使用BRAF抑制劑的傷口癒合的製作方法
2023-05-18 15:43:33 2
本申請要求於2014年5月6日提交的美國臨時申請系列號61/989,398的優先權，其通過引用被併入本文。
政府利益的聲明
本發明根據各自由美國國立衛生研究院(the National Institute of Health；NIH)授予的P01CA168585、CA-16042和AI-28697，在政府支持下做出。政府在本發明中具有一定權利。
領域
本公開內容涉及包含BRAF抑制劑的組合物和使用包含BRAF抑制劑的組合物治療傷口的領域。
背景
絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-Raf(「B-Raf」或「BRAF」)是信號轉導蛋白激酶，其參與調節MAP激酶/ERK信號傳導通路，影響細胞分化、分裂和分泌。BRAFV600E是常見的致癌BRAF突變，其通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路誘導組成型信號傳導，刺激癌細胞增殖和存活。阻斷BRAF激酶的活性構象的致癌BRAF的抑制劑的臨床開發，當與標準化學療法相比時，已引起高比率的目標腫瘤反應和總存活率的改善。然而，非黑素瘤性皮膚癌(例如，高分化皮膚鱗狀細胞癌和角化棘皮瘤)在約15％至30％的用BRAF抑制劑諸如維羅非尼(vemurafenib)和達拉菲尼(dabrafenib)(GSK-2118436)治療的患者中發展。
針對細胞培養物、動物模型和人類中的BRAFV600E–突變細胞的BRAF抑制劑諸如維羅非尼的抗腫瘤活性，與致癌MAPK信號傳導的抑制相關，如由磷酸化的ERK(pERK)的抑制證明的，所述磷酸化的ERK(pERK)是BRAF的下遊效應物，其當被磷酸化時是有活性的。然而，BRAF抑制劑在具有野生型BRAF的細胞系中誘導相反的作用——即，增加pERK，所述具有野生型BRAF的細胞系具有上遊通路的激活，諸如致癌RAS或上調的受體酪氨酸激酶。BRAF野生型細胞中MAPK信號傳導的該RAF抑制劑依賴性激活稱為「特殊MAPK通路激活(paradoxical MAPK-pathway acitvation)」，並且受到RAF二聚體的形成驅動，其通過CRAF和隨後的MAPK通路超活化引起信號傳導。通過誘導特殊(paradoxical)MAPK激活來抑制非癌環境中BRAF抑制劑的這些皮膚增殖性副作用以加速皮膚傷口癒合將是期望的。
概述
根據本文描述的實施方案，提供了用於治療傷口的方法。此類方法包括使傷口與有效量的BRAF抑制劑接觸來刺激傷口癒合的步驟。BRAF抑制劑可以是抑制BRAF的活性的任何合適的劑，除了其他劑以外包括：AMG542、ARQ197、ARQ736、AZ628、CEP-32496、GDC-0879、GSK1120212、GSK2118436(達拉菲尼(dabrafenib)，)、LGX818(encorafenib)、NMS-P186、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396、NMS-P730、PLX3603(RO5212054)、PLX4032(維羅非尼(vemurafenib)，)、PLX4720(二氟苯基-磺胺(Difluorophenyl-sulfonamine))、PF-04880594、PLX4734、RAF265(CHIR-265)、RO4987655、SB590885、索拉非尼(sorafenib)、索拉非尼甲苯磺酸鹽和XL281(BMS-908662)。
在一些方面，BRAF抑制劑可以是藥物組合物的部分。在此類情況中，藥物組合物可包含有效量的BRAF抑制劑和藥學上可接受的載體。在某些方面，藥物組合物是局部用劑(topoical agent)，包括軟膏、乳狀液體(cream liquid)、凝膠、水凝膠或噴霧。
此外，在一些實施方案中，BRAF抑制劑或其藥物組合物可以是用於在治療傷口中使用的傷口敷料的部分。在該情況中，傷口敷料可以用BRAF抑制劑或其藥物組合物浸漬或塗覆。可以在根據本文描述的實施方案中使用的合適的傷口敷料包括藻酸鹽敷料、抗微生物敷料、繃帶、生物合成的敷料、生物敷料、膠原敷料、複合敷料(composite dressing)、壓縮敷料(compression dressing)、接觸層敷料、泡沫敷料、紗布敷料、水膠體敷料、水凝膠敷料、皮膚密封劑或液體皮膚敷料、專用吸收性敷料、透明薄膜式敷料或傷口填充物。
附圖簡述
圖1是圖解了在BRAFV600E突變的黑素瘤中的BRAF抑制(圖1A)、在發展HRAS突變來源的皮膚鱗狀細胞癌和角化棘皮瘤(cuSCC/KAs)的黑素瘤患者中的BRAF野生型細胞中的BRAF抑制(圖1B)和在健康受試者中的BRAF和RAS野生型細胞中的BRAF抑制(圖1C)的差異作用的示意圖。
圖2圖解了BRAF抑制在人類角化細胞中誘導特殊MAPK激活，引起增加的增殖。圖2A是通過自動化顯微鏡分析儀進行的增殖和刮傷癒合作為在維羅非尼的存在或不存在下的HEKa的重複培養物中在不同時間點的細胞的相對傷口密度百分比的定量分析。通過t-檢驗的P值<0.0044。在圖3A中顯示了代表性圖像。圖2B顯示了在0小時(基線)和24小時在維羅非尼的存在或不存在下人類成人上皮角化細胞(HEKa)的細胞增殖傷口癒合測定的代表性圖像。圖2C圖解了在暴露於或未暴露於維羅非尼的軟瓊脂中生長的HEKa和M249細胞的集落定量的倍數變化展示。在圖3B中顯示了代表性圖像。圖2D顯示暴露於或未暴露於維羅非尼的HEKa集落的平均斑點尺寸的增加。圖2E顯示具有和不具有維羅非尼和/或曲美替尼的HEKa集落的平均數目。圖2F是與BRAFV600E突變的黑素瘤細胞系M249相比，HEKa中的pERK的蛋白印跡分析和Ki67的表達水平。圖2G是當用維羅非尼、曲美替尼或維羅非尼和曲美替尼的組合處理時，與BRAFV600E突變的黑素瘤細胞系M249相比，HEKa細胞中的pERK和pMEK的蛋白印跡分析。圖2H是用媒介物或VEM(2μM)處理並用pERK和Ki67染色的HEKa和M249細胞的磷酸化流式細胞術(phosphoflow cytometry)分析。左邊顯示HEKa和M249中單獨的pERK和Ki67表達的直方圖。pERK和Ki67的共表達水平顯示在圖的中部，且定量的和代表性的倍數變化顯示在左邊。
圖3顯示了圖2中描述的實驗的代表性結果。圖3A顯示了在維羅非尼的存在或不存在下人類成人上皮角化細胞(HEKa)的細胞增殖刮傷測定的時間進程圖像。增殖的定量分析展現在圖2A中。圖3B顯示了用DMSO或VEM處理的M249和HEKa的3D培養物圖像。
圖4顯示了代表性磷酸化流式細胞術圖像，顯示產生圖2H中展現的數據的門控策略。圖4A顯示M249細胞的磷酸化流式細胞術圖像；圖4B顯示HEKa細胞的磷酸化流式細胞術圖像。
圖5圖解了BRAF抑制加速了小鼠中的傷口癒合。圖5A是根據一些實施方案在CH3小鼠中進行的傷口癒合測定的示意圖。圖5B顯示在第2、6和14天，PBS治療的和VEM治療的小鼠的代表性圖像。圖5C顯示了圖解在三次重複實驗中(媒介物(DMSO/生理鹽水)和VEM；實驗#1-3)和在使用維羅非尼(VEM)和/或曲美替尼(TRAME)以及DMSO/生理鹽水作為媒介物/對照的單獨的實驗(實驗#4)中的傷口牽張強度(WTS)的一組圖，所述三次重複實驗的每次實驗具有8隻小鼠/組。WTS展示為克力(gf)(對於所有三次實驗通過t-檢驗的p<0.0001)。
圖6是在治療後第1天(D1)、第2天(D2)和第6天(D6)的傷口癒合的病理分析的示意圖。圖6A顯示在維羅非尼(VEM)、曲美替尼(TRAME)或組合(VEM+TRAME)的存在和不存在下的代表性顯微照片H&E圖像(200X)。在每組中，切割的傷口的癒合包括相同的標準過程。傷口鄰近的表皮經歷增生和增殖，並且來自該過程的表皮細胞向中央遷移以封閉切割的表皮缺損。切口的空間最初被纖維蛋白填充，然後其被成纖維細胞、巨噬細胞、多形核細胞和新的毛細血管佔據。在維羅非尼的存在下(圖V1、V2、V6)，癒合過程加速。相比於對照樣本(圖C2)，在維羅非尼組(圖V2)中在切割後第2天傷口鄰近的表皮增生更廣泛。皮膚表面完整性以表皮下纖維化開始在6天中重建(圖V6)，而此時，對照組中的再上皮化不完全並且不存在真皮修復性纖維化(圖C6)。僅用曲美替尼治療的組在第2天顯示輕微的損傷周圍的增生(圖M2)，並且到第6天未顯示修復的跡象(圖M6)。在維羅非尼加曲美替尼組合的組(圖VM1、VM2、VM6)中，在第2天，損傷周圍的增生(圖VM2)低於用維羅非尼治療的組(圖V2)，但高於單獨的曲美替尼(圖M2)。此外，在第6天不存在再上皮化(圖VM6)。圖6B顯示在用媒介物、維羅非尼、曲美替尼或組合治療後第1天、第2天和第6天，從傷口的右側和左側的表皮增生的長度的定量。每個條包括來自4個樣品的數據。
圖7顯示在暴露於或未暴露於維羅非尼的小鼠中，癒合皮膚傷口的基因表達譜分析。上圖顯示BRAF特徵基因的熱圖，和其使用基因集合變異分析(Gene Set Variation Analysis；GVSA)計算的總體富集得分；下圖顯示傷口癒合特徵基因的熱圖和總體GVSA得分。
詳述
本文提供了使用BRAF抑制劑用於治療傷口的方法、藥物組合物和傷口敷料。根據本文描述的實施方案，BRAF抑制劑可以單獨地、作為藥物組合物的部分、或作為傷口敷料的部分使用以加速傷口癒合。
目前，BRAF抑制劑被用於在諸如癌症的疾病和狀況中利用其涉及BRAF的突變的形式的抗增殖活性(圖1A)。然而，儘管BRAF抑制劑對BRAF的突變的形式的抗增殖效果，已觀察到，用BRAF抑制劑治療癌症諸如黑素瘤的患者發展二次增殖性狀況。
