高純度白蛋白生產方法

2023-05-22 07:44:16 2

專利名稱：高純度白蛋白生產方法
技術領域：
本發明涉及純化從血清中提取的人血清白蛋白(HSA)或用編碼人血清白蛋白胺基酸序列的核苷酸編碼序列轉化一種微生物生產地重組人白蛋白(rHA)。在此說明書中，術語「白蛋白」通常指人血清白蛋白和/或重組人白蛋白。
白蛋白用於治療有嚴重燒傷，休克或失血的病人。也用作補充培養高等真核細胞的培養基和作為治療用蛋白配方中的賦形劑。目前，從人血液中提取的白蛋白可以滿足對這種產品的需求。提取和分離技術的實例包括那些公開於如下專利中JP03/258728關於一種陽離子交換劑的使用；EP428758關於陰離子交換緊接著陽離子交換的應用；和EP452753關於加熱、加鹽和滲濾的使用。
微生物中重組人白蛋白的生產已在EP330451和EP361991中公開。重組人白蛋白的純化技術已公開在WO92/04367，源於基質的染料的去除；EP464590，源於酵母的著色劑的去除；和EP319067鹼沉澱及隨後的將重組人白蛋白應用於對白蛋白有特異親和力的親脂相。
本發明提供高度純化的白蛋白。
本發明一方面提供了一種純化白蛋白的技術，該技術包括將相對不純的白蛋白溶液加入白蛋白可非特異結合的層析材料以便白蛋白與該材料結合，和用含可與白蛋白特異結合的化合物的溶液從該材料上洗脫結合的白蛋白的步驟。優選地，層析材料是一種陽離子交換劑，如SP-瓊脂糖FF，SP-多孔微球矽膠等，列於實施例2之中。與白蛋白有特異親和力的化合物可以是辛酸鹽(如辛酸鈉)，其它長鏈(C6至C22)脂肪酸，水楊酸鹽，辛醯丁二酸鹽，N-乙醯色氨酸或兩種或多種這類化合物的混合物。
本發明的第二方面提供一種純化白蛋白的方法，該方法包括的步驟有將白蛋白溶液進行陽離子交換層析。其中白蛋白與陽離子交換物質結合，然後進行陰離子交換層析，其中白蛋白與陰離子交換物質結合。
從陽離子交換物質洗脫的白蛋白可在進行所說陰離子交換層析之前用親和層析、超濾和凝膠滲透中的一種或多種方法處理。因此，在一優選的實施方案中，該方法包括的步驟有
(a)在白蛋白能與一種陽離子交換基質結合的條件下，將白蛋白溶液通過該基質；
(b)從所說的基質上洗脫出包含白蛋白的陽離子交換洗脫液；
(c)將所說的洗脫液通過一種包含一種白蛋白結合化合物的親和基質；
(d)從所說的基質上洗脫出一種含有白蛋白的親和基質的洗脫液；
(e)在超濾之後，任選地將洗脫液通過一種凝膠滲透基質以獲得一種富含白蛋白的組分；
(f)在白蛋白能與一種陰離子交換基質結合的條件下，將所說的富含白蛋白的組分通過該基質；並
(g)從所說的陰離子交換基質中洗脫出一種純化的含白蛋白的產品。
另一種選擇是，從陽離子交換物質中洗脫的白蛋白可直接通過所說陽離子交換物質而不需加入任何處理(不包括稀釋)。因此，第二種優選的提供純化白蛋白的方法的實施方案包括的步驟有
(a)在白蛋白能與一種陽離子交換基質結合的條件下，將白蛋白溶液通過該基質；
(b)從該基質中洗脫出一種含有白蛋白的陽離子交換洗脫液；
(c)在白蛋白能與一種陰離子交換基質結合的條件下，將陽離子交換洗脫液通過該基質；
(d)從該陰離子交換基質中洗脫出一種含白蛋白陰離子交換洗脫液；
(e)將陰離子交換洗脫液通過一種包含一種白蛋白結合化合物的親和基質；
(f)從該親和基質中洗脫出一種含白蛋白的親和基質洗脫液；
(g)將該親和基質洗脫液通過一種凝膠滲透基質以獲得富含白蛋白的組分。
優選地，在進行陽離子交換的步驟之前，通過加入辛酸鹽和/或其它白蛋白穩定劑(如乙醯色氨酸鈉)至其達終濃度約為1-10mM，並調節pH至約4.0-5.0而調節該白蛋白溶液。
在將陽離子交換步驟中的白蛋白進行洗脫之前，如用一種高鹽溶液(如在pH4.0，用10-100mM，優選地為20-40mM，例如27mM乙酸鈉作為緩衝的0.5-2.0M氯化鈉)洗脫則更為有益。
優選地，在陽離子交換洗脫液直接過陰離子交換劑的方法中，在陽離子交換一步中的白蛋白的洗脫採用一種含有與白蛋白有特殊親和力的化合物的緩衝液，尤其是該化合物是一種酸或其鹽，例如辛酸鹽或任何其它長鏈(C6-C22)脂肪酸，水楊酸鹽，辛醯丁二酸鹽或N-乙醯色氨酸。
