一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置及方法
2023-05-21 23:57:41
一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置及方法
【專利摘要】本發明公開了一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置及方法，所述裝置包括旋轉電機、旋轉圓盤、離心盤蓋和離心盤，所述離心盤與所述離心盤蓋圍成離心盤內腔，旋轉電機的旋轉軸穿過離心盤蓋並與所述旋轉圓盤連接，所述旋轉圓盤置於離心盤內腔中，所述旋轉圓盤背面設有對稱的待測樣件固定位。固定在待測樣件固定位上的待測樣件隨著旋轉圓盤旋轉的過程中，離心盤腔中的培養基液對黏附在待測樣件上的細胞產生一定的流體剪切力作用力；當流體剪切力增大到一定值，成骨細胞就會脫落進入細胞培養基中，把使50％細胞從待測樣件脫落的流體剪切力作為細胞粘著力。本發明設備簡單，操作簡便，靈敏度高。
【專利說明】一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測細胞粘著力的方法，更具體而言，涉及一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置及方法。
【背景技術】
[0002]成骨細胞與胞外基質成分的粘附是骨組織形成、代謝、重建的基礎，細胞粘附首先發生的是表面整合素受體和胞外基質成分中的特定多肽序列特異性結合。整合素是介導細胞與細胞外基質粘附的細胞膜表面糖蛋白受體，也是胞膜應力信號受體，可將應力傳遞給細胞骨架。研究發現骨細胞能直接感受骨應變產生的液體流動，且對液體流動剪切力敏感度較高。另外，骨細胞與植入材料良好的接觸更有利於骨組織的形成及骨結合率。為探究成骨細胞與不同鈦植入材料表面的粘著力，目前常採用流體剪切力研究細胞與基層的粘著力(流體剪切力對RGD肽修飾純鈦表面細胞粘附穩定性影響的研究，朱曉斌，陳奕帆，宋光保，萬乾炳，劉長虹，楊曉喻，巢永烈，廣東牙病防治，2010:5，18)，通過在待測試的材料表面流過液態流體，測試前後測試材料表面細胞數目，把使50%細胞從基體脫落流體剪切力作為細胞的粘著力。相對待測材料表面微觀形貌，細胞(體積)尺寸較小，材料基底表面流動的流體對細胞剪切力不夠明顯；檢測前後對待測材料表面細胞計數的方法較為繁瑣，且不夠準確。
[0003]因此，現有技術 還有待於改進和發展。
【發明內容】
[0004]有鑑於此，有必要針對上述的問題，提供一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置及方法。
[0005]為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
[0006]一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置，包括旋轉電機、旋轉圓盤、離心盤蓋和離心盤，所述離心盤與所述離心盤蓋圍成離心盤內腔，所述離心盤蓋上設有進液口，所述離心盤底部設有出液口 ；旋轉電機的旋轉軸穿過離心盤蓋並與所述旋轉圓盤連接，所述旋轉圓盤置於離心盤內腔中，所述旋轉圓盤背面設有對稱的待測樣件固定位。
[0007]優選地，所述待測樣件固定位為偶數個。
[0008]優選地，所述進液口設有進液閥門，所述出液口設有出液閥門。
[0009]優選地，所述旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置還包括測溫器，所述測溫器位於離心盤內腔中。
[0010]更優選地，所述測溫器為熱電偶。
[0011]優選地，所述離心盤及離心盤蓋均由光滑透明的塑料製成。
[0012]一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的方法，包括以下步驟:
[0013]S1、將待測樣件地對稱的固定於旋轉圓盤的待測樣件固定位上，所述待測樣件黏附細胞面朝下；向離心盤中注入細胞培養基，直至浸沒旋轉圓盤；蓋上離心盤蓋；[0014]S2、開啟旋轉電機，逐漸增大旋轉電機轉速，每次調節後待轉速穩定後取樣進行細胞計數，直至細胞計數變化不大；
[0015]S3、根據阿基米德定律計算細胞粘著力，以使50%細胞從基體脫落的流體剪切力為細胞粘著力。
[0016]優選地，細胞粘著力的計算公式為
