具有抗脂質累積活性的川芎內酯提取物製備方法及用途的製作方法

2023-05-21 14:37:36

專利名稱：具有抗脂質累積活性的川芎內酯提取物製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬中藥化學領域，具體地說涉及一種從川芎中提取的有效組分及其製備方法，以及該組分在製備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應用。
背景技術：
肝損傷是由多種病因引起且有多種因素參與的複雜過程。肝損傷引發的肝臟疾病已成為常見病、多發病，更為嚴重的是其引發的肝功能衰竭和肝性腦病等，發病率和死亡率高，極大地威脅著人類健康。很多因素可引起肝損傷。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD),又稱非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver, NAFL),是一種無過量飲酒史，以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特徵的臨床病理症候群。非酒 精性脂肪肝包含一系列的肝臟疾病，從單一的脂肪變性到不同程度的脂肪變性聯合壞死和纖維化。而肝細胞內脂質異常累積則是脂肪肝類疾病發生的最主要因素。油酸是人體內最為豐富的脂肪酸之一，它參與形成肝臟中的三酸甘油酯並能促進脂滴的形成，油酸誘導HepG2脂肪累積是一種常用的脂質累積細胞模型，可用於評價藥物的抗脂質累積作用。目前，非酒精性脂肪肝治療方法有很多，且均有一定療效，但也存在著明顯的不足。首先，西藥具有較大的毒副作用，且療效並不確切。而另一方面，實驗和臨床研究證實，中藥在改善肝功能、抗氧化、改善微循環、調節免疫功能以及抗肝纖維化等方面顯示出良好的療效，安全、可靠、有效，進一步顯示出中醫辨證論治的合理性，突顯了中藥在治療稱非酒精性脂肪肝方面的良好前景。川彎為傘形科植物川彎chuanxiong Hort.的乾燥根莖,其性味辛，溫。歸肝、膽、心包經。活血祛瘀作用廣泛，適宜瘀血阻滯各種病症；祛風止痛，效用甚佳，可治頭風頭痛、風溼痺痛等症。現代藥理學研究表明，川芎提取物對離體豚鼠心臟有劑量依賴性抑制作用，對離休大鼠或豚鼠心臟均具有顯著的增加冠脈流量作用，其主要活性成分川芎嗪能擴張大鼠肺血管，抑制缺氧性肺血管收縮反應和右心室肥大。此外，川芎還具有中樞神經系統抑制作用，對動物大腦的活動具有抑制作用，而對延腦呼吸中樞、血管運動中樞及脊髓反射中樞具有興奮作用。但目前研究大都集中在川芎嗪和阿魏酸等成分，對於川芎內酯類組分是否具有抑制肝細胞脂質累積的活性尚不清楚。

發明內容
本發明的目的是提供一種川芎有效組分，該有效組分主要含有藁本內酯，含量為30 90%。本發明的另一目的是提供該川芎有效組分的製備方法，通過以下步驟實現將川芎藥材粉碎後加入20°/Γ90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取0. 8^1. 2小時，提取f 3次，合併濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮後用正相矽膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮後得到有效組分。本發明的再一個目的是提供該川芎有效組分在製備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應用。本發明第一方面提供了一種川芎提取物，其中含有3(Γ90%的藁本內酯。根據本發明第一方面的川芎提取物，其中含有8(Γ97%(例如85%_95%)的藁本內酯。根據本發明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法製備得到的將川芎藥材粉碎後，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡並回流提取1_4次，合併提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合併的萃取液回收溶劑至幹，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，力口入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。根據本發明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法製備得到的將川芎藥材粉碎後加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取O. 8^1. 2小時，提取f 3次，合併 濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮後用正相矽膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮後得到提取物。根據本發明第一方面的川芎提取物，其是通過以下方法製備得到的將IOOOg川芎藥材粉碎後，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合併提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液,加入500ml石油醚萃取3次，合併萃取液，回收溶劑至幹。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經過濃縮後即得。本發明第二方面提供了製備川芎提取物的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎後，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡並回流提取1_4次，合併提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合併的萃取液回收溶劑至幹，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。