特殊MAPK激活是用BRAF抑制劑治療的患者中這些二次增殖性狀況(例如，浸潤性鱗狀細胞癌和角化棘皮瘤)的發展背後的致病基礎(Su等2012；Oberholzer等2012)。在這些二次皮膚損傷中的非突變的BRAF上遊的RAS突變的頻繁存在導致強烈的RAS-GTP激活，其引起ERK的特殊地增加的磷酸化、增加的MAPK通路輸出和增強的細胞增殖(圖1B)。特殊MAPK激活是RAF抑制劑的特性(Hall-Jackson等1999)，其中與BRAF啟動子的優先結合在強烈的上遊RAS-GTP信號傳導的環境中引起其CRAF異二聚體配偶體的反式激活(Heidorn等2010；Poulikakos等2010；Holderfield等2013)。因此，經BRAF抑制劑治療的患有BRAF突變的轉移性黑素瘤的患者發展多種其他皮膚增殖性狀況(Belum等2013)，其中的大多數當伴隨施用MEK抑制劑時被改善(Flaherty等2012)，所述MEK抑制劑阻斷特殊RAF激活的下遊作用(Su等2012；Escuin-Ordinas等2013)。在下面的實施例中，表明在癌症治療中BRAF抑制劑的皮膚增殖性副作用的該機制理解可以在另外的健康受試者(即，野生型(wt)RAS和BRAF)中被利用以通過在野生型細胞中誘導特殊MAPK激活加速皮膚傷口癒合(圖1C)。
BRAF抑制劑
可根據本文描述的實施方案使用的BRAF抑制劑可以包括選擇性地抑制野生型BRAF或BRAF的突變形式(例如，BRAFV600E、BRAFV600K、BRAFV600D、BRAFV600L、BRAFV600R)的至少一部分生物活性(例如，信號轉導活性)的任何劑。在一些方面，BRAF抑制劑可以是單獨的BRAF選擇性的，或可以具有針對在RAF/MEK/ERK通路中的一種或更多種另外的靶的抑制活性。例如在一方面，BRAF抑制劑可以是RAF激酶抑制劑，即，抑制劑可以具有針對除了BRAF之外的RAF激酶諸如ARAF、CRAF或二者的抑制活性。在某些實施方案中，選擇BRAF抑制劑以具有增加的特殊MAPK激活活性。如此，根據本文描述的實施方案使用的BRAF抑制劑可以充當MAPK特殊激活物，意味著，BRAF抑制劑引起MAPK信號傳導的增加。在一些方面，MAPK特殊激活物是當靶BRAF激酶是野生型BRAF激酶時呈現增加的MAPK信號傳導的BRAF抑制劑。
本領域已描述了若干BRAF激酶抑制劑，其中的任何一個可以適合用於在本文描述的方法、敷料和組合物中使用。合適的BRAF抑制劑可包括但不限於1,2-二-環基取代的炔化合物或衍生物；1-甲基-5-(2-(5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)吡啶-4-基氧基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)-1H-苯並[d]咪唑-2-胺)；2,6-二取代的喹唑啉、喹喔啉、喹啉和異喹啉化合物或衍生物；4-氨基-5-氧絡-8-苯基-5H-吡啶並-[2,3-D]-嘧啶化合物或衍生物；4-氨基-噻吩並[3,2-C]吡啶-7-羧酸化合物或衍生物；5-(4-氨基苯基)-異喹啉化合物或衍生物；苯磺胺噻唑化合物或衍生物；苯並咪唑化合物或衍生物；雙環化合物或衍生物；吡唑並[1,5-a]嘧啶化合物或衍生物的橋接、雙環雜環或螺旋雙環雜環衍生物；肉桂醯胺和氫-肉桂醯胺化合物或衍生物；二-取代的咪唑化合物或衍生物；稠合的三環吡唑並[1,5-a]嘧啶化合物或衍生物；雜芳基化合物或衍生物；雜環化合物或衍生物；1H-苯並[D]咪唑化合物或衍生物；咪唑並[4,5-B]吡啶化合物或衍生物；N-(6-氨基吡啶-3-基)-3-(亞磺醯氨基)苯甲醯胺化合物或衍生物；N-[3-(1-氨基-5,6,7,8-四氫-2,4,4B-三氮雜芴-9-基)-苯基]苯甲醯胺化合物或衍生物；含氮的雙環雜芳基化合物或衍生物；雜環取代的二芳基脲化合物或衍生物的N-氧化物；omega-羧基芳基取代的二苯基脲化合物或衍生物；噁唑化合物或衍生物；苯乙胺化合物或衍生物；苯基磺醯胺取代的、吡唑並[1,5-a]嘧啶化合物或衍生物；苯基三唑化合物或衍生物；雜環化合物或衍生物；1h-吡唑並[3,4-b]吡啶化合物或衍生物；嘌呤化合物或衍生物；吡唑[3,4-B]吡啶化合物或衍生物；吡唑化合物或衍生物；吡唑啉化合物或衍生物；吡唑並[3,4-b]吡啶、吡咯並[2,3-b]吡啶化合物或衍生物；吡唑並[3,4-d]嘧啶化合物或衍生物；吡唑並[5,1-c][1,2,4]三嗪化合物或衍生物；吡唑基化合物或衍生物；嘧啶化合物或衍生物；吡咯化合物或衍生物；吡咯並[2,3-B]吡啶化合物或衍生物；取代的6-苯基-吡啶並[2,3-D]嘧啶-7-酮化合物或衍生物；取代的氮茚化合物或衍生物；取代的苯並咪唑化合物或衍生物；取代的二芳基-脲化合物或衍生物；噻吩並吡啶化合物或衍生物；噻吩並嘧啶、噻吩並吡啶或吡咯並嘧啶化合物或衍生物；噻吩醯胺化合物或衍生物、和任何其他合適的芳基和/或雜芳基化合物或衍生物。在一些方面，本文描述的合適的BRAF抑制劑可以包括化合物或衍生物本身，或可以是其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
若干專利和專利申請公開了可根據本文描述的實施方案使用的範例BRAF抑制劑，包括但不限於國際專利申請公布號WO2011117381、WO2011119894、WO2011117381、WO2011097594、WO2011097526、WO2011085269、WO2011090738、WO2011025968、WO2011025927、WO2011023773、WO2011028540、WO2010111527、WO2010104973、WO2010100127、WO2010078408、WO2010065893、WO2010032986、WO2009115572、WO2009108838、WO2009111277、WO2009111278、WO2009111279、WO2009111280、WO2009108827、WO2009111260、WO2009100536、WO2009059272、WO2009039387、WO2009021869、WO2009006404、WO2009006389、WO2008140850、WO2008079277、WO2008055842、WO2008034008、WO2008115263、WO2008030448、WO2008028141、WO2007123892、WO2007115670、WO2007090141、WO2007076092、WO2007067444、WO2007056625、WO2007031428、WO2007027855、WO2007002433、WO2007002325、WO2006125101、WO2006124874、WO2006124780、WO2006102079、WO2006108482、WO2006105844、WO2006084015、WO2006076706、WO2006050800、WO2006040569、WO2005112932、WO2005075425、WO2005049603、WO2005037285、WO2005037273、WO2005032548；和美國專利號US8642759、US8557830、US8504758、US7863288、US7491829、US7482367和US7235576；其所有的說明書在此通過引用被併入，如同在本文充分陳述。
在某些實施方案中，BRAF抑制劑可以從選自以下的一組分子中選擇：AMG542、ARQ197、ARQ736、AZ628、CEP-32496、GDC-0879、GSK1120212、GSK2118436(達拉菲尼，)、LGX818(encorafenib)、NMS-P186、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396、NMS-P730、PLX3603(RO5212054)、PLX4032(維羅非尼，)、PLX4720(二氟苯基-磺胺)、PF-04880594、PLX4734、RAF265(CHIR-265)、RO4987655、SB590885、索拉非尼、索拉非尼甲苯磺酸鹽或XL281(BMS-908662)。
在一些實施方案中，BRAF抑制劑具有式(I)或式(II)的結構或其藥學上可接受的鹽：
其中：
R1是H、任選地用氰基取代的C3-C6環烷基、任選地用氰基取代的C1-C3烷基、-C(O)NH2、羥基、-X1NHC(O)OR1a、-X1NHC(O)NHR1a，其中X1是任選地用1至3個基團取代的C1-C4亞烴基，所述基團的每個獨立地選自滷素、C1-C4烷基或滷素取代的C1-C4烷基，並且R1a是H、C1-C4烷基或滷素取代的C1-C4烷基；
R1b是H或甲基；
R2是H或滷素；
R3是H、滷素、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、滷素取代的C1-C4烷氧基、或滷素取代的C1-C4烷基；
R4是滷素、H或C1-C4烷基；
R5是C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C3-C8支鏈烷基、滷素取代的C1-C6烷基、滷素取代的C3-C8支鏈烷基、C3-C6環烷基-(C1-C3)-亞烴基、或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基的每個獨立地選自滷素、CH3或CF3；