一種含高濃度(如至少50mM，50-200mM較好，例如80-150mM)硼酸鹽，例如四硼酸鈉或四硼酸鉀的緩衝液適於從陰離子交換劑中洗脫白蛋白。
按本發明純化的白蛋白經過或不經介入的工藝步驟後，用含有可選擇性結合糖綴合物和多糖的固化的化合物，如氨基苯硼酸(PBA)的樹脂進行層析。
在本發明中涉及親和層析的任何步驟中，親和層析優選地採用一種包含有固化染料，諸如Cibacron藍型染料的樹脂，固化於樹脂上優選地通過諸如1，4-二氨基丁烷基的間隙基團或另一個C1-8的且優選地為C1-6，如C1-5，最優選地是C4長度，優選地α-ω-二氨基取代基團的間隔基團。令人驚奇的是，我們發現這種染料事實上對能夠由分泌HA的微生物的培養生產的45KD的白蛋白片段比對全長的白蛋白分子具有更高的親和力。這種45KD片段通常由1-403至1-409區組成，並在Sleep等(1990)生物技術(Bio/Technology)8，42-46及WO 95/23857中公開。
應用本發明的方法製備的純的白蛋白溶液可根據其預定的用途進一步加工。例如，其可通過超濾膜超濾獲得白蛋白濃度至少達每升80克白蛋白的超濾保留液，超濾保留液用至少相當其5倍體積的水透濾。在某些層析步驟中，有銨離子是有利的，如在涉及固化的氨基苯硼酸鹽的步驟。令人吃驚的是，我們發現這些銨離子與白蛋白結合得相當緊密。優選地，從白蛋白中去除這些銨離子，我們已發現這可使用抗衡離子來實現。在本領域的現有方法中沒有出現需要將白蛋白加入抗衡離子，因為其沒有涉及銨離子而且沒有理由假設銨離子結合於白蛋白。
因而，本發明的下一個方面提供一種純化白蛋白溶液的方法，其包括將該溶液加入一種抗衡離子溶液以使銨離子從白蛋白中被取代並從溶液中去除。
抗衡離子(優選地為一種金屬離子如鈉離子)加入到白蛋白溶液中，銨離子通過透析去除，或者通過半透膜將白蛋白與抗衡離子溶液隔開的透濾去除，或通過凝膠滲透層析去除。透濾通常用至少5倍保留物體積的50mM的氯化鈉是合適的。
所得到的白蛋白含極低水平的，或基本去除了著色劑、乳酸、檸檬酸、金屬、人源蛋白如免疫球蛋白，前激肽釋放酶激活因子，轉鐵蛋白，α1-酸性糖蛋白，血紅蛋白和凝血因子，真核細胞蛋白，白蛋白片段，白蛋白聚合體或多聚體，內毒素，膽紅素，血紅素，酵母蛋白和病毒。「基本去除」意味著低於可檢測水平。術語「著色劑」用於此處代表任何使白蛋白著色的化合物。例如色素是一種源自有機體，特別是用於製備重組白蛋白的酵母的著色劑，而染料是出現在用於白蛋白純化的層析步驟的著色劑。以本發明的方法純化的白蛋白製劑中以蛋白重量計，至少有99％，優選為至少99.9％是白蛋白。這樣高純度的白蛋白不太可能會引起有害副作用。
用本發明的方法生產的白蛋白至少99.5％是單體，優選地是通過還原性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定的實際100％的單體，並具有如下的一個或多個特徵。以一克白蛋白計，其鋁離子含量低於150ng，優選為低於100ng；鐵離子含量低於3,000ng，優選為低於1,000ng；銅離子水平低於10,000ng，優選為低於5,000ng；鎂離子水平低於3,000ng，優選為低於1,500ng；鋅離子水平低於5,000ng，優選為低於3,000ng；錳離子水平低於50ng；以摩爾己已糖/摩爾蛋白計，糖化水平低於0.6，優選地低於0.15(更優選地低於0.05)；按下列實施例9的方法測定，低分子量雜質的水平低於20V.sec，優選地低於10V.sec；毛細管區帶電泳圖中單一峰，完整的，即均一的羧基末端和氨基末端；至少0.8mol SH/mol蛋白中不含硫醇；不超過0.3mol/mol C10至C20脂肪酸和實質上的無C18或C20脂肪酸。
最初的原料可能是含有白蛋白的發酵培養基，或者不純的白蛋白溶液可能是用過去50年中發展起來的過多的提取和純化技術從血清中獲得的溶液，這些技術如Stoltz等(199)國際製藥技術(Pharmaceut.Tech.Int.)1991年6月，60-65以及More和Harvey(199)在「血液分離和血漿分級分離」Ed.Harris，Wiley-Liss出版261-306.中所公開的。
