靶向打靶載體及靶向整合外源基因至MYH9Intron2位點構建小鼠胚胎幹細胞株的方法和應用與流程
2023-05-21 21:01:21
本發明屬於生物技術領域，具體涉及靶向打靶載體及靶向整合外源基因至MYH9 Intron2位點構建小鼠胚胎幹細胞株的方法和應用。
背景技術：
轉基因、基因敲除/敲入技術已成為現代生命科學基礎研究和應用開發領域所倚重的關鍵技術，其中，將人工分離和修飾過的基因導入生物體基因組中，通過導入基因的表達引起生物體性狀的可遺傳改變，這一技術稱之為轉基因技術(Transgenic technology)；通過同源重組將外源基因定點整合至靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的，這種基於基因打靶(Gene Targeting)的技術稱之為基因敲除/敲入(Gene knock-out/knock-in)技術。轉基因和基因敲除/敲入技術最主要的區別在於前者是隨機插入而具有盲目性和偶然性，而後者是定點整合而具有確定性和可預測性，從而成為一種更理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。儘管基因敲除和敲入技術都是基於同源重組，但是也存在方法上的些許差異，基因敲除僅把需要被破壞的基因的幾個重要外顯子或者功能區域用篩選標誌基因如Neomycin替換掉，而基因敲入除了篩選標誌基因外還需將預先設計的目的DNA片段一併整合至相應的基因組位點。這些經典技術在推動人類對於基因功能與調控的認識、疾病發生機制以及藥物研發等方面發揮了重要作用，並且還將結合最新的基因編輯工具如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄因子樣效應物核酸酶(TALEN)和成簇規律間隔短回文重複及其關聯蛋白系統(CRISPR/Cas9)等在理論研究和應用開發中繼續發揮不可或缺的作用。
將外源基因靶向整合至特定的染色體位點在基因療法、細胞工程、遺傳動物模型、基因功能研究及藥物開發等中具有重要應用價值，而所有這些應用一方面依賴於轉入基因功能的可靠性和可預測性，另一方面要求轉入基因不影響內源基因和或其他調控因子的功能。因此，一個適合外源基因良性插入並表達的基因組位點非常重要，而這種適合插入外源基因的所謂安全/友好位點(safe harbor)需要具備如此一些特性：1)該位點處於一個開放的染色體狀態而消除任何可能的位置效應，保證轉入基因能被正常轉錄及表達而不會出現基因沉默現象；2)該位點插入外源目的DNA片段對細胞/機體無已知的副作用，如不破壞內源編碼基因和高度保守區以及激活癌基因或microRNAs(Sadelain M 2011 Nature Reviews Cancer 12,51-58)；3)在該位點靶向插入外源基因時有可以接受的同源重組效率，否則難以獲得所需細胞株，隨著基因編輯工具的出現，這一要求開始降低。目前研究確定可以用作safe harbor的基因組位點為數很少，如人類基因組中的ROSA26，AAVS1，CCR5以及小鼠基因組中的ROSA26等位點(Sadelain M 2011 Nature Reviews Cancer 12,51-58)，並且仍可能存在潛在的未知問題。因此，探尋和鑑定其它safe harbor位點仍是十分需要的。
技術實現要素：
本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種靶向打靶載體及靶向整合外源基因至MYH9Intron2位點構建小鼠胚胎幹細胞株的方法和應用。
為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
所述靶向打靶載體序列如SEQ ID NO.7所示，命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R載體；該載體僅將抗性基因Neomycin靶向整合。
上述靶向打靶載體的製備方法包括如下步驟：
(1)構建空載體mpNTKV-LoxP，所述空載體mpNTKV-LoxP序列如SEQ ID NO.17所示；
(2)以bMQ-369E5BAC DNA為模板，利用序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物進行PCR，擴增出序列如SEQ ID NO.1所示的左側同源臂；以bMQ-369E5BAC DNA為模板，利用序列如SEQ ID NO.5所示的正向引和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物進行PCR，擴增出序列如SEQ ID NO.2所示的右側同源臂；
