引物9和10，可獲得能在真核生物細胞中表達的完整長度的cDNA克隆(E)。
6.1.3.Northern吸印試驗分析採用胍硫氰酸鹽提取法從各種鼠組織中提取RNA(Chomczynski，P.and Sacchi，N.，1987，Anal.Biochem.，162156-159)。將等量的總RNA(30μg RNA，但肌肉的mRNA是50μg)乙醛酸化後，在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(Lindholm et al.，1988，Biol.Chem.26316348-16351)。為了測定鼠坐骨神經中CNTF mRNA的發育中的表達，按上文所述電泳由鼠坐骨神經得到的25μg總RNA;圖4(b)中的PO、P4和P13涉及的RNA分別來自新生的，4天的和13天的鼠坐骨神經。已知量的847bp CNTF轉錄物(使用ribo探針系統，PROMEGA體外合成的)分別在各泳道一起電泳，以便對樣品中的CNTF-mRNA定量。在電泳分析後，將RNA真空吸印到尼龍濾紙(Hybond-N，Amersham)，利用雙鏈32P標記的適於CNTF(600bp)編碼區的CDNA探針，將該濾紙在50℃的50%甲醯胺中雜交(Lindholm et al.，上文)，隨後洗滌濾紙，暴露於X射線膠片下60小時，之後攝取放射自顯影圖。
6.1.4.重組體CNTF的表達具有巨細胞-病毒-啟動子的表達載體(由David Russell提供)以兩個方向定向用於亞克隆完整長度的CNTF克隆。Hela細胞用於轉染，在這些細胞中能檢測，作為增進胚胎雞睫狀神經元存活活性的非基礎表達，利用DEAE-Dextran法在每一培養皿(100mm直徑)用10μg的載體轉染(spandidos，D.A.，and wilhie，N.M.，1984，Transcription and Translation-A Practical Approach，1-48)。培養48小時後移走上清液，細胞用冷PBS洗滌三次並於含30mM NaCl的5mM磷酸鹽緩衝液(PH7.0)中溶解，在溶胞蛋白超離心(100，000xg，30分鐘)後測定濃度並將不同濃度的上清液加到培養的E8-睫狀神經元中。培養24小時後，按前述(Hughes et al.，1988，Nature，33570-73)方法計算存活的神經元。圖3各點表示三次測量的平均值;橫線表示標準誤差。
6.2.結果6.2.1.CNTF胺基酸順序的測定按上文所述，從鼠坐骨神經中純化CNTF，為了定量胺基酸數目，生產溴化氰(BRCN)和胰蛋白酶片段(N-末端被阻斷)必須增加Bakerbond Gold純化步驟。由氣相-微序列分析測定的各種片段的胺基酸順序大於總序列的50%以上，該順序與根據CDNA推斷的順序相一致並且用示於圖1的核苷酸順序表示。純化的CNTF胺基酸組分示於圖1(d)。
6.2.2.CNTF CDNA克隆的產生和順序分析鼠腦星形細胞培養物用作分子克隆中RNA的來源;以前曾證明過這些細胞能產生大量的CNTF(Lillien et al.，1988，Neuron.1485-494)。在各種PCR步驟之後(使用按上文6.2.1.所述獲得的胺基酸順序資料產生的合成寡聚核苷酸作引物)，克隆A、B、C的核苷酸順序顯示有一個短的77bp的5′末轉譯區域和600bp的開放式閱讀框架，同時預測出帶有436bp的3′末轉譯區域的200個胺基酸長的蛋白質，它以多聚(A)尾結束(圖1)。一個框架內的轉譯起始位點定位於核苷酸順序位置的78-80位。定位於位置72-74的起始位點5′的終止密碼子和位置75和81的G′S，能滿足按照Kazak，M.J.所公開的(1989，J.Cell Biol.，108229-241)常規轉譯起始位點的要求。位置678-680的終止密碼子跟在編碼肽CB2順序後面。由微序列分析鑑定的最後胺基酸是高絲氨酸，表明根據核苷酸順序預測的甲硫氨酸已進行轉譯後修飾並代表C-末端。
雖然在預測的順序位置13和14上，二元(Arg-Arg)順序表示可能的轉譯後的裂解位點，針對該裂解位點而言，純化的CNTF的胺基酸組成(圖11d)中在N-末端區域內存在的胺基酸苯丙氨酸、精氨酸和氨基丙酸相對於該區域不存在的其它胺基酸來說(如異亮氨酸)，並沒有被還原。然而，予測的200個胺基酸順序的MW(22.8KD)與PAGE分析所確定的值(22.5KD)完全吻合(Saadat et al.，上文)。因此，CNTF的胺基酸順序表明胞液蛋白的特性，即無信號肽，序列沒有糖基化和僅在17位上有一個半胱胺基酸殘基。已確定的CNTF順序與FIR和EMBL數據基底相比未顯示與任何其它已知蛋白具有意義的相似性。尤其是，不同源於神經生長因子(NGF)，由腦產生的神經營養因子(BDNF)、或成纖維細胞生長因子(FGF)和紅紫素，其中每一種都與類似於CNTF的存活活性有關(Unsicker et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，845459-5463;Schubert et al.，1986，J.Cell Biol.，1022295-2301)。
6.2.3.重組CNTF的表達CNTF是一種細胞質蛋白的可能性，通過觀察全長CDNA克隆在Hela細胞中表達而得到證實。該細胞能導致活性CNTF的表達但未釋放到培養基中(圖3)。因此，CNTF似乎是一種類似於對細胞起深遠影響的FGF和Interleukin-1(IL-1)分子，但是它們是胞液蛋白。對於FGF，還沒有建立釋放機制(Abraham et al.，1986，Science，233545-548)。相反，可證明IL-1是通過特異酶(轉化酶)切割後，藉助於非常規機制由受刺激的巨噬細胞釋放(Kostura et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，865227-5231)。尤其感興趣的是近來發現大分子可藉助載體將它從酵母胞液運輸出來，它與哺乳動物細胞中多藥物-抗性糖蛋白具結構同源性(Mc Grath and Varshasky，1989，Nature，340400-404)。這種糖蛋白能否在哺乳動物細胞中作為蛋白載體，有待於證實。
6.2.4.Northern印跡分析法在成年鼠組織中CNTF-mRNA的分布Northern印跡分析(圖4)揭示出一種大小為1.2kb的單一帶。這比坐骨神經Northern印跡中存在的信號強得多，而且在脊髓提取液中存在一個弱帶。然而，在肌肉和皮膚的mRNA中不存在可檢測的信號，即在50μg的總RNA中CNTF-mRNA＜2pg。肌肉和皮膚中的低水平CNTF-mRNA表明在坐骨神經中存在的大量的CNTF並不表示從周邊倒退地運送CNTF，正如NGF的情況，然而卻表示局部地合成CNTF。
此外，CNTF-mRNA表達的發育時間-途徑不同於NGF(Thoenen et al.，1987，Biochem.Pharmacol.，109145-178)。CNTF-mRNA在新生鼠的坐骨神經中是檢測不到的，只有4天後才變明顯(圖4(b))。CNTF-mRNA表達的發育時間-途徑表明產期中的神經元存活調節不涉及CNTF，因為靶-調節的神經元細胞的死亡早已超過CNTF合成開始增加的時間(Oppenheim，1986，J.Comp.Neurol，246281-286;Johnson et al.，1980，Science.210∶916-918)。
6.3討論上述純化CNTF的方法第一次提供生產適於進行胺基酸序列分析的CNTF的方法。缺少在Bakerbond Gold C4Widepore柱上純化的最後一步，許多汙染的肽存在於CNTF製劑中，如圖2(a)所示。然而，在Bakerbond Gold C4Widepore FPLC/HPLC柱上的純化後，用2D凝膠電泳法法鑑定只有一個斑點(圖2(b))，實際上證明是完全純化的。值得注意的是在發現Bakerbond Gold C4Widepore柱是有效的之前，許多利用HPLC柱純化CNTF計劃都沒有成功。可以假設金培養皿的惰性有利於CNTF的純化。
儘管CNTF活性開始時定性為雞睫狀神經元體外存活因子(Adler et al.，1979，Science，2041434-15362)，然而最近，已證明由雞或鼠組織產生的描述為CNTF的活性物能增進各種其它神經元細胞型的存活(Barbin et al.，1984，J.Neurochem.，431468-1478;Manthorpe et al.，1986，Brain Res.，367282-286)，且也已證明通過阻斷其複製和通過誘導腸血管(Vasointestinal)肽(VIP)免疫活性和膽鹼乙醯轉移酶(CHAT)活性(Ernsberger et al.，1989，Neuron 21275-1284)以及新生鼠的交感鏈神經節神經元(Saadat et al.，1989，J.Cell Biol.1081807-1816)，鼠坐骨神經CNTF能影響E7雞交感神經元的分化。然而，純化的鼠坐骨神經CNTF能增進2型-星形細胞兩性潛在02A祖先細胞體外分化(Hughes 1988，Nature 33570-73)。為了有助於確定CNTF在體內是否具有這些功能，必須測定其一級結構、細胞表達、發育中的調節和定位。由CDNA推導的胺基酸順序和隨後的全長CDNA克隆在Hela-細胞中的表達證實CNTF是胞液蛋白。這個結果與其區域分布和其發育中的表達一起表明CNTF不可能是靶-產生的神經營養因子。因此，CNTF只有在通過細胞損傷或按已知機制釋放後變成有效之後，才能顯示神經營養和分化的性質。
總之，由於缺乏已知基本的釋放機制，以及在發育過程中其表達的時間-途徑以及其區域分布不同，CNTF不同於已知的神經營養因子NGF和BDNF。很有可能CNTF具有作為分化因子的生理作用，它的神經營養功能可能只有在病理生理學條件下而不是在胚胎的發育過程中起作用。
7.例CNTF在大腸桿菌中的表達7.1.材料和方法7.1.1.CNTF表達載體的構造利用與覆蓋基因5′終端的順序互補的合成的低聚脫氧核苷酸引物和與相對的DNA鏈上覆蓋基因3′終端的順序互補的第二引物，將鼠CNTF(rCNTF)基因插入表達載體pCP93，兩種引物均被設計成含有限制性酶BspMI的識別順序，其順序如下所示5′－CAGTTACCTGCGGGGATGGCTTTCGCAGAGCAAACAC－3′5′－CAGAGGTATGAGCAGGTGGCTACATCTGCTTATCTTT
GG－3′使用作為模板的pCMV-rCNTF-C-1 DNA和市售的試劑盒，在標準聚合酶鏈反應(PCR)中由這些引物產生幾微克的637bp片段，該片段在6%聚丙烯醯胺凝膠上電泳純化之後電洗脫。洗脫下來的片段再用BspMI消化，所得到的619bp片段用同樣的方法再次純化。利用Klenow DNA聚合酶，進行標準反應使伸出的BspMI末端變成平齊末端，然後將該片段連接到pCP93載體的唯一的SalI.限制性位點，該位點已通過標準反應用S1標準酶處理而成為平齊末端。
7.1.2.含CNTF表達載體的細菌鑑定用上述連接體DNA轉化感受態的E.Coli W3110iqF細胞，之後篩選質粒大小，隨後通過限制性分析而定性，用標準方法進行DNA序列分析(Panayotatos，N.，1987，In PlasmidsA practical Approach，Hardy，K.G.，ed.IRL Press.Oxford)。
7.2.結果和討論在這些質粒當中發現有一種質粒(pCP-rcNTF-C-1)質攜帶有以正確方向融合的完整rCNTF基因和載體的核蛋白體結合信號的轉譯閱讀框架。這種質粒的拷貝數高於親代三倍，原因在於載體DNA缺失1400bp。
E.Coli W3110iqF-/rCNTF-C-1細胞在有乳糖的液體培養基內培養(以便能進行rCNTF基因的活性轉錄和轉譯)，並且發現含有有效量的(2-5%的總細胞蛋白)生物活性rCNTF。這一點可通過8-25%梯度聚丙烯醯胺凝膠的電泳，隨後如圖4所示的考馬斯亮蘭著色得到證實。另外，蛋白提取物是由溶菌酶處理，隨後，進行三次冷凍和融化的循環而裂解的相同細胞製備的。採用這種方法由幾微升的培養液提取的蛋白，發現在體外24和48小時後能增進大於50%的E10鼠睫狀神經節神經元和大約30%的E8背根神經節神經元的存活和神經突派生。可看到低於1毫微克的rCNTF具最大活性。這樣的活性決不可能在由帶有不含rCNTF基因的質粒載體的同種寄主細胞製備的對照提取物中檢測到。
人CNTF順序，已設計成缺少內含子的順序，被插入pCP93載體並用於轉化感受態的E.Coli。已轉化的帶有重組人CNTF順序的細菌能表達合適分子量的人CNTF蛋白，還發現這些培養物的蛋白提取物在DRG試驗中具有CNTF活性。
8.例人CNTF基因的克隆8.1.材料和方法8.1.1.DNA.質粒和噬菌體載體人基因組DNA可從人胎盤DNA(Clontech)獲得。pBLUESCRIPT質粒載體可由Stratagene獲得。細菌噬菌體載體EMBL-3 SP6/T7可由Clontech獲得。
8.1.2.聚合酶鏈反應在按製造試劑盒(Perkins-Elmer/Cetus)所提出的標準條件下，循環40次完成PCR，每次循環包括在94℃下保溫1分鐘，或40°或50°下保溫2分鐘，或在72℃下保溫2分鐘。
8.2.結果和討論
8.2.1.人CNTF基因的存在證據在嚴格條件下，用EcoRI限制性核酸內切酶消化的人基因組DNA的Southern印跡雜交，表明大約10kb的單鏈DNA片段顯示出與鼠CNTF探針具有弱同源性(圖6，泳道6)。為了從分子水平上克隆推斷出的人CNTF基因，通過採用相應於鼠CNTF基因的準確順序的成對低聚核苷酸引物的聚合酶鏈反應(PCR)擴增這種基因的片段方面作了努力。為了使這種方法成功，需要鼠和人CNTF基因的兩個短片段，在DNA序列上相同或幾乎相同。
檢驗五對低核苷酸(每一對長17-21鹼基)在利用總人基因組DNA作模板的PCR中作為DNA片段擴增合成的引物的能力。所有5個低核苷酸對都是從鼠CNTF基因的第二個外顯子中選擇出來的。假設人CNTF基因具有與鼠基因相類似的內含子-外顯子結構。只有一對引物，定名為CNTF.10和CNTF.11，使人基因組DNA的一個DNA片段得到擴增，該片段與使用鼠DNA模板(270bp)和相同引物而獲得的片段大小(270bp)相同。通過較高(更嚴格)溫度(50℃)下發生DNA合成來完成PCR時，觀察到的放大程度更高而背景更小。CNTF.10和CNTF.11的順序如下CNTF.10(36-mer，胺基酸EADGMPA的反意義鏈;每一末端胺基酸2鹼基;以多克隆位點結尾)。
5′－CCAAGCTTCTAGAATTCGCAGGCATCCCATCAGCCT－3′CNTF.11(34-mera，對胺基酸EMTEAE有意義;末端aa2鹼基，最終A;低聚核苷酸5′端有多克隆位點)。
5′GACTCGAGTCGACATCGGAGATGACTGAGGCAGA－3′(相應於鼠CNTF的順序下邊加橫線;添加另外的核苷酸以便為隨後的克隆步驟提供多克隆位點)。
通過在2%的瓊脂糖凝膠(低熔點;NuSieve)上的電泳分離出PCR反應的產物。接近270bp的陽性譜帶切去後，用相同引物對通過PCR循環35次(93℃30秒，50℃1分鐘，72℃1分鐘)重複放大。再放大的DNA片段用2%瓊脂糖電泳再次純化，並且在使用市售得到的試劑盒(由IBI得到的「FASTaq」kit)，採用二脫氧核苷酸鏈終止法進行的DNA序列分析中作為模板。用於序列分析的引物是CNTF.10和CNTF.11，以及兩種根據由末端引物獲得的初順序資料而選擇的內引物。人DNA擴增片段的完整順序如圖6。所述順序包括一個與鼠CNTF非常相似但又不相同的多肽片段的開放閱讀框架。