R6是H、C1-C4烷基或滷素；並且
R7是H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、1-甲基-(C3-C6)-環烷基、1-(滷素取代的-甲基)-(C3-C6)-環烷基、C3-C8支鏈烷基、滷素取代的C1-C6烷基、滷素取代的C3-C8支鏈烷基、或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基選自滷素、C1-C4烷基或滷素取代的C1-C4烷基，優選地其中R7是H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、1-甲基-(C3-C6)-環烷基、C3-C8支鏈烷基或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基選自滷素、C1-C4烷基或滷素取代的C1-C4烷基。
在式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽的一個特定的實施方案中，R1是任選地用氰基取代的C1-C3烷基、-C(O)NH2、羥基、-X1NHC(O)OR1a，其中X1是任選地用1至3個基團取代的C1-C4亞烴基，所述基團的每個獨立地選自滷素、C1-C4烷基或滷素取代的C1-C4烷基，並且R1a是H、C1-C4烷基或滷素取代的C1-C4烷基；
R2是H或滷素；
R3是H、滷素、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、滷素取代的C1-C4烷氧基、或滷素取代的C1-C4烷基；
R4是滷素、H或C1-C4烷基；
R5是C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C3-C8支鏈烷基、滷素取代的C1-C6烷基或滷素取代的C3-C8支鏈烷基；
R6是H、C1-C4烷基或滷素；並且
R7是H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、1-甲基-(C3-C6)-環烷基、1-(滷素取代的-甲基)-(C3-C6)-環烷基、C3-C8支鏈烷基、滷素取代的C1-C6烷基、或滷素取代的C3-C8支鏈烷基、或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基選自滷素、C1-C4烷基或滷素取代的C1-C4烷基，優選地其中R7是H、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、1-甲基-(C3-C6)-環烷基、或苯基，其中所述苯基任選地用1至3個取代基取代，所述取代基選自滷素、C1-C4烷基或滷素取代的C1-C4烷基。
在優選的實施方案中，提供了式(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽(本文還被稱作「LGX818」或「encorafenib」)，其中
R1是–CH2-(S)-CH(CH3)NHC(O)OCH3；
R1b是H；
R2是H；
R3是Cl；
R4是H；
R5是CH3；
R6是F；並且
R7是異丙基。
在另一個實施方案中，提供了式(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中
R2是H或F；
R3是H、滷素、C1-C2烷氧基、C1-C2烷基、滷素取代的C1-C2烷氧基、或滷素取代的C1-C2烷基；
R4是H或甲基；
R5是C1-C4烷基、C3-C6環烷基、C3-C5支鏈烷基、滷素取代的C1-C4烷基、滷素取代的C3-C6支鏈烷基或C3-C6環烷基-(C1-C3)-亞烴基；
R6是H、C1-C2烷基或滷素；並且
R7是C3-C6環烷基、1-甲基-(C3-C6)-環烷基或C3-C6支鏈烷基。
在另一個實施方案中，提供了式(II)的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中
R2是H；
R3是H、Cl、F、甲氧基、甲基或二氟甲氧基；
R4是H；
R5是甲基、環丙基、乙基、丙基、異丙基、仲丁基、異丁基、三氟甲基或3,3,3-三氟丙基；
R6是H、甲基、F或Cl；並且
R7是叔丁基、環丙基或1-甲基環丙基。
在一些實施方案中，BRAF抑制劑是式(III)的化合物或其藥學上可接受的鹽：
其中：
a為0、1、2或3；
每個R1是相同的或不同的，並且獨立地選自滷素、烷基、滷代烷基、–OR6、–CO2R6、–NR6R7和–CN；
環A選自C3-C6環烷基、苯基、5-6元雜環和5-6元雜芳基，所述雜環和所述雜芳基每個具有1或2個選自N、O和S的雜原子；
Q1、Q2、Q3和Q4中的每個是CH、CR2或N，其中Q1、Q2、Q3和Q4中不超過一個是N；
每個R2是相同的或不同的，並且獨立地選自滷素、烷基、滷代烷基和–OR6；
W選自–O–和–S–；
R3選自H、烷基、滷代烷基-、-亞烴基-OH、–NR5R7、–C3-C6環烷基、-亞烴基-C(O)-OH、-亞烴基-NH2和Het；
其中當R3是C3-C6環烷基時，所述C3-C6環烷基任選地用1或2個取代基取代，所述取代基是相同的或不同的，並且獨立地選自滷素、C1-C3烷基、滷代-(C1-C3)-烷基、OH、O-(C1-C3)-烷基、氧絡、S-(C1-C3)-烷基)、SO2、NH2、N(H)(C1-C3)-烷基和N(C1-C3烷基)2；
Het是具有1或2個選自N、O和S的雜原子的5-6元雜環，並且任選地用1或2個取代基取代，所述取代基是相同的或不同的，並且每個獨立地選自滷素、C1-C3烷基、滷代-(C1-C3)-烷基、O-(C1-C3)-烷基、C1-C3亞烴基-O-(C1-C3)-烷基、OH、C1-C3亞烴基-OH、氧絡、SO2((C1-C3)-烷基)、C1-C3亞烴基-SO2((C1-C3)-烷基)、NH2、N(H)((C1-C3)-烷基)、N(C1-C3烷基)2、CN和–CH2CN；
R4選自H、烷基、滷代烷基、烯基、–OR6、–R5-OR6、–R5-CO2R6、–R5-SO2R6、–R5-Het、–R5-C(O)-Het、–N(H)R8、–N(CH3)R8和–R5-NR6R7；每個R5是相同的或不同的，並且獨立地是C1-C4亞烴基；
每個R6和每個R7是相同的或不同的，並且獨立地選自H、烷基、滷代烷基、–OR6–C(O)-烷基和–C(O)-環烷基；
R8選自H、烷基(任選地被–OH取代)、滷代烷基、C3-C6環烷基、–R5-(C3-C6)-環烷基、Het2、–R5-Het2、–R5-OR6、–R5-O-R5-OR6、–R5-C(O)2R6、–R5-C(O)NR6R7、–R5-N(H)C(O)-R6、–R5-N(H)C(O)-R5-OR6、–R5-N(H)C(O)2-R5-R5-NR5R7、–R5-S(O)2R6、–R5-CN和–R5-N(H)S(O)2R6；
其中當R8是C3-C6環烷基時，所述C3-C6環烷基任選地用1或2個取代基取代，所述取代基是相同的或不同的，並且獨立地選自滷素、C1-C3烷基、滷素-(C1-C3)-烷基、OH、O-(C1-C3)-烷基、氧絡、S-(C1-C3)-烷基、SO2(C1-C3烷基)、NH2、N(H)-(C1-C3)-烷基和N(C1-C3烷基)2、和N(H)SO2-(C1-C3)-烷基；並且
Het2是具有1或2個選自N、O和S的雜原子的4-6元雜環，並且任選地用1、2、3、4或5個C1-C3烷基或1或2個取代基取代，所述取代基是相同的或不同的，並且每個獨立地選自滷素、C1-C3烷基、滷代-(C1-C3)-烷基、O-(C1-C3)-烷基、C1-C3亞烴基-O-(C1-C3烷基)、OH、C1-C3亞烴基-OH、氧絡、SO2(C1-C3烷基)、C1-C3亞烴基-SO2(C1-C3烷基)、NH2、N(H)-(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、N(H)SO2-(C1-C3烷基)、C(O)(C1-C3烷基)、CO2(C1-C4烷基)、CN和–CH2CN；
並且R9和R10獨立地選自H和烷基。
在優選的實施方案中，提供了式(III)的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中
a是2；
R1是F；
每個R2是F；
R3是叔丁基；
R4是N(H)R8；
R8是H；並且
W是S(在本文稱為「GSK2118436」、「達拉菲尼」或)。
在某些實施方案中，BRAF抑制劑是式(IV)的化合物：
其中：
R2、R4、R5和R6獨立地選自由以下組成的組：氫、滷素、任選地取代的低級烷基、任選地取代的低級烯基、任選地取代的低級炔基、任選地取代的環烷基、任選地取代的雜環烷基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜芳基、-CN、-NO2、-CRaRbR26和-LR26；
R3選自由以下組成的組：氫、滷素，任選地取代的低級烷基、任選地取代的低級烯基、任選地取代的低級炔基、任選地取代的環烷基、任選地取代的雜環烷基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜芳基、-CN、-NO2、-CRaRbR26、-LR26和-A-Ar-L1-R24；
A選自由以下組成的組：-O-、-S-、-CRaRb-、-NR1-、-C(O)-、-C(S)-、-S(O)-和-S(O)2-；