(3)將左側同源臂和右側同源臂插入空載體mpNTKV-LoxP中，即得靶向打靶載體mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R載體。
上述靶向打靶載體可用於靶向整合外源基因至MYH9Intron2位點構建小鼠胚胎幹細胞株，即，將上述的靶向打靶載體將外源基因靶向整合至MYH9Intron2位點。
本發明還提供了整合外源基因的打靶載體，所述整合外源基因的打靶載體是將構建的外源基因表達盒插入mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R載體中左側同源臂和抗性基因Neomycin之間而構建成的。
優選地，所述整合外源基因的打靶載體序列如SEQ ID NO.8所示，命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-EF1α-GFP-pA-MAI2R(Knock-in EF1α-GFP-pA)載體；或者，所述整合外源基因的打靶載體序列如SEQ ID NO.9所示，命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-pA-GFP-EF1α-MAI2R(Knock-in pA-GFP-EF1α)載體；或者，所述整合外源基因的打靶載體序列如SEQ ID NO.10所示，命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-αMHC-Puro-IRES-GFP-pA-MAI2R(Knock-inαMHC-Puro-IRES-GFP-pA)載體。
本發明利用MYH9基因第二號內含子上遊4.5kb和下遊2.0kb DNA序列構建靶向打靶載體左、右側同源臂，經電轉導入細胞、正負標記藥物篩選、long-range PCR篩選與鑑定，所獲得的胚胎幹細胞單克隆陽性率≥70％。在上述基礎上，將EF1α啟動子控制的GFP表達盒正向或反向，或者αMHC啟動子控制的Puro-T2A-GFP表達盒置於上述左、右同源臂之間，可以實現高效靶向整合。結果表明EF1α控制的GFP表達正常且與插入方向無關；同樣αMHC控制的Puro和GFP表達準確。3)內源MYH9基因表達水平不受外源基因插入的影響。由此表明MYH9基因內含子2區域具有類似於小鼠Rosa26位點特性，是小鼠基因組內另一個可供外源基因高效、安全、靶向整合以及正確表達的位點。
本發明的有益效果為：
本發明建立了一種高效、安全靶向整合外源DNA序列至小鼠胚胎幹細胞基因組MYH9位點的方法並提供了應用實例。
本發明針對目前小鼠基因組中可供外源基因靶向整合的染色體位點很少的現狀而提供了一個可供基因定點插入的小鼠基因組位點。
本發明首先構建靶向小鼠MYH9內含子2位點的打靶載體，確定在胚胎幹細胞中能否實現高效同源重組從而容易獲得所需細胞株。
本發明提供了靶向小鼠MYH9Intron2位點的打靶載體左、右同源臂DNA序列信息及構建方法。
本發明提供了篩選與鑑定陽性細胞株/克隆的方法。
本發明提供了構建外源基因靶向整合至小鼠MYH9Intron2位點的打靶載體的方法，並證實敲入的外源基因表達正常。
本發明確認了內源MYH9表達不受外源基因整合的影響，從而可以成為小鼠基因組中一個新的safe harbor。
如背景技術中所提到的，目前小鼠基因組中可供靶向整合的位點很少，本發明提供了一個新的能實現靶向整合的位點序列，利用該位點可構建靶向插入外源基因的打靶載體，並且能夠保證外源基因在小鼠胚胎幹細胞中穩定表達而內源基因表達不受影響，從而為構建轉基因細胞系以及小鼠搭建了一個好的平臺。
附圖說明
圖1：靶向MYH9基因Intron2位點打靶載體的構建，及同源重組後進行PCR篩選與鑑定的引物示意圖；
圖2：PCR篩選與鑑定靶向MYH9Intron2位點的小鼠胚胎幹細胞單克隆，正確靶向的單克隆細胞出現約2.2kb條帶；
圖3：外源基因靶向插入MYH9Intron2位點打靶載體的構建；
圖4：靶向整合至MYH9內含子2位點的外源GFP表達僅受EF1α啟動子控制而不受插入方向的影響(objective 20X)；
圖5：靶向插入MYH9內含子2位點的外源GFP和Puromycin表達僅受αMHC啟動子控制，從而相應的胚胎幹細胞在藥物嘌呤毒素處理下定向分化成心肌細胞，GFP螢光強度隨著分化時間延長而增強(objective 20X)；
圖6：Western blot檢測表明MYH9基因表達不受外源基因插入的影響，該蛋白與正常細胞中的水平一致。
具體實施方式
實施例1：構建靶向小鼠MYH9基因內含子2位點的打靶載體