8.2.2.由PCR放大的人CNTF基因片段的克隆通過用EcoRI和Xhol切割(並且與用相同2種酶切割的載體DNA連接)。而將放大的人CNTF基因片段亞克隆到pBLUESCRIPT質粒載體。DNA被引入E.Coli菌株XL1-Blue(Stratagene)的感受態細胞內，並選擇具α-氨基苄青黴素抗藥性的轉化體。用標準方法純化質粒DNA，用EcoRI和Xhol切割插入的人DNA片段，分離後，標記以用作雜交探針，完成標記使用的是用約20ng DNA作為模板和低聚核苷酸CNTF.10和CNTF.11作引物的PCR進行的，在含有Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer/Cetus)、dATP、dGTP、dTTP和32P-dCTP的反應混合物中，94℃下1分鐘，50℃2分鐘，和72℃下3分鐘循環6次，採用標準色譜法使標記的片段與未摻入的dCTP分開。
為了測定用鼠CNTF探針在人基因DNA中檢測的DNA片段是否含有能通過以CNTF.10和CNTF.11作為引物的PCR加以放大的序列，將放射性標記的人片段，用作用EcoRI消化的人和鼠基因組DNA的Southern印跡雜交的探針(圖6，泳道a)。探針與約10kb的帶明顯地雜交，與用鼠CNTF探針雜交很弱的區帶不能區分。相反地，人探針與鼠基因DNA的約4kb的譜帶雜交很弱，與用鼠CNTF探針強烈雜交的區帶很難區分，這些結果，加上順序數據，有力地表明人DNA與鼠CNTF基因具同源性。
8.2.3.基因庫產生的人CNTF基因的克隆利用上文所述的放射性標記的人CNTF探針選擇細菌噬菌體載體EMBL-3 SP6/T7中的人DNA基因組文庫，該文庫含有通過使用限制性核酸內切酶Sau3a的部分消化，再在BamH1位點上插入載體的人胎盤DNA片段，細菌噬菌體平板培養於E.Coli菌株LE392上，使用基本上與Benton和Davis (1977，Science 196180-182)和Mahmaudi和Lin(Mahmoudi，M.和Lin，V.K.，1989，Biotechniques 1331-333)所述相同條件，用探針雜交，重複篩選出大約750，000個噬菌斑。通過使用人CNTF探針雜交以鑑定陽性斑點的方法，鑑定陽性噬菌斑，並且通過三個回合的單一噬菌斑分離使重組噬菌體得以純化。帶有人CNTF基因的重組細菌噬菌體被定為λhCNTF-G-1，為進一步分析，使用LE392細菌作寄主在液體培養中生長的辦法製備繁殖母株。
存在於λhCNTF-G-1中的人CNTF順序可通過PCR放大和DNA序列分析進一步得到分析，使用具有原來已編碼的(見上)270bp人片段的一對內引物的放大反應證實了在純化的噬菌體克隆中存在正確的片段;低核苷酸被定為CNTF.13和CNTF.16(順序如下)。正如所希望的，在用λhCNTF作模板和這些引物的PCR反應中，約128bp的產物譜帶被放大。如上所述完成PCR，然後使用包括94℃下1分鐘，50℃下2分鐘，72℃下2分鐘的35次保溫循環。
CNTF.135′－GCAGCGACTTGGAGAAG － 3′(反意義鏈)CNTF.165′－TACCTTCCATGTTTTGTTGG － 3′(有意義鏈)(該引物含有具多克隆位點的順序的5′「尾」-僅顯示該順序的CNTF部分)。
為了確定λhCNTF-G-1克隆是否含有CNTF編碼順序的5′和3′末端，PCR反應是用相應於鼠CNTF編碼順序末端的精確順序(即非退化)引物來完成的。應當注意放大來自人基因組克隆的DNA的能力表明存在相應於人基因的區域，但是放大DNA的失敗既是因為缺乏來自克隆的編碼順序的末端，也可因鼠和人之間的順序差異。
為檢驗可能存在的人CNTF編碼順序的5′末端，使用CNTF.13(上述)和CNTF.14作引物。後面的低聚核苷酸含有相應於鼠CNTF(有意義鏈)編碼順序5′末端的22鹼基，而且在5′末端還含有另外不相關的順序(未顯示)，該序列含有有利於放大片段可能克隆的多個限制性內切酶識別位點CNTF.145′－ATGGCTTTCGCAGAGCAAACAC－3′採用CNTF.13和CNTF.14低聚核苷酸對，由λhCNTF-G-1模板放大大約1.4kb的片段。假若人CNTF基因含有的內含子與在鼠CNTF基因中發現的大小差不多相同(接近1kb)時，這個大小即是所希望的。
對於放大介於已知的人CNTF基因的內順序和編碼順序的3′末端間的區域所作的類似努力未獲成功。引物是CNTF.16(上述)和CNTF.15，它們含有鼠編碼順序(反意義)3′末端的順序CNTF.15 5′－CTACATCTGCTTATCTTTGG － 3′順序分析是由克隆的人CNTF基因的部分完成的，並且證實與鼠CNTF基因的相似性，然而在編碼蛋白中出現大量的胺基酸替代(subtitutions)。人CNTF編碼區域內的DNA順序分析結果和與鼠順序比較的結果示於圖8。所述數據與在相同於鼠CNTF基因的位置上具有單一內含子的人基因相符，還存在復蓋內含子-外顯子連結的胺基酸順序等同物(ESYVKHQGLNKN)延伸段。在內含子內人順序顯著區別於鼠的，與基本編碼區保存物形成明顯的對照。還有一延伸段，其中6個胺基酸中有5個在人和鼠之間有差別(人HVLLAR;鼠QGMLTK)，另外還有兩段，其中4個胺基酸中有3個是不同的(人TEHS;鼠AEQT，位置4到7;和人NNKK;鼠KDKQ，在位置196到199上;圖8(b))。
9.例CNTF中產生的肽片段的利用9.1.材料和方法9.1.1.肽的合成利用f-moc化學現象在應用生物系統固相肽合成儀上合成肽。
9.1.2.細胞培養按(Hughes et al.，1988，Nature 33570-73)提出的方法產生雞胚胎睫狀神經節培養物並維持存活。
9.1.3.免疫方法對於14胺基酸CNTF肽的抗體(SALESHYGAKDKQ)是通過使用與KLH(Keyhole Limpet haemocyanin)結合的肽免疫兔的方法製備的。為了能偶聯KLH，14胺基酸肽在C-末端用一個Cys殘基加以延伸。KLH和肽的偶聯是用過量100倍的肽和MBS(m-馬來醯亞胺苯甲醯基-n-羥琥珀酸亞胺酯)作偶聯劑完成的。
用在弗氏完全佐劑中的1mg連結物(肽-KLH)促進兔免疫。3周後用另外在弗氏不完全佐劑中的1mg結合物增加兔免疫。2周後再次免疫該動物，2周之後採血，製備血清，發現這種血清能免疫沉澱免疫源，及純化鼠坐骨神經CNTF。
9.2.結果和討論9.2.1.抗合成肽的抗體中和CNTF活性的能力飽和量的CNTF與蛋白質-A-瓊脂糖結合的抗體一起培養，該抗體來自於由14胺基酸合成肽(ISALESHYGAKDKQ)免疫的兔得到預免疫血清或免疫血清，經培養和離心以後，檢定上清液，維持E8雞睫狀神經節神經元生長的能力。在對照上清液中可看到正常的CNTF劑量應答。在用抗-CNTF肽片段抗體免疫沉澱後，基本上檢測不出CNTF的活性(圖9)。
9.2.2.合成的CNTF肽片段的神經營養活性E8雞胚胎睫狀神經節神經元在一系列濃度的28胺基酸合成肽片段存在時培養兩天，所述片段是由原始的CNTF順序數據產生的，然後定量測定神經元的存活。在介於肽濃度和神經營養活性之間，觀察劑量-應答的相互關係(圖10)。所使用的肽順序是MVLLEQKIPENEADGMPATVGDGGLFEK。
9.2.3.抗合成肽的抗體對鑑定含CNTF細胞的能力抗28胺基酸肽的抗體用於鼠坐骨神經組織的免疫螢光研究。抗28胺基酸肽的兔抗體與鼠坐骨神經的固定部分共同培養，接著神經部分再與rhodamine標記的抗-兔IgG抗體反應。如圖11所示，能看到周邊軸突染色，從而假設CNTF可能是由Schwann細胞合成的。另外還有，軸突胞質中存在的結構能被目測(圖11，小箭頭)，該結構與軸突的合成或CNTF轉移到軸突相一致的。通過加入過量CNTF肽阻斷標記反應(MVLLEQKIPENEADGMPATVGDGGLFEK)。
10.例睫狀神經營養因子增進脊髓神經元的存活10.1.材料和方法10.1.1.實驗動物Sprague-Dawley鼠(HSD)用於所有的實驗。懷孕鼠用二氧化碳窒息致死，然後迅速取出胚胎，放在冰-冷Puck生理鹽水G中，以進行後面的解剖。
10.1.2.組織培養技術在無菌條件下由妊娠14天的鼠胚胎中取出脊髓。從延髓尾部切下脊髓，不含感覺神經節和腦膜。脊索再細分成腹部和背中部片段以便分開培養。將脊髓組織切成小片再用搗碎機械方法離解，通過巴斯德移液管吸至規定的培養基中，該培養基含有50%基本培養基Eagle(BME;Gibco)和50%Ham營養混合物F12(Gibco)，並補充有葡萄糖(33mM)、穀氨醯胺(2mM)，NaHCO3(15mM)、HEPES(10mM)、胰島素(25μg/ml)、鐵傳遞蛋白(100μg/ml)、腐胺(60μm)黃體酮(20nM)、亞硒酸鈉(30nm)、青黴素G(0.5μg/ml)、鏈黴素(0.5μg/ml)和牛血清清蛋白(2.5μg/ml)。重複搗碎兩次並將上清液收集起來，通過尼龍(Nitex，Tetko)過濾器(40μm)過濾，所產生的總細胞在有錐蟲蘭存在下用血球計數板計數、分離的腹細胞以0.5百萬細胞/35mm培養皿的密度塗於平板上，培養皿用聚-D-賴氨酸(10μg/ml)覆蓋。分離的背中部細胞以1.5百萬細胞/35mm培養皿的密度塗於平板上，培養皿已用聚-D-賴氨酸(10μg/ml)、聚-L-鳥氨酸(10μg/ml)或帶有昆布氨酸(Laminin)的聚-L-鳥氨酸(5μg/ml)覆蓋。在平板培養時間，對這些培養物進行處理。培養保持在37℃下，接近100%相對溼度的95%空氣/5%CO2的大氣中。每3-4天換一次培養基。一周時，這些培養液主要含有隻具有幾個星形細胞(用纖維狀神經膠質酸性蛋白抗體著色的;Bignami and Dahl，1973，Brain Res，49393-402)神經元(用神經絲單克隆抗體RT97著色的;Wood and Anderton，1981，Biosci.Rep.1263-268)，正如免疫細胞化學所證實的。
10.2.結果和討論10.2.1.睫狀神經營養因子(CNTF)對背中部(MD)脊髓神經元的作用在規定的培養基第一個48-72小時後，背中部(MD)培養物不能存活，細胞開始結塊最後與基質分離。然而，在平皿培養時間內用CNTF處理一次後(每ml培養液中，2μl的E.Coli提取物有20ng的重組鼠CNTF)，到48小時時顯示出MD神經元的存活數增加;它們緊緊地附著在基質上並延長了神經突(圖12)。這種差別不可能是細胞附著程度的結果，因為平皿培養3小時後，在對照和CNTF處理的兩種培養液中細胞都緊密地附著情況。此外，使用不同的基質得到結果類似。因此，這種結果表明CNTF能提高這些培養物中MD神經元的存活。還測定了蛋白水平。CNTF-處理過的培養物含有的蛋白/皿較未處理的對照物和NGF處理過的(50ng/ml)培養物高6倍(表1)。由於培養液一開始含神經元，所以蛋白質水平的提高就可認為提高了神經元的存活。
10.2.2.CNTF對腹部脊髓神經元的作用腹部脊髓片段培養液富有體細胞的運動神經元，正如在有關雞胚胎運動神經元論文所證實的(Dohrman等人，1986，Dev.Biol.118209-221並可參見例8，下文)並且如本文通過使用膽鹼乙醯轉移酶(CAT)抗體進行的免疫細胞化學對鼠胚胎運動神經元的研究所證實。在規定培養基中，腹部神經元存活得相當好，然而最終於一星期後變壞，大概是由於缺乏神經膠質細胞分泌的因子(因為這些培養物含有的神經膠質較少)，在CNTF(2μl/ml)存在條件下，腹部神經元存活超過一周，與對照相比，增加的蛋白質和CAT酶水平較低(表Ⅱ)。
表Ⅰ平皿培養時間內，背中部神經元用CNTF(2μl/ml)、NGF(50ng/ml)處理或不處理。7天時，收集培養物，用Bradford方法測定蛋白質(Bradford，1976，Anal.Biochem.，72248-254)。
對照物 CNTF NGFμg蛋白質平皿 20 120 20表Ⅱ在平板培養期間，腹部神經元用CNTF(2μl/ml)、NGF(50ng/ml)處理或不處理。7天時，收集培養物測定CAT酶水平(Hartika和Hefti，1988，J.Neursci.82967-2985)並測量蛋白質。
蛋白質 CAT活性μg/皿 cpm/皿對照 33 590±26.52CNTF 45 959.5±24.32NGF 38 621.25±33.5911.例純化鼠坐骨神經CNTF防止新生鼠面部神經(第7顱側神經)中的運動神經元損傷-誘導細胞死亡。
11.1.材料和方法新生鼠仔的面部神經單側分段並且將含5μg牛血清白蛋白或5μg CNTF的小明膠海綿植入物放在受傷部位。一組未接收明膠海綿植入物的受傷動物用作對照。一周後，殺死動物製作，含有與損傷的神經同側(與損傷同側)的面部神經核和損傷處對面一側(與損傷處對側)面部神經核的腦幹切片。對側面的面細胞核作體內對照。面部核切片用Nissl染色(染色運動神經元)或用纖維狀神經膠質酸性蛋白的抗體染色(為檢測神經膠質細胞對傷痛的應答)。
11.2.結果和討論如圖13A和B所示，面部神經的損傷和含BSA明膠海綿植入物的替代導致其中運動神經元數量的降低;此外，剩餘運動神經元出現凝聚和皺縮。然而，面部神經的損傷和安置CNTF的明膠海綿植入物本質上好象與較大的運動神經元的存活有關(圖14A和B);圖14A中的運動神經元與圖13A的皺縮的、退化的運動神經元相比，似乎與未損傷側面的健康運動神經元(圖14B)更相似。而且，能觀察到CNTF的作用主要是促進運動神經元的存活，而不是防止神經膠質增生;在BSA處理和CNTF處理的鼠中在與面部神經損傷對側面的面部核中，能觀察到相當量的神經膠質增生(圖13C和14C)。
計數未處理鼠、BSA-明膠海綿和CNTF-明膠海綿處理鼠的面部核中運動神經元的數量，數據列於表Ⅲ。
在未處理或用明膠海綿+BSA處理的損傷動物中，觀察到損傷對側面的運動神經元損失有90%。在用浸過CNTF的明膠海綿植入物處理的動物中，損傷對側面的運動神經元庫有70%正常(損失
12.例重組人和鼠睫狀神經營養因子在Escherichia Coli(大腸桿菌)中高水平表達和純化。
12.1.材料和方法12.1.1.細菌菌株和質粒E.Coli W3110 laclqF-，一種能過量產生乳糖操縱子阻遏物的菌株，和親代質粒載體pCP93、pCP110、pblko和pblkl已用於早先的研究中(Panayotatos，N.，1988，Gene 74357-363;Panayotatos et al.，1989，J.Biol.Chem.26415066-15069)。為CNTF的表達設計的載體按下面方面產生並且它們的相關性質綜述於表Ⅳ中。
12.1.1.1.鼠CNTF載體12.1.1.1.1.pRPN11編碼完整鼠CNTF蛋白質的622bpDNA片段，是通過聚合酶鏈反應(PCR)由cDNA克隆獲得的(Stockli et al.，Nature 342920-923)。用於獲得這種片段的合成低聚脫氧核苷酸引物被指定產生編碼蛋白質氨基末端的丙氨酸的5′末端，以及產生3′末端的TAG終止密碼子以外的結尾19bp。表達載體pCP93用SalI線性化，再通過使用Sl核酸酶處理得到平齊末端，得到的3920bp片段用瓊脂糖凝膠電泳法純化。這樣製備的載體和PCR片段連結起來，轉化到E.Coli W3110 LacIqF-。按所期望質粒的大小和限制性圖譜篩選轉化體(圖16)，通過DNA序列分析證實陽性候選物(pRPN11)攜帶期望中的與正確的閱讀框架中轉譯起始信號融合的全長基因。然而，如下文討接近30%)總之，新生鼠面部神經損傷後，發現有90%的面部神經核的運動神經元在一周內退化。應用CNTF切割新生鼠面部神經的剩餘部分，顯著地降低了細胞的損失。見示於圖14A和表Ⅲ中的神經切片;發現CNTF能挽救至少60%的面部神經運動神經元，通常這些神經元在axotomy後都會死去。因此證明CNTF是體內運動神經元的存活因子。
