一種用於豬、人和蚊子中乙型腦炎病毒抗原檢測的elisa試劑盒及應用的製作方法

2023-05-18 02:03:46

專利名稱：一種用於豬、人和蚊子中乙型腦炎病毒抗原檢測的elisa試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物病毒學與免疫學技術領域。具體涉及一種利用乙型腦炎病毒鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體建立的檢測乙型腦炎抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒及應用，該試劑盒可用於快速檢測豬、人、蚊子等多種臨床樣品中乙型腦炎病毒抗原。本發明提供了乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體和兔源多克隆抗體的製備及純化，以及用該單克隆抗體和多克隆抗體建立的可以檢測乙型腦炎抗原的雙抗體夾心ELISA檢測方法。
背景技術：
乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE，下文稱之為JE)是由乙型腦炎病毒 (Japanese encephalitisvirus, JEV，下文稱之為JEV)引起的一種嚴重的人畜共患的蟲媒病毒性疾病，近年來其在東南亞的流行分布範圍正在不斷擴大。該病毒主要經過蚊子進行傳播，豬是該病毒的主要自然宿主和傳染源，感染後可引起母豬流產、死胎、木乃伊胎及公豬發生睪丸炎，對公眾健康及畜牧業的發展都造成了嚴重的影響。JEV屬於黃病毒科(Flaviridae)，黃病毒屬，病毒基因組為單股正鏈RNA，長約 111Λ，病毒RNA只含有一個長的開放閱讀框架，該框架可分為二個區段近5』末端1/4區段編碼病毒的三個結構蛋白基因，主要包括C，M(PrM)以及E蛋白基因；近3』末端3/4區段編碼7個非結構蛋白基因，主要包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。其中，E蛋白是乙型腦炎病毒的主要結構蛋白，是病毒表面最重要的成分，它與病毒粒子的吸附、穿入、致病和誘導宿主的免疫應答等密切相關，同時E蛋白是體外中和作用的主要靶位點和特異性抗體的作用位點，可激發中和抗體和保護性免疫，針對E蛋白的特異性單克隆抗體具有很高的中和活性，對乙型腦炎的感染有很強的保護作用。我國是乙型腦炎病的高發國家，歷來重視對乙型腦炎的檢測及防治。迄今，國內用於乙型腦炎檢測的方法可以分為抗原檢測和抗體檢測兩大類。對抗原的檢測主要包括病毒的分離鑑定、分子生物學方法如RT-PCR等，該類方法檢測周期長、操作繁瑣、對實驗條件要求嚴格，不適用於臨床大規模檢測。針對抗體的診斷方法主要指血清學檢測方法，如空斑減數中禾口試驗(Plaque reduction neutralization test)、補體結合試驗(Complement Fixation Test, CFT)、血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibition test, HIT)等，但這些傳統的抗體檢測方法也僅能用於疫苗免疫效果的評價，不能用於對病毒感染情況的監測。因而建立一種快速、簡便、特異、靈敏的病原檢測方法，並能夠同時應用於臨床患者及感染動物的診斷，就成為了乙型腦炎防治技術研究中的一項重要課題。目前，應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測乙型腦炎抗體的方法已有不少報導。 例如有的是採用抗體捕捉ELISA檢測血清中的IgM用於乙型腦炎的早期診斷(張明傑等，快速IgM抗體捕捉ELISA的建立及其在乙型腦炎早期診斷中的初步應用.病毒學雜誌.1989，3 =251-154 ；)；有的是應用間接ELISA測定乙型腦炎病人血清中的特異性IgG(顧方舟等，酶聯免疫吸附法ELISA測定乙型腦炎病人血清中特異性IgG.北京醫學.1981，1-4)；也有應用乙型腦炎病毒的囊膜E蛋白或非結構蛋白建立的檢測抗體的間接ELISA方法(張寧等，豬乙型腦炎病毒囊膜E蛋白間接ELISA診斷方法的建立與初步應用.中國畜牧獸醫，2010,37(7) :170-175 ；吳鵬等，乙型腦炎病毒非結構蛋白NSl的原核表達及重組蛋白間接ELISA方法的初步建立.畜牧與獸醫.2010,42(3) :5_8)。但針對乙型腦炎抗原的檢測方法則少有報導，而同時能用於豬、人和蚊子樣品中乙型腦炎病毒檢測的ELISA方法則未見報導。