尤其是當白蛋白是由缺乏蛋白酶的酵母或其它微生物生產所得的重組人白蛋白，其純化方法通常不包括作為純化工藝一部分的加熱處理步驟(與EP428758和EP658569對比)。類似的，如果白蛋白是從微生物(而不是人)製備，它通常不需要最後的巴斯德滅菌步驟(通常為60℃，一小時)。
最終的產物需配製以增加其穩定性。優選地，本發明的高純白蛋白產品至少包含100g，更優選地為1kg或10kg，其可用大量小藥瓶分裝。
儘管本發明的方法可用於從許多來源，如血清中獲得的不純白蛋白溶液中獲取更純的白蛋白，但它特別可應用於純化重組人白蛋白(rHA)。按本發明製備白蛋白可以是任何哺乳類白蛋白，如大鼠、牛或綿羊的白蛋白，但優選地是人白蛋白。編碼白蛋白的DNA可在適當的宿主中表達生產白蛋白。因此，DNA可按已知的技術用於構建一表達載體，然後用基轉化適當的宿主細胞以表達和生產白蛋白。這些技術包括在EP-A-73646，EP-A-88632，EP-A-201239和EP-A-387-319中公開的技術。
已知有許多表達系統，包括細菌(如大腸桿菌和枯草桿菌)，酵母(如啤酒糖酵母，巴斯德畢赤氏酵母，和乳克魯維氏酵母)，絲狀真菌(如麴黴)，植物細胞，動物細胞和昆蟲細胞。優選的微生物是啤酒糖酵母。
可考慮用於本發明操作的酵母的典型的屬是畢赤氏酵母屬(漢遜氏酵母屬)，糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，假絲酵母屬，球擬酵母屬，有孢圓酵母屬，裂殖糖酵母屬，固囊酵母屬，Pachysolen，德巴利氏酵母屬，梅奇酵母屬，紅冬孢屬，Leucosporidium，Botryoascus，鎖擲酵母屬，擬內孢黴屬和類似的屬。優選的屬是選自畢赤氏酵母屬(漢遜氏酵母屬)，糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，Yarrowia和漢遜氏酵母屬。糖酵母屬種的例子是啤酒糖酵母、義大利糖酵母和魯氏糖酵母。克魯維氏酵母屬種的例子是脆壁克魯維氏酵母和乳克魯維氏醇母。畢赤氏酵母屬(漢遜氏酵母屬)的例子是P.angusta(原多形漢遜氏酵母)，P.anomala，巴斯德畢赤氏酵母和P.capsulata。Y.lipolytica是一個合適的yarrowia種的例子。
使用一種有一種或多種蛋白酶缺陷的酵母菌株是有益的。這類菌株包括熟知的pep4-3突變株和含有PRA1和/或PRB1基因突變的菌株，這些菌株在Woolford等(1993)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)268，8990-8998，Cabezon等(1984)美國國家科學院院報(PNA.S.)81，6594-6598，EP-A-327797和Jones等(1982)遺傳(Genetics)102，665-677.中公開。另一種方法是，發酵培養基中的蛋白酶可通過加熱使之失活。在整個操作過程中蛋白酶的存在會降低白蛋白的產量。
酵母的Yap3p蛋白酶和/或hsp150熱休克蛋白的水平最好很低(或為零)，例如由破壞各個基因導致的結果，這可在我們公開的專利WO 95/23857和W0 95/33833中分別獲知。Yap3p能引起下述45KD白蛋白片段的形成，hsp 150在某些分離步驟中與白蛋白一起被純化。
酵母可用基於啤酒糖酵母的2μm質粒構建的表達質粒轉化。轉化酵母時，質粒包含細菌的複製子和所選的序列，該序列在轉化後可能通過根據EP286424所述的內部重組而被切除。質粒也可包含一表達盒，包括一個公開在EP431880中的酵母啟動子(如啤酒糖酵母PRB1啟動子)；一段編碼分泌前導區的序列，如在WO 90/01063中公開的一段包括絕大部分天然人血清白蛋白分泌前導區，加上一小部分啤酒糖酵母α-交配因子分泌前導區的順序；人血清白蛋白編碼順序，可通過已知的分離和人類基因相對應的cDNA的方法獲得，這在例如EP73646和EP286424中公開；一段轉錄中止子，如EP 60057中公開的來源於糖酵母ADH1的終止子。