表ⅢCNTF挽救新生鼠面部神經運動神經元免於Axotomy-誘導細胞死亡處理 面部神經核中運動神經元數損傷側 對側(對照側)對照(無凝膠海綿) 685 2985330(530)明膠海綿+BSA 775 3360(5μg) 645 3300440 315(620) (3271)明膠海綿+CNTF 2205 3425(5μg) 34451270 29903095 3490(2120) (3301)
論的，發現在pRPN11的CNTF基因中有單一bp突變，與原始鼠cDNA相關，導致在蛋白質順序的193位處天冬醯胺取代酪氨酸摻入。可能在PCR的放大過程中發生的這種突變，被轉到所有攜帶鼠CNTF基因的其它載體中。
12.1.1.1.2.pRPN12這種質粒與pRPN11相同，但該質粒在拷貝對照區(copl)有一單bp突變，該突變可使寄主細胞中的拷貝數提高5倍。可將Eag Ⅰ和PvuⅠ位點(順時針)之間的DNA用由pCP110產生的相同序列置換而構建該質粒(Panayotatos et al.，1989，J.Biol.Chem.26415066-15069)。
12.1.1.1.3.pRPN37PRG12中復蓋b-內醯胺酶基因的兩個AseⅠ限制性位點間的DNA區域(圖16)，用產生卡那黴素(KanR)抗藥性的DNA片段置換。在該載體內，KanR基因是處於其天然啟動子的轉錄控制之下。
12.1.1.1.4.pRPN38這種質粒和pRPN37是一樣的，但它有4個鹼基對的位點-特異性突變，該突變能減弱KanR啟動子的強度(Panayotatos，N，1988，Gene74357-363)。
12.1.1.2.人CNTF載體12.1.1.2.1.pRPN32這種質粒與pRPN11相類似，除了它帶有人的而不是鼠的基因。為了能在細菌中表達人CNTF蛋白，必須除去分隔蛋白質-編碼順序的內含子。這一點是通過使用PCR放大和連結內含子側面區域完成的，步驟如下。進行兩個反應，每一個使用100ng的gen C.1DNA作為模板(圖17)一個含1M CNTF.23引物和10nM CNTF.21引物，而另一個含1μM CNTF24引物和10nM CNTF.22引物。10個PCR循環後(每次循環包括在94℃下保溫1分鐘，50℃2分鐘，72℃2分鐘)，混合兩個樣品再在DNA Thermal Cycler(熱循環器)中進行另外的25次循環，由於內引物CNTF.21和CNTF.22彼此完全互補，第一階段PCR反應的產物隨後能退火。此外，在第二階段反應中，存在濃度顯著高的外引物CNTF.23和CNTF.24引起所需要的全長產物的大量合成。選擇內引物以橋鍵合編碼區的兩個片段，因此導致內含子缺失。最終PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，而且經溴化乙錠染色後只檢測到一個主帶。大小約600bp，和部分核苷酸順序表明這個帶表示一個精密地連接的人CNTF編碼區域。
設計5′外引物CNTF.23(圖17)能產生編碼蛋白質氨基末端上丙氨酸平齊末端3′外引物CNTF.24(圖17)在CNTF編碼順序末端以外提供一個12bp的EagⅠ限制性位點。該引物也能用TAA置換天然出現的TAG終止密碼子，這種替代在E.Coli中不易轉譯通讀。PCR片段用EagI限制後，所得到的612bp片段用聚丙烯胺凝膠電泳純化。可提供ATG起始密碼子的表達載體pCP93用SalI線性化後，通過Sl核酸酶處理得到平齊末端，再用EagI消化，所得到的3，636bp片段用瓊脂糖凝膠電泳純化。這樣製備的載體和PCR片段連結起來轉化到E.Coli W3110LacIqF-，通過限制性圖譜鑑定帶有期望分子的轉化體再檢驗誘導產生的所需大小的蛋白的存在。
通過凝膠電泳分析攜帶有一個候選質粒(pRPN32)的E.Coli W3110LacIqF-的誘導培養物中，蛋白質合成結果顯示有約27.000MW蛋白帶存在，它在攜帶pCP93質粒載體的細菌誘導對照培養物中是不存在的。快速從這些培養液製備的蛋白提取液顯示有生物活性CNTF。
12.1.1.2.2.pRPN33、pRPN39和pRPN40除了有人的而不是鼠的CNTF基因外，這些質粒分別與pRPN12、pRPN37和pRPN38是類似的，而且同樣用pRPN32作親代質粒構造。介於pRPN32中的EagI和PvuI位點間的拷貝對照區域(順時針)可由pCP110產生的相同順序取代以產生pRPN33，之後，pRPN33中的AseI限制性位點間的β-內醯胺酶編碼區域可由pblkl的突變KanR區域(Panayo-tatos，N.，1988，Gene74357-363)置換以產生pRPN40。最後，pRPN40和pblko的NdeI和BglⅡ限制性位點之間的區域(Panayotatos，N.，1988，Gene 74357-363)交換以產生pRPN39，其中KanR基因在其野生型啟動子控制之下。
12.1.2.蛋白合成的誘導細胞在LB肉湯內於37℃下振蕩培養至OD590＝1。添加乳糖至終濃度為1%並連續培養16-20小時。
12.1.3.「快速」蛋白質提取凝膠電泳樣品的製備是通過將0.5ml培養液OD590＝2產生的細胞沉澱重新懸浮於0.16ml溶解緩衝液中(100mMTris HCl、10%甘油、4%十二烷基硫酸鈉、1mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml溴酚蘭，PH6.8)並煮沸5分鐘。
最初描述使用於重組人白細胞幹擾素α2的方法選擇性提取/溶解-(Thatcher，D.and Panayotatos，N.，1986，Methods Enzymol.119166-177)，按下列修改。由誘導培養液產生的細胞重新懸浮並儲存於-20℃以下。在溶菌酶處理後，粘性懸浮液在8，000psi下通過French Press(SLM-Aminco)，以11，000xg速度離心，再處理，加工得到的沉澱(Thatcher，D.and Panayotatos，N.，1986，Methods Enzymol.119166-177)。將溶於8M胍鹽酸鹽中的樣品在緩衝液D(10mM Tris-Hcl，PH8.0，5mM EDTA，0.1mM二硫蘇糖醇)中充分透析，在11，000xg離心，在無菌條件下，將清亮上清液通過Millipore Sterifil D-GV過濾。
12.1.4.色譜法濾液調整至25mM NaCl中，以0.5ml/min速度加到5×10cm DEAE Sephacel柱(Pharmacia)該柱已用緩衝液E(20mM Tris HCl PH8.0，0.1mM EDTA，0.1mM二硫蘇糖醇，25mM NaCl)平衡處理過。該柱用基底體積的相同緩衝液洗滌，再用3倍基底體積的線性梯度25-500mM NaCl的同樣緩衝液洗脫，在250-350mM NaCl梯度處洗脫出重組鼠CNTF。同時在50-100mM NaCl梯度處洗脫出人CNTF。
對於鼠CNTF，將收集的峰餾份在緩衝液E中滲析，無菌過濾和儲存於-70℃。
對於人CNTF，從DEAE Sephacel柱收集到的峰餾份經調整至40mM MES(Boehringer)PH6.0，0.1mM EDTA，0.1mM二硫蘇糖醇(緩衝液G)，通過0.22μm Millex GF過濾器，以1.0ml/hr速度施加於5×10cm Fast-S柱(Pharmacia)，用含250mM NaCl的兩倍基底體積的緩衝液G洗滌後，再使用3倍基底體積的含250-1000mM NaCl梯度的緩衝液G洗。在約600mM NaCl處洗脫出人CNTF。峰餾份在緩衝液E中滲析，無菌過濾，儲存於-70℃。
12.1.5.肽分析12.1.5.1.鼠CNTF按(Stockli et al.，Nature 342920-923)描述用BrCN離解重組鼠CNTF(50μg)。所得到的肽用RP C4的反相HPLC分離，所得色譜圖與BrCN離解的鼠坐骨神經CNTF相比較。將曾鑑定作為大多數C-末端肽進行胺基酸分析。另外，鑑定N-末端肽再進行胺基酸分析。
12.1.5.2.人CNTF使1.5ml 0.1%TFA/50%乙腈中的重組人CNTF(400皮摩爾)在Speedvac中濃縮至終體積為300μl。該樣品載於微型柱(Vydac C-4，214TPB，300A，10μm)，用0.1%TFA/10%乙腈洗滌兩次，再用0.1% TFA/70%乙腈洗脫。洗脫液在Speedvac中濃縮至約10μl。完成C-末端裂解是用在33℃下用檸檬酸鈉(終濃度為0.025～0.05M)調節PH為3.79、5.0和6.12的總體積為20μl的2%羧肽酶Y和P(Boehringer Mannheim，Sequencing grade)，在保溫10到60分鐘過程中，添加3μl的99%甲酸和200pmol的氨基乙醇(作為內標)，並按上述方法將樣品加於微型柱中。裂解的胺基酸洗脫後，用0.1%TFA/10%乙腈洗滌該柱兩次。胺基酸經乾燥，再用O-phtal-二醛衍生後進行分析。用0.1%TFA/70%乙腈由微型柱洗脫出CNTF，濃縮至10μl再重複裂解。
12.1.6.生物活性重組CNTF的生物活性是按Lindsay和Rohrer(1985，Devel.Biol 11230-48)所述在雞胚胎背根神經節(DRG)的外植體和睫狀神經節(CG)的離體培養物上進行。簡單地說，由培養10天(E10)的雞胚胎解剖得DRG和5-6神經節植入盛有1ml膠原凝膠間質的35mm組織培養皿。在凝膠固化之後，加入補充有5%熱-失活馬血清(GIBCO)的1ml組織培養生長基質F14(Imperial Labs.，U.K.)，然後加入人CNTF(1-20 l)達到終濃度為100pg-100ng/ml。E8雞胚胎解剖後得CG在含0.25%胰蛋白酶(worthington)的無鈣和鎂的磷酸鹽緩衝生理鹽水中培養30分鐘，神經節再用含5%馬血清的F14培養基洗滌三次，搗碎後，通過Pasteur移液管的孔分離成單細胞懸浮液，可在一個60mm培養皿內培養細胞懸浮液3.5小時，得到豐富的CG神經元，在這過程中，非神經元細胞(成纖維細胞和Schwann細胞)牢固地附著於塑料壁上，相一明亮的神經元在懸浮液中。純化的神經元以8，000-10，000神經元/皿的密度塗在已覆蓋聚烏氨酸-昆布氨酸的35mm培養皿上培養。通過與對照相比來評價處理過的培養物纖維派生程度而測定外植體培養液CNTF活性，採取比較培養物對外植的DRG和NGF的劑量-應答照片將纖維派生程度分作0-5+。在離體的CG神經元培養物中，CNTF活性的測定是在48小時計算對照和CNTF處理的培養物中加工過神經元的百分數。在各種情況下結果都是從三份培養物得到的。
12.1.7.其它方法用於這些研究中的酶反應的條件，DNA電泳和其它技術都已詳細描述(Panayotatos，N.，1987，In K.G.Hardy(Ed.)，PlasmidsA Practical Approach.IRL Press，Oxford，U.K.，pp.63-176)。使用4mg超螺旋質粒作模板藉助Sequenase Version 2.0Kit(USB Corporation)完成DNA序列分析。
12.2.結果與討論對外源蛋白在E.Coli中表達的早期研究已鑑定了幾個參數，這些參數有助於高水平的表達和有利於回收生物活性產物。我們已利用具有一些重要特徵的表達載體，特徵包括受乳糖操縱子阻遏物調節的LacUV5啟動子;由細菌噬菌體T7產生的很強的核蛋白體結合部位;在質粒複製控制區有一個提高拷貝數的突變;以及限制抗菌素抗性蛋白表達的突變。尤其是，我們仔細研究了後面兩個特徵對CNTF在E.Coli中生產的影響。
12.2.1.鼠CNTF的表達
12.2.1.1.拷貝數的影響用凝膠電泳法分析乳糖-誘導的E.ColiW3110 LacIqF-/pRPN11培養物中的蛋白質合成結果顯示較弱地表達約24，000KDa的多肽，相當於鼠CNTF的期望的大小，它在帶有pCP93載體的細菌的誘導對照培養物中是不存在的(圖18)。帶有pRPN11的細胞提取物也含有有效水平的CNTF活性。值得注意的是在E.Coli W3110 LacIqF-/RPN12誘導培養物中，與pRPN11不同之處在於拷貝數突變copl的存在，使CNTF的生產量提高到約為總細胞蛋白的30-50%(圖18)。於是，相對於pRPN11來說，pRPN12的拷貝數增加5倍，導致重組蛋白水平增加30-50倍(表Ⅳ)。copl突變的這一作用已為其它重組蛋白所證明(Buell，G.and Panayotatos，N.1987，In「From Gene to ProteinSteps Dictating the Maximal Levels of Gene Expression」，Reznikoff，W.S.and Gold，L.eds Butterworths，Stoneham，Mass.)。
12.2.1.2.抗菌素抗藥性的作用在有關重組蛋白在E.Coli中表達的早期研究中，人們注意到由載體編碼的抗菌素抗性蛋白的合成受適當的重組蛋白產物的幹擾。這種幹擾是由於細胞的限制性細胞合成機理中而種種基因發生競爭引起的(Panayotatos，N.，1988，Gene 74357-363)。為了進一步驗證這一假設，和有可能提高CNTF生產的水平，在其天然啟動子(prpn37)的轉錄控制之下，或在較弱的突變啟動子(pRPN38)控制之下。pRPN12中的β-內醯胺酶基因被卡那黴素抗藥性(KanR)基因置換，分析寄生有pRPN37的誘導細胞中。蛋白質水平，表明鼠CNTF組成總細胞蛋白的10-20%，和合成的KanR蛋白約為該水平的一半。相反，在寄生有pRPN38的細胞中，它帶有突變KanR啟動子，CNTF組成總細胞蛋白的50-70%，而沒有檢測到KanR蛋白(圖18和表Ⅳ)。所觀察到的用pRPN38非常高水平地表達CNTF，估計可能直接起因於抗菌素抗藥性基因表達水平的降低。正如有關用這些載體高水平表達其它重組蛋白所觀察和討論的(Panayotatos，N.，1988，Gene 74357-363)，減少KanR啟動子的強度就會減少明顯限制細胞合成能力方面的競爭。
12.2.2.人CNTF的表達用幾種載體獲得的相關水平的人CNTF表達列於圖18中，而且概括於表Ⅳ。就每一載體的最高水平低於帶有鼠基因的類似載體所具有的水平，然而總圖譜是一樣的;用更高拷貝數(copl)質粒，可再一次看到增長30-50倍，而且藉助於高拷貝數和卡那黴素抗藥性的低表達結合，可再次獲得最高水平。還原的KanR(pRPN39對pRPN40)對人CNTF的表達的作用與對鼠CNTF表達(pRPN37對pRPN38)的作用相比明顯減少。所以希望當細胞合成機構達到限度時如重組蛋白水平特別高，兩種轉錄單位競爭才變得明顯。
本文報導的鼠CNTF在E.Coli中生產水平是例外地高很明顯這是由於一些因素的有利結合，包括使用適度強度的啟動子，強核蛋白體轉譯起始信號，在穩定保持相對高拷貝數的載體質粒和選擇性抗菌素抗藥性蛋白的最低合成。另外，重組蛋白生產取決於蛋白本身的物理性質及其在寄主中的穩定性，在這方面，鼠CNTF似乎特別適合於在E.Coli中表達。人CNTF也非常有效地得到表達，儘量水平有些低。
12.2.3.鼠和人CNTF的純化類似於在E.Coli中高水平表達的其它重組蛋白質，CNTF大部分是在不溶性內含體中發現85-90%的鼠和60-70%的人蛋白質對於用中性緩衝液的提取是穩定的。用8M胍鹽酸鹽能有效地提取和溶解截留在內含體中的CNTF和其它(大部分是疏水的)蛋白。隨後用滲析法緩慢除去胍鹽使疏水性寄主蛋白沉澱並且使留在溶液中的鼠CNTF純度95%以上，而人CNTF純度高於90%(圖19)。在這一點上，單純色譜步驟(DEAE Sephacel)足以純化重組鼠CNTF達到99%以上純度，正如從有意超載的聚丙烯醯胺凝膠上得到的相對強度(圖19A)和通過HPLC分析測定的。部分是由於人蛋白對DEAE Sephacel親和力較弱，所以必須增加第二個色譜步驟(Fast s)以取得高於99%的純度(圖19B)。