根據本發明第二方面的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎後加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取O. 8^1. 2小時，提取f 3次，合併濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮後用正相矽膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮後得到提取物。根據本發明第二方面的方法，其包括以下步驟將IOOOg川芎藥材粉碎後，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合併提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合併萃取液，回收溶劑至幹。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經過濃縮後即得。根據本發明第二方面的方法，其所得川芎提取物中含有3(Γ90%的藁本內酯。根據本發明第二方面的方法，其所得)11芎提取物中含有8(Γ97% (例如85%_95%)的藁本內酯。本發明第三方面提供了本發明第一方面的川芎提取物在製備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應用。
本發明第四方面提供了一種藥物組合物，其中包括本發明第一方面的川芎提取物以及藥學可接受的載體或賦形劑。本發明的川芎有效組分可以作為活性部位，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法製成製劑。所述藥物的製劑形式包括液體製劑、固體製劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、衝劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。在本發明中，術語「川芎有效組分」亦可稱為「川芎組分」、「川芎提取物」、「川芎內酯」等，這些術語可以互換使用。本發明的有益效果為
I.本發明的提取分離工藝簡單，能快速準確地得到有效組分。 2.本發明提供的川芎有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易於闡明其作用機制，在生產中更易於藥物的質量控制。3.本發明首次在油酸誘導HepG2脂肪累積模型上，評價了川芎內酯類提取物對抗脂質累積降脂作用，得到較好的藥理活性。


圖I為本發明川芎提取物的GC-MS分析圖，模坐標表示分鐘。圖2.不同濃度川芎提取物對500uM油酸誘導的H印G2細胞脂質累積的影響。
具體實施例方式本發明結合附圖和下面實施例進一步詳細說明本發明的實質內容，該實施例僅用於說明本發明而並非對本發明的限制。實施例一川芎有效組分的製備
將IOOOg川芎藥材粉碎後，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合併提取液，濃縮至密度I. 08。將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合併萃取液，回收溶劑至幹。取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:1的石油醚(60-90)和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經過濃縮後得到淡黃色液體
11.3g，為本發明川芎提取物，其在本發明中亦可稱為川芎內酯，並且用於下文生物學試驗例。實施例二川芎有效組分的分析
稱取如實施例I所示川芎提取物溶解，取適量轉移至棕色液相進樣瓶，用於液相色譜分析。分析條件如下Agilent 1100型液相色譜儀,進樣量10 μ I ;流速lml/min,柱溫30。。。色譜流動相梯度為:(T40min :水(O. 1%甲酸)70% 20%，乙腈30% 80% ;40_50min 水(O. 1%甲酸)20% 5%，乙腈80% 95% ;50 55min :水(O. 1%甲酸)5%，乙腈95% ;檢測波長271nm。分析譜圖如附圖I所示。液相色譜分析顯示川芎提取物在26. 5min有I個明顯色譜峰，經與標準品比對後鑑定該峰代表的化合物為藁本內酯。分析結果顯示，川芎內酯提取物中主要成分為藁本內酯，其含量約為90%。出人意料地發現，在實施例I中，如果用濃度低於70%的乙醇提取，或者用石油醚為洗脫劑，或者所用洗脫劑中乙酸乙酯份量大於5，即50份石油醚與5份以上的乙酸乙酯混合液為洗脫劑時，藁本內酯獲得量比實施例I的獲得量低30%以上。用75%以上乙醇提取，或者用石油醚乙酸乙酯為50 :0. 5^3的比例的混合液作為洗脫液時，藁本內酯獲得量是實施例I的獲得量的909^115%，並且提取物中藁本內酯含量均在80 97%。實施例三川芎有效組分製劑
取實施例I所得的川芎有效組分O. 5g與10. 5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料後移至滴丸滴灌中，藥液滴至6 8°C液體石蠟中，除油，製得滴丸400粒。實施例四川芎有效組分製劑
取實施例I所得的川芎有效組分O. 5g，磨成細粉，與約1/3的澱粉混勻，加澱粉漿混勻製成軟材，16目篩制粒，70°C乾燥，幹粒過14目篩整粒，加剩餘澱粉(預先在100 - 105 V乾燥)與吸附有液狀石蠟的滑石粉(將輕質液狀石蠟噴於滑石粉中混勻)，再通過14目篩，壓片，即得。實施例五川芎有效組分(實施例I的川芎提取物)抗脂質累積活性評價 溶待測組分於DMSO中，得50 mg -inL-l儲備液，與細胞孵育的終濃度為50 μ g -inL-l,