[0017]F= (P「P JVeXRCF,其中P。為細胞的密度，P m為培養基的密度，V。為細胞的體積，RCF為相對離心力。
[0018]優選地，電機轉速每次提速100-500轉/分鐘。
[0019]相較於現有技術，本發明提供的旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的方法及其裝置具有以下優點:
[0020](I)固定在待測樣件固定位上的待測樣件隨著旋轉圓盤旋轉的過程中，離心盤腔中的培養基液對黏附在待測樣件上的細胞產生一定的流體剪切力作用力；當流體剪切力增大到一定值，成骨細胞就會脫落進入細胞培養基中，把使50%細胞從待測樣件脫落的流體剪切力作為細胞粘著力。通過調節旋轉電機的轉速改變培養基對旋轉圓盤上的待測樣件的剪切力，可以通過細胞計數間接表示黏附在基底的細胞抗流體剪切力大小，設備結構簡單，操作便捷；
[0021](2)僅需要取少量樣品即可進行細胞計數，靈敏度高； [0022](3)所述離心盤中的流體採用細胞培養基，更好的模擬細胞的微環境，進而更好的提聞檢測細胞粘著力的準確性；
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置的結構示意圖。
[0024]圖2為圖1中A部分的放大圖。
[0025]圖3為本發明旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0026]本發明提供一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置及方法，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0027]實施例1
[0028]如圖1所示，本發明旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置，所述旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置包括旋轉圓盤1、離心盤2、離心盤蓋3和旋轉電機4，所述離心盤2與所述離心盤蓋3圍成離心盤內腔，所述離心盤蓋3上設有進液口 6，所述離心盤2底部設有出液口 7 ;旋轉電機4的旋轉軸5穿過離心盤蓋3並與所述旋轉圓盤I連接，所述旋轉圓盤I置於離心盤內腔中，所述旋轉圓盤I背面設有對稱的待測樣件固定位8。
[0029]作為本發明的一種優選實施方式，所述待測樣件固定位為偶數個；更優選地，所述待測樣件固定位為2-20之間的偶數個。
[0030]作為本發明的一種優選實施方式，所述進液口 6設有進液閥門61，所述出液口 7設有出液閥門71。所述進液口閥門61用於控制進液口 6的打開或關閉，所述出液口閥門71用於控制出液口 7的打開或關閉。
[0031]更進一步地，所述進液口 6位於離心盤蓋3的一端，所述出液口 7位於離心盤3底部的與進液口 6相對的另一端。
[0032]作為本發明的一種優選實施方式，所述旋轉圓盤I的中心位置設置有與旋轉軸5連接的卡槽，所述旋轉電機4通過旋轉軸5與旋轉圓盤I連接，並在背面對稱設置有待測樣件固定位8。
[0033]作為本發明的一種優選實施方式，所述離心盤蓋3中心設有中心孔，所述旋轉軸5穿過中心孔後與旋轉圓盤I連接。更優選地，所述離心盤蓋3包括兩個半圓型蓋。進一步優選地，所述離心盤蓋3為透明塑料蓋，更優選為絕緣透明塑料蓋。所述離心盤蓋3和離心盤2形成了一密閉的離心盤內腔，使得整個離心分離檢測過程在該密閉的腔體中進行。
[0034]一般而言，液體的粘度隨溫度升高而降低。為了更準確的測定細胞粘著力，需要控制檢測過程中的溫度，測定溫度首選人體溫度37.2°C左右。所以，所述旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置還可以包括測溫器，所述測溫器位於離心盤內腔中。更優選地，所述測溫器為熱電偶。
[0035]採用實施例1所述的旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置進行細胞粘著力檢測，下面結合具體實施例來對細胞粘著力檢測過程進行詳細說明。本發明中使用的細胞、試劑等都是市售產品，本發明中使用的細胞培養方法、計數方法等也是本領域的技術人員所熟知的，在此不再一一贅述。
[0036]實施例2
[0037]—種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的方法，包括以下步驟:
[0038]S1、細胞培養及黏附