我們早先的研究表明，在小鼠MYH9基因第一個ATG所處的外顯子2進行基因替代，其同源重組效率高達90％以上，但是這也同時破壞內源MYH9基因，不利於除基因替代外的其它外源基因的插入。我們考慮是否可以將外源基因靶向整合至MYH9基因內含子2位點，這樣不僅可以利用該位點具有的高效同源重組效率，而且可以保持內源基因的完整性。為此，從genome.ucsc.edu網站檢索並下載獲得小鼠MYH9基因組序列，結合小鼠MYH9mRNA(Genbank No:NM_022410)序列，確定各外顯子和內含子位置及序列，特別是第二號內含子。根據MYH9第二號內含子上、下遊各6kb基因組序列，利用Primer3軟體設計4kb左右長臂和2kb左右短臂PCR引物，選取最佳序列。參照David J.Adams 2005文獻報導，獲得包含整個MYH9基因的BAC Clone No:bMQ-369E5，並從Chieldren』hospotal Oakland Research Institute購買獲得，BAC DNA利用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen)製備備用。以bMQ-369E5BAC DNA為模板利用正向引物MAI2R-F(Pme I)5』-AGCTTTGTTTAAACGAAGATCAAGCTCCCACCTGC(SEQ ID NO.5)和反向引物MAI2R-R(BamH I)5』-CGGGATCCGGAGGCTGAAGCCCTGCCCAG(SEQ ID NO.6)及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)作PCR擴增約2.0kb右側同源臂(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2min,30cycles,68℃10min)，下劃線序列為酶切位點。PCR產物經PCR clean-up kit純化後利用Pme I和BamH I(Fermantas)進行雙酶切，而空載體mpNTKV-LoxP(該載體為本實驗室構建並正在申報專利)利用Pme I和Bgl II(Fermantas)進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳分離後，分別切出目的條帶並回收，然後利用T4DNA ligase(Fermantas)將載體與目的片段連接，接著轉化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養，提取質粒DNA，經酶切初步鑑定後送商業公司測序。測序結果顯示右側同源臂插入成功並命名為mpNTKV-LoxP MAI2R，右側同源臂序列如SEQ ID NO.2所示。接著，以bMQ-369E5BAC DNA為模板利用正向引物MAI2L-F(Sal I)5』-ACGCGTCGACGAAGTGAAGCTCCTGGCTTTG(SEQ ID NO.3)和反向引物MAI2L-R(Sac II)5』-TCCCCGCGGCTGCATGCAGGGAACAGAGGG(SEQ ID NO.4)及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity作PCR擴增約4.5kb左側同源臂(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃4.5min,30cycles,68℃10min)，下劃線序列為酶切位點。PCR產物經PCR clean-up kit純化後與質粒mpNTKV-LoxP MAI2R一道利用Sal I和Sac II進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳分離後，分別切出目的條帶並回收，然後將載體與目的片段連接，接著轉化至大腸桿菌DH5α,挑取單個菌落培養，提取質粒DNA，經酶切初步鑑定後送商業公司測序。測序結果顯示左側同源臂插入成功並命名為mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R(knock-in Neo)，左側同源臂序列如SEQ ID NO.1和圖1所示。此外，用於確定靶向是否成功的PCR引物位置如圖1所示，其序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
實施例2：靶向整合外源基因的打靶載體的構建
為使外源基因能夠靶向整合至MYH9基因內含子2位點，必須將外源基因表達盒插入上述靶向載體中mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R，其過程包括如下：