12.2.3.1產率得到確定的表達水平並推斷溼細胞沉澱的總蛋白含量5-15%蛋白(按重量計)，理論產率每克溼細胞沉澱產生30-90mg鼠CNTF和15-45mg人CNTF。發現實際產率是鼠CNTF約20mg而人CNTF約6mg。對人蛋白質的情況，大部分損失是由於在製備內含體的過程中，「溶解的」CNTF提取和拋棄。
12.2.3.2特徵由上述程序製備的鼠和人兩者的重組CNTF純度高於99%。通過Limulus Amebocyte Lysate檢驗法(Associatesof Cape Cod)測得蛋白質具有的發熱性(！5ng/mg蛋白)。此外，如下述討論的，發現它們的生物活性在皮摩爾水平。
重組鼠和人CNTF蛋白用BrCN處理並鑑定N-末端和C-末端肽後進行胺基酸組成和/或順序分析。N-末端肽的分析表明在鼠和人兩種蛋白質中定量回收N-末端胺基酸為丙氨酸。這結果暗示起始的甲硫氨酸可定量除去，當第二殘基是非龐大的胺基酸丙氨酸時，在E.Coli中通常出現這種的情況。反之，從鼠坐骨神經中純化到的CNTF N-末端被阻斷，估計可能留下末端的甲硫氨基殘基。
在羧基末端，獲得用於重組人CNTF的末端BrCN肽的期望順序。反之，鼠的CNTF的N-末端肽胺基酸組分分析表明當它具有希望的組分時;它就缺少期望的酪氨酸殘基，並且，具有額外的天冬醯胺。DNA順序分析表明存在一個點突變，在密碼子193上產生由酪氨酸到天冬醯胺的替代;很明顯，這一點的出現是在通過PCR而拷貝克隆鼠CNTF cDNA過程中以構建原始表達載體pRPN11。我們已經確定突變位於對生物活性非必需的CNTF區域內。
鼠和人CNTF具有相同數目的胺基酸(在除去N-末端甲硫氨酸後，計算的分子量分別為22，780和22，700)並共有它的順序的很大部分。在還原和非還原的SDS-聚丙烯醯胺凝膠上，人CNTF遷移較鼠CNTF慢些(圖19)。介於結構相似和長度相等的這兩種分子之間的這種運動性上的差異反映出在人蛋白質中一些異常的結構上的強制力。
12.2.4生物活性由上述程序純化的重組鼠CNTF完全是活性的，圖20表明離體的、富含神經元的E8雞胚胎睫狀神經節培養物的劑量-應答曲線，是由從鼠坐骨神經純化到的CNTF(Stockli et al，Nature 342920-923)和重組鼠CNTF獲得的。從坐骨神經純化到的蛋白質的活性可檢測量在5pg/ml，而且最大神經元存活量為1-2ng/ml(EC50＝80pg/ml)。在相同檢驗中，發現純化的重組鼠CNTF在2pg/ml時具活性，並觀測到飽和度為0.5-1.0ng/ml(EC50＝35pg/ml或1.5PM)。因此，純化的重組鼠CNTF具有至少和從坐骨神經中純化的天然蛋白質一樣的活性。
在平行實驗中，檢測純化的重組人CNTF的生物活性。開始，10天雞胚胎(E10)DRG的外植體被用於快速和半定量檢測E.Coli溶胞物中CNTF的活性。在CNTF存在下，可見纖維派生，同時在缺少外源神經營養因子的情況下，在對照神經節中很少或幾乎沒有派生(圖21A、B)。飽和水平CNTF出現的最大纖維派生約為用飽和水平的NGF而出現的派生的50-75%。
一種更特異性的檢驗法測量了E8雞睫狀神經節的離體、富含神經元的培養物中神經元存活。在對照培養液48小時後，幾乎所有的神經元都退化(圖21C)，而在飽和水平的CNTF存在下。培養時至少有60-70%的神經元存活並且精心做成很長的神經突(圖21D、E)，對睫狀神經元產生的這些特異性作用，是用亞ng量的細菌細胞粗裂解液和純化的重組蛋白觀察到。根據用逐漸增加的純蛋白質進行的這些實驗中，可以發現重組人CNTF對雞睫狀神經元的活性與鼠CNTF相同。
本文所述的CNTF的表達和純化，可以按比例增加用於藥物生產。根據近來的論證CNTF能增進實驗動物中受傷運動神經元的存活，這一點是很重要的(Sendtaner et al.，1990，Nature 345440-441)。
13.例修飾和截斷睫狀神經營養因子蛋白對生物活性的影響13.1.材料和方法13.1.1.親代表達載體的構造親代rCNTF表達載體pRPN11、pRPN37和pRPN40的遺傳工程描述於12.1.1.1.1、12.1.1.1.3和12.1.1.2.2各部分。
13.1.2.構建經修飾人睫狀神經營養因子載體質粒pRPN108是通過用一個片段置換pRPN33中介於唯一的AatⅡ和NheⅠ限制性位點間的DNA順序而產生的，所述片段帶有在Nhel位點上遊15bp的兩個位置上經過修飾嚴格相同的順序。完成這一點是用復蓋Nhel位點和包含三個殘基的合成低聚脫氧核苷酸「3引物」，所述殘基是用編碼丙氨酸的GCA密碼子置換TGT半胱氨酸密碼子。該3′引物與復蓋AatⅡ位點的5′引物結合以通過聚合酶鏈反應(PCR)獲得來自於pRPN33的所期望的順序。因此pRPN108與pRPN33是相同的，除了hCNTF的17位胺基酸的丙氨酸密碼子(圖22)。
質粒pRPN109按與pRPN108完全相同的方式由pRPN33產生，不同的是復蓋Nhel位點的3′引物包含兩個殘基，它們轉化TGT半胱氨酸密碼子成為編碼絲氨酸的AGT密碼子。因此，pRPN109，與pRPN108是一樣的，不同的是編碼hCNTF17位點胺基酸的絲氨酸密碼子(圖22)。
質粒pRPN59是通過在pRPN33中移走介於唯一的限制性位點，BamH1和Nru1之間的DNA順序而產生的，在pRPN59中，hCNTF基因順序在第185位密碼子後被阻斷並且保證有編碼與hCNTF不一致的另外10個AA的序列和一個轉譯-終止密碼子(圖22)。
當帶有介於Ase1位點之間的部分hCNTF基因的限制性片段的定向倒轉時，可將來自於pRPN33(MS2)的pRPN40經遺傳工程方法產生質粒pRPN112。在pRPN112中，hCNTF基因在第145密碼子之後立即阻斷並且保證的順序導入兩個密碼子;一個密碼子編碼與hCNTF不相應的一種胺基酸(亮氨酸)和一個轉譯一終止密碼子(圖22)。
通過將一個以Bst×1位點為末端，編碼hCNTF的最後133個胺基酸的CPR片段插入編碼與CNTF非同源的蛋白質的基因的Bstx1位點，而產生pRPN82質粒。在pRPN82中，所得到的融合蛋白含有外源蛋白的開始35個胺基酸以及跟隨它們2個甘氨酸殘基和133個hCNTF的殘基(圖22)。
13.1.3構建經修飾的鼠睫狀神經營養因子載體質粒pRPN65的產生是通過插入介於pRPN12的唯一的限制性位點Sacl和Nru1之間一個規定的PCR片段以便在緊接著rCNTF的第165個密碼子後導入轉譯-終止密碼子(圖22)質粒pRPN110的產生是通過用一個片段置換介於pRPN12中的唯一的Nhe1和Eag1限制性位點之間的DNA順序，所述片段帶有在單核苷酸上經修飾的嚴格相同序列，所述核苷酸將TAT酪氨酸密碼子轉化成編碼天冬醯胺的AAT密碼子。完成這一點是藉助於3′引物，該3′引物是從發生突變的位置延伸到rCNTF基因的3′末端而且隨後是Eag1的識別順序。該3′引物結合復蓋Nhel位點的5′引物使用，為的是能通過PCR獲得來自於pRPN12的所期望的順序。在pRPN110中，rCNTF基因編碼的蛋白質與由鼠DNA編碼的蛋白質相同(圖22)。
13.1.4睫狀神經營養因子質性的生物檢驗分析背根神經節和/或離體的睫狀神經元的生物活性，是按12.1.6部分的描述進行的，可溶蛋白是按描述於12.1.3部分中的「快速」蛋白提取法從寄生各種質粒的誘導細菌中提取的。
13.2.結果和討論檢驗生物活性結果表明在pRPN108和pRPN109中編碼的修飾hCNTF蛋白和在pRPN59中編碼的截斷蛋白的活性與親代質粒pRPN33中編碼的全長蛋白的活性相同。反之，在pRPN112中編碼的截斷蛋白是無活性的。
這些結果表明為人、鼠和兔CNTF順序在位置17上共有的唯一半胱氨酸殘基能被修飾而無明顯的活性損失。同樣地，hCNTF最後的15個胺基酸對於活性並不是必不可少的。反之，除去hCNTF羧基末端的最後55個胺基酸則活性消失。因此，活性hCNTF的臨界區域位於氨基146和186之間。
分析截斷和修飾的鼠CNTF蛋白的結果與這種解釋是一致的並且進一步縮小了具CNTF活性的臨界區域。在由pRPN65編碼的蛋白中，移走最後的35個胺基酸使蛋白失活，同時用天冬醯胺殘基在193位上置換酪氨酸，對活性沒有影響。這些結果能進一步限定，具CNTF活性的臨界區域是介於胺基酸166和186之間的順序。
14.例CNTF對腹部脊髓神經元的其它作用14.1.材料和結果14.1.1.實驗動物所有實驗都使用Sprague-Dawley鼠(HSD或Zivic-Miller)。懷孕鼠(E14)按10.1.1所述致死。
14.1.2組織培養技術按10.1.2所述在無菌狀態下從鼠胚胎取出脊髓，該脊髓組織切碎成小片後在37℃下於0.1%胰蛋白酶(GIBCO)和0.01%脫氧核酸酶型1(sigma)中培養20分鐘。然後除去胰蛋白酶溶液，漂洗和用培養基置換，該培養基是由45%Eagle最低基本培養基(MEM)、45%Ham營養混合物F12(F12)、5%胎牛血清(GIBCO)、5%馬血清(GIBCO)、穀氨醯胺(2mM)、青黴素G(0.5U/ml)和鏈黴素(0.5μg/ml)組成。然後輕度搗碎和通過Pasteur移液管吸至同樣培養基中，而用機械方法分離兩次，合併上清液後用尼隆過濾器(Nitex，Tetko;40μm)過濾。所產總細胞數在錐蟲蘭存在條件下用血球計計數來測定，離體的腹細胞以約50，000細胞數/cm2的密度在塗有聚-L-鳥氨酸(10μg/ml)和昆布氨酸(5μg/ml)的培養皿上培養。在培養當天進行處理，但在延遲附加實驗中，其中處理是在2或6天進行。培養物在37℃下，接近100%的相對溼度的95%空氣/5%CO2的大氣中培養。培養基每3-4天換一次。為了降低非神經元細胞，在2天時添加核分裂抑制劑，胞嘧啶-阿拉伯糖苷(AraC;0.5μM)。在7天時，收集細胞測量膽鹼乙醯轉移酶(CAT;Fonnum，1975，J.Neurochem24407-409)和蛋白質(Bradford，1976，Annal.Biochem.72248-254)水平或固定於4%的仲乙醛中以進行NF檢驗(Doherty et al.，1984，J.Neurochem.421116-1122)和免疫細胞化學分析。一些培養物是在指定的培養基內生長，該培養基包含50%F12和50%MEM，穀氨醯胺(2mM)、胰島素(5μg/ml)、轉鐵蛋白(100μg/ml)、黃體酮(20nM)、腐胺(100uM)和亞硒酸鈉(30nM)(Bottenstein and Sato，1979，PNAS76514-517)。培養1天時，用指定培養基置換這些培養物中含血清的培養基。
14.1.3神經絲(NF)分析細胞於4℃下在4%仲甲醛中固定2小時後，按Doherty等人所述的程序將培養液滲透和阻斷(1984，J.Neurochem.421116-1122)。神經絲蛋白的檢測採用單克隆抗體RT97(Wood and Anderton，1981，Biosci.Rep.1263-268)以1∶1000稀釋度進行。反應產物用0-苯二胺(OPD)作為基質顯色後看到並在490nm下測量光密度。
14.1.4.膽鹼乙醯轉移酶(CAT)檢測通過將細胞溶解於含0.1%Triton X-100的20mM Tris-HCl(pH8.6)溶液中而收集培養物。取出2微升的細胞溶解物按照micro-Fonnum程序檢驗CAT活性(Fonnum，1975，J.Neurochem.24407-409)。最終基質組分為0.2mM〔1-14C〕Acetyl-CoA(NEN，54.4mci/mmol)，300mM Nacl，8mM溴化膽鹼，20mM EDTA和溶於50mM NaH2PO4(pH7.4)緩衝液的0.1mM新斯的明。在這些酶和基質濃度上，酶反應呈線性進行90-120分鐘。對於CAT的誘導的特殊性檢驗是通過在檢測過程中添加CAT活性特異抑制劑，N-羥乙基-4-(1-萘乙烯基)苯基偶氮二氨基吡啶(HNP)(White and Cavallito，1970，J.Neurochem.171579-1589)。
14.1.5.乙醯膽鹼酯酶(AchE)的組織化學著色通過利用改進的Geneser-Jensen和Blackstadt(1971，Z.Zellforsch.114460-481)的著色法而對AchE進行組織化學染色鑑定膽鹼能細胞。在培養液固定於4%仲甲醛後，細胞於4℃下在有AchE基質溶液存在下培養5-6天，所述基質溶液是由下列組成4mM乙醯硫代膽鹼碘，2mM硫酸銅，10mM甘氨酸和溶於50mM醋酸鹽緩衝液(PH5.0)中10μg/ml明膠。按前述(Hartikka and Hefti，1988，J.Neurosci.82967-2985)完成反應產物的顯色。
14.1.6用甲泛影醯胺密度梯度分餾腹角細胞分餾程序(Dohrman et al.，1986，Dev.Biol.118209-221)是改進的Schnaar和Schaffner(1981，J.Neurosci.1204-207)所述方法，甲泛影醯胺溶解於F12MEM(1∶1)的培養基中並且製備由3ml 17%的甲泛影醯胺，3ml 12%甲泛影醯胺和3ml 8%甲泛影醯胺組成的逐級梯度。下列步驟都在4℃下完成。按前述獲得的腹角細胞懸浮液(2.5ml)成層放在各等級梯度上，使用Swing-Out轉頭以2500×g轉速離心20分鐘，離心結果是細胞0-8%(餾份Ⅰ)、8-12%(餾份Ⅱ)和12-17%(餾份Ⅲ)界面上分三層。從每一界面收集很小體積(約1ml)的細胞平板培養、處理、並按所述方法檢驗。由餾份Ⅰ產生的神經元被保持於由培養的前角細胞產生的限制性培養基中。
14.2.結果和討論14.2.1.培養物的普通形態學生產在含Sera培養基的腹角細胞產生混合的神經元-神經膠質細胞培養物。24小時後，神經膠質全部變平並開始增殖，而只有少數幾個神經元開始延伸神經突。然而，48小時後，許多神經元長出神經突並且顯示特徵性的相一明亮體細胞(圖23)，2天時添加AraC後，非神經元細胞開始死亡並且浮起，留下含約5%神經膠質的富含神經元培養物。在規定的培養基中，培養物還含有大約5%的能為Ara C處理進一步還原的神經膠質。在甲泛影醯胺梯度-純化的運動神經元角培養物中(餾份Ⅰ)，實際上不存在神經膠質並且有90%以上的神經元是大的膽鹼功能神經元。
14.2.2 CNTF對神經絲(NF)水平的作用為了評價CNTF對神經元的作用。而測量NF水平。發現在CNTF處理(10ng/ml)的腹角培養物中就NF含量與未處理的對照物對比增長2.0倍。NGF並未產生任何重要的作用(圖24)。這一結果表明CNTF能增進存活和/或促進培養的腹神經元中神經突派生。
14.2.3.CNTF對含AchE神經元存活的作用為了確定增加NF水平是否反映出增加神經元存活或神經突派生，對AchE進行組織化學著色，因為在腹角培養物中絕大多數的神經元是膽鹼功能的運動神經元。發現CNTF處理的(10ng/ml)培養物比未處理的對照中AchE;陽性神經元增加2.5倍。NGF似乎具有很小的影響。這些結果表明CNTF能提高神經元的存活這可以解釋為NF水平的提高。
14.2.4.CNTF對CAT活性的影響為了估計CNTF對傳導物質表型表達的影響，要測量CAT活性的水平。CAT是Ach合成的一種速度限制酶，如圖26所示，添加CNTF(10ng/ml)能使CAT活性在培養7天後平均增加4.0倍，而添加其它生長因子。例如NGF(50ng/ml)和FGF(50ng/ml)，沒有作用。這種膽鹼功能活性的增加是與劑量有關的，當CNTF的濃度為1ng/ml(圖26B)時能達到最大應答。在處理後，這種增長快到3天就很明顯，而且好象不受培養物密度的影響。根據這些結果可以認為CNTF還可刺激膽鹼功能傳導物質表達，因為CAT活性的增加超過膽鹼功能神經元數增長的1.6倍;也就是說，存活的膽鹼功能神經元表達更多的Ach/神經元。