儘管上述質粒中的不同成分對增加產量的收穫有不同的作用，但並不認為它們的選擇直接與獲得的白蛋白產物的純度相關。
現在將通過實施例並參照


本發明優選的方面，

為
圖1圖示用於生產重組人白蛋白的發酵罐。
圖2是C18 PTH反向HPLC柱(Applied Biosgstem Inc)的紫外掃描圖，顯示本發明提供的白蛋白中低分子量雜質的水平低。
圖3與圖2類似，但顯示的是現有技術提供的白蛋白中的低分子量雜質。
圖4是一氣相色譜圖顯示市場上提供的白蛋白中的脂肪酸含量。
圖5與圖4一樣但顯示的是本發明提供的白蛋白；
圖6a和圖6b分別顯示本發明提供的白蛋白和現有技術提供的白蛋白的電子流質譜圖。
實施例1不純白蛋白溶液的製備
構建生產白蛋白的微生物的克隆策略公開在EP431880中。質粒pAYE316用Hinnen等(1978)美國科學院院刊(P.N.A.S.)75，1929中描述的方法導入一啤酒糖酵母萄株(MATa，Leu2，pep43，[cir°])。轉化體用缺乏亮氨酸的基本培養基(酵母氮基質，Difco)篩選。當轉化體在含有10ml複合物(YEP，1％(w/v)醇母浸膏，2％(w/v)細菌蛋白腖和2％(w/v)蔗糖)或特定的液體培養基(0.15％(w/v)不含胺基酸和硫酸銨的酵母氮基質，0.5％(w/v)硫酸銨，0.1M檸檬酸/十二水磷酸氫二鈉，pH6.5，5.2％(w/v)蔗糖)的燒瓶中，在200rpm，30℃下生長72小時，在無細胞的培養上清液中可用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳和/或用火箭凝膠免疫電泳檢測到重組人白蛋白。
在特定液體培養基(緩衝的基本培養基(BMM)鹽培養基酵母氮基質[不含胺基酸和硫酸銨Difco]，1.7g/L；一水檸檬酸6.09g/L；無水磷酸氫二鈉，20.16g/L，pH6.5±0.2，蔗糖加至20g/L)中培養的原種主細胞用於製備生產適宜於用冷凍分裝的含20％(w/v)海藻糖的培養物製備燒瓶振蕩培養物的酵母工藝的流通原種(製造商使用的細胞庫)。發酵
這一部分涉及從原種培養到最母的發酵以生產重組人白蛋白，是人重組白蛋白發酵過程總的定義，其不局限於特殊設備或尺寸的具體的細節。震蕩燒瓶培養酵母[cir°pAYE 316]以生理上適宜於種子管的接種的無菌培養方式生長。當種子管的時間選擇重複時，確定生長期(基本碳水化合物過量)和接種物生物量(12±2mg/L，每10升培養基需接種物100ml)是必要的。一菌種管的菌種接種至含100ml BMM+2％(w/v)蔗糖的振蕩燒瓶中並在30℃下用軌道振蕩器(每分鐘200rpm轉率)孵育直至得到0.6-1.2g/L(通過在600nm處的光密度值估計)的細胞乾重。這一培養物再接種至種子發酵管至12±2mg/L水平。種子發酵主產物發酵罐的接種物是通過生產產物的有機體，優選地是啤酒糖酵母[cir°pAYE 316]，在種子發酵罐(在本實施例，為20L工作體積)生長至高達約100gL1細胞乾重(cdw)隨後採用補料分批的培養方式以使乙醇和乙酸的積累降至最少而因此使細胞產物最多。每次發酵的整個過程通過計算機控制系統監沿和控制，計算控制系統如多發醇罐計算機系統(MFCS)軟體由B.Braun提供。由B.Braun提供的軟體是一個監視控制和數據獲取軟體包；其它的公司可提供相似的軟體包。補料控制規則用於控制補加的蔗糖以通過避免Crabtree效應獲得最多的生物量，因而使乙醇和/或乙酸的產量降至最低。發酵管用熱氫氧化鈉清洗並用無熱原的水(PFW)淋洗。熱的無菌的容器將含約10L無菌的MW10培養基(表1)，分批鹽加上微量元素。用於人重組白蛋白的培養基能經超濾(截流分子量10,000)去除內毒素。
表1
MW 10培養基成份分批培養基補料培養基鹽磷酸二氫鉀 2.74g/L 10.9g/L七水硫酸鎂 0.58g/L 2.3g/L二水氯化鈣 0.06g/L 0.24g/L磷酸(85％w/w)0.88ml/L 1.76ml/L維生素泛酸鈣 20mg/L180mg/L尼克酸 33.3mg/L 300mg/Lm-肌醇 20mg/L180mg/Ld-生物素 0.133mg/L 0.8mg/L鹽酸硫胺素 16mg/L32mg/L微量元素貯存液 10ml/L20ml/L蔗糖 0* 500g/L微量元素貯存液成分七水硫酸鋅 3g/L七水硫酸亞鐵 10g/L四水硫酸錳 3.2g/L五水硫酸銅 0.079g/L硼酸 1.5g/L碘化鉀 0.2g/L二水錳酸鈉 0.5g/L六水氯化鈷 0.56g/L