EF1α-GFP-rGlobin polyA表達盒的構建：以pEF-GFP質粒質粒(Addgene)為模板利用正向引物EF1a-F(Pac I)5』-CCTTAATTAACGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC(SEQ ID NO.13)和反向引物rGlobin pA-R(Pac I)5』-CCTTAATTAA CTGCAGGTCGAGGGATCTTCAT及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity作PCR擴增約2.5kb包括human EF1α啟動子、GFP表達序列以及rabbit Globin polyA終止序列的DNA片段(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2.5min,30cycles,68℃10min)，下劃線序列為酶切位點。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、切出目的條帶並利用DNAGel extraction kit(Qiagen)回收DNA片段，接著將該片段連接至T-easy載體(Promega)中，轉化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養，提取質粒DNA，經酶切初步鑑定後送商業公司測序，測序證實無誤後進行下一步。
EF1α-GFP-rGlobin polyA表達盒插入靶向載體mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R：利用Pac I(Fermantas)將hEF1α-GFP-rGlobin polyA片段從T-easy載體切出；同時利用Pac I對mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R質粒(以上構建)進行酶切，酶切後利用Shrimp Alkaline Phosphatase(Fermantas)對線性化載體進行去磷酸化處理。經瓊脂糖凝膠電泳分離後，分別切出目的和載體條帶並回收，然後將載體與目的片段連接，接著轉化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養，提取質粒DNA，經酶切初步鑑定後送商業公司測序以確定插入方向。根據測序結果確定，與MYH9基因轉錄方向一致的為正向插入稱為mpNTKV-LoxP MAI2L-EF1α-GFP-pA-MAI2R(Knock-in EF1α-GFP-pA)，反之則為反向插入稱為mpNTKV-LoxP MAI2L-pA-GFP-EF1α-MAI2R(Knock-in pA-GFP-EF1α)，這些載體及序列如圖3所示和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。這些外源基因定點整合產生的相應突變等位基因分別稱為AKI EF1α-GFP-pA，AKI pA-GFP-EF1α。
αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA表達盒的構建：以pMSCV Puro-IRES-GFP質粒(Addgene)為模板利用正向引物PIG-F(SalI)5』-ACGCGTCGACATGACCGAGTACAAGCCCACGGTG(SEQ ID NO.15)和反向引物PIG-R(SalI)5』-ACGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO.16)及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity作PCR擴增約2.0kb包括Puro-IRES-GFP表達序列的DNA片段(94℃2min,94℃30s,60℃30s,68℃2min,30cycles,68℃10min)，下劃線序列為酶切位點。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、切出目的條帶並利用DNA Gel extraction kit回收DNA片段，接著將該片段連接至T-easy載體中，轉化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養，提取質粒DNA，經酶切初步鑑定後送商業公司測序，測序證實無誤後進行下一步。利用Sal I(Fermantas)將Puro-IRES-GFP片段從T-easy載體切出；同時利用Sal I對pJG/αMHC質粒(Addgene)進行酶切，酶切後利用Shrimp Alkaline Phosphatase(Fermantas)對線性化載體進行去磷酸化處理。經瓊脂糖凝膠電泳分離後，分別切出目的和載體條帶並回收，然後將載體與目的片段連接，接著轉化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養，提取質粒DNA，經酶切初步鑑定後送商業公司測序以確定插入方向。根據測序結果確定，與αMHC啟動子方向一致的為正向插入稱為αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA質粒。
αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA表達盒插入靶向載體mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R：利用Not I(Fermantas)將αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA片段從上述αMHC-Puro-IRES-GFP-hgh polyA質粒中切出，然後利用T4DNA polymease將粘性末端補平；同時利用Swa I對mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R載體(以上構建)進行酶切，酶切後利用Shrimp Alkaline Phosphatase(Fermantas)對線性化載體進行去磷酸化處理。經瓊脂糖凝膠電泳分離後，分別切出目的和載體條帶並回收，然後將載體與目的片段連接，接著轉化至大腸桿菌DH5α，挑取單個菌落培養，提取質粒DNA，經酶切初步鑑定後送商業公司測序以確定插入方向。根據測序結果確定，與MYH9基因轉錄方向一致的為正向插入稱為mpNTKV-LoxP MAI2L-αMHC-Puro-IRES-GFP-pA-MAI2R(Knock-inαMHC-Puro-IRES-GFP-pA)載體，如圖3所示，其序列如SEQ ID NO.10所示。該外源基因定點整合產生的相應突變等位基因稱為AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA。
至此，本發明中擬進行應用的三個靶向整合外源基因的打靶載體構建完畢，如圖3所示。
接下來，利用Not I將上述構建的一個靶向打靶載體和三個靶向整合外源基因的打靶載體(100μg)進行線性化處理，然後應用UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol(25:24:1,v/v)(Invitrogen)抽提DNA線性化酶切體系兩次，高速離心10min後將上清轉移至另一新的1.5ml EP管，加入2.5倍上清體積的100％乙醇，充分混融後高速離心10min獲得白色DNA沉澱，然後用70％乙醇洗滌DNA沉澱一次，在超淨臺中去除上清並風乾DNA沉澱約10min，待乙醇溶液完全風乾後，加入適量TE溶液溶解DNA約2小時以上，測定線性化DNA濃度並調節DNA濃度約為1μg/μl，同時利用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，DNA溶液4℃保存備用。
到此為止，導入細胞的靶向整合外源基因的打靶載體DNA製備完成。
實施例3：靶向整合外源基因的打靶載體導入小鼠胚胎幹(ES)細胞
本發明中所使用的滋養層細胞是經γ-射線處理的具有Neomycin抗性的(Neomycin-resistant)小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)；小鼠胚胎幹細胞系是V6.5具有C57BL/6和129S6vEv雜合遺傳背景，均來自美國國立心肺血液研究所轉基因中心。所使用的MEF和ES細胞培養液DMEM及所需添加物LIF、NEAA、L-glutamine、HEPES、β-mercaptoethanol、PEN/STREP、Puromycin等，均購自Millipore公司。
用於培養胚胎幹細胞的培養皿製備，按如下程序和比例進行：10cm細胞培養皿用3ml 0.1％Gelatin於37℃包被2小時或者4℃包被過夜備用，然後37℃水浴快速解凍MEF細胞、1000rpm離心5min後去上清、重懸，加入2X106 Neomycin-resistant MEFs培養過夜，其它大小培養皿按比例放大和縮小使用量。
ES細胞培養與傳代過程是：37℃水浴快速解凍ES細胞、1000rpm離心5min後去上清，重懸後將適量ES細胞接種至上述製備好的培養皿中。ES細胞長至70％豐度以1：3比例傳代。
準備用於電轉的ES細胞過程是：37℃0.25％胰酶消化細胞4min，反覆吹打至單個細胞，並計數，1000rpm離心收集，PBS洗滌一次，按0.5X107個細胞/ml濃度重懸於電轉緩衝液中(Millipore)。