14.2.5延遲添加試驗腹角細胞被分成如圖27所示的三組。在圖27A中，CNTF(10ng/ml)是在平板培養時加到細胞中的，而且細胞在CNTF存在下保持7天。在圖27B和C中，在無CNTF下培養物保持2天或6天，然後在另外的7天用CNTF(10ng/ml)處理。延遲到第2天添加CNTF導致CAT活性減少增加到1.2倍。然而，延遲6天後，CNTF不再影響CAT的活性(圖27)。這些結果表明存在一群對CNTF敏感的神經元，通常如果在培養的幾天內沒有CNTF存在，它仍會死亡。如有CNTF存在，這些細胞存活並且表達出數量增加的Ach。
14.2.6 CNTF在神經膠質缺乏條件下對腹角培養物的作用減少腹角培養物中神經膠質細胞存在的方法有2種a)用抗有絲分裂劑處理(Arac;0.5μM)，和b)使用無血清的培養基。在任一種情況下，神經膠質群可降至總細胞的5%左右，然而，CNTF對CAT活性的作用保持不變(圖28)。這些結果表明CNTF對CAT活性的作用好像不是藉助於神經膠質傳遞的，而是來自神經元的直接應答。
14.2.7.CNTF對甲泛影醯胺梯度-純化的運動神經元的作用腹角培養物已富集膽鹼功能神經元。為保證培養物的均一性，通過密度梯度從腹角培養物進一步純化運動神經元。利用逐級甲泛影醯胺梯度根據它們較輕的浮力密度而選擇運動神經元。所得到的培養物含有90%以上的運動神經元，如早先Schnaar和Schaffner(1981，J.Neurosci.1204-207)所說明的。在純化的運動神經元培養物中，與未處理的培養物相比，CNTF(10ng/ml)能刺激CAT活性增長10倍(圖29)。甲泛影醯胺梯度能分開可能存在的來自大運動神經元的小膽鹼功能神經節前的交感神經元的汙染庫。結果證明CNTF能增進存活並且能刺激運動神經元中的膽鹼功能表達。
15.例睫狀神經營養因子對海馬狀突起培養物的作用15.1 材料和方法15.1.1 海馬狀突起細胞培養由Sprague-Dawley鼠的E18-19鼠胚胎解剖出海馬狀突起，並收集於F10培養基中。組織經搗碎用F10培養基(Gibco)衝洗兩次再用0.25%胰蛋白酶(Gibco)在37℃下作用20分鐘，胰蛋白酶可通過添加含血清的培養基作用失活，所述培養基的組成為最低基本培養基(MEM)補充胎牛血清(FCS.10%)，穀氨醯胺(2mM)，青黴素(25U/ml)和鏈黴素(25μg/ml)。收集通過輕度搗碎所獲得的分離細胞，再於低速(500rpm)下離心30秒，離心重複兩次，然後將細胞沉澱再懸浮於含血清的培養基中。細胞平板培養在6mm微滴板孔或35mm培養皿，它們已用聚鳥氨酸(10μg/ml)和昆布氨酸(10μg/ml)覆蓋。在大多數的實驗中，細胞以約71，000細胞/cm2較低密度平板培養。在細胞平板培養後的5-6小時，培養基換成無血清含1%N3和青黴素-鏈黴素(分別為25單位/ml和25μg/ml)的培養基，在此培養基中培養時加CNTF。每3-4天換一次培養基，同時再添加因子。
為了獲得富神經元的培養物，在24小時時間內加入胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C，0.3μM)。在這種條件下，海馬狀突起培養物含有大約5-10%神經膠質細胞，如由GFAP免疫組織化學所估價的。
15.1.2檢驗GAD酶活性按照Kimura和Kuriyama(1975，Jpn.J.Pharm.25189-195)的方法，通過測量由L-〔1-14C〕穀氨酸釋放CO2而決定GAD酶的活性。用30μl含50mM KH2PO4(pH7.2)和0.25%TritonX-100的溶液溶解35mm皿中的細胞，刮出來收集。用5微升的細胞裂解液測定GAD酶活性。在典型的檢驗中，反應混合物含有在KH2PO4緩衝液(50mM，pH7.2)中的0.57mM的L-〔1-14C〕穀氨酸(NEN，NEC-715，52.6mci/mmol)，穀氨酸(3mM)，吡哆醛磷酸鹽(0.2mM)和AET(1mM)。在這些反應條件下，發現酶反應呈線性直到2.5小時。培養於37℃下進行2小時，並且通過向反應混合物注射25μl的8N H2SO4而終止反應。培養延續另外60分鐘。釋放的14CO2用氯化苄乙氧胺(Hyamine)鹼溶液中捕獲並計數。
15.1.3.神經絲蛋白的測量按Doherty等人的方法(1984，J.Neurochem.421115-1122)定量神經絲蛋白，如14.13.部分所描述的。
15.1.4高親合性GABA攝取的測定用經修改的Tomozawa和Appel的方法(1986，Brain Res.399111-124)測量高親合性GABA的攝取。細胞用GABA攝取緩衝液洗滌，該緩衝液含140mM NaCl，2.6mM KCl，1mM KH2PO4，1mM Na2HPO4，6mg/ml葡萄糖，1mM MgCl2，1mM CaCl2，0.1%BSA。洗滌後，細胞與GABA攝取緩衝液一起於37℃培養5分鐘。然後加3H-Gaba(NEN、NET-191X，111.4Ci/mmol)達到最終濃度為12nM，並於37℃培養10分鐘。其後將細胞保存於冰上，再用攝取緩衝液洗滌三次。細胞用0.14N NaOH於室溫下培養2小時，對提取物中3H-GABA進行計數。發現在高達至少30分鐘內對3H-GABA攝取是線性的。GABA攝取到非神經元細胞可通過補加2mMB-丙氨酸而抑制，而用1mM3-哌啶甲酸的抑制作用可證實神經元的特異性攝取。
15.1.5 GAD或GABA的免疫組織化學染色細胞用4%仲甲醛於室溫下固定30分鐘，用PBS洗滌。對於GAD染色法，用50%，70%，和50%乙醇連續浸洗而滲透細胞。使用含5%正常兔血清的PBS連續浸洗一小時阻滯培養物，並用1∶6000稀釋的羊抗-GAD抗體1440於4℃培養過夜。用PBS清洗三次後，用1∶400稀釋的生物素化兔抗羊抗體，於室溫下培養細胞至少90分鐘。對於GABA染色法，在Tris-HCl(0.1M，pH7.3)中用Triton X-100滲透細胞，並用10%正常山羊血清阻滯90分鐘，然後用兔抗GABA抗體(1∶5000)於4℃培養過夜。用PBS清洗三次後，用1∶200稀釋的生物素化山羊抗兔抗體於室溫下培養細胞至少90分鐘。用Vectastain ABC試劑盒(Vector實驗室)觀測GAD或GABA免疫活性細胞。
15.1.6神經元特異性烯醇酶(NSE)的免疫組織化學染色在用4%仲甲醛固定後，用溶於含0.1%Triton X-100的PBS中的10%正常山羊血清(NGS)阻滯細胞。然後用第一種抗體(兔抗-NSE，1∶5000)於4℃下培養細胞過夜。再用第二種抗體(山羊抗兔按1∶200稀釋)於室溫培養細胞至少90分鐘。用Vectastain ABC藥盒(Vector實驗室)觀測NSE-免疫陽性細胞15.1.7 Calbindin組織化學染色法細胞用PBS清洗兩次，再用4%仲甲醛於室溫下固定30分鐘。在用1%正常的馬血清(NHS)洗滌，再用含5%NHS的PBS於室溫阻滯1小時後，細胞與溶於1%NHS中的鼠抗-Calbindin抗體(按1∶1000稀釋)於4℃培養過夜。該細胞再用1%NHS清洗三次，在室溫下用第二種抗體(馬抗鼠，按1∶400稀釋)培養90分鐘。用Vectastain ABC試劑盒(Vector實驗室)觀測Calbindin的免疫活性細胞。
15.1.8乙醯膽鹼酯酶的組織化學染色法根據Geneser-Jensen與Blackstadt方法(1971，Z.Zellforsch 114460-481)進行乙醯膽鹼酯酶的組織化學染色。細胞用PBS洗滌三次，並用4%仲甲醛於室溫固定30分鐘。固定的細胞再用含有50mM醋酸鹽緩衝液(pH5.0)，4mM乙醯硫膽鹼碘，2mM硫酸銅，10mM甘氨酸和10μg/ml白明膠的反應混合物培養。非特異的膽鹼酯酶受到培養介質中含有的0.2mM愛普把嗪(ethopropazine)的抑制。膽鹼酯酶染色的特異性通過添加5μm新斯的明進行檢驗。在培養7天結束時，在37℃短暫培養而溶解白明膠。用水洗滌細胞，用1.25%Na2S處理1分鐘，再用水洗滌。然後用1%AgNO3處理1分鐘，再用水和PBS洗滌。
15.1.9睫狀神經營養性因子所有試驗中使用的CNTF都是重組鼠CNTF，是按前面第12部分實施例中所描述的方法進行表達和純化
15.2結果取出發育年令為E18的海馬狀突起，進行培養，大多數神經元群體由分裂期後的錐形神經元組成。在平板培養後五至六小時，神經元已延伸成軸突，並有證據證明在培養1天後，細胞-細胞接觸。帶長突起的相-明亮細胞便是證據。
在各個時間期間，有或沒有CNTF的情況下，以低密度(約71，000個細胞/Cm2)培養海馬狀突起神經元。用CNTF(10ng/ml)連續處理海馬狀培養物，從而提高了該細胞攝取3H-GABA的能力(圖30)。CNTF誘導的特異性神經元對GABA攝取的增加的時間進程是慢的，如圖30A所示。在培養第6天;CNTF(10ng/ml)處理對GABA攝取有較少的提高，並且在加CNTF後8天觀察到最大的增加，約4倍(與未處理的對照相比)。培養期長到11天沒有產生更大的提高。為進一步估價CNTF對培養物中海馬狀突起神經元的影響，在ELISA試驗之前，用一種抗神經絲蛋白質的抗體(RT97)定量分析神經絲蛋白質。已確定，到培養的第六天，神經絲只稍微提高，在第8天增加最大，約5倍(圖30B)。在1ng/ml CNTF的情況下可觀察到GABA攝取和神經絲蛋白質具有相似時間過程。
正如圖31所示，CNTF的作用似乎是與劑量有關。在0.01ng/ml時，特異性神經元的GABA攝取是增加的，在用0.1ng/ml CNTF處理8天的細胞時，增加最大，約3倍(圖31A)。CNTF濃度高達50ng/ml，沒有使GABA攝取有更大的增加。同樣，CNTF處理的培養物中神經絲蛋白質也以劑量依賴性的方式增加。在0.1ng/mlCNTF時，達到平穩狀態(圖31B)。CNTF的濃度高達50ng/ml，沒有進一步增加神經絲蛋白的量。
作為一種補充的方法研究CNTF對GABAergic神經元的影響，測定了有CNTF時培養8天的培養物中GAD酶活性。已發現CNTF以劑量依賴性方式提高海馬狀突起的神經元中GAD酶活性(圖31C)。所得到的劑量-響應曲線的形狀與對GABA攝取和神經絲蛋白的觀察結果是相似的。用0.1ng/mlCNTF可觀察到GAD酶活性增加到最大，為3.8倍。
為了考察CNTF對GAD酶活性的影響是否是由於對酶活性的誘導作用，或由於對GABAergic神經元的存活的影響，在有CNTF或沒有CNTF時，測定生長的細胞中GAD-免疫活性神經元的數目。在濃度為10ng/ml，CNTF分別使NSE-和GAD-陽性神經元數目增加2.2倍與2.3倍(圖32A)。用抗GABA的抗體進行免疫組織化學染色得到類似的結果(圖33A)。曾將Calbindin定位到海馬狀突起的神經元的亞群包括齒狀回，CAl錐體神經元和一些中間神經元(Balmbridge和Miller1982，Brain Res.245223-229)。CNTF(10ng/ml)處理低密度海馬狀培養物，使Calbindin免疫陽性細胞增加3倍(圖32B)，培養8天後，與對照相比，在CNTF處理的培養物中乙醯膽鹼酯酶陽性細胞數也增加約17倍(圖33B)。
為進一步提供證據證明CNTF是作為挽救培養物中GABAergic神經元的存活因子，而不是起誘導GABAergic表型特性的作用，進行延遲添加試驗。在平板培養後不同時間裡添加CNTF(10ng/ml)，在培養第8天測定培養物中GABA攝取量或神經絲蛋白質水平。如圖34A所示，如果延遲一天，添加CNTF，在七天後檢測時，則CNTF-誘導的GABA攝取增加已降低。如在平板培養的第三天添加CNTF，則CNTF不再使GABA攝取增加。當延遲三天添加CNTF時，CNTF誘導的神經絲蛋白質增加有類似的降低(圖35A)。為了排除這種觀察結果是由於這種因子作用的時間不充分而產生的這一可能性，進行下面的試驗。將CNTF(10ng/ml)於培養的第三天加到培養物的細胞中，該因子處理細胞達8天，然後測定GABA攝取和神經絲蛋白質。在該條件下，CNTF沒有誘導GABA攝取增加，並且對神經絲蛋白質的影響大大降低(圖34B，35B)。
曾證明星形細胞是許多神經營養性因子(包括CNTF)的豐富來源。為研究CNTF的作用是通過從膠質細胞釋放這些因子，而不是直接對神經元起作用的可能性，研究了在富含神經元的培養物中CNTF誘導的GABA攝取的增加。如圖36所示，與未處理的對照相比較時，在Arac處理的培養物中，CNTF使GABA攝取增加2.4倍。在神經元-神經膠質的混合培養物(-Arac)或在富含神經元的培養物(+Arac)中，對GABA攝取的刺激作用是相似的。另外，在Arac處理的培養物中CNTF劑量-響應曲線稍向左移動，產生最大響應所需要的CNTF濃度較低(與0.1ng/ml相比只有0.03ng/ml)。
CNTF對GABAergic神經元的影響取決於細胞平板培養時的密度。在以71000細胞/cm2的低密度平板培養時，CNTF(10ng/ml)產生的GABA攝取增加約為2.6倍
CNTF的效果可用選擇性誘導GABAergic表型標記進行解釋。然而，延遲添加的結果強烈地支持CNTF起存活作用的論點。我們發現，當延遲三天後添加CNTF時，CNTF不能對GABAergic細胞產生影響。儘管神經絲蛋白質水平仍顯著地增加，但其作用比在零天時加CNTF所觀察到的作用小得多。
CNTF的密度相關作用表明，在高密度時，細胞存活似乎不需要CNTF。這可能是由於由神經元或星形細胞局部釋放內生神經營養性因子，或者是由於細胞-細胞相互作用。曾證明，在星形細胞存在下，提高海馬狀突起神經元存活(Banker和Cowan，1977，Brain Res.126397-425)。可能是所涉及這種因子是CNTF或神經營養性族的一員。在神經元富集的培養物中，CNTF對GABA攝取和神經絲蛋白質的作用不受影響。該結果與CNTF影響中的星形細胞的作用形成尖銳對立，並且認為其影響是通過對神經元的直接作用傳遞的。使用真菌標記的CNTF配體和真菌抗體，我們有證據證明在該神經元上有CNTF的受體存在。
CNTF對海馬狀突起神經元的存活促進活性似乎不限於GABAergic神經元。我們有證據證明，在CNTF存在下，乙醯膽鹼酯酶-免疫陽性細胞數目也增加。在CNTF處理的培養物中，AchE-組織化學染色的強度比預計的大得多。可能CNTF對側正隔的膽鹼能神經元的退化存活與分化因子的作用方面具有重要的意義。
在CNTF存活下，神經元表型的兩種一般標記NSE和NF的表達都是增加的。使用酶結合的免疫吸附劑試驗測定NF蛋白質累積。使用的單克隆抗體(RT97)顯著地識別該NF蛋白質三聯體的(圖37A)。在較高的平板密度(143000細胞/cm2)，在飽和濃度(10ng/ml)下，CNTF沒有誘導GABA攝取的有效增加。類似地，CNTF對神經絲蛋白質水平的影響也取決於細胞密度(圖37B)。這或許是由於在高密度培養物中神經培養性因子水平提高。以前曾證明培養物中海馬狀突起神經元對穀氨酸神經毒性是很敏感的(Mattson，M.P.等人(1988)J.Neurosu.82087-2100)。正如圖38所示，我們曾用比色MTT試驗研究了不同濃度的穀氨酸(10-1000μM)的神經毒性作用。在1mM濃度，穀氨酸使細胞存活降到約10%。在CNTF存在下(10μg/ml)，細胞接觸穀氨酸後，細胞存活有提高。
15.3 討論已證明CNTF提高了培養物中幾種不同神經元群體的存活與生長。另外，已證明類似CNTF的活性物能誘導培養物中來自膠質先祖細胞的類型-2星形細胞的分化(Hughes等人，1988，Nature 33570-73，Lillien等人，1988，Neuron 1485-494)。我們已提供在CNS中CNTF新作用的證據，也就是說，CNTF維持從E18海馬狀突起中分離出的神經元的體外存活。CNTF處理海馬狀突起的神經元能使對GABA攝取的增加，並伴隨GAD酶活性的增加。在CNTF存在下，海馬狀培養物中神經絲蛋白質水平有類似的增加。劑量-應答研究表明這些各種標記之間有相關性，以及在0.1ng/ml CNTF時達到CNTF的最大效果。更高濃度的CNTF似乎得不到更大的效果。