微量元素加在去礦物質水中，用98％的硫酸按35ml/L酸化。
*在20L種子發酵階段加入20g蔗糖/L於分批培養基中。可用任何方便的方法除菌，亦作為除熱原的方法，例如超濾。維生素通常過濾除菌。
培養基加入容器後，設置操作溫度為30℃，及最低攪拌速率，通常為400-500rpm。超始pH用pH控制器設置在5.7±0.2，以氨溶液(特殊的比重為0.901)調節。2M的硫酸也用作pH校正劑。容器中加入蔗糖至20gL-1，MW10批培養維生素和Breox FMT30除泡劑至0.04gL-1。
過濾除菌的空氣以0.5v/v/m(即每分鐘每升培養基0.5升非壓縮空氣)速率注入容器中，培養基用無菌震蕩培養物接種至每升含12±2mg細胞乾重並啟動MFCS計算機系統。完成批生長期(以30分鐘內溶解氧的壓力(tension)上升大於15％為標誌)之後，MFCS系統控制下的開始添加補料培養基。控制策略實際上與下述的生產發酵是一樣的。發酵時氣流分兩步增加以維持約1v/v/m的氣流。通過改變攪拌速率將溶解氧壓力(DOT)控制在20％空氣飽和度。一旦攪拌速率不能進一步增加且氣流率達到最高值，補料控制規則系統控制補料率以使發酵產物的形成降於最低。在補料結束時，培養物轉入生產容器。發酵生產酵母[cir°，pAYE316]的無菌培養物是通過補料發酵獲得細胞外重組人白蛋白生產所需的高水平的細胞乾重(＞80gL-1)而產生的。本實施例中的發酵罐工作容積為8000L，用種子發酵罐中生長的培養物接種生產發酵罐，其細胞乾重優選地大於80gL-1。移入種子發酵罐的培養物後，生產發酵罐的初始細胞乾重濃度優選地在0.25-1.00gL-1。儘管優選地在一個小時內開始補料，但如果需要也可以延遲。由於在補料期的開始階段OUR和CER的值很低及其檢測導致的誤差，使用RQ的補料率的自動控制在最初不可行。補料方法是試圖使乙醇和乙酸的積累降至最低，從而使細胞和產物的產量達到最高。
發酵是在發酵罐中進行，如圖1所示的具有最佳氣體溶解和大量混合設計的發酵罐。經熱氫氧化鈉洗滌和無熱原水淋洗的容器將容納約4000L的無菌MW10(表1)，批量鹽和微量元素。該培養基可在容器外以加熱或過濾的方式除菌。根據本發明的發現，在諸如MW10的培養基中不含乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽或其它重金屬鰲合劑有益，因為這些物質的存在導致所得的白蛋白中有色雜質的程度明顯升高。
工作溫度設置為30℃，且攪拌速率調至足夠維持溶液的均勻，通常約50rpm。啟始pH用氨溶液(特定比重0.901)(控制器設置為5.7±0.2)。2M硫酸可作為第二種pH校正劑。加入MW10的批發酵的維生素，如需要加入適當的除泡劑(如Breox FMT 30至0.125gL-1)。
向容器中以最初0.5v/v/m的速率注入過濾除菌的空氣至耗氣分析達最大靈敏度，並啟動MFCS計算機系統。耗氣量的分析，可以使用諸如連續質譜儀(如Fisons VG氣體分析儀)。容器用所有的種子容器培養物(最低0.4％v/v)接種。補料的MW10的體積與批培養的體積相等。補料開始，RQ不能控制，直至OUR和CER的值足夠高時才能使控制有效。在沒有RQ控制的階段，如果RQ持續大於1.2，補料率要手動調節。按照下面的計算公式，補料率通過計算機控制而上升。
補料率(FR)＝Keμt
這裡K是初始補料率，μ是指數生長率，t是時間。K值作為初始補料率是由經驗決定的，它是達到使乙醇和乙酸的積累降低最低的生長率所必需的。對於本實施例，K確定為每升培養物每分鐘加0.08mL的MW 10補料培養基。μ值與完全呼吸的生物的最大生長率有關，在本實施例為0.1h-1。
t是從0開始的變化的計數，每分鐘增加1，除非RQ＞1.2或DOT＜15％。在那種情況下，t值下降。