雖然針對乙型腦炎抗原及抗體的ELISA檢測方法國內已開展了以上一些相關研究，但無論是在人醫還是獸醫領域，至今仍沒有一項完善的既能用於人的乙型腦炎抗原檢測，又可以用於豬、蚊子等多種動物樣品中乙型腦炎抗原檢測的成熟方法。因此，建立一套快速、靈敏並面向基層的乙型腦炎抗原檢測方法也就成為了防控乙型腦炎課題中的重要內容。已證實，利用乙型腦炎病毒囊膜E蛋白製備的單克隆抗體具有很高的中和活性， 它可以與乙型腦炎病毒E蛋白抗原表位發生特異性的結合。而利用病毒多個抗原表位製備的多克隆抗體則具有結合力更強、反應效果更好的特性，所以利用這兩種抗體構建的檢測乙型腦炎抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，並可用於多種臨床樣品的檢測，這將為乙型腦炎的診斷和防治提供有效的工具。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，研製一種利用乙型腦炎病毒鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體建立的檢測乙型腦炎抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒及應用，該試劑盒可用於快速檢測豬、人、蚊子等多種臨床樣品中乙型腦炎病毒抗原。本發明提供了乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體和兔源多克隆抗體的製備及純化，以及用該單克隆抗體和多克隆抗體建立的可以檢測乙型腦炎抗原的雙抗體夾心ELISA檢測方法。本發明的的第一個目的是製備乙型腦炎E蛋白的單克隆抗體，為乙型腦炎雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法提供了包被一抗。本發明的第二個目的是提供一種針對乙型腦炎病毒多抗原表位的多克隆抗體的製備方法，為乙型腦炎雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法提供了第二抗體。本發明的第三個目的是利用該E蛋白單克隆抗體和兔源多克隆抗體製備一種適用於豬、人、蚊子中乙型腦炎病毒檢測的雙抗體夾心ELISA診斷試劑盒及其在臨床診斷中的應用，該試劑盒既可以檢測疑似感染動物，同時也可用於感染病人的診斷。本發明通過以下技術方案實現1、乙型腦炎病毒E蛋白的單克隆抗體的製備1)以乙型腦炎病毒感染倉鼠腎細胞(BHK21)後提取的總RNA為模板，通過RT-PCR 方法擴增乙型腦炎病毒外膜蛋白E基因(基因登錄號AF315119. 1)，並將其重組到表達載體pGEX-KG(pKG)上，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。將構建得到的原核表達載體pKG-E轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，用氨苄青黴素抗性篩選單個重組菌，該菌株經誘導可以特異性地表達乙型腦炎病毒的E蛋白；2)將步驟1)所述的表達的E蛋白進行純化後作為免疫原免疫Balb/c小鼠，並採血，用間接ELISA方法檢測動物產生的抗體滴度，選擇抗體滴度高的Balb/c小鼠進行加強免疫，並從該小鼠體內製備得到免疫脾細胞；3)製備骨髓瘤細胞(SP2/0)懸浮液並注射Balb/c小鼠，待小鼠長出實體瘤後製備骨髓瘤細胞，將骨髓瘤細胞與步驟幻所述的免疫脾細胞進行融合，製備出雜交瘤細胞4D1C，檢測篩選出效價較高的雜交瘤細胞株並進行克隆擴大培養，該雜交瘤細胞株 JEV/4D1C於2010年11月11日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)保藏，其保藏號為 CCTCC NO :C2010114 ；4)將步驟幻所述的建株後的雜交瘤細胞4D1C擴大培養，收集上清液後腹腔注射小鼠，收集小鼠腹水，純化後即得到乙型腦炎病毒E蛋白的單克隆抗體。2、兔源乙型腦炎病毒多克隆抗體的製備將乳化好的乙型腦炎弱毒疫苗按推薦劑量免疫兔，分別免疫四次，收集第四次免疫後的血清經純化後即可獲得抗乙型腦炎病毒的多克隆抗體，並測定該純化的多克隆抗體的蛋白濃度及其反應效價。3、本發明的試劑盒的組裝本發明製備的試劑盒由下列部分構成保藏號為CCTCC NO :C2010114的單克隆抗體包被的酶標板和乙型腦炎兔源多克隆抗體構成的雙夾心抗體，辣根過氧化酶標記的羊抗兔酶標抗體，標準陽性對照乙型腦炎E蛋白，標準陰性對照大腸桿菌BL-21菌體蛋白，洗滌液，樣品稀釋液，底物液A、底物液B和終止液，其中所述的洗滌液，樣品稀釋液，底物液A、底物液B和終止液的組分及配比如下洗滌液=NaCl80. 