200KDa形式，以及在較小程度上識別150KDa亞單位。以前曾證明，RT97的結合水平可能作為培養的神經元中神經突派生，尤其是軸突派生的任意指數(Doherty等人，1984，Neurosci.Lett.5155-60)。用CNTF保持八天的海馬狀突起的培養物中存在一個稠密和複雜的突起網絡。NF蛋白質相對量的這種增加對改善的神經元存活來說僅僅可能是次要的。換句話說，CNTF對誘導軸突派生可能具有選擇性的影響。
CNTF促進存活活性的專一性曾通過研究海馬狀突起中存在的已知的其它神經營養性因子的作用進行過討論(Maisonpierre等人，1990.Science 2471446-1451)。以前的觀測結果表明NGF不是海馬狀突起的神經元的存活因子，與此結果相一致的是，未能檢測到NGF對GABAergic神經元的任何影響。神經營養性族中的另一個成員，BDNF，似乎也不會促進培養物中GABA ergic神經元的存活。另一方面，已證明bFGF是海馬狀突起的一個重要的存活因子(Wallicke et al.，1986，PNAS USA 833012-3016)，並且已推斷bFGF作為CNS的神經營養性因子的作用(Morrison et al.，1986，PNAS USA 837537-7541;Anderson et al.，1988，Nature 332360-361)。與bFGF相類似，CNTF在非常低的濃度下是有活性的。
已證明海馬狀突起受到幾種神經退化錯亂疾病的影響，其中包括Alzheimer病。現在還未弄清楚導致海馬狀突起產生選擇性退化的基本機制。曾假定，興奮性胺基酸神經遞質穀氨酸可能在致病過程中起作用。論證CNTF可以維持海馬狀突起神經元體外存活，這對於設計治療神經退化病的方法可能具有重要的意義。正如曾對FGF所作的觀察一樣(Mattson et al.，1986，PNAS 837537-7541)，確定CNTF是否可以保護海馬狀突起神經元免受穀氨酸神經毒性是重要的。近來曾用Northern印跡分析檢測海馬狀突起中的CNTF信使RNA(Masia Kowski，個人通訊)。體內CNTF合成的細胞類型特異性至今仍未確定。在體內，CNTF對發育中的海馬狀突起的生理作用仍需繼續證實，但根據本文的發現，CNTF可能是一種內生神經營養性因子，具有調節海馬狀突起的神經元存活的潛在作用。
16.實施例大鼠CNTF提高培養物中鼠海馬狀突起的星形細胞增殖的速率16.1 材料和方法16.1.1 製備鼠海馬狀突起的星形細胞從E18鼠胚胎切割出海馬狀突起，並收集到含有24mM HEPEs的F10培養介質中(Gibco)。該組織切碎成小塊並用0.25%胰蛋白酶(13海馬狀突起/5ml 0.25%胰蛋白酶)於37℃消化20分鐘。在另外10分鐘裡加DNA酶，達到最終濃度為0.2mg/ml。其反應用等體積DME終止，該DME補充10%胎牛血清，其組織再洗滌兩次。用輕度研磨得到的分離細胞收集到DME/FCS中，懸浮液通過20mm Nitex篩(Tetko)除去原料中的碎塊。用錐蟲蘭排斥法測定細胞生存性。然後將細胞培養於組織培養塑料T75瓶中，濃度為4.82×106細胞/瓶。在培養的第1、3、5、7和9天分別用DME-FCS(10ml)更換培養介質。在第7天和第9天，用手搖瓶除去少突神經膠質細胞和任何存活的神經元。在第10天，用0.25%胰蛋白酶除去星形細胞，並用培養於96孔平板上供試驗。
16.1.2.在鼠的海馬狀突起星形細胞中CNTF有絲分裂試驗對於有絲分裂試驗，以密度為16000細胞/孔將星形細胞培養於含有10%胎牛血清的介質(DMEM)中4小時，使細胞粘連。然後清洗細胞，再加150μl規定的介質(DMEM，0.5% BSA)。將如上述第7節實施例所述製備的重組鼠CNTF加入介質中24小時。在24小時培養期的最後2個小時，用1μc/孔3H-胸苷(NEN，20ci/mM)標記上述細胞。培養之後，細胞作如下處理用PBS洗滌培養孔兩次，並在50ml 10%三氯乙酸(TCA)中於4℃培養過夜。除去TCA後，用冷水洗滌細胞，溶於100μl 1N NaOH中，並在10ml水溶膠中用液體閃爍計數器計數。
16.1.3(125I)CNTF結合試驗在37mm2培養皿中使海馬狀突起星形細胞生長達到約80-90%連生。星形細胞單層首先用Ham′s F-12培養質清洗兩次，然後加Ham′s F-12(1ml)，細胞在冰上培養15分鐘。再用等體積的冷Ham′s更換培養介質。在作為非競爭結合測定的井孔裡，加入未標記CNTF(100×過量的未標記CNTF)，並在4℃將培養物再培養物60分鐘。在每份培養物中加入125I-CNTF(用Bolton-Hunter試劑製備，10μl含每毫微摩爾約112μci的280，000dpm)，再在4℃繼續培養不同的時間，最高達60分鐘。用含10mg/ml BSA的冷PBS溶液洗滌細胞3次(每次2ml)除去未結合的CNTF。然後將該培養物在室溫下在0.5ml 20mM Tris-HCl，pH7.2，0.15M NaCl，1%Triton，0.1%SDS，1%脫氧膽酸鹽中培養至少20分鐘，使細胞溶解。除去細胞裂解物，並用含10μl/ml BSA的PBS清洗培養物二次(每次250μl)。將清洗液和細胞溶解產物一起收集，在γ計數器進行計數。
16.2 結果增殖試驗的結果示於圖39，其結果表示隨著鼠海馬狀突起的星形細胞中CNTF濃度增加的雙相劑量響應曲線。CNTF引起3H-胸苷摻入增加，直到劑量為0.01ng/ml。濃度高於0.1ng/ml時，CNTF失去刺激細胞增殖的能力。
星形細胞對CNTF的生物響應表明這些細胞具有功能性CNTF受體。另外兩個證據支持起初的發現，類1星形細胞表達它們細胞表面上CNTF受體。在單層培養物中用(125I)CNTF進行的結合試驗證明可競爭的配體-受體的位置;所觀察到的最大特異結合的125I-CNTF約為加到每種培養物中的總CNTF的1%。此外，Northern印跡分析表明CNTF強烈地誘導很早的基因C-fos的表達。到1小時觀察到最大的mRNA誘導作用，而到2小時則返回到正常的基部水平。
17.實施例睫狀神經營養性因子的新單克隆抗體和人體睫狀神經營養性因子的雙抗體夾層試驗17.1 材料與方法17.1.1睫狀神經營養性因子的單克隆抗體的產生17.1.1.1 免疫方法用完全的弗氏佐劑中的10-40μg重組人CNTF(按實施例12中描述的方法製得的)接種CB6F1/J雌鼠，然後用完全弗氏佐劑的rCNTF再接種，每三星期一次，直到約6個月。
17·1·1·2雜種瘤的形成用PEG4000將免疫鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按2∶1比例(淋巴細胞∶骨髓瘤細胞)融合，然後在有2%HAT(次黃嘌呤，氨蝶呤、胸苷)的完全RPMI中，細胞密度為每井孔約105淋巴細胞培養細胞12選擇雜交瘤。
17·1·1·3篩選對CNTF具反應性的雜交瘤用與塑料試驗盤結合的重組體hCNTF，通過酶結合的免疫吸附劑試驗(ELISA)對人體CNTF(hCNTF)反應性抗體進行初步鑑定。抗體與重組體hCNTF、重組體大鼠CNTF(rCNTF)以及下面敘述的修飾過的hCNTF的反應能力，進一步用ELISA和Western免疫吸附法表徵。
17.1.2 人體CNTF變異體的製備人體CNTF的變異形式當通過在第13.1.2節中敘述的載體的表達與純化產生的。簡要地說，人體CNTF變異體蛋白質＃112是通過載體pRPN112的表達得到的，並在人體CNTF羧基末端上缺少55個胺基酸殘基。蛋白質＃49是用pRPN59產生的，且缺少hCNTF的羧基端的15個胺基酸。蛋白質＃82是一種融合的蛋白質，其中缺失人體CNTF的開始的66個胺基酸，該分子的剩餘部分融合到一種未鑑定的人體蛋白質(圖22)。
17.1.3雙位點免疫試驗方法學為了測定生物原料樣品中CNTF的量，對蛋白質進行免疫學分析試驗是有利的。一種靈敏方便的免疫分析是雙抗體夾層法(參見如E.Harlow和D.Lane，Anti bodiesA Laboratory Manual.，1988，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，P.578-583)。在該方法，第一個抗體與固體載體結合，使它們能與含有相關抗原的溶液反應;然後將通常對應於該抗原上的不同表位的第二個抗體，與第一個抗體結合的抗原反應，並對所結合的第二個抗體的量(它應與結合的抗原的量成正比)進行定量。本方法的一個實施方式中第一個和第二個抗體兩者都是單克隆抗體。
圖40表示對人體CNTF進行的雙位點分析。實質上，對鼠免疫球蛋白G的一個亞類(在所指的情況下為IgG2b)特異性的親和純化的第二抗體吸附到分析平板上，並用於從雜交瘤細胞的消耗盡的培養物上層清液中第一單克隆抗體(RP3-12，鼠的IgG2b)然後加人體CNTF，使其與第一種單克隆抗體結合。再加入與第一種單克隆抗體不同亞類的第二種抗-CNTF單克隆抗體(RP12-2，一種鼠的IgG1)，該抗體來自未分離的雜交瘤培養物上層清液，並使其與由第一種單克隆抗體俘獲的CNTF結合。任何結合的RP12-2分子按如下方法檢測，使用對鼠IgG1特異性的親合-純化的第二抗體，與鹼性磷酸酶結合，然後用磷酸酶底物對硝基苯磷酸酯培養，磷酸酯分裂產生有顏色的反應產物(測定405nm處的吸收值)。
17.2結果與討論用RP3-12和RP3-17表示的該類單克隆抗體是利用單次免疫老鼠的脾細胞由同樣的融合試驗產生的。RP3-12和RP3-17兩者都不與試驗用的兩個羧基末端缺失的hCNTF中的任何一個反應，而且也不與表Ⅴ中所列的大鼠CNTF結合。然而，它們與融合蛋白質＃82反應，該融合蛋白質＃82中保留有hCNTF羧基末端。因此，這些抗體識別位於hCNTF羧基末端附近的表位(或相近空間結構的表位)，該表位位於hCNTF蛋白質＃59中缺失的羧基一端部的15個胺基酸殘基片段內或與該片段重疊，相反地，單克隆抗體RP12-2和RP12-9與hCNTF蛋白質＃59和hCNTF蛋白質＃112兩者反應，也與融合蛋白質＃82反應。因此，這兩種抗體應該識別大約位於在hCNTF的66位胺基酸與145位胺基酸的表位。其圖譜資料表明，由RP12-2和RP12-9識別的表位應該是由RP3-12或RP3-17識別的表位上遊至少約40個胺基酸殘基(圖22)。RP12-2與RP12-9抗體(表Ⅴ)在於識別大鼠CNTF的能力上的差別，意味著它們識別不同的表位，其中之一(由RP12-9識別的)在齧齒動物和靈長類動物中或許很好地保存著。在Western免疫吸印測定法中，所有這些單克隆抗體有與變性CNTF結合的能力，由此可假定它們識別單一的表位，包括鄰近的或間隔很近的胺基酸殘基，而不是構象表位。
進行初步實驗確定對hCNTF的成對單克隆抗體是否適應這種配體的雙抗體夾層分析。在大規模生產或純化這種抗體之前，設計一種試驗來評價早期階段的這種抗體，即利用亞類專一的抗鼠免疫球蛋白試劑使一種單克隆抗體固定到固體載體上，並分別測定第二種「指示器」單克隆抗體。由於要求兩種單克隆抗體屬於不同的亞類，僅僅某些單克隆抗體對能用這種方法評價。採用在已描述雙位免疫測定法中的RP-3-12和RP-12-2這一對單克隆抗體可以得到極好的結果。圖41示出二個抗體夾層試驗結果，滴定時重組體人體CNTF的量逐漸增加(通過兩個因子)由每次試驗7.8微微克(0.156ng/ml為50μl)增加到每次試驗500微微克(10ng/ml為50μl)。用15.6微微克人體CNTF就可測得背景(0.044±0.010吸收單位)上的可信信號，並且直到所試驗的最高水平，其試驗結果都是線性的。用適當亞類的不相於的鼠骨髓瘤蛋白質取代該單克隆抗體中的任何一種(Mopc-141，一種IgG2b，取代RP3-12;或Mopc-21，一種IgG1，取代RP12-2)都使信號降低到背景水平。
因此，甚至使用未經純化的培養物上層清液，用單克隆抗體RP3-12和RP12-2都可以證明人體CNTF的雙抗體夾層試驗極好。這些單克隆抗體都可用常規的方法由在無血清的介質中生長的雜交瘤細胞的上層清液中純化得到。可以預料將更直接地研製一種較簡單的夾層試驗，其中一種單克隆抗體可以直接與固體載體結合，而第二種抗體將直接接到指示器上(例如如放射性同位素125碘，或一種酶，如鹼性磷酸酶，辣根過氧化酶，或β-半乳糖苷酶;或一種半抗原，如生物素，它可用標記的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白測定)，因此避免需要類型專一的第二種抗體。
這裡描述的高專一性的靈敏抗體夾層測定法在很多情況下都可使用，在這些情況下希望定量測定人體CNTF的存在。例如，可以用於純化步驟中監測人體CNTF。同樣地，該測定方法可以用於監測在注射到實驗動物之後的CNTF，以確定它所定位的組織。最後，該測定方法還可以用於測定健康人與病人的人體組織和/或體液(如血清或腦脊髓液)中CNTF的水平。因為發現CNTF在神經細胞內，並且具有神經營養性活性，表明在對各種類型神經損傷或疾病的應答中釋放該蛋白質。因此，合適的胞外液中CNTF水平所以為諸如神經病或神經元退化之類的症狀提供定量的診斷性測量。
18.睫狀神經營養性因子促進培養物中脊髓運動神經元的存活18.1材料與方法18.1.1組織培養技術在立體顯微鏡下，從發育六天的雞胚胎的脊髓索的腹部切下運動神經柱，貯存在補充有葡萄糖(4g/l)冷的無鈣鎂的Hanks平衡的鹽溶液(HBSS)中。組織用HBSS洗滌，在輕度搖動下於37℃用0.03%胰蛋白酶在HBSS溶液中處理20分鐘，用冷的HBSS清洗，在1ml 0.1%冷的大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma)的HBSS溶液中，用8孔攪拌器進行3個步驟的輕度研磨後，通過燒邊的矽化巴斯德移液管。每份上層細胞懸浮液用50μm尼龍篩過濾，收集並倒到置於12ml矽化錐形玻璃管管中的溶於HBSS-25mM HEPES(pH7.4)的4ml 6.8%的冷的metrizamide(Fluka)上。該管於4℃用400g離心15分鐘，並將中間層(0.5ml)收集到另一個裝有6.5ml冷培養介質的矽化管，該介質是補充葡萄糖(4g/l)的Leibovitz′s L-15培養介質(Gibco)。0.15M碳酸氫鈉、熱失活的和已過濾的馬血清和青黴素G(105單位/ml)的混合物，其比例為75∶15∶10∶0.1，新鮮製備並用5%CO2緩衝。在4℃以100×g離心7分鐘後，除去上清液，再將細胞緩慢地再懸浮在培養介質中，並在Greiner 4-井培養皿(井直徑，10mm，C.A.Greiner and Sohne GmbH，Nurtingen，West Germany)以1000-2000細胞/井密度平板培養。該皿已用聚-DL-鳥氨酸(Sigma，在0.15M硼酸鈉緩衝液(pH8.3)中0.5mg)在4℃預覆蓋過夜，再用磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)清洗，其後用昆布氨酸(Gibco;溶於血清已除去的培養介質中為10μg/ml)覆蓋，再放到5%CO2-培養箱中直到細胞平板培養(5-6小時)。細胞於37℃在潮溼的5% CO2-和95%空氣的培養器中培養。在平板培養後1小時加入樣品，在24小時和72小時後更換培養介質。在平板培養後3小時計算初始的細胞數。