容器必要的時候可加壓以加強OTR。在補料終結時，培養物維持在下遊處理。
這一維持時間應保持一分鐘，但如果需要可以處長至48小時或更長。在同步期，培養溫度儘可能降至最低，通常在4至15℃，優選地為4℃，DOT可降至0％。停止補料，關閉通氣，降低過壓。但維持pH控制。維持足夠的攪動以使細胞處於懸浮並有助於冷卻和pH的均勻，優選地在約50rpm。
根據上述步驟的預期收穫是生物量＞80g細胞乾量/L培養物；重組人白蛋白＞1.5g單體/L培養物(用SDS-PAGE確定，與整個培養有關)。
當白蛋白是重組人白蛋白時，為了製備用於純化處理的按本發明獲得的不純的白蛋白溶液，將微生物細胞從發酵培養基中分離。細胞優選在所描述的純化步驟之前分離，但也可在一定條件下和第一步同時進行，如在流化床上進行的第一步純化。在同步期，無通氣條件下將於發酵罐中冷卻至15℃以下的發酵培養物轉移至一罐中稀釋使生物量的濃度達180-210g/kg，如需要可進一步冷卻。稀釋的培養物在無通氣時降溫應保持儘量短的時間同時有足夠的攪拌以防止酵母細胞的沉澱。
細胞和上清進行初步分離，例如微孔濾膜過濾或用諸如Alfa Laval BTUX510連續出樣口型的任何適宜的離心機以5700rpm運行進行離心。這樣獲得的濃縮液(centrate)可一起過濾，例如用Cuno提供的深度過濾器(1μm孔徑)，轉移所有的殘留物和破碎的酵母細胞和其它顆粒。至少75％的存在於稀釋培養物中的重組人白蛋白可僅通過離心操作回收。這步操作中的細胞漿渣可任意地重懸於水或緩衝液中並再次離心以獲得第二次濃縮液(centrate)，以增加產物的回收。所得的溶液按本發明的方法純化白蛋白，如實施例2所示。實施例2根據本發明純化白蛋白
準備或調整發酵物的濃縮液(centrate)(如實施例1所述)，或其它任何來源(如血清)的不純的白蛋白溶液以便用陽離子交換基質進行層析，同時防止白蛋白的多聚化(通過加入正率酸)和蛋白酶活性(通過加熱或選擇不含損害水平的蛋白酶的酵母)。優選地是加入辛酸鈉(色譜溶液13(CS13)-表2)至終濃度1-10mM，例如約5mM以穩定白蛋白。用乙酸(CS09)調pH至4.3-4.8，優選地為4.5±0.1(最優選地為±0.05)，電導率檢測應小於5.5mScm-1。
來源於某些宿主菌株或種的培養物上清含有在後續過程中能降解重組人白蛋白的蛋白酶。這種情況下，這種蛋白酶的活性可通過對含有重組人白蛋白的培養物上清加熱處理以破壞。通常1-10mM辛酸鈉足以防止重組人的蛋白的熱變性，在60-80℃的溫度下30秒至10分鐘足以使蛋白酶失活。隨後，上清可進一步如前所述地調節。如果不存在蛋白酶的降解作用，優選地省略熱處理。層析
所有的操作均可在室溫下(20±50℃)進行。層析柱中白蛋白的上樣量(g白蛋白/L基質)取決於用SDS-PAGE(在SP-FF柱的情況下)或GP-HPLC(對所有其它柱)確定的白蛋白滴度(g/L)。每一步驟的過程可用連機的紫外吸收，如在254或280nm處的測定來監測。
這裡所描述的層析步驟的程序在許多方面是新穎的和創造性的。第一步純化步驟中陽離子基質的使用使大部分從酵母發酵中得到低分子量有色物質直接通過柱子，而那些與基質結合的也是弱的結合且能用諸如1M氯化鈉的高離子強度的鹽洗滌液去除。因此，不象陰離子基質，其不可逆地吸附那類物質，陽離子基質可再生並用於純化中第一步的層析的多次循環。因而，這一步驟形成了耐用的商品化的層析方法的基礎。
在本實施例中應用Cibacron藍型柱作為第二步純化對於特異地用於去除一種由於其物理化學特徵，如大小和等電點而難以從白蛋白中去除的45KDa的白蛋白片段是新穎的。該片段令人吃驚地比全長的白蛋白能更強地與染料結合，因而可將它們分離。
白蛋白純化中所用的層析液詳細列於表2中。因為在白蛋白純化中大量使用，並且相對廉價，這種緩衝鹽溶液因其工業上可提供高純度的形式和與其它通常用於緩衝液的如Tris、HEPES或MOPS相比廉價而最適於本方法。其它的緩衝液可代替表2中所列，如相近pKa值的緩衝液(如蘋果酸對乙酸)，但在大多數情況下，價錢如在大範圍的適用性排除了他們的應用。其它的鹽形式的使用取決於其可溶性，可工業上提供及低價格。然而，在CS06和CS10柱中包含四硼酸鹽離子有特殊的益處因為其在與大分子的碳水化合物部分複合和使其與基質中的陰離子基團緊密結合起特別的作用。這一結果可以增加洗脫液中白蛋白的純度。