在油酸誘導的HepG2肝細胞模型評價其抑制脂質累積活性。將生長良好的HepG2細胞以每孔20萬細胞的密度接種於24孔細胞培養板中，每孔培養液1ml。待細胞貼壁後(約24小時)，分對照組和給藥組處理，平行三次實驗，對照組中加入O. 5mM油酸，給藥組中加入O. 5mM油酸及實施例I所得川芎提取物(濃度為25、50、100,200 ug/ml)，於37°C、5%C02的條件下培養24h後，棄去每孔上清，酶法測定甘油三酯、總膽固醇含量。測定方法為24孔細胞培養板用預冷PBS500ul洗兩次，每孔加入200ul細胞裂解液裂解30min，取裂解總液於I. 5ml離心管中，離心(12000rpm，4°C，lOmin)，分別取上清液80ul加IOOul甘油三酯酶劑測每孔甘油三酯(TG)含量，80ul加IOOul膽固醇酶劑測每孔膽固醇(TC)含量，IOul用BCA法測蛋白含量，計算每孔單位蛋白的TG和TC含量(ug/mg蛋白)。結果表明，實施例I所得川芎提取物在50ug/ml，100ug/ml, 200ug/ml濃度下有明顯的抑制油酸誘導HepG2細胞中甘油三酯累積的作用，並呈量效關係。結果見圖2，其中顯示了不同濃度川芎提取物對500uM油酸誘導的H印G2細胞脂質累積的影響。縱坐標表示對照的％。
權利要求
1.一種川芎提取物，其中含有3(Γ90%的藁本內酯。
2.根據權利要求I的川芎提取物，其中含有8(Γ97%的藁本內酯。
3.根據權利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法製備得到的將川芎藥材粉碎後，用70°/Γ99%乙醇(例如75°/Γ98%)浸泡並回流提取1_4次，合併提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合併的萃取液回收溶劑至幹，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
4.根據權利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法製備得到的將川芎藥材粉碎後加入20°/Γ90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取O. 8^1. 2小時，提取f 3次，合併濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮後用正相矽膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮後得到提取物。
5.根據權利要求I或2的川芎提取物，其是通過以下方法製備得到的將IOOOg川芎藥材粉碎後，加入4000ml 95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合併提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液,加入500ml石油醚萃取3次，合併萃取液，回收溶劑至幹；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經過濃縮後即得。
6.製備川芎提取物的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎後，用709Γ99%乙醇(例如759Γ98%)浸泡並回流提取1-4次，合併提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合併的萃取液回收溶劑至幹，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:0. 5 5 (例如50:0. 5^3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
7.根據權利要求6的方法，其包括以下步驟將川芎藥材粉碎後加入20% 90%的乙醇浸泡5 12小時，加熱回流提取O. 8^1. 2小時，提取f 3次，合併濾液得提取液，將提取液用石油醚萃取，將萃取液濃縮後用正相矽膠柱對其進行純化，以體積比為50:1的石油醚與乙酸乙酯為洗脫劑，收集洗脫液濃縮後得到提取物。
8.根據權利要求6的方法，其包括以下步驟將IOOOg川芎藥材粉碎後，加入4000ml95%乙醇浸泡過夜，回流提取2小時，再加入4000ml用95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，合併提取液，濃縮至密度I. 08 ;將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，加入500ml石油醚萃取3次，合併萃取液，回收溶劑至幹；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50:1的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，經過濃縮後即得。
9.權利要求1-6的川芎提取物在製備非酒精性脂肪肝治療藥物中的應用。
10.一種藥物組合物，其中包括權利要求1-6的川芎提取物以及藥學可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發明涉及具有抗脂質累積活性的川芎內酯提取物製備方法及用途。具體地，本發明涉及一種川芎提取物，其中含有30～90%的藁本內酯。該提取物是通過以下方法製備得到的將川芎藥材粉碎後，用70%～99%乙醇(例如75%～98%)浸泡並回流提取1-4次，合併提取液，濃縮，用石油醚萃取，將合併的萃取液回收溶劑至幹，得石油醚萃取浸膏；取石油醚萃取部分浸膏，加入正相矽膠拌樣後過正相矽膠柱，以體積比為50∶0.5～5(例如50∶0.5～3)的石油醚和乙酸乙酯溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得。
文檔編號A61K36/236GK102824382SQ20121030221
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者程翼宇, 張萌, 王怡, 王毅, 劉二偉 申請人:天津中醫藥大學