0g, KH2PO4 2. 7g, Na2HPO4 · 12H20 14. 2g, KCl 2. 0g, Tween20 5mL，，加雙蒸水至IOOOmL ；樣品稀釋液=NaCl0. 8g, KH2PO4 0. 27g, Na2HPO4 · 12H20 1. 42g, KCl 0. 2g, BSA 10g，加雙蒸水至IOOOmL ；底物液A:3，3，，5，，5-四甲基聯苯二胺200mg，無水乙醇IOOmL,加雙蒸水至 IOOOmL ；；底物液B =Na2HPO4 14. 6g，檸檬酸9. 3g，0. 75%濃度的過氧化氫尿素6. 4mL，加雙蒸水至IOOOmL,調節pH至5. 0 5. 4 ；終止液2mol/L硫酸溶液。4、乙型腦炎病毒抗原檢測的雙抗體夾心ELISA方法該方法包括製備保藏號為CCTCC N0:C2010114的單克隆抗體包被的酶標板，乙型腦炎兔源多克隆抗體，辣根過氧化酶標記的羊抗兔酶標抗體，標準陽性對照乙型腦炎E蛋白，標準陰性對照BL-21菌體蛋白，洗滌液，樣品稀釋液，底物液A和底物液B和終止液，其步驟包括(1)以乙型腦炎E蛋白作為免疫原；(2)用步驟(1)的免疫原製備得到保藏號為CCTCC NO :C2010114的單克隆抗體；(3)用步驟(2)所述的單克隆抗體包被酶標板作為一抗；(4)將待檢測樣品用樣品稀釋液按體積比為1 10稀釋得到待檢測物；(5)用乙型腦炎弱毒疫苗免疫兔獲得兔源多克隆抗體作為二抗；(6)對步驟(4)所述的待檢測物進行檢測，於酶標儀上讀取630納米處的吸光光度值；其中洗滌液，樣品稀釋液，底物液A和底物液B和終止液的組分及配比如下
洗滌液=NaCl80. 0g, KH2PO4 2. 7g, Na2HPO4 · 12H20 14. 2g, KCl 2. 0g, Tween20 5mL，，加雙蒸水至IOOOmL ；樣品稀釋液=NaCl0. 8g, KH2PO4 0. 27g, Na2HPO4 · 12H20 1. 42g, KCl 0. 2g, BSA 10g，加雙蒸水至IOOOmL ；底物液A:3，3，，5，，5-四甲基聯苯二胺200mg，無水乙醇IOOmL,加雙蒸水至 IOOOmL ；；底物液B =Na2HPO4 14. 6g，檸檬酸9. 3g，0. 75%濃度的過氧化氫尿素6. 4mL，加雙蒸水至IOOOmL,調節pH至5. 0 5. 4 ；終止液2mol/L硫酸溶液。更詳細的技術方案如實施例所述。本發明的有益效果是1、本發明的有益效果之一是構建了檢測乙型腦炎抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，為乙型腦炎病毒的抗原檢測奠定了一定的基礎。目前，ELISA主要是用於乙型腦炎的早期診斷或抗體水平的監測，但由於乙型腦炎病毒感染後，病毒血症時期短，腦脊液中病毒含量少，病毒分離陽性率極低，因此臨床上檢測該病原一直是個難題，本發明採用雙抗體夾心 ELISA方法，探索影響因素，摸索實驗條件，建立了有效檢測乙型腦炎抗原的診斷方法。2、本發明的有益效果之二是為臨床上乙型腦炎病毒感染情況的快速檢測提供了有效的工具。ELISA方法實驗操作簡便易行，檢測快速敏感，同時不需要精密的儀器設備，是一種面向基層並適用於大批量檢測的有效方法。本發明根據實際應用需要所構建的雙抗體夾心ELISA乙型腦炎抗原診斷試劑盒就解決了臨床上乙型腦炎病毒難於檢測的問題。3、本發明的有益效果之三是建立的雙抗體夾心ELISA方法不僅可以用於豬的樣品檢測，也可以同時用於蚊子和人的樣品中乙型腦炎病毒的檢測，為本發明提供了更加廣闊的應用空間。


序列表SEQ ID NO=I是本發明克隆的乙型腦炎病毒E基因的核苷酸序列。圖1 本發明的ELISA反應原理圖。圖中A為E蛋白單克隆抗體；B為待檢測抗原或樣品；C為兔源多克隆抗體；D為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔酶標抗體；E為TMB底物。圖2 本發明的技術流程圖。圖3 是本發明的表達乙型腦炎E蛋白重組質粒的構建圖。圖4 本發明在同一塊酶標板上進行的標準陽性對照及標準陰性對照顯色後的效果照片。圖5 是將乙型腦炎病毒接種倉鼠腎細胞(BHK-21)後，用製備的兔源多克隆抗體進行間接免疫螢光的效果。圖中圖5A是乙型腦炎病毒接毒組；圖5B是正常對照組。