R1選自由以下組成的組：氫、低級烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、-C(O)R7、-C(S)R7、-S(O)2R7、-C(O)NHR7、-C(S)NHR7和-S(O)2NHR7，其中低級烷基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和-NR8R9，其中低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環烷氨基，然而，條件是，結合到烷氧基的O、硫代烷基的S或單或二烷氨基的N的烷基鏈碳的任何取代是氟，然而，另外條件是，當R1是低級烷基時，結合到-NR1-的N的低級烷基碳上的任何取代是氟，並且其中環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：滷素、-OH、-NH2、低級烷基、氟取代的低級烷基、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環烷氨基；R7選自由以下組成的組：低級烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基，其中低級烷基任選用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷氧基、低級烷基硫、單烷氨基、二烷氨基和-KR8R9，然而，條件是，結合到-C(O)NHR7、-C(S)NHR7或-S(O)2NHR7的N的烷基碳的任何取代是氟，其中低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環烷氨基，然而，條件是，結合到烷氧基的O、硫代烷基的S或單或二烷氨基的N的烷基鏈碳的任何取代是氟，並且其中環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：滷素、-OH、-NH2、低級烷基、氟取代的低級烷基、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環烷氨基；
Ar選自由任選地取代的亞芳基和任選地取代的雜亞芳基組成的組；
在每次出現時，L獨立地選自由以下組成的組：-(alk)a-S-(alk)b-、-(alk)a-O-(alk)b-、-(alk)a-NR25-(alk)b-、-(alk)a～C(O)-(alk)b-、-(alk)a-C(S)-(alk)b-、-(aUc)a-S(O)-(alk)b-、-(alk)a-S(O)2-(alk)b-、-(alk)a-OC(O)-(alk)b-、-(alk)a-C(O)O-(alk)b-、-(alk)a-OC(S)-(alk)b-、-(alk)a-C(S)O-(alk)b-、-(alk)a-C(O)NR25-(alk)b-、-(alk)a-C(S)NR25-(alk)b-、-(alk)a-S(O)2NR25-(alk)b-、-(alk)a-NR25C(O)-(alk)b-、-(alk)a-NR25C(S)-(alk)b-、-(alk)a-NR25S(O)2-(alk)b-、-(alk)a-NR25C(O)O-(alk)b-、-(alk)a-NR25C(S)O-(alk)b-、-(alk)a-OC(O)NR25-(alk)b-、-(alk)a-OC(S)NR25-(alk)b-、-(alk)a-NR25C(O)NR25-(alk)b-、-(alk)a-NR25C(S)NR25-(alk)b-和-(alk)a-NR25S(O)2NR25-(alk)b-；a和b獨立地是0或1；alk是C1-C3亞烴基或用一個或更多個取代基取代的C1-C3亞烴基，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和-NR8R9，其中低級烷基或低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環烷氨基，然而，條件是，與烷氧基的O、烷硫基的S或單或二烷氨基的N結合的烷基鏈碳的任何取代是氟；
L1是-(CRaRb)v-或L，其中v是1、2或3；其中在每次出現時Ra和Rb獨立地選自由以下組成的組：氫、氟、-OH、-NH2、低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和-NR8R9，其中低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環烷氨基，然而，條件是，結合到烷氧基的O、硫代烷基的S或單或二烷氨基的N的烷基鏈碳的任何取代是氟；或在相同或不同碳上的Ra和Rb中的任何兩個組合以形成3-7元單環環烷基或5-7元單環雜環烷基，並且Ra和Rb的任何其他的獨立地選自由以下組成的組：氫、氟、-OH、-NH2、低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和-NR8R9，其中低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、單烷氨基或二烷氨基的烷基鏈任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環烷氨基，然而，條件是，結合到烷氧基的O、硫代烷基的S或單或二烷氨基的N的烷基鏈碳的任何取代是氟，並且其中3-7元單環環烷基或5-7元單環雜環烷基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：滷素、-OH、-NH2、低級烷基、氟取代的低級烷基、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基、氟取代的低級烷硫基、單烷氨基、二烷氨基和環烷氨基；
R8和R9與其附接的N組合以形成5-7元雜環烷基，所述5-7元雜環烷基任選地用一個或更多個取代基取代，所述一個或更多個取代基選自由以下組成的組：氟、-OH、-NH2、低級烷基、氟取代的低級烷基、低級烷氧基、氟取代的低級烷氧基、低級烷硫基和氟取代的低級烷硫基；
在每次出現時R25獨立地選自由以下組成的組：氫、任選地取代的低級烷基、任選地取代的環烷基、任選地取代的雜環烷基、任選地取代的芳基和任選地取代的雜芳基；和
在每次出現時R24和R26獨立地選自由以下組成的組：氫，然而，條件是，氫不與L或Li的S(O)、S(O)2、C(O)或C(S)中的任何一個結合；任選地取代的低級烷基；任選地取代的低級烯基，然而，條件是，當R24或R26是任選地取代的低級烯基時，其烯烴碳不結合到L或L1的N、S、O、S(O)、S(O)2、C(O)或C(S)；任選地取代的低級炔基，然而，條件是，當R24或R26是任選地取代的低級炔基時，其炔烴碳不結合到L或L1的N、S、O、S(O)、S(O)2、C(O)或C(S)；任選地取代的環烷基；任選地取代的雜環烷基；任選地取代的芳基和任選地取代的雜芳基。
在優選的實施方案中，提供了式(III)的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中：
R2是H；
R3是-A-Ar-L1-R24；
A是-C(O)-；
Ar是2,4-二氟苯基；
L1是-SO2-；
R4是H；
R5是4-氯苯基；
R6是H；
R24是正丙基(本文稱為「PLX4032」、「維羅非尼」或)。
在其他實施方案中，本領域技術人員可使用體外、體內、計算機模擬或本領域已知的其他篩選方法產生或鑑定出新型BRAF抑制劑。例如，可以使用用於檢測在MAPK信號傳導級聯中BRAF的下遊分子(例如，MEK和/或ERK)的磷酸化的測定，從小分子、肽或核酸的訓練集鑑定野生型BRAF的BRAF抑制劑。BRAF抑制劑可以發揮阻遏(suppress)或抑制(inhibit)BRAF表達和/或信號傳導功能的作用，從而降低MEK和ERK的磷酸化。可以在此類實施方案中使用的若干磷酸化測定是可得的，包括但不限於激酶活性測定(例如，由R&DLife 銷售的那些)；用於與免疫測定諸如蛋白印跡、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、流式細胞術、免疫細胞化學、免疫組織化學一起使用的磷酸化特異性抗體；質譜、蛋白質組學和磷酸化-蛋白多重測定。在某些實施方案中，可以使用測量候選抑制劑激活MAPK通路的能力的篩選方法鑑定用於在本文描述的實施方案中使用的BRAF抑制劑。可以通過反式激活CRAF實現MAPK通路的這一激活。與用於在治療癌症和與異常的BRAF表達相關的其他疾病中使用的典型的BRAF抑制劑篩選不同，以此方式鑑定的BRAF抑制劑(本文還被稱作MAPK特殊激活物)可被使用以利用特殊MAPK激活通過誘導皮膚細胞的增加的增殖來加速皮膚傷口癒合。
如本文使用的，術語「藥學上可接受的鹽」意指本發明的化合物的對於在受試者中應用是安全並且有效的，並且具有所需的生物活性的那些鹽。藥學上可接受的鹽包括存在於本發明的化合物中的酸或鹼基團的鹽。藥學上可接受的鹽包括但不限於氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異煙酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸、龍膽酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、穀氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(即，1,11-亞甲基-二-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))、鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、鋅和二乙醇胺鹽。本發明的某些化合物可以與多種胺基酸形成藥學上可接受的鹽。對於藥學上可接受的鹽的綜述，參見Berge等,66J.Pharm.Sci.1-19(1977)，其通過引用併入本文。