層析可使用軸流式柱(axial flow columns)，如由Pharmacia提供的那種，或輻流式柱(radial flow columns)，如由Sepragen提供的那種。在本實施例中，所用的柱子都是軸流式。
緩衝溶液可按下述濃度配製，或者配製濃縮的貯存液，使用時即時混和或稀釋。
表2用於純化實施例2中白蛋白層析溶液對此具體的實施例而言，所有稱量都是±2％。
陽離子交換層析白蛋白是用陽離子交換層析，從至少是酵母蛋白(如果白蛋白是來源於酵母發酵的重組人白蛋白)和其它抗原，低分子量雜質和色素化合物中純化和濃縮。本方法採用的是商品化的陽離子交換基質，如SP-瓊脂糖FF，SP-多孔微球矽膠(Spnerosil)，CM-瓊脂糖FF，CM-纖維素，SE-纖維素或S-葡聚糖凝膠。優選的基質是SP-瓊脂糖FF(Pharmacia)床高5-25cm，優選地為10-15cm，本實施例為12.5cm，柱的上樣量為10至50g白蛋白/L基質，優選地為40±10g白蛋白/L基質。基質以緩衝液平衡以去除鹼性貯存液，緩衝液優選地應具足夠的緩衝能力以降低pH至約pH6.0。如CS01的緩衝液用於去除柱中的CS07貯存液；然而，任何pH小於6.0的緩衝液都可使用。當柱流出液的pH值約6.0時，即可判斷為平衡完成。
調整的濃縮液(centrate)以一定的流率加入層析柱，例如以1.0-8.0cm/min，優選地為4.0-70cm/min，本實施例為6.36cm/min，然後以一種溶液洗滌柱子以去除殘留的雜質。這種洗滌溶液應為pH＜6.0並且電導率低於5mScm-1，優選地低於3mScm-1以防白蛋白被洗脫。合適的溶液是CS01。前面的步驟都以6.36cm/min的流率進行；對於洗脫和所有隨後的步驟流率降至0.5-5.0cm/min，優選地為2.0-4.0cm/min，本實施例為3.18cm/min，以減少洗脫的體積。增加離子強度將有效地洗脫白蛋白；使用電導率範圍在5-10mScm-1的溶液，優選地為6-8mScm-1，本實施例使用CS02。當紫外吸收信號上升至1.0A280/cm以上時開始收集白蛋白，直至紫外吸收信號降至0.6A280/cm或收集的最大體積達6.5倍柱體積時為止。層析柱然後用CS03和04清洗，貯藏於CS07。親和層析。這一步進一步純化白蛋白以去除45KDa白蛋白N-末端片段，酵母抗原(如果白蛋白是來源於酵母發酵的重組人白蛋白)和色素。親和基質可包括任何型的結合白蛋白的Cibacron藍染料，如活性藍2，Procion藍HB，藍瓊脂糖，藍丙烯醯基和其它蒽醌型化合物。該基質優選地是下述的「Delta藍瓊脂糖」基質。這可降低基質產生藍浸出液的程度和增強基質的鹼穩定性以有助於洗滌和去熱原。和商品化的基質相比，進一步改進的基質是在染料(活性藍2)和基質之間引入-間隔基團，1，4-二氨基丁烷。這對於白蛋白純品的洗脫而言，間隔基團的長度是合適的。
活性藍2的化學結構顯示如下。
鄰位，間位或對位異構體或任何其混合物都可使用。優選的異構體是鄰位SO3-型但難以製備理想的純度，故使用間位異構體。氨丁醯-活性藍2的製備達到用分析型高效液相色譜測定至少整個峰區佔98％的純度。還可通過使用粗的商品化的染料，其必須純化氨丁醯衍生的染料，或使用純的合成的染料。在後一種方法中，開始用的染料物質應在分析型高效液相色譜280nm測定純度至少為98％。這種材料由ACL，Isle of Man提供。通過加熱混和物至60℃，使活性藍2與1，4-二氨基丁烷在水中反應，然後以混合物中純化修飾的染料，如通過沉澱。然後氨丁醯-活性藍2與基質偶合，例如與3-氯-1-2-環氧丙烷活化的瓊脂糖CL-6B(Pharmacia，瑞典)偶合。見Porath等(1971)色譜雜誌(J.Chromatog.)60，167-177。這種Delta藍瓊脂糖(DBA)基質的染料的含量優選地是50±5mmol/g乾重。