具體實施例方式實施例1乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體及兔抗乙型腦炎多克隆抗體的製備1)乙型腦炎病毒E基因的克隆及原核表達載體的構建按徐高原報導的方法(徐高原等，乙型腦炎病毒SA14-14-2株E基因的克隆、測序與表達，中國人獸共患病雜誌.2004，20(1) :22-25)，用包含乙型腦炎病毒E基因(基因登錄號AF315119. 1)的重組質粒pKG_E (質粒構建圖見圖；3)轉化大腸桿菌BL21感受態細胞， 塗布濃度為60ug/mL LB/氨苄青黴素(Amp)平皿，挑選多個單菌落放入LB液體培養基中於 37°C下培養12小時後用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達出乙型腦炎病毒E 蛋白，該蛋白的核苷酸序列如SEQ ID:1所示。2)免疫脾細胞及骨髓瘤細胞的製備將步驟1)表達的E蛋白純化後免疫4-6周齡的雌性Balb/c小鼠(購自湖北省疾病預防與控制中心實驗動物中心)各5隻。每次免疫2周後採血用間接ELISA檢測動物產生的抗體滴度；至少間隔一個月後，選擇抗體滴度高的Balb/c小鼠加強免疫後眼眶放血處死，分離製備免疫脾細胞；同時用骨髓瘤細胞(SP2/0)懸浮液注射Balb/c小鼠，待9-10天實體瘤生長後，處死小鼠並分離製備出活化的骨髓瘤細胞。3)免疫脾細胞與骨髓瘤細胞的融合將步驟2)所述的免疫脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，製備得到雜交瘤細胞株4D1C，將獲得的該雜交瘤細胞株於2010年11月11日送交武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC N0:C2010114。用間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞上清用E蛋白包被酶標板作為陽性對照，以破碎的BL-21菌體蛋白包被同一塊酶標板作為陰性對照，用洗滌液洗滌三次，加封閉液封閉，於37°C溫育lh，洗滌三次，然後加入雜交瘤細胞的培養上清，於37°C溫育lh，洗滌液洗三次後，加入體積比為1 5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，37°C反應lh，用洗滌液洗滌三次後，分別加入底物液A 和B顯色lOmin，加終止液終止反應之後，測定0D630值。選取與抗原包備板反應陽性而陰性對照板反應陰性且細胞生長旺盛形態好的細胞生長孔，進行克隆擴大培養雜交瘤細胞。上述包被液，封閉液，洗滌液，底物液A、B的組分及配比見附錄。4)單克隆抗體的生產、純化及效價的測定取8-10周齡的Balb/c小鼠，腹腔注射滅菌的液體石蠟0. 5ml/只，於7_10天後腹腔注射擴大培養的本發明製備的雜交瘤細胞4D1C，接種量為IO5-IO6/只，7-10天後抽取小鼠腹水，該腹水內即含有大量的乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體。使用IgG抗體純化試劑盒(NAb Protein A/G Spin Kit，購自Thermo公司)純化獲得的E蛋白單克隆抗體(簡稱E單抗)，使用蛋白質濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit，購自PIERCE公司)測得該抗體濃度為0. 78mg/ml。具體步驟是，用本發明製備的乙型腦炎E蛋白包被酶標板，於4°C過夜，次日取出包被的酶標板洗滌後於37°C內封閉1小時，洗滌液洗滌5次後於孔內加入倍比稀釋的乙型腦炎E蛋白單克隆抗體，每個稀釋度做兩孔重複，37°C內孵育30min，於孔內加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(Goat Anti-MouselgG，購自博士德公司)，37°C反應 30min，加洗滌液洗滌後分別再加入底物液A和B避光顯色lOmin，終止反應後於酶標儀上讀取630納米處的吸光光度值(即0D630值，下同)，結果表明，本發明製備的單克隆抗體經 10萬倍(體積比)稀釋後的0D630值仍可達到1，說明本發明製備的單克隆抗體的效價可達到1 10萬以上。測定結果見表1表1本發明的單克隆抗體的效價的測定
權利要求
1.一種乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體，其特徵在於，它是由保藏號為CCTCC NO C2010114的雜交瘤細胞株JEV/4D1C所分泌的。
2.權利要求1所述的雜交瘤細胞株JEV/4D1C，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為 CCTCC NO :C2010114o