藥物組合物
在一些實施方案中，以上描述的一種或更多種BRAF抑制劑可以是藥物組合物的部分。在一些方面，藥物組合物包括至少一種BRAF抑制劑和藥學上可接受的載體。如本文使用的術語「藥學上可接受的載體」意指參與將BRAF抑制劑從一個位置、體液、組織、器官(內部或外部)、或身體的部分攜帶或運輸到另一位置、體液、組織、器官或身體的部分的藥學上可接受的材料、組合物或媒介物，諸如液體或固體填充物、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料。
在一些實施方案中，藥物組合物包含藥學上可接受的載體和與式(I)或式(II)或其藥學上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是LGX818(encorafenib)或其鹽或衍生物。
在一些實施方案中，藥物組合物包含藥學上可接受的載體和與式(III)或其藥學上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是GSK2118436(達拉菲尼，)或其鹽或衍生物。
在一些實施方案中，藥物組合物包含藥學上可接受的載體和與式(IV)或其藥學上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是PLX4032(維羅非尼，)或其鹽或衍生物。
從與製劑的其他成分例如BRAF抑制劑是相容的並且適合用於在與生物系統的組織或器官接觸中使用而無過度的毒性、刺激、過敏反應、免疫原性或其他問題或併發症，與合理的效益/風險比相稱的意義上而言，每種載體是「藥學上可接受的」。
可以用作藥學上可接受的載體的材料的一些實例包括：(1)糖，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)澱粉，諸如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；(3)纖維素和其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉末化的黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；(9)油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原的水；(17)等滲的生理鹽水；(18)林格氏溶液；(19)醇，諸如乙醇和丙烷醇；(20)磷酸鹽緩衝溶液；和(21)在藥物製劑中採用的其他無毒相容的物質諸如丙酮。
藥物組合物可根據需要包含藥學上可接受的輔助物質以接近生理條件，所述藥學上可接受的輔助物質諸如pH調節劑和緩衝劑、毒性調節劑等等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等等。另外，用於藥物組合物的製劑還可包括潤溼劑、著色劑、脫模劑(release agent)、包衣劑、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑或其他輔助成分。
在一個實施方案中，藥學上可接受的載體是水性載體，例如緩衝的生理鹽水等等。在某些實施方案中，藥學上可接受的載體是極性溶劑，例如丙酮和醇。在某些方面，藥學上可接受的載體是合適的材料，所述合適的材料允許、促進或增強經皮、局部、霧化吸入、可吸入或任何其他合適的施用方式，諸如在下面詳細描述的那些施用途徑。
在這些製劑中的BRAF抑制劑的濃度可以廣泛不同，並且將主要基於流體體積、粘度、體重等等，根據選擇的特定施用方式和生物系統的需要被選擇。通常，存在於藥物組合物中的一種或更多種BRAF抑制劑的量將是將產生治療效果的量。例如，在一些實施方案中，藥物組合物中的一種或更多種BRAF抑制劑的重量/體積(w/v)或重量百分比(wt％)濃度可以是在約0.001％到100％、0.001％到90％、0.001％到80％、0.001％到70％、0.001％到60％、0.001％到50％、0.001％到40％、0.001％到30％、0.001％到20％、0.001％到10％、0.001％到1％、0.01％到100％、0.01％到90％、0.01％到80％、0.01％到70％、0.01％到60％、0.01％到50％、0.01％到40％、0.01％到30％、0.01％到20％、0.01％到10％、0.01％到1％、0.1％到100％、0.1％到90％、0.1％到80％、0.1％到70％、0.1％到60％、0.1％到50％、0.1％到40％、0.1％到30％、0.1％到20％、0.1％到10％、0.1％到1％、1％到100％、1％到90％、1％到80％、1％到70％、1％到60％、1％到50％、1％到40％、1％到30％、1％到20％、1％到10％、1％到5％、1％到4％、1％到3％、1％到2％、0.1％到0.9％、0.1％到0.8％、0.1％到0.7％、0.1％到0.6％、0.1％到0.5％、0.1％到0.4％、0.1％到0.3％、0.1％到0.2％、0.2％到1％、0.3％到1％、0.4％到1％、0.5％到1％、0.6％到1％、0.7％到1％、0.8％到1％或0.9％到1％之間。
在其他實施方案中，藥物組合物中的一種或更多種BRAF抑制劑的濃度可以是約1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1M。在一些方面，BRAF抑制劑在受試者(例如，人類或其他哺乳動物)中產生治療效果的濃度(摩爾濃度或wt％)可以從體外或體內數據、從細胞培養物和/或動物實驗諸如以下實施例中描述的那些來推斷。
在一些方面，藥物組合物還包含至少一種另外的治療劑。除了一種或更多種BRAF抑制劑之外，可以作為藥物組合物的部分被包含的合適的治療劑包括但不限於，傷口治療劑諸如生長因子(例如，重組血小板來源的生長因子(PDGF；/貝卡普勒明凝膠))、基於魚皮的MariGen Omega3組織再生技術、糖、抗酸藥、維生素A、維生素D、抗微生物劑和防腐劑(例如，醋酸、酸化亞硝酸鹽、acticoat 7、aquacel-Ag、抗微生物肽、桿菌肽、BCTP納米乳劑、卡地姆碘、碘、西曲溴銨、氯己定、精油、flammacerium、FPQC、夫西地酸、慶大黴素、葡糖酸鹽、六氯酚、蜂蜜、碘化合物、碘酊、脂質體碘、醋酸磺胺米隆、甲硝唑、莫匹羅星、莫匹羅星鈣、硫酸新黴素、新孢黴素(neosporin)、硝基糠腙、制黴菌素、噬菌體療法、木瓜、益生素、多粘菌素B、聚維酮碘、瑞他帕林、次氯酸鈉、過氧化氫、銀、silvercel、銀羊膜、硝酸銀、銀敷料、銀泡沫、磺胺嘧啶銀、磺胺醋醯Na+和超氧水)；和止痛劑諸如發紅劑(例如，水楊酸鹽、煙酸鹽、辣椒素、辣椒提取物)、NSAID(例如，布洛芬、雙氯芬酸、聯苯乙酸、酮洛芬、吡羅昔康、萘普生、氟比洛芬)、氫化可的松、苯扎氯銨、苄達明、多磺酸粘多糖、水楊醯胺、苯酚、冷卻噴霧、爐甘石和局部麻醉劑(例如，利多卡因、利諾卡因、丙胺卡因、苯佐卡因、普莫卡因、地布卡因)。
傷口敷料
本文描述的BRAF抑制劑和其藥物組合物可以與一種或更多種傷口敷料組合或聯合使用。在某些實施方案中，一種或更多種BRAF抑制劑或其藥物組合物被用於浸漬或塗覆傷口敷料。任何傷口敷料，諸如下面描述的那些，可以用一種或更多種BRAF抑制劑或包含一種或更多種BRAF抑制劑的藥物組合物來浸漬或塗覆。上文詳細描述了此類藥物組合物。
在一個實施方案中，用包含一種或更多種BRAF抑制劑的藥物組合物浸漬或塗覆的傷口敷料可以作為單一的傷口癒合敷料或一組獨立包裝的傷口癒合敷料出售。在此類情況中，當應用於傷口時，在單一的敷料單元中一起供應的敷料和BRAF抑制劑不但起作用以賦予典型的敷料的傷口癒合特性(例如，停止出血、減輕疼痛、保護免受進一步傷害或損傷、保護免受感染)，還行使增強和/或加速傷口癒合的功能。
若干合適的傷口敷料是已知的並且在本領域中被使用以促進傷口癒合、保護開放的傷口、提供疼痛緩解和防止感染和/或汙染，其中的任何一個可以根據本文描述的實施方案使用。合適的傷口敷料的實例包括但不限於藻酸鹽、抗微生物劑、繃帶、生物合成製品、生物製品、膠原、複合敷料、壓縮繃帶、接觸層、泡沫、紗布、水膠體、水凝膠、皮膚密封劑/液體皮膚敷料、專用吸收性敷料、透明薄膜式敷料、傷口填充物。在一些方面，可以在傷口上使用用一種或更多種BRAF抑制劑浸漬或塗覆的多於一種傷口敷料。在其他方面，傷口敷料可以與局部用軟膏、凝膠、噴霧、糊劑、液體或其他製劑組合使用，其中的每一個可以包含一種或更多種BRAF抑制劑或其組合物。