ES細胞電轉過程是：將0.6ml上述細胞加入含50μg線性化打靶載體DNA的1.5ml EP管中混勻，並轉移至Eppendorf電轉儀配套電轉杯中，室溫靜置5min。用Eppendorf multiporator電轉儀320V 500μF電轉，取出電轉杯室溫放置5min。轉移至含30ml培養液的50ml離心管中混勻，再均勻分配至事先準備好含滋養層細胞的3個10cm培養皿中，37℃5％CO2培養箱中培養。
ES細胞藥物處理過程是：電轉後的ES細胞在24小時後，換成含800μg/ml G418和200μM ganciclovir培養液，此後每天更換含藥物的培養液
ES細胞單克隆挑選、培養與凍存過程是：連續藥物處理7天後，在尼康SMZ1500顯微鏡下用特製吸管挑取胚胎幹細胞單克隆並轉移至事先準備好的含滋養層細胞及培養液的48孔培養板中，每種打靶載體各挑取30個左右單克隆，於37℃5％CO2培養箱中培養。24小時後，用胰酶消化挑取的單克隆細胞並吹打6次，再轉移至新的事先準備好的含滋養層細胞及培養液的48孔培養板中，於37℃5％CO2培養箱中培養3-4天，每天換液。待單克隆細胞長至80％豐度，細胞經胰酶消化、吹打、培養基中和後，將1/3細胞懸液轉移至事先準備好的含滋養層細胞及培養液的24孔培養板中，並於37℃5％CO2培養箱中培養至細胞豐度達90％，用於製備基因組DNA；向剩餘在48孔培養板的細胞懸液中加入等體積的2X胚胎幹細胞凍存液(Millipore)，用Parafilm封好培養板四周再包裹兩層以上吸水紙，儲存在-80℃冰箱備後續利用。
實施例4:外源基因靶向整合至MYH9內含子2位點的陽性ES細胞單克隆的篩選與鑑定
基因組DNA製備：移去培養在上述24孔板中的經藥物篩選的ES單克隆細胞的培養液，PBS洗滌一次，加入600μl含RNaseA的Nuclei lysis solution(Promega)，反覆吹打並轉移至一乾淨EP管中，加入200μl Protein precipitation solution，有力地振蕩30s後，冰上放置5min，接著高速離心10min，然後轉移上清至一新EP管；加入等體積的Isopropanol並充分混勻，接著室溫高速離心10min，然後去除上清；用1ml 70％乙醇洗滌DNA沉澱一次，再高速離心5min，然後用真空泵吸去上清，室溫風乾10-15min，最後加入100μl DNA Rehydration solution，於37℃溶解DNA 2小時或者4℃溶解過夜並保存備用。
PCR篩選與鑑定：我們以前的研究表明，利用Southern Blot和PCR方法篩選與鑑定獲得一致的結果，因此本發明中主要利用PCR方法對同源重組事件進行分析和確定。以提取的小鼠ES細胞基因組DNA為模板利用P1 5』-ATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC(SEQ ID NO.11)和P2 5』-GGAACCTCGATGCGCATACATAG(SEQ ID NO.12)及Platinum Taq High Fidelity DNA Polymerase進行PCR反應，其中P1位於Neomycin 3』末端，P2位於右側同源臂下遊。PCR反應條件是94℃3min,94℃30s,60℃30s,68℃140s,30cycles,68℃10min。PCR擴增產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，若為野生型等位基因A+則無條帶，若為突變型等位基因AKI Neo、AKI EF1α-GFP-pA、AKI pA-GFP-EF1α、AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA皆可產生約2.2kb條帶。
PCR反應特異性確認：為確認該2.2kb DNA條帶的特異性，隨機從每一種打靶載體產生的陽性細胞單克隆中挑取一個，進行二次證實，並將該2.2kb DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切出，經DNA extraction kit回收後，連接至T-easy載體中，經轉化、細菌單克隆隨機挑取和培養、質粒DNA製備、酶切初步鑑定等過程，最後送商業公司測序。測序結果表明，完全符合預期序列，從而證實該2.2kb條帶是由於MYH9基因內含子2位點發生特異性突變所產生的。各靶向整合外源基因的打靶載體在小鼠ES細胞中發生同源重組的效率如表1所示。
表1：基因打靶同源重組效率
實施例5：定點敲入基因的表達分析