[0039]採用組織塊法結合酶消化法培養SD大鼠原代成骨細胞。取3~5d齡SD乳鼠顱蓋骨，剔除骨表面小血管和結締組織，用含I %慶大黴素的PBS液洗滌3次，將骨片剪成約Imm2小塊，0.25%胰蛋白酶和0.1% IV型膠原酶消化5~IOmin後，用含血清的F12培養基終止消化，接種在培養瓶內，置於37°C、5 %二氧化碳、95 %空氣、飽和溼度的孵箱中培養。待細胞增殖貼壁融合成單層後分瓶傳代。將第三代成骨細胞按2 X IO5個/mL接種在各組鈦片上，培養5d後，取出6片試樣作為待測樣件。
[0040]S2、細胞計數
[0041]對待測樣件(黏附有細胞9)進行細胞粘著力檢測時，首先將所述6片待測樣件通過彈片壓緊、粘貼等方式對稱固定於所述旋轉圓盤I上，距旋轉中心35mm。所述旋轉圓盤I固定於旋轉軸5上，置於所述離心盤的內腔中，並將所述離心盤蓋3蓋上，通過所述離心盤蓋3上的所述進液口 6注入細胞培養基，然後啟動旋轉電機4，調節電機轉速為1200轉每分鐘，穩定2分鐘後，打開出液口閥門71，用微型取液計取培養基10 μ L，使用細胞計數儀進行計數。本實施例中，熱電偶顯示的測定溫度為37.2°C。
[0042]當旋轉電機的轉速為1200、1600、2000、2400、2800、3200、3600轉每分鐘時，細胞計數儀細胞計數值分別為:653、1427、1630、2713、3341、3418、3489。此時，細胞計數結果變化不大，可以認為黏附在待測樣件上的所有細胞都已脫落，不需再進行加速計數了。
[0043]S3、粘著力計算
[0044]粘著力F為使50%細胞從基體脫落的流體剪切力。[0045]根據阿基米德定律(Archimede，sTheorem), F = (Pc-Pm)VcXRCF
[0046]其中P。為細胞的密度，Pm為培養基的密度，V。為細胞的體積，RCF為相對離心力。
[0047]RCF = co2r/g = CN2r = 1.118 X KT5XN2Xr
[0048]其中，Pc約為 1.046g/mL, P m 約為 1.123g/mL，V。約為 1.455nL，N 為轉速，r 為旋
轉半徑。
[0049]故F= (p c-P m) VcX 1.118X IO^5XN2Xr = (1.046-1.123)/1000Kg/m3X 1.455/1012m3Xl.118X IO-5X 24002 (r/min)2X0.035m ^ -2.52 μ dynes。
[0050]實施例3
[0051]一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的方法，包括以下步驟:
[0052]S1、細胞培養及黏附
[0053]採用組織塊法結合酶消化法培養SD大鼠原代成骨細胞。取3~5d齡SD乳鼠顱蓋骨，剔除骨表面小血管和結締組織，用含I %慶大黴素的PBS液洗滌3次，將骨片剪成約Imm2小塊，0.25%胰蛋白酶和0.1% IV型膠原酶消化5~IOmin後，用含血清的F12培養基終止消化，接種在 培養瓶內，置於37°C、5 %二氧化碳、95 %空氣、飽和溼度的孵箱中培養。待細胞增殖貼壁融合成單層後分瓶傳代。將第三代成骨細胞按I X IO6個/mL接種在各組鈦片上，培養5d後，取出6片試樣作為待測樣件。
[0054]S2、細胞計數
[0055]對待測樣件(黏附有細胞9)進行細胞粘著力檢測時，首先將所述6片待測樣件對稱固定於所述旋轉圓盤I上，距旋轉中心35mm。所述旋轉圓盤I固定於旋轉軸5上，置於所述離心盤內腔中。蓋上所述離心盤蓋3，通過所述離心盤蓋3上的所述進液口 6注入細胞培養基至浸沒旋轉圓盤1，所述細胞培養基的含量優選所述離心盤內腔容積的80%。啟動旋轉電機4，調節電機轉速為1400轉每分鐘，穩定2分鐘後，打開出液口閥門71，用微型取液計取培養基10 μ L，使用細胞計數儀進行計數。本實施例中，熱電偶顯示的測定溫度為37.2。。。
[0056]當旋轉電機的轉速為1400、1800、2200、2600、3000、3400、3600轉每分鐘時，細胞計數儀細胞計數值分別為:874、1827、2432、3013、3941、4481、4558。此時，細胞計數結果變化不大(兩次計數結果相差小於等於2%)，可以認為黏附在待測樣件上的所有細胞都已脫落，不需再進行加速計數了。
[0057]S3、粘著力計算
[0058]粘著力F為使50%細胞從基體脫落的流體剪切力。
[0059]根據阿基米德定律(Archimede，sTheorem), F = (Pc-Pm)VcXRCF