根據一些實施方案，用單獨的或作為藥物組合物的部分的一種或更多種以上描述的BRAF抑制劑浸漬或塗覆傷口敷料。在某些方面中，可以用於浸漬或塗覆傷口敷料的一種或更多種BRAF抑制劑選自以下的一種或更多種：AMG542、ARQ197、ARQ736、AZ628、CEP-32496、GDC-0879、GSK1120212、GSK2118436(達拉菲尼，)、LGX818(encorafenib)、NMS-P186、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396、NMS-P730、PLX3603(RO5212054)、PLX4032(維羅非尼，)、PLX4720(二氟苯基-磺胺)、PF-04880594、PLX4734、RAF265(CHIR-265)、RO4987655、SB590885、索拉非尼、索拉非尼甲苯磺酸鹽和XL281(BMS-908662)。浸漬的或塗覆的傷口敷料可以直接地應用到傷口，使得敷料向傷口提供一種或更多種BRAF抑制劑的治療作用。
在一些實施方案中，傷口敷料用單獨的或作為藥物組合物的部分的與式(I)或式(II)或其藥學上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑浸漬或塗覆。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是LGX818(encorafenib)或其鹽或衍生物。
在一些實施方案中，傷口敷料用單獨的或作為藥物組合物的部分的與式(III)或其藥學上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑浸漬或塗覆。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是GSK2118436(達拉菲尼，)或其鹽或衍生物。
在一些實施方案中，傷口敷料用單獨的或作為藥物組合物的部分的與式(IV)或其藥學上可接受的鹽一致的BRAF抑制劑浸漬或塗覆。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是PLX4032(維羅非尼，)或其鹽或衍生物。
使用方法
在一些實施方案中，單獨的或作為藥物組合物的部分的以上描述的BRAF抑制劑可以在用於治療受試者傷口的方法中使用。本文描述的此類方法可以用於治療任何類型的傷口，包括但不限於急性非穿透性傷口(例如，擦傷、撕裂傷、挫傷)、急性穿透性傷口(例如，戳傷、表面切口、刮傷或撕裂傷、手術切口和傷口、槍傷)、熱傷口(例如，燒傷、曬傷和凍傷)、潰瘍(例如，慢性糖尿病性潰瘍、壓迫性潰瘍/褥瘡)、化學傷口、動物或昆蟲咬傷和蜇傷、和電傷口。
用於治療傷口的方法可以包括使傷口與有效量的一種或更多種BRAF抑制劑接觸以加速傷口癒合的步驟。可以根據本文描述的方法使用的合適的BRAF抑制劑包括但不限於以上描述的那些。在某些方面中，一種或更多種BRAF抑制劑可以選自以下的一種或更多種：AMG542、ARQ197、ARQ736、AZ628、CEP-32496、GDC-0879、GSK1120212、GSK2118436(達拉菲尼，)、LGX818(encorafenib)、NMS-P186、NMS-P349、NMS-P383、NMS-P396、NMS-P730、PLX3603(RO5212054)、PLX4032(維羅非尼，)、PLX4720(二氟苯基-磺胺)、PF-04880594、PLX4734、RAF265(CHIR-265)、RO4987655、SB590885、索拉非尼、索拉非尼甲苯磺酸鹽和XL281(BMS-908662)。
在一些實施方案中，可以根據本文描述的方法使用的BRAF抑制劑與式(I)或式(II)或其藥學上可接受的鹽一致。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是LGX818(encorafenib)或其鹽或衍生物。
在一些實施方案中，可以根據本文描述的方法使用的BRAF抑制劑與式(III)或其藥學上可接受的鹽一致。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是GSK2118436(達拉菲尼，)或其鹽或衍生物。
在一些實施方案中，可以根據本文描述的方法使用的BRAF抑制劑與式(IV)或其藥學上可接受的鹽一致。在一些實施方案中，BRAF抑制劑是PLX4032(維羅非尼，)或其鹽或衍生物。
根據本文描述的方法，使傷口與一種或更多種BRAF抑制劑或其藥物組合物接觸可通過任何合適的遞送或施用途徑實現。為了治療傷口，BRAF抑制劑或其藥物組合物可通過本領域已知的任何施用途徑遞送或施用，包括但不限於，口服、經鼻、局部、霧化吸入、經黏膜、表皮、經皮、皮膚、眼、肺、皮下和/或吸入。取決於施用方法，藥物組合物可以以多種單位劑型施用。例如，適合於經皮施用的單位劑型包括經浸漬的或塗覆的貼劑、繃帶、紗布或本文描述的任何其他敷料。
根據一些實施方案，BRAF抑制劑或其藥用組合物可以以適合每種施用途徑的製劑或製品的形式給予受試者。可用於本發明的方法中的製劑可以包含一種或更多種BRAF抑制劑、一種或更多種用於其的藥學上可接受的載體和任選地一種或更多種另外的治療劑或成分。製劑可以呈單位劑型方便地呈現，並且可通過藥學領域熟知的任何方法製備。取決於待被治療的受試者和特定的施用方式，可以與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量將不同。可以與載體材料組合以產生藥學上有效劑量的BRAF抑制劑的量通常將是產生治療效果的BRAF抑制劑的量。
在一些實施方案中，製劑可以適合於口服施用，以用於治療口腔傷口或瘡。在此類實施方案中，製劑可以呈固體劑型(例如，膠囊、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用風味基礎，通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠)、散劑、顆粒劑)，或呈液體劑型(例如，作為在水性或非水性液體中的溶液或懸浮液、作為水包油或油包水液體乳劑或微乳劑、作為酏劑或糖漿、作為糖果錠劑(使用惰性基質，諸如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯樹膠)和/或作為漱口劑等等)，每種含有預定量的BRAF抑制劑作為活性成分。
在用於口服施用的固體劑型(例如，膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、散劑、顆粒劑等等)中，BRAF抑制劑可以與一種或更多種藥學上可接受的載體諸如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣和/或以下的任何一種混合：1)填充物(filler)或填充劑(extender)，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或矽酸；2)粘合劑，諸如，例如，羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠；3)保溼劑，諸如甘油；4)崩解劑，諸如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、藻酸、某些矽酸鹽和碳酸鈉；5)溶液阻滯劑，諸如石蠟；6)吸收加速劑，諸如季銨化合物；7)潤溼劑，諸如，例如，乙醯基醇和單硬脂酸甘油酯；8)吸收劑，諸如高嶺土和膨潤土；9)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、以及其混合物；和10)著色劑。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩衝劑。相似類型的固體組合物也可以被採用作為在使用諸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等等的賦形劑的軟填充和硬填充的明膠膠囊中的填充物。
在液體劑型中，BRAF抑制劑可以與本領域中通常使用的惰性稀釋劑混合，諸如，例如，水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯、以及其混合物。除惰性稀釋劑之外，口服組合物還可以包含佐劑，諸如潤溼劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、調味劑、著色劑、香味劑和防腐劑。另外，懸浮液可以包含助懸劑，如例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、膨潤土、瓊脂-瓊脂和黃芪膠、以及其混合物。
在一些實施方案中，用於BRAF抑制劑組合物的局部、經皮、表皮或皮膚施用的製劑包括散劑、噴霧、軟膏、糊劑、乳霜、洗液、凝膠、溶液、貼劑、敷料和吸入劑。活性組分可以在無菌條件下與藥學上可接受的載體、以及與可需要的任何防腐劑、緩衝液或推進劑混合。此類軟膏、糊劑、乳霜和凝膠除了BRAF抑制劑組合物之外可以包含賦形劑，諸如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽酮、膨潤土、矽酸、滑石和氧化鋅或其混合物。散劑和噴霧除了BRAF抑制劑組合物之外可以包含賦形劑，諸如乳糖、滑石、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣和聚醯胺粉末、或這些物質的混合物。噴霧可以另外含有通常的推進劑，諸如氯氟烴和揮發性的未被取代的烴，諸如丁烷和丙烷。