18.1.2.退化標記運動神經元與估算運動神經元培養物的純度在某些實驗中，細胞製備前在體內用螢光染料退化標記運動神經元(U.Dohrman等人，1986，Dev.Biol.118209-221)以鑑定運動神經元細胞群體。在培育了5天的蛋殼上打一個小孔，將小片若丹明異硫氰酸鹽晶體(Sigma)在二個或三個位置上插入各個後肢大腿中，其蛋殼孔用玻璃紙帶封住。該蛋再培養24小時，在甲醛固定之後，一將處理過的胚胎製成冷凍切片。在脊髓索內，僅發現側運動神經元柱被標記。對於使用上述方法(18.1.1)製備細胞時使用其他胚胎。在培養5小時後，細胞用溫熱的HBSS清洗，用含4%甲醛的PBS溶液於室溫固定20分鐘，用PBS清洗，然後用玻璃蓋片置到甘油-PBS(1∶1)中。細胞總數的約83%被標記，並鑑定如圖42運動神經。這些標記的運動神經大部分都是大細胞，其餘的是中等大小的細胞。小細胞沒有被標記。另一方面，在螢光染料未標記細胞的實驗中，細胞總數中近70%是具有園細胞體的大的相一亮細胞，約20%是中間大小神經元(其中大部分可能是運動神經元)和約10%是小的未成熟神經元(它們同生長錐體具有類似神經元的突起，而具有相一暗半平細胞體)。非神經元細胞或者不存在，或者總計不到2%。一併參考，人們可以得出結論，至少83%的細胞是運動神經元，而其餘的由非標記的運動神經元，及少量未鑑定的中等大小神經元和約10%未成熟的小神經元組成。我們還發現，如果用雞的胚胎肌提取物培養已標記的細胞(U.Dohrman等人，1986，DeV.Biol.118209-211)，其螢光-陽性細胞數在數天內降低。因為總細胞數或大細胞數減少慢得多，這表示螢光的損失和/或衰減而不是細胞死亡。因此，要估算常規試驗中樣品的存在活性，大的相-明亮細胞而不是螢光陽性細胞計數作為運動神經元。
18.2 結果與討論18.2.1睫狀神經營養性因子(CNTF)對培養物中雞胚胎脊髓運動神經元的影響空白對照的培養物中，大部分運動神經元在3天內死亡。在重組鼠CNTF存在下，3天後培養物中約70%是活的，6天後培養物約60%是活的(圖43和圖44)。因為空白對照中大部分運動神經元在3天內死去，所以存活活性在第3天計算。CNTF的濃度-響應曲線(圖45)表明，CNTF的EC50(存活50%所要求的濃度)是如約20pg/ml(1PM)一樣低，幾乎與在睫狀神經元的結果相同。EC50很低的CNTF，其存活活性很大，這可充分地認為，正如已證明的那樣(參見上面的實施例11;Sendtner等人，1990，Nature 345440-441)，CNTF對體內運動神經元存活可能起關鍵作用。
18.2.2特定的神經營養性分子與細胞運動的存活影響在所有已試驗的分子中，CNTF和鹼性成纖維細胞生長因子(FGF)證明是最有效的分子(表Ⅵ)。當培養物補充有肝素時，酸性FGF的存活活性可能增加，肝素幹擾酸性FGF的蛋白水解降解。類似胰島素的生長因子(IGF)Ⅰ和Ⅱ和胰島素都顯示小的影響，這些活性分子的濃度-響應曲線(圖46)表明，可以用下述條件得到最高的存活作用(a)1ng/ml的CNTF＝64%存活;(b)30ng/ml的鹼性FGF＝51%;(c)300ng/ml的酸性FGF＝18%;(d)在1μg/ml肝素存在下，100ng/ml酸性FGF＝35%;(e)100ng/ml的IGF-Ⅰ＝15%;(f)300ng/ml的IGF-Ⅱ＝15%;(g)25μg/ml的胰島素＝16%。CNTF的EC50值是0.023ng/ml與鹼性FGF的是0.26ng/ml。對於IGFⅠ和Ⅱ以及胰島素，可信的EC50值還不能測出來，因為與對照相比時，其最大的效果也是很小的。
肝素的濃度對提高酸性FGF的活性是至關重要的。本實驗中使用的濃度(1μg/ml)，相對於提高酸性FGF的存活活性來說似乎不是最大。然而，較高的肝素濃度造成神經元脫離培養盤。甚至肝素濃度為1μg/ml，在培養3天後吸附的神經元就開始脫離。甚至當使用超最大濃度(相對於對其他類細胞的生物學作用)時，βNGF、BDNF、pDGF、EGF、TGFa、TFGβ1、IL-1β、IL-3或IL-6或IFNc都沒有可察覺的作用。在這些試驗中也使用NT-3，一種NGF-BDNF基因族中新的神經營養性分子。由支持培養物中胚胎結節狀神經節的神經元的存活的已轉染COS-細胞，產生的NT-3蛋白質的濃度似乎對運動神經元沒有存活作用。
18.2.3.CNTF、鹼性FGF與IGF-Ⅰ結合CNTF與鹼性FGF在最佳濃度下結合導致在一星期以上期間運動神經元100%存活(表Ⅶ)。CNTF、鹼性FGF和IGF-Ⅰ的結合也得到完全相同結果。IGF-Ⅰ本身的作用是小的(表Ⅵ)，但是當它與CNTF和/或鹼性FGF之任何一個組合時都變更明顯(表Ⅶ)。
表Ⅵ已知分子的運動神經元存活活性分子濃度存活a對照 -bNGF(鼠) 10μg/ml -BDNF(豬) 10μg/ml -NT-3 -CNTF(鼠，rec.) 500pg/ml +++鹼性FGF(人，rec.) 10ng/ml ++酸性FGF(人體，rec) 300ng/ml ±酸性FGF+肝素 100ng/ml+1μg/ml ++pDGF(rec.) 5ng/ml -EGF(鼠) 10ng/ml -TGFa(人體，rec.) 10ng/ml -TGFβ1(豬，rec.) 5ng/ml -IL-1β(人體，rec.) 100單位/ml -IL-3(鼠，rec.) 100單位/ml -IL-6(鼠，rec.) 50單位/ml -
表Ⅵ(續)分子濃度存活aIFNc(鼠，rec.) 1000單位/ml -IGF-Ⅰ(人體，rec.) 100ng/ml ±IGF-Ⅱ(人體，rec.) 300ng/ml ±胰島素(牛的) 25μg/ml ±轉鐵蛋白(人體) 100lg/ml -a培養3天後測定的存活活性，並用-～+++估算-與對照無顯著差別(存活8.3±3.8%，平均值±SD，n＝18);±約15-20%(與每個空白對照有統計學上的顯著差異，P＜0.01);++約35-55%;+++約55-75%。由不同試驗的結果合併得到這些結果。
rec為重組體。
表ⅦCNTF、鹼性FGF和IGF-Ⅱ的附加作用因子運動神經元存活(%)a對照 4.8±1.0IGF-Ⅰ(1μg/ml) 14.5±0.5＊＊鹼性FGF(30ng/ml) 51.9±3.6CNTF(1.5ng/ml) 60.7±5.8鹼性FGF+IGF-Ⅰ 76.1±4.1＊＊CNTF+IGF-Ⅰ 87.0±4.5＊鹼性FGF+CNTF 98.2±3.0鹼性FGF+CNTF+IGF-Ⅰ 102.5±5.3NS
a在培養3天後。由計算相應於每個井底之23%的面積內細胞數來測定運動神經元的存活。平均值±SEM(n＝4)。＊，P＜0.05;＊＊，P＜0.01;NS，不顯著。t-試驗結果僅表示有或沒有IGF-Ⅰ的值之間的比較，因為IGF-Ⅰ的作用是相當小的。任何其他有意義的比較中的差異都是顯著的(P＜0.01)。
19.微生物的寄存下面的重組噬菌體和重組質粒DNA保藏於美國典型培養物收集中心12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852。
ATCC登記號 寄存日期質粒 PCP-r-CNTF-C-1 40655 89.9.12質粒 pCMV-rCNTF-C-1 40656 89.9.12噬菌體 λhCNTF-G-1 40657 89.9.12雜交瘤 RP3-12 90.8.15雜交瘤 RP12-2 90.8.15以下重組體質粒DNA寄存於農業研究培養物收集處(NRRL)Northern Regional Research Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61640。
NRRL登記號 寄存日期質粒 pRPN38 90.8.15質粒 pRPN40 90.8.15本發明的範圍並不受到在這裡描述的特殊實施方式的限制。的確，除了這裡所敘述的以外的本發明的各種改進，本技術領域的技術人員根據前面的敘述和附圖，都將變得是顯然易見的。計劃進行的這種改進都落在所附權利要求的範圍之內。
這裡引用了各種出版物，所公開的內容，完整地作為本發明的參考文獻。
權利要求
1.一種重組DNA分子，它包含一種編碼睫狀神經營養性因子的核酸序列或它的至少含約10個核苷酸的亞序列。
2.權利要求1的重組DNA分子，其中編碼睫狀神經營養性因子的核酸順序或亞順序實質上是如圖1(b)所描述的。
3.權利要求1的重組DNA分子，其中編碼睫狀神經營養性因子的核酸順序或亞順序實質上是如圖1(b)所描述的從約核苷酸79到核苷酸581的序列。
4.權利要求1的重組DNA分子，其中編碼睫狀神經營養性因子的核酸順序或亞順序實質上是如圖8(a)所描述的，並且是一種人的核酸序列。
5.權利要求1的重組DNA分子，其中編碼睫狀神經營養性因子的核酸順序或亞順序實質上如圖8(a)所描述的，從約核苷酸126到核苷酸724，並且是一種人的核酸順序。
6.權利要求1、2或4的重組DNA分子，該分子含有一個CDNA序列。
7.權利要求1、2或4的重組DNA分子，該分子含有一個基因組DNA順序。
8.權利要求2的重組DNA分子，它包含於質粒pCMV-rCNTF-C-1中，該質粒寄存於ATCC，寄存號為40656。
9.權利要求4的重組DNA分子，它包含於噬菌體λhCNTF-G-1，該噬菌體寄在於ATCC，寄存號為40657。
10.與權利要求1、2或4的重組DNA分子互補的重組核糖核酸分子。
11.一種核酸順序，該順序包含一種編碼蛋白質的序列，該蛋白質實際上同源於圖1(b)中所描述的胺基酸順序或者該序列的部分。
12.一種核酸順序，該順序包含一種編碼蛋白質的序列，該蛋白質實質上同源於圖8中所描述的人體胺基酸順序或者是該序列的部分。
13.一種核酸順序，該順序包含一種實質上與圖1(b)中所描述的核酸順序同源的序列或是該序列的一個能雜交的部分。
14.一種核酸順序，它含有實質上與圖8(a)中所描述的核酸順序同源的一種順序，或它的能雜交的部分。
15.權利要求1、2或4的重組DNA分子，其中編碼睫狀神經營養性因子蛋白質或肽的核酸順序的表達，是受第二種核酸順序調節的，因此，腦衍生的神經營養性因子蛋白質或肽是在用該重組DNA分子轉化的寄主中表達的。
16.權利要求14的重組DNA分子，包含於pCMV-rCNTF-C-1中。
17.含有權利要求1、2或4DNA分子的一種核酸載體。
18.一種含權利要求1、2、4或13的DNA分子的重組微生物。
19.權利要求18的重組微生物，它是細菌。
20.權利要求18的重組微生物，它是酵母菌。
21.一種含有權利要求15的重組DNA分子的細胞。
22.一種含權利要求16的重組DNA分子的細胞。
23.一種核酸順序，它包含編碼實質上如圖1(b)描述的胺基酸順序的序列，或者是，其包含一種抗原決定簇的亞順序。
24.一種純化蛋白質，它包含實質上如圖1(b)描述的一種胺基酸順序，或它含一種抗原決定簇的亞順序。
25.一種純化的蛋白質，它包含實質上如圖1(b)所描述的一種胺基酸順序，或者它的含一種功能活性肽的亞順序。
26.一種純化的蛋白質，它包含實質上如下的胺基酸順序MV LLEQKIPENEADGMPAT VGDGGLFEK或它的含一個功能活性肽的亞順序。
27.一種純化蛋白質，它包含如人體胺基酸順序一樣的，實質上如圖8(a)中描述的胺基酸順序，或它含一個抗原決定簇的亞順序。
28.一種純化的蛋白質，它包含實質上如圖8(a)中描述的人體睫狀神經營養性因子的胺基酸順序，或它含一個功能活性肽的亞順序。
29.一種生產睫狀神經營養性因子蛋白質或它的片段的方法，包括使含有權利要求1DNA分子的重組微生物生長，便於該微生物表達DNA分子;以及分離表達出的睫狀神經營養性因子蛋白質或片段。
30.一種生產睫狀神經營養性因子蛋白質或它的片段的方法，包括使含有權利要求2或權利要求4的DNA分子的重組體微生物生長，便於微生物表達該DNA分子;以及分離表達出的睫狀神經營養性因子蛋白質或片段。
31.根據權利要求30所述的方法，其中微生物是細菌。
32.一種生產睫狀神經營養性因子蛋白質或它的片段的方法，包括(a)在這種微生物能表達DNA分子的條件下，使含有權利要求15的DNA分子的重組微生物生長;以及(b)分離表達出的睫狀神經營養性因子蛋白質或片段。
33.一種生產睫狀神經營養性因子蛋白質或它的片段的方法，包括(a)在微生物表達DNA分子的條件下，使含有權利要求16的DNA分子的重組體微生物生長;以及(b)分離出表達的睫狀神經營養性因子蛋白質或片段。
34.一種生產睫狀神經營養性因子蛋白質或它的片段的方法，包括(a)在寄主能表達DNA分子的條件下，使含有權利要求2的DNA分子的重組體受體生長;以及(b)分離出表達的睫狀神經營養性因子蛋白質或片段。
35.一種生產睫狀神經營養性因子蛋白質或它的片段的方法，包括(a)在寄主能表達DNA分子的條件下，使含有權利要求4的DNA分子的重組體受體生長;以及(b)分離出表達的睫狀神經營養性因子蛋白質或片段。
36.根據權利要求34或35所述的方法，其中寄主是真核細胞。
37.根據權利要求34或35所述的方法，其中寄主是非人體轉移基因動物。
38.權利要求29方法的產品。
39.權利要求30的方法的產品。
40.權利要求31的方法的產品。
41.權利要求32的方法的產品。
42.權利要求33的方法的產品。
43.權利要求34的方法的產品。
44.權利要求35的方法的產品。
45.權利要求36的方法的產品。
46.權利要求37的方法的產品。
47.權利要求38的產品，該產品不含去汙劑。
48.權利要求39的產品，該產品不含去汙劑。
49.權利要求40的產品，該產品不含去汙劑。
50.權利要求41的產品，該產品不含去汙劑。
51.權利要求42的產品，該產品不含去汙劑。
52.權利要求43的產品，該產品不含去汙劑。
53.權利要求44的產品，該產品不含去汙劑。
54.權利要求45的產品，該產品不含去汙劑。
55.權利要求46的產品，該產品不含去汙劑。
56.權利要求38、42或43的產品，該產品己糖基化。
57.權利要求39的產品，該產品己糖基化。
58.權利要求38、42或43的產品，該產品未糖基化。
59.權利要求39的產品，該產品未糖基化。
60.一種藥物的組合物，它包含存在於合適藥用載體中的有效量的實質上純的睫狀神經營養性因子蛋白質。
61.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適藥用載體中的有效量的實質上純的、具功能活性的睫狀神經營養性因子肽片段或衍生物。
62.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適藥用載體中的有效量的實質上純的睫狀神經營養性因子肽片段或其攜帶一個抗原決定簇的衍生物。
63.權利要求61或62的藥物組合物，其中睫狀神經營養性因子肽片段或衍生物至少包含有實質上如圖1(b)描述的胺基酸順序部分。
64.權利要求61的藥物組合物，其中睫狀神經營養性因子肽片段或衍生物至少包含實質上如下述的部分胺基酸順序MVLLEQKIPENEADGMPATVGDGGLFEK。
65.權利要求61或62的藥物組合物，其中睫狀神經營養性因子肽片段或衍生物至少含有實質上如圖8(a)所描述的部分胺基酸順序為人體胺基酸順序。
66.權利要求61的藥物組合物，其中睫狀神經營養性因子肽片段或衍生物至少包含實質上如下述的部分胺基酸順序MILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEK。
67.權利要求60的藥物組合物，其中睫狀神經營養性因子肽包含實質上如圖1(b)所描述的胺基酸順序。
68.權利要求60的藥物組合物，其中睫狀神經營養性因子肽包含實質上如圖8(a)所描述的胺基酸順序為人體胺基酸順序。
69.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適的藥用載體中的有效量的權利要求38、42或43的產品。
70.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適的藥用載體中的有效量的權利要求39的產品。