如上述所示，在本發明中每種靶向整合外源基因的打靶載體皆獲得多個陽性細胞單克隆，為此隨機從上述48孔培養板中挑取一個單克隆細胞進行定點敲入基因的表達分析，並與對照的野生型ES細胞進行比較。本發明中使用無組織特異性啟動子EF1α和組織特異性啟動子αMHC調控插入基因的表達，接下來將分別進行分析。
無組織特異性啟動子EF1α調控下的基因表達分析：在37℃解凍凍存於48孔培養板中的ES細胞，隨機挑取一個A+/AKI EF1α-GFP-pA,A+/AKI pA-GFP-EF1α和A+/A+(對照)基因型ES單克隆細胞，轉移至1.5ml EP管中，1000rpm離心5min，去除上清，重懸細胞，然後接種至事先準備好的含滋養層細胞及培養基的6孔細胞培養板內，ES細胞培養、傳代和凍存按例行方法進行。接種約1000個ES細胞至一35x10mm Tissue Culture Dish(Thermo Fisher)中，正常條件下培養3天後，在螢光顯微鏡下觀察並攝取活細胞圖像，結果顯示EF1α啟動子調控下的GFP蛋白發出強烈螢光信號，而野生型ES細胞則無螢光，並且正向、反向插入表達盒的兩種細胞之間螢光信號強度無明顯差異，由此充分說明定點插入MYH9基因內含子2位點的外源基因表達正常且與插入反向無關，如圖4所示。
組織特異性啟動子αMHC調控下的基因表達分析：在37℃解凍凍存於48孔培養板中的ES細胞，隨機挑取一個A+/AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA和A+/A+(對照)基因型ES單克隆細胞，於一個10cm tissue culture dish中擴增培養，待長至70％以上豐度，利用胰酶消化細胞，吹打成單個細胞，1000rpm離心5min去除上清，再使用不含胚胎幹細胞分化抑制劑LIF但含20％FCS的DMEM培養基重懸並配製成2X105cells/ml細胞懸液。將30μL/滴的單細胞懸液點至直徑10cm的培養皿蓋內面上，獲得多個彼此分開的小滴；在培養皿中加入15mL無菌D-Hank’s緩衝液，然後小心蓋上培養皿蓋，放置在37℃5％CO2培養箱中倒懸培養2天。用無菌吸管收集單個懸滴形成的擬胚體，轉入含100ng/ml重組人類Activin A蛋白(R&D Systems)的分化培養基的6孔細胞培養板中於37℃5％CO2培養箱培養24小時，然後換成含10ng/ml重組人類BMP4蛋白(R&D Systems)的分化培養基繼續培養96小時。在分化培養液中共計培養5天後，換成含10μg/ml Puromycin的正常培養基處理擬胚體狀細胞7天。換液過程中，將細胞用吸管轉入15ml無菌管中並使用200rpm低速離心5min方法去除上清。從分化培養基中培養開始至藥物處理整個過程中，用螢光顯微鏡攝取擬胚體實時圖像，並觀察心肌細胞(群)的自主節律性收縮。結果表明自分化兩天後，A+/AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA擬胚體可見微弱GFP螢光信號，而A+/A+擬胚體無螢光；藥物處理7天後，A+/AKI αMHC-Puro-IRES-GFP-pA擬胚體可見強烈螢光，並伴隨自主節律性收縮，而A+/A+擬胚體不僅無螢光，還因藥物處理逐步凋亡，如圖5所示。
實施例6：定點插入的外源基因對內源MYH9基因表達的影響分析
採用蛋白質印記實驗分析定點插入的外源基因對內源MYH9基因的表達進行分析。如實施例5在6孔板中培養A+/AKI EF1α-GFP-pA,A+/A KI pA-GFP-EF1α和A+/A+(對照)基因型ES單克隆細胞直到長至80％以上豐度，移去培養基，PBS洗滌細胞一次，然後直接加入0.3ml 2X SDS Sample Buffer(Thermo Fisher)裂解細胞。從上述細胞中提取的蛋白經10％SDS-PAGE Gel電泳分離，轉移至PVDF膜，1小時5％milk封閉；根據分子量大小將膜分成兩半，一部分與Anti-NMHC IIA antibody和另一部分與Anti-βactin antibody(Abcam)4℃孵育過夜，洗膜，與Anti-mouse HRP(Abcam)室溫孵育2小時，再洗膜，最後經辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法(Pierce)獲得結果，掃描膠片，利用Image J進行圖片灰度分析。以NMHC IIA/β-actin比值衡量和比較NMHC IIA在不同細胞中的表達量變化。結果顯示，與A+/A+(對照)細胞比較，A+/AKI EF1α-GFP-pA和A+/A KI pA-GFP-EF1α細胞中NMHC IIA的表達量幾乎一致，表明定點插入MYH9基因內含子2位點的外源基因對內源MYH9基因不產生任何影響，從而確定MYH9基因內含子2位點完全可以作為一個新的外源基因插入的safe harbor。