在某些方面，BRAF抑制劑或其藥物組合物可以通過霧化吸入被施用。這通過製備含有BRAF抑制劑的水性氣霧劑、脂質體製品或固體顆粒或粉末來實現。可以使用非水性(例如，氟碳化合物推進劑)懸浮液。也可以使用聲波噴霧器。水性氣霧劑通過將劑的水性溶液或懸浮液與常規的藥學上可接受的載體和穩定劑配製在一起製成。載體和穩定劑隨著特定化合物的需要而不同，但通常包括非離子型表面活性劑(吐溫、普朗尼克或聚乙二醇)、無害的蛋白質如血清白蛋白、脫水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、胺基酸(諸如甘氨酸)、緩衝液、鹽、糖或糖醇。通常從等滲溶液製備氣霧劑。
經皮貼劑或傷口敷料還可以用於將BRAF抑制劑或其藥物組合物遞送到傷口部位。在上文詳細描述了可以使用的傷口敷料的實例。此類製劑可以通過將劑溶解或分散在適當的介質中製成。吸收促進劑還可以用於增加擬肽穿透皮膚的通量。此類通量的速率可通過提供速率控制膜或將擬肽分散在聚合物基質或凝膠中來控制。
在一些實施方案中，在治療傷口的方法中使用的BRAF抑制劑或其藥物組合物是傷口敷料的部分。在一些方面，這意味著，BRAF抑制劑或其藥物組合物被用於塗覆或浸漬如上文描述的傷口敷料的全部或一部分。可以根據該實施方案使用的傷口敷料包括，藻酸鹽敷料、抗微生物敷料、繃帶、生物合成的敷料、生物敷料、膠原敷料、複合敷料、壓縮敷料、接觸層敷料、泡沫敷料、紗布敷料、水膠體敷料、水凝膠敷料、皮膚密封劑或液體皮膚敷料、專用吸收性敷料、透明薄膜式敷料或傷口填充物。
如本文使用的術語「有效量」指產生期望的效果的BRAF抑制劑的量。例如，細胞群體可以與有效量的BRAF抑制劑接觸以研究其體外效果(例如，細胞培養物)或以產生期望的離體或體外治療效果。有效量的BRAF抑制劑可以用於在受試者中產生治療效果，諸如治療靶狀況、緩解與狀況相關的症狀或產生期望的生理作用。例如，BRAF抑制劑的有效量可以是刺激傷口癒合的量。在此類情況中，BRAF抑制劑的有效量是「治療有效量」、「治療有效濃度」或「治療有效劑量」。精確的有效量或治療有效量是在給定的受試者或細胞群體中在治療功效方面將產生最有效結果的BRAF抑制劑的量。該量將取決於多種因素而不同，所述因素包括但不限於BRAF抑制劑的特徵(包括活性、藥代動力學、藥效動力學和生物利用度)、受試者的生理狀況(包括年齡、性別、傷口類型和狀態、全身性狀況、對給定劑量的反應和藥物的類型)或細胞的生理狀況、製劑中的藥學上可接受的一種或更多種載體的性質、和施用途徑。另外，取決於BRAF抑制劑是單獨施用還是與化合物、藥物、療法或其他治療方法或方式組合施用，有效量或治療有效量可以不同。臨床和藥理學領域的技術人員通過常規實驗將能夠確定有效量或治療有效量，也就是通過監測細胞或受試者對施用的BRAF抑制劑的反應並且相應地調整劑量將能夠確定有效量或治療有效量。對於另外的指導，參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Univ.of Sciences in Philadelphia(USIP),Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2005，其在此通過引用被併入，如同在本文充分陳述。
傷口的治療「(treating)」或「治療(treatment)」可以指使用任何劑或敷料以幫助治癒、保護、修復或恢復急性或慢性受傷的、損傷的或患病的組織的結構和功能；預防狀況，減慢狀況的發作或發展的速率，預防或降低發生繼發於傷口的狀況的風險，殺死存在於傷口部位的抗微生物感染，預防或延遲與傷口相關的疼痛和其他症狀的發展，減少或終止與傷口相關的疼痛和其他症狀，產生傷口的完全或部分消退，或其一些組合。
在一些實施方案中，如以上描述的BRAF抑制劑或其藥物組合物可以與一種或更多種另外的治療劑組合或聯合施用或遞送。BRAF抑制劑與治療劑可一起疊加地或協同地作用。如本文使用的「組合」、「與……組合」或「與……聯合」意指在治療同一受試者的同一傷口的過程中，以任何順序並且以任何次數的應用，使用兩種或更多種劑、敷料、藥物、治療方案、治療方式或其組合。這包括同時施用及以間隔多達若干天的時間上間隔的順序的施用。兩種或更多種劑、敷料、藥物、治療方案、治療方式或其組合可以是單一應用或施用的部分，或可被分開應用或施用。例如，BRAF抑制劑可以作為藥物組合物或製劑的成分被施用。該組合物或製劑可以包括作為單一局部用組合物被應用的一種或更多種另外的治療劑，或可選地，該組合物可與含有一種或更多種另外的治療劑的第二治療組合物或製劑一起應用於傷口。當應用組合物或製劑後，可在局部用組合物上應用傷口敷料。在另一個實例中，BRAF抑制劑可單獨地或作為藥物組合物的部分被用於浸漬傷口敷料。組合治療還可以包括多於一次施用劑、藥物、治療方案或治療方式中的任何一種或更多種。此外，兩種或更多種劑、敷料、藥物、治療方案、治療方式或其組合的施用可通過同一或不同的施用途徑進行。
可以與BRAF抑制劑和其藥物組合物組合或聯合施用或遞送的合適的治療劑可包括但不限於傷口治療劑諸如生長因子(例如，重組血小板來源的生長因子(PDGF；/貝卡普勒明凝膠))、基於魚皮的MariGen Omega3組織再生技術、糖、抗酸藥、維生素A、維生素D、抗微生物劑和防腐劑(例如，醋酸、酸化亞硝酸鹽、acticoat 7、aquacel-Ag、抗微生物肽、桿菌肽、BCTP納米乳劑、卡地姆碘、碘、西曲溴銨、氯己定、精油、flammacerium、FPQC、夫西地酸、慶大黴素、葡糖酸鹽、六氯酚、蜂蜜、碘化合物、碘酊、脂質體碘、醋酸磺胺米隆、甲硝唑、莫匹羅星、莫匹羅星鈣、硫酸新黴素、新孢黴素、硝基糠腙、制黴菌素、噬菌體療法、木瓜、益生素、多粘菌素B、聚維酮碘、瑞他帕林、次氯酸鈉、過氧化氫、銀、silvercel、銀羊膜、硝酸銀、銀敷料、銀泡沫、磺胺嘧啶銀、磺胺醋醯Na+和超氧水)；和止痛劑諸如發紅劑(例如，水楊酸鹽、煙酸鹽、辣椒素、辣椒提取物)、NSAID(例如，布洛芬、雙氯芬酸、聯苯乙酸、酮洛芬、吡羅昔康、萘普生、氟比洛芬)、氫化可的松、苯扎氯銨、苄達明、多磺酸粘多糖、水楊醯胺、苯酚、冷卻噴霧、爐甘石和局部麻醉劑(例如，利多卡因、利諾卡因、丙胺卡因、苯佐卡因、普莫卡因、地布卡因)。
以下實施例旨在說明本發明的多種實施方案。如此，討論的特定實施方案不被解釋為對本發明範圍的限制。對於本領域技術人員將是明顯的是可以做出多個等同物、變化和修改而不偏離發明的範圍，並且應理解，此類等同的實施方案將被本文包括。例如，儘管下面的實施例針對的是用維羅非尼治療進行的實驗，本領域技術人員將理解，其他BRAF抑制劑可被用於代替維羅非尼以產生類似的結果。此外，本公開內容中引用的所有參考文獻在此通過引用以其整體被併入，如同在本文充分陳述。
實施例
BRAF抑制劑對於治療患有BRAFV600E突變的轉移性黑素瘤的患者是高度有活性的，其主要副作用是一系列的皮膚增殖變化，從過度角化到浸潤性鱗狀細胞癌。這些副作用的致病基礎是由MAPK通路的特殊激活介導的，其中BRAF抑制劑增加了為BRAF野生型的細胞中的MAPK通路信號傳導。在下面的研究中利用了該現象以通過誘導增加的皮膚細胞增殖來加速皮膚傷口癒合。在刮傷測定中，BRAF抑制劑維羅非尼加速了人類角化細胞的增殖和遷移，這是由增加的ERK磷酸化和細胞周期進程介導的。在傷口癒合小鼠模型中，局部應用的維羅非尼通過特殊MAPK激活改善了癒合的傷口的牽張強度，如通過基因表達譜分析評價的。因此，局部用BRAF抑制劑可在加速皮膚傷口的癒合方面具有應用。
實施例1：BRAF抑制劑增強角化細胞的再生長以覆蓋體外刮傷部位
使在96孔板中培養的人類成人上皮角化細胞(HEKa)經歷刮傷測定，其中增殖的角化細胞應該再生長並且覆蓋刮傷。將具有或不具有BRAF抑制劑維羅非尼的重複培養物放置在具有自動顯微鏡分析儀的培養箱中，並且隨著時間的推移記錄了原始刮傷中有核細胞的數目。維羅非尼的存在誘導了覆蓋原始刮傷方面的統計學上顯著的改善，這在研究開始後的6、8和12小時非常明顯(圖2A和圖3A)。使用在每個孔的中部具有播種機閉鎖裝置(seeder stopper)的96孔板，在維羅非尼的存在下培養的HEKa的增殖優勢也是明顯的；用維羅非尼處理的增殖的角化細胞在24小時後覆蓋孔的中部，而對照處理的孔在中部仍沒有細胞(圖2B)。通過將曲美替尼(一種MEK抑制劑)添加到用維羅非尼處理的培養物中抑制了增強的遷移(圖2B；「TRAME」)。此外，三維軟瓊脂集落測定了暴露於維羅非尼後增殖的HEKa集落，而BRAFV600E突變的黑素瘤系M249具有集落的減少(圖2C和圖3B)。HEKa集落不但數目增加，而且其平均斑點尺寸也顯著地增加(通過t-檢驗的p＝0.007，圖2D)。添加曲美替尼減小了由維羅非尼誘導的HEKa集落的數目和尺寸(圖2E)。使用這些培養物，通過蛋白印跡(圖2F-2G)和定量磷酸化流式細胞術(圖2H和圖4A-4B)分析了特殊MAPK激活和細胞增殖。通過這兩種測定，維羅非尼在BRAFV600E突變的人類黑素瘤細胞系M249中誘導了預期降低的pERK和細胞周期停滯，而在HEKa細胞中則存在pERK和細胞周期進程的特殊增加(通過t-檢驗的p＝0.0225)。
實施例2：BRAF抑制劑由於上皮細胞的特殊增殖增強皮膚傷口的癒合