71.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適的藥用載體中的有效量的權利要求47、51或52的產品。
72.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適藥用載體中的有效量的權利要求56的產品。
73.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適藥用載體中的有效量的權利要求57的產品。
74.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適的藥用載體中的有效量的權利要求58的產品。
75.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適藥用載體中的有效量的權利要求59的產品。
76.權利要求61、62、64、66或67的藥物組合物，該組合物能提高神經元存活。
77.權利要求63的藥物組合物，該組合物能提高神經元的存活。
78.權利要求65的藥物組合物，該組合物能提高神經元的存活。
79.權利要求61、62、64、66或67的藥物組合物，該組合物能促進神經元的生長。
80.權利要求63的藥物組合物，該組合物能促進神經元的生長。
81.權利要求65的藥物組合物，該組合物能促進神經元的生長。
82.權利要求61、62、64、66或67的藥物組合物，該組合物能維持已分化的細胞的機能。
83.權利要求63的藥物組合物，該組合物能支持已分化細胞的機能。
84.權利要求65的藥物組合物，該組合能能維持已分化細胞的機能。
85.權利要求61、62、64、66或67的藥物組合物，其中蛋白質、肽或衍生物是糖基化的。
86.權利要求63的藥物組合物，其中蛋白質、肽，或衍生物是糖基化的。
87.權利要求65的藥物組合物，其中蛋白質、肽，或衍生物是糖基化的。
88.權利要求61、62、64、66或67的藥物組合物，其中蛋白質、肽或衍生物是未糖基化的。
89.權利要求63的藥物組合物，其中蛋白質、肽或衍生物是未糖基化的。
90.權利要求65的藥物組合物，其中蛋白質、肽，或衍生物是未糖基化的。
91.一種藥物組合物，該組合物包含存在於合適藥用載體中的有效量的，實質上純的睫狀神經營養性因子蛋白質或肽片段或它們的衍生物與第二種試劑的組合物。
92.權利要求91的藥物組合物，其中第二種試劑是神經生長因子。
93.權利要求91的藥物組合物，其中第二種試劑是腦衍生的神經營養性因子。
94.權利要求91的藥物組合物，其中第二種試劑是鹼性成纖維細胞生長因子。
95.一種診斷神經系統疾病或錯亂的方法，該方法包含(a)在將允許進行雜交的條件下，讓組織與可檢測的標記核酸分子接觸，該標記核酸分子含有至少實質上如圖1(b)所描述的10個核苷酸;以及(b)檢測發生的任何雜交。
96.一種診斷神經系統疾病或錯亂的方法，該方法包括(a)在允許進行雜交的條件下，讓組織與可檢測的標記核酸分子接觸，該標記核酸分子含有實質上如圖8(a)中所描述的人體睫狀神經營養性因子順序的至少10個核苷酸;以及(b)檢測發生的任何雜交。
97.一種診斷神經系統疾病或錯亂的方法，該方法包括(a)在允許進行雜交的條件下，使從組織收集到的RNA與可檢測的標記的核酸分子接觸，該標記核酸分子含有實質上如圖1(b)所描述的至少10個核苷酸;以及(b)檢測發生的任何雜交。
98.一種診斷神經系統疾病或錯亂的方法，該方法包括(a)在允許進行雜交的條件下，使從組織收集到的RNA與可檢測的標記的核酸分子接觸，該標記的核酸分子含有實質上如圖8(a)所描述的人體睫狀神經營養性因子順序的至少10個核苷酸;以及(b)檢測發生的任何雜交。
99.一種診斷神經系統疾病或錯亂的方法，該方法包括(a)在允許進行雜交的條件下，使從組織收集到的RNA產生的CDNA與可檢測的標記的核酸分子接觸，該標記核酸分子含有實質上如圖1(b)中描述的至少10個核苷酸;以及(b)檢測發生的任何雜交。
100.一種診斷神經系統疾病或錯亂的方法，該方法包括(a)在允許進行雜交的條件下，使從組織收集到的，RNA產生的CDNA與可檢測的標記的核酸分子接觸，該標記的核酸分子含有實質上如圖8(a)的描述的人體睫狀神經營養因子順序的至少10個核苷酸;以及(b)檢測發生的任何雜交作用。
101.根據權利要求95、96、97、98、99或100中任何一項所述的方法，其中神經系統的疾病或錯亂是選自一組腫瘤和退化疾病。
102.一種治療神經系統的疾病或錯亂的方法，該方法包括給病人施用有效量的睫狀神經營養性因子蛋白質，或機能活性肽片段或它的衍生物。
103.根據權利要求102所述的方法，其中活性肽片段包含實質上如下述的至少部分胺基酸順序MVLLEQKIPENEADGMPATVGDGGLFEK。
104.根據權利要求102所述的方法，其中活性肽片段包括實質上如下述的至少部分胺基酸順序MILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEK。
105.根據權利要求102所述的方法，其中神經系統的疾病或錯亂是退化疾病。
106.根據權利要求102所述的方法，其中神經系統的疾病或錯亂是涉及脊髓索的退化疾病。
107.根據權利要求102所述的方法，其中神經系統的疾病或錯亂是涉及運動神經元的退化疾病。
108.根據權利要求107所述的方法，其中神經系統的疾病或錯亂是涉及面神經的運動神經元的退化疾病。
109.根據權利要求107所述的方法，其中神經系統的疾病或錯亂是選自肌萎縮側硬化，早期側硬化，漸進延髓麻痺，脊髓肌肉萎縮和後脊髓灰質綜合症組成的組中的運動神經疾病或退化。
110.根據權利要求105所述的方法，其中退化疾病是選自於由外周神經病、帕金森氏疾病或享廷頓氏午蹈病組成的組中。
111.根據權利要求102所述的方法，其中神經系統的疾病或錯亂包含神經系統的損傷。
112.根據權利要求111所述的方法，其中損傷是由選自於由創傷、外科、梗塞、傳染和惡性腫瘤組成的組中的事件引起的。
113.根據權利要求105所述的方法，其中疾病或錯亂是受到有毒試劑作用引起的。
114.根據權利要求105所述的方法，其中疾病或錯亂是由營養缺乏引起的。
115.根據權利要求102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114所述的方法，其中神經系統疾病或錯亂涉及脊髓索。
116.根據權利要求102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114所述的方法，其中神經系統的疾病或錯亂涉及膽鹼能神經元。
117.治療神經系統疾病或錯亂的方法，該方法包含施用有效量的，睫狀神經營養性因子蛋白質，或機能性活性肽片段，或它們的衍生物與第二種試劑的組合物。
118.權利要求117的方法，其中第二種試劑是神經生長因子。
119.權利要求117的方法，其中第二種試劑是腦衍生的神經營養性因子。
120.根據權利要求118所述的方法，其中疾病或錯亂是退化的疾病。
121.根據權利要求120所述的方法，其中退化疾病選自於由運動神經元疾病、Alzheimer氏病或享廷頓氏午蹈病組成的組中。
122.根據權利要求118所述的方法，其中疾病或錯亂包括神經系統的損傷。
123.根據權利要求118所述的方法，其中錯亂是選自於由創傷、外科、梗塞、傳染和惡性腫瘤組成的組中的事件引起的損失。
124.一種分離實質上純的睫狀神經營養性因子(CNTF)的方法，該方法包括(a)製備已知或未知含睫狀神經營養性因子的組織提取物;(b)用離子交換色譜分餾睫狀神經營養性因子活性;(c)由製備SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳收集睫狀神經營養性因子活性;(d)用生物惰性反相HPLC或FPLC柱純化睫狀神經營養性因子;以及(e)在惰性氣體下濃縮睫狀神經營養性因子。
125.根據權利要求124所述的方法，其中的組織是雞胚眼組織。
126.根據權利要求124所述的方法，其中組織是坐骨神經。
127.根據權利要求125或126所述的方法，其中惰性反相HPLC或FPLC柱用惰性金屬填充。
128.根據權利要求127所述的方法，其中惰性金屬是金。
129.根據權利要求125或126所述的方法，其中惰性反相柱是Bakerbond Gold C4Widerpore柱。
130.根據權利要求124所述的方法，其中睫狀神經營養性因子在氬氣環境下濃縮。
131.在純化睫狀神經營養性因子的方法中，該方法包括製備已知或未知含睫狀神經營養性因子的組織提取物，用離子交換色譜分級分離睫狀神經營養性因子的活性，由製備SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳收集睫狀神經營養性因子活性，其改進之處包含用生物學上惰性的HPLC或FPLC柱通過色譜進一步純化睫狀神經營養性因子。
132.在純化睫狀神經營養性因子的方法中，該方法包括製備已知或未知含睫狀神經營養性因子的組織提取物，用離子交換色譜分級分離睫狀神經營養性因子活性，由製備SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳收集睫狀神經營養性因子活性，其改進之處包含用Bakerbond Gold C4Widepore柱通過色譜法進一步純化睫狀神經營養性因子。
133.寄存在NRRL並指定的登記號的重組載體pRPN38，或機能上等效的載體。
134.寄存於NRRL並指定的登記號的重組載體pRPN40，或機能上等效的載體。
135.一種提高海馬狀細胞中GABA攝取的方法，該方法包括使海馬狀細胞與有效濃度的CNTF接觸。
136.一種提高海馬狀細胞中神經絲蛋白質表達的方法，該方法包括使海馬狀細胞與有效濃度的CNTF接觸。
137.一種提高海馬狀細胞的存活的方法，該方法包括使海馬狀細胞與有效濃度的CNTF接觸。
138.一種提高海馬狀突起的星形細胞存活的方法，該方法包括使海馬狀突起的星形細胞受到有效濃度的CNTF的作用。
139.一種提高運動神經元存活的方法，其方法包括使運動神經元受到有效濃度的CNTF的作用。
140.一種提高腹脊髓索神經元存活的方法，其方法包括使腹脊髓索神經元受到有效濃度的CNTF的作用。
141.一種促進腹脊髓索神經元中膽鹼乙醯轉移酶表達的方法，其方法包括使腹脊髓神經元受到有效濃度CNTF的作用。
142.一種治療Alzheimer氏病的方法，該方法包括在需要這種治療時給病人施用有效量的CNTF。
143.一種治療肌萎縮側硬化的方法，其方法包括在需要這種治療時給病人施用有效量的CNTF。
144.一種測量樣品中CNTF量的方法，其方法包括(ⅰ)使第一種抗-CNTF抗體與固體載體結合;(ⅱ)在準許CNTF與第一種抗體結合的條件下，將步驟(ⅰ)的已免疫的第一種抗體置於含有CNTF的溶液;(ⅲ)在準許第二種抗-CNTF抗體與CNTF結合的條件下，使與第一種抗CNTF抗體結合的CNTF受到第二種抗-CNTF抗體的作用;以及(ⅳ)檢測第二種抗-CNTF抗體與CNTF的結合，其中第一種抗體是單克隆抗體RP3-12，它寄存於ATCC，並有登記號。
145.一種測量樣品中CNTF量的方法，該方法包括(ⅰ)第一種抗-CNTF抗體與固體載體結合;(ⅱ)在準許CNTF與第一種抗體結合的條件下，使步驟(ⅰ)的已免疫的第一種抗體置於含有CNTF的溶液;(ⅲ)在準許第二種抗-CNTF抗體與CNTF結合的條件下，使與第一種抗-CNTF抗體結合的CNTF受到第二種抗-CNTF抗體的作用;以及(ⅳ)檢測第二種抗-CNTF抗體與CNTF的結合，其中第一種抗體是單克隆抗體RP12-2，它寄存於ATCC，並有登記號。
146.一種測量樣品中CNTF量的方法，該方法包括(ⅰ)第一種抗-CNTF抗體與固體載體結合;(ⅱ)在準許CNTF與第一種抗體結合的條件下，使步驟(ⅰ)的已免疫的第一種抗體受到含有CNTF的溶液的作用;(ⅲ)在準許第二種抗-CNTF抗體與CNTF結合的條件下，使與第一種抗-CNTF抗體結合的CNTF受到第二種抗-CNTF抗體的作用;以及(ⅳ)檢測第二種抗-CNTF抗體與CNTF的結合，其中第二種抗體是單克隆抗體RP3-12，它寄存於ATCC，並有登記號。
147.一種測量樣品中CNTF量的方法，其方法包括(ⅰ)第一種抗-CNTF抗體與固體載體結合;(ⅱ)在準許CNTF與第一種抗體結合的條件下，使步驟(ⅰ)的已免疫的第一種抗體受到含有CNTF的溶液的作用;(ⅲ)在準許第二種抗-CNTF抗體與CNTF結合的條件下，使與第一種抗-CNTF抗體結合的CNTF受到第二種抗-CNTF抗體的作用;以及(ⅳ)檢測第二種抗-CNTF抗體與CNTF的結合，其中第二種抗體是單克隆抗體RP12-2，它寄存於ATCC，並有登記號。
148.一種測量樣品中CNTF量的方法，其方法包含(ⅰ)將第一種抗-CNTF抗體與固體載體結合;(ⅱ)在準許CNTF與第一種抗體結合的條件下，使步驟(ⅰ)的已免疫的第一種抗體受到含有CNTF的溶液的作用;(ⅲ)在準許第二種抗-CNTF抗體與CNTF結合的條件下，使與第一種抗-CNTF抗體結合的CNTF受到第二種抗-CNTF抗體的作用;以及(ⅳ)檢測第二種抗CNTF抗體與CNTF結合，其中第一種抗體是RP3-12，第二種抗體是RP12-2，每種都由ATCC寄存，並有登記號分別是 。
149.一種測量樣品中CNTF量的方法，其方法包含(ⅰ)第一種抗-CNTF抗體與固體載體結合;(ⅱ)在準許CNTF與第一種抗體結合的條件下，使步驟(ⅰ)的已免疫的第一種抗體受到含有CNTF的溶液的作用;(ⅲ)在準許第二種抗-CNTF抗體與CNTF結合的條件下，使與第一種抗-CNTF抗體結合的CNTF受到第二種抗-CNTF抗體的作用;(ⅳ)測定第二種抗CNTF抗體與CNTF的結合，其中第一種抗體是RP12-2，第二種抗體是RP3-12，每種由ATCC寄存，它們分別有登記號。
150.如由雜交瘤RP3-12生產，ATCC寄存並有登記號為的單克隆抗體RP3-12，或片段，或它們的衍生物。
151.如由雜交瘤RP12-2生產、ATCC寄存並有登記號 的單克隆抗體RP12-2，或片段，或它們的衍生物。
152.一種單克隆抗體，它競爭性地抑制權利要求151的單克隆抗體的結合，或片段，或它們的衍生物。
153.一種單克隆抗體，它競爭性地抑制權利要求152的單克隆抗體的結合，或片段，或它們的衍生物。
154.權利要求108的方法，其中涉及面部神經的運動神經元的退化疾病是Bell氏麻痺。
155.權利要求139的方法，該方法進一步包含使運動神經元受到有效濃度的鹼性的成纖維細胞生長因子作用。
156.權利要求140的方法，該方法進一步包括使運動神經元受到有效濃度的鹼性成纖維細胞生長因子的作用。
全文摘要
本發明涉及編碼睫狀神經營養性因子(CNTF)的核酸順序，以及蛋白質、肽及由它們產生的衍生物。本發明還涉及一種生產實質上純的CNTF的新方法。本發明還涉及藥物組合物，其組合物包括有效量的CNTF基因產物，這種產物可用於診斷與治療各種神經性疾病與錯亂。本發明涉及克隆的序列分析和CNTF的表達，並首次提供利用人體CNTF編碼核酸順序生產人體CNTF的方法。而且，本發明的CNTF核酸順序可用於鑑定各種物種與組織中的編碼CNTF或CNTF-同源分子的核酸順序。
文檔編號C12P19/34GK1054099SQ9010856
公開日1991年8月28日 申請日期1990年9月15日 優先權日1989年9月15日
發明者彼得·蒙夏高斯基, 王蔚雲, 尼科斯·帕納約塔託斯, 漢斯·弗裡德裡希·厄爾溫·特倫, 庫特·A·斯託克利-裡普斯坦, 麥可·森納, 新川吉弘, 派屈克·德斯蒙德·卡羅爾, 魯道夫·格奧爾格·格茨, 格奧爾格·W·克羅伊茨堡, 丹·B·林德霍爾姆, 弗裡德裡希·洛斯派希, 南希·葉, 馬克·E·弗思 申請人:馬克斯普朗克科學促進協會, 裡珍納龍藥品有限公司