3.包含權利要求1所述的單克隆抗體和兔源多克隆抗體的乙型腦炎雙抗體夾心ELISA 抗原檢測試劑盒。
4.一種適用於豬、人、蚊子中乙型腦炎病毒抗原檢測的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特徵在於，該試劑盒由下列部分構成保藏號為CCTCC NO :C2010114的單克隆抗體包被的酶標板和乙型腦炎兔源多克隆抗體構成的雙夾心抗體，辣根過氧化酶標記的羊抗兔酶標抗體，標準陽性對照乙型腦炎E蛋白，標準陰性對照大腸桿菌BL-21菌體蛋白，洗滌液，樣品稀釋液，底物液A、底物液B和終止液，其中所述的洗滌液，樣品稀釋液，底物液A、底物液B和終止液的組分及配比如下洗滌液(10X 濃縮):NaCl 80. 0g, KH2PO4 2. 7g, Na2HPO4 · 12H20 14. 2g, KCl 2. Og, Tween205mL，，加雙蒸水至 IOOOmL ；樣品稀釋液:NaCl 0. 8g, KH2PO4 0. 27g, Na2HPO4 · 12H20 1. 42g, KCl 0. 2g, BSA 10g，力口雙蒸水至IOOOmL ；底物液A :3，3，，5，，5-四甲基聯苯二胺200mg,無水乙醇IOOmL,加雙蒸水至IOOOmL ；；底物液B =Na2HPO4 14. 6g，檸檬酸9. 3g，0. 75%濃度的過氧化氫尿素6. 4mL，加雙蒸水至 IOOOmL,調節 pH 至 5. 0 5. 4 ；終止液anol/L硫酸溶液。
5.一種適用於豬、人、蚊子等臨床樣品中乙型腦炎病毒抗原檢測的雙抗體夾心ELISA 方法，包括製備保藏號為CCTCC NO :C2010114的單克隆抗體包被的酶標板，乙型腦炎兔源多克隆抗體，辣根過氧化酶標記的羊抗兔酶標抗體，標準陽性對照乙型腦炎E蛋白，標準陰性對照BL-21菌體蛋白，洗滌液，樣品稀釋液，底物液A和底物液B和終止液，其步驟包括(1)以乙型腦炎E蛋白作為免疫原；(2)用步驟(1)的免疫原製備得到保藏號為CCTCCNO :C2010114的單克隆抗體；(3)用步驟(2)所述的單克隆抗體包被酶標板作為一抗；(4)將待檢測樣品用樣品稀釋液按體積比為1 10稀釋得到待檢測物；(5)用乙型腦炎弱毒疫苗免疫兔獲得兔源多克隆抗體作為二抗；(6)對步驟(4)所述的待檢測物進行檢測，於酶標儀上讀取630納米處的吸光光度值； 其中洗滌液，樣品稀釋液，底物液A和底物液B和終止液的組分及配比如下洗滌液(10X 濃縮):NaCl 80. 0g, KH2PO4 2. 7g, Na2HPO4 · 12H20 14. 2g, KCl 2. Og, Tween205mL，，加雙蒸水至 IOOOmL ；樣品稀釋液:NaCl 0. 8g, KH2PO4 0. 27g, Na2HPO4 · 12H20 1. 42g, KCl 0. 2g, BSA 10g，力口雙蒸水至IOOOmL ；底物液A :3，3，，5，，5-四甲基聯苯二胺200mg,無水乙醇IOOmL,加雙蒸水至IOOOmL ；；底物液B =Na2HPO4 14. 6g，檸檬酸9. 3g，0. 75%濃度的過氧化氫尿素6. 4mL，加雙蒸水至 IOOOmL,調節 pH 至 5. 0 5. 4 ；終止液anol/L硫酸溶液。
6.權利要求1所述的單克隆抗體在製備乙型腦炎雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒中的應用。
7.權利要求3或4所述的試劑盒在乙型腦炎抗原體外檢測中的應用。
全文摘要
本發明屬於動物病毒學與免疫學技術領域，具體涉及一種用於豬、人和蚊子中乙型腦炎病毒抗原檢測的雙抗體夾心ELISA試劑盒。該試劑盒的核心試劑包括乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體作為一抗，兔源多克隆抗體作為二抗。本發明公開了乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體和兔源多克隆抗體的製備及純化方法。還公開了乙型腦炎抗原的雙抗體夾心ELISA檢測方法。分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NOC2010114。
文檔編號G01N33/569GK102464716SQ201010549519
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月16日 優先權日2010年11月16日
發明者吳兵, 曹勝波, 朱碧波, 李麼明, 梅力, 邵林, 陳煥春, 陳龍 申請人:華中農業大學