在C3H小鼠中的受控制的傷口癒合測定中，誘導了2.5cm的背部皮膚傷口並且用媒介物對照(DMSO/生理鹽水)或在媒介物中的2mM的維羅非尼的懸浮液(通過粉碎該劑的臨床級丸劑獲得)填充。在第0天用手術方法剪出皮膚傷口，並且追蹤小鼠直到第14天(圖5A-5B)。在這段時間，每隔一天分別向測試組中的24隻小鼠或對照組中的24隻小鼠局部應用維羅非尼懸浮液或媒介物對照，每隻小鼠共七個劑量。在第14天，小鼠被安樂處死並且取下含有傷口的皮膚並且安裝在20mm條狀物中，每個條狀物中一個橫斷面(horizontal)傷口樣品。使用拉力計分析傷口牽張強度(WTS)，所述拉力計拉伸條狀物並且記錄以克力(gf)計的WTS。在三次獨立的重複實驗中，用維羅非尼治療的小鼠相比於生理鹽水對照在WTS方面具有統計學上顯著的改善(52.6％、32.9％和42.8％，通過t-檢驗的p<0.0001；圖5C，實驗#1-3)。在單獨的皮膚傷口癒合測定中，通過用維羅非尼治療的WTS方面的37％的改善(對比媒介物對照通過t-檢驗的p＝0.01)通過添加1mg/kg的曲美替尼被部分地逆轉(圖5B；「TRAME」、「VEM+TRAME」)。對於這些傷口，相比於媒介物對照，WTS降低至29％(通過t-檢驗的p<0.0001；圖5C，實驗#4)。
傷口和其周圍的區域由兩名病理學家通過H&E染色在組織學上進行分析，並且在治療後第1天、第2天和第6天測量在癒合的傷口兩側的表皮增生的程度(圖6A和6B)。在切割後第1天，在維羅非尼的存在下傷口鄰近的表皮炎症更廣泛，強烈和快速的再上皮化在第2天起始。到第6天，在維羅非尼治療的組中表面完整性被重建，而在用媒介物、曲美替尼或組合治療的小鼠中未觀察到真皮修復性纖維化的跡象。在曲美替尼或維羅非尼和曲美替尼治療的小鼠中未觀察到癒合或再上皮化的徵象，並且傷口潰爛，尤其是僅用曲美替尼治療的小鼠(圖6A)。在第1天和第2天，來自維羅非尼組的皮膚傾向展示比其他治療組覆蓋更大距離的表皮增生(通過單因素ANOVA，分別地，p＝0.0132和p＝0.0338)，而到第6天，維羅非尼組具有較少的表皮增生，與較快的傷口消退相一致(通過單因素ANOVA的p＝0.0012；圖4B)。到第6天，79％的對照傷口顯示再上皮化，而100％的維羅非尼治療的傷口完全再上皮化。在單獨的曲美替尼中和維羅非尼與曲美替尼組合的組中未觀察到再上皮化。
實施例3：BRAF抑制劑增強MAPK和傷口癒合通路輸出
通過RNASeq分析從用維羅非尼或媒介物治療的小鼠獲得的皮膚樣品的MAPK和傷口癒合通路輸出中的變化。將MAPK的基因輸出與公布的數據或與公布的皮膚傷口癒合基因特徵比較，所述公布的數據關於通過使用BRAF抑制劑阻斷突變的BRAFV600E下遊的致癌MAPK信號傳導被差異調節的轉錄本。如在圖7中通過基因表達熱圖顯示的，到第2天(「D2」)，在維羅非尼治療後的BRAF特徵中存在略微增加，但在傷口癒合特徵中幾乎無變化。到第6天(「D6」)，在維羅非尼治療的樣品中兩種特徵相比於其各自的對照被顯著富集。在維羅非尼治療的傷口中觀察到BRAF和傷口癒合特徵的更明顯的降低，與較快癒合相一致。特徵的基因集合變異分析(GSVA)富集得分顯示相同的趨勢。
總體地，在上文實施例1-3中描述的研究表明，通過BRAF抑制劑的特殊MAPK激活現象可以被利用以增強皮膚傷口癒合。這可以具有加速其中惡性腫瘤前期或惡性腫瘤不是臨床問題的皮膚傷口諸如擦傷、手術切口和糖尿病性皮膚潰瘍的癒合的用途。
參考文獻
下面列出的參考文獻、專利和公布的專利申請，及以上說明書中引用的所有參考文獻在此通過引用以其整體被併入，如同在本文充分陳述。
V.R.Belum,A.Fischer,J.N.Choi,M.E.Lacouture,Dermatological adverse events from BRAF inhibitors:a growing problem.Current oncology reports 15,249(2013年6月).
B.Comin-Anduix等,Modulation of cell signaling networks after CTLA4 blockade in patients with metastatic melanoma.PLoS One 5:e12711(2010).
H.Escuin-Ordinas等,COX-2inhibition prevents the appearance of cutaneous squamous cell carcinomas accelerated by BRAF inhibitors.Mol Oncol,(2014年3月).
K.T.Flaherty等,Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma with BRAF V600mutations.The New England journal of medicine 367,1694(2012年11月).
R.Gorodetsky,W.H.McBride,H.R.Withers,Assay of radiation effects in mouse skin as expressed in wound healing.Radiation research 116,135(1988).
R.Gorodetsky,The use of fibrin based matrices and fibrin microbeads(FMB)for cell based tissue regeneration.Expert Opin Biol Ther 8,1831(2008年12月).
C.A.Hall-Jackson等,Paradoxical activation of Raf by a novel Raf inhibitor.Chem Biol 6,559(1999年8月).
S.Hanzelmann,R.Castelo,J.Guinney,GSVA:gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data.BMC Bioinformatics 14,7(2013).
G.Hatzivassiliou等,RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.Nature 464,431(2010年3月18日).
S.J.Heidorn等,Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.Cell 140,209(2010年1月22日).
M.Holderfield等,RAF inhibitors activate the MAPK pathway by relieving inhibitory autophosphorylation.Cancer Cell 23,594(2013年5月13日).
E.W.Joseph等,The RAF inhibitor PLX4032inhibits ERK signaling and tumor cell proliferation in a V600E BRAF-selective manner.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107,14903(2010年8月17日).
D.Kim等,TopHat2:accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions,deletions and gene fusions.Genome Biol 14,R36(2013).
J.Larkin等,Combined Vemurafenib and Cobimetinib in BRAF-Mutated Melanoma.New England Journal of Medicine(in press),(2014).
G.V.Long等,Combined BRAF and MEK Inhibition Versus BRAF Inhibition Alone in Melanoma.New England Journal of Medicine(in press),(2014).
R.Nazarian等,Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E)inhibition by RTK or N-RAS upregulation.Nature 468,973(2010年12月16日).
P.A.Oberholzer等,RAS Mutations Are Associated With the Development of Cutaneous Squamous Cell Tumors in Patients Treated With RAF Inhibitors.Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology 30,316(2012年1月20日).
P.I.Poulikakos,C.Zhang,G.Bollag,K.M.Shokat,N.Rosen,RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.Nature 464,427(2010年3月18日).
F.Su等,RAS mutations in cutaneous squamous-cell carcinomas in patients treated with BRAF inhibitors.The New England journal of medicine 366,207(2012年1月19日).
J.Zavadil等,Genetic programs of epithelial cell plasticity directed by transforming growth factor-beta.Proc Natl Acad Sci U S A 98,6686(2001年6月5日).