[0060]其中P。為細胞的密度，Pm為培養基的密度，V。為細胞的體積，RCF為相對離心力。
[0061]RCF = co2r/g = CN2r = 1.118 X KT5XN2Xr
[0062]其中，P。約為1.046g/mL, P m 約為 1.123g/mL, Vc 約為 1.455nL, r 為離心半徑，C為 1.118Χ10-5，N 為轉速。
[0063]故F= (p c-P m) VcX 1.118X IO^5XN2Xr = (1.046-1.123)/1000Kg/m3X 1.455/1012mXl.118 XKT5X 22002 (r/min)2X 0.035m ^ -2.59 μ dynes。
[0064]綜上所述，本發明提供的旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置及方法，借鑑離心分離原理，結合抗流體剪切力及細胞計數的方式間接檢測黏附在材料基底的細胞的粘著力。進一步地，採用細胞培養基作為流體，有助於為細胞提供生存環境；進一步地，通過細胞計數儀記錄細胞培養基中細胞數目隨轉速的變化過程；進一步地，整個檢測過程在密閉的腔體中進行。本發明提供的檢測細胞粘著力裝置造型美觀、使用方便，能夠用於植入材料表面細胞黏附情況的研究。[0065]應當理解的是，本發明的應用不限於上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
【權利要求】
1.一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置，其特徵在於，包括旋轉電機、旋轉圓盤、離心盤蓋和離心盤，所述離心盤與所述離心盤蓋圍成離心盤內腔，所述離心盤蓋上設有進液口，所述離心盤底部設有出液口 ；旋轉電機的旋轉軸穿過離心盤蓋並與所述旋轉圓盤連接，所述旋轉圓盤置於離心盤內腔中，所述旋轉圓盤背面設有對稱的待測樣件固定位。
2.根據權利要求1所述的旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置，其特徵在於，所述待測樣件固定位為偶數個。
3.根據權利要求1所述的旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置，其特徵在於，所述進液口設有進液閥門，所述出液口設有出液閥門。
4.根據權利要求1所述的旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置，其特徵在於，所述旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置還包括測溫器，所述測溫器位於離心盤內腔中。
5.根據權利要求4所述的旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置，其特徵在於，所述測溫器為熱電偶。
6.根據權利要求1所述的旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的裝置，其特徵在於，所述離心盤及離心盤蓋均由光滑透明的塑料製成。
7.一種旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 51、將待測樣件地對稱的固定於旋轉圓盤的待測樣件固定位上，所述待測樣件黏附細胞面朝下；向離心盤中注入細胞培養基，直至浸沒旋轉圓盤；蓋上離心盤蓋； 52、開啟旋轉電機，逐漸增大旋轉電機轉速，每次調節後待轉速穩定後取樣進行細胞計數，直至細胞計數變化不大； 53、根據阿基米德定律計算細胞粘著力，以使50%細胞從基體脫落的流體剪切力為細胞粘著力。
8.根據權利要求7所述旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的方法，其特徵在於，細胞粘著力的計算公式為F= (P。-Pm) VeXRCF,其中P。為細胞的密度，Pm為培養基的密度，V。為細胞的體積，RCF為相對離心力。
9.根據權利要求7所述旋轉剪切應力法檢測細胞粘著力的方法，其特徵在於，電機轉速每次提速100-500轉/分鐘。
【文檔編號】C12M1/34GK103952303SQ201410186723
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月5日 優先權日:2014年5月5日
【發明者】歐陽江林, 孫學通, 陳賢帥, 陳建宇 申請人:廣州中國科學院先進技術研究所