藍基質的使用。本方法使用DBA，床高10-30cm，優選地為20-30cm(本實施例為25cm)，柱的上樣量為7.14g重組人白蛋白/L基質，優選地為8-12g/L(本實施例為10±1g白蛋白/L基質)。所有步驟以0.3-2.0cm/min的流率進行，優選地為1.0-2.0cm/min，本實施例中為1.53cm/min。DBA在來源自CS07的CS01中平衡；當柱中流出液的pH約為9.5時，平衡完成。層析之前，SP-FF的洗脫液用氨調節pH約為8.5-9.5，優選地pH9.0，然後上樣至層析柱。上樣完畢後，層析柱以1-5倍體積的電導率10-30mScm-1，優選地是15-25m5cm-1的緩衝液洗滌以去除雜質，例如用CS12，優選地以5倍體積。白蛋白用電導率大於100mScm-1，優選地為125-165mScm-1的高離子強度的緩衝液洗脫，例如用CS03。當紫外信號(A280/cm)升至高於0.4時開始收集洗脫液，在信號再次低於0.4時停止。層析柱再用CS04洗滌並貯存於CS07。中間體超濾。這一步為進行凝膠滲透層析而濃縮白蛋白。超濾裝置中的纖維素型濾膜(最小分子量截留低於或相當於30,000，例如10,000)用於濃縮DBA洗脫液以保持白蛋白濃度20-120g/L，優選地為80-100g/L。使用後，濾膜以水或表3中的CS03或CS05衝洗去殘留的蛋白質，並以0.1M的氫氧化鈉清洗。濾膜可貯存於20mM的氫氧化鈉中。凝膠滲透層析。這一步純化白蛋白是針對酵母蛋白(如果白蛋白是來源於酵母發醇的重組人白蛋白)，色素和二聚化的白蛋白並進行緩衝液交換的步驟。本方法使用商品化的凝膠滲透基質，如交聯葡聚糖凝膠G100，G150，G250，Sephacryl S-100，S-200或S-300，Toyopearl HW50S或瓊脂糖凝膠6或12。優選地，基質為Sephacryl S-200HR(Pharmacia)凝膠床高度大於60cm，最好在90±cm(3×30cm)。層析柱在CS05中平衡並以0.1-1.5(cm/min，優選地為0.5-1.0cm/min的流率進行層析，在本實施例流率為0.75cm/min；然後當層析柱的pH達到9.5時，將中間體超濾所得的白蛋白上樣至層析柱。上樣體積約相當2-9％細層析柱體積，優選地為5-8％，本實施例為柱體積的7.5％。白蛋白組分分三部分收集棄去最初小量的白蛋白二聚體直至A280/cm上升至指針滿偏(FSD)的10％；這時開始連續收集回收的組分直至達滿偏的90％；然後所收集的白蛋白作為初級產品組分。這一連續收集直至A280降至5％滿偏值之下，之後的流出液再直接棄去。回收初級產品組分分開收集。重複這一步驟直至所有原料上樣至層析柱。S-200HR回收超濾。一種標稱截流分子量等於或小於30,000，或如本實施例所用的10,000的纖維素型濾膜置於超濾裝置中，用以濃縮匯集的回收組分至保留濃度為20-120g/L白蛋白，優選地為80-110g/L。使用後的濾膜按中間體超濾中所述方法處理。
另一種選擇是，在本方法的任何超濾步驟中，標稱截流分子量≤30,000的聚醚碸或PVDF膜可代替纖維素型的濾膜。這種膜由Amicon和Millipore提供。最好選用適宜用NaOH貯存和清洗的濾膜。S-200HR回收超濾保留物的純化。從回收超濾所得的保留物上樣至和初級S-200純化同樣的層析柱，從每個峰收集產物組分，然後與前面收集的大量的初級產物組分混和。重複這一步驟直至所有的原料上樣至層析柱。陰離子交換層析。這一步的目的是純化白蛋白以去除至少酵母抗原(如果白蛋白是來源自酵母發酵的重組人白蛋白)和含色素的白蛋白。本方法使用的陰離子交換基質，如QMA-多孔微球矽膠(Spherosil)，DEAE-Spherodex，Q-Hyper D，DEAE-纖維素，QAE-纖維素或TMAE-DMAE或DEAE分級凝膠(Fractogel)優選地，基質用商品化的陰離子交換基質二乙氨基乙基瓊脂糖凝膠-FF(DEAE Sepharose-FF)(Pharmacia)，床高在5-25cm範圍內根據方便選擇，優選地為10-15cm，如12.5cm，柱的上樣量為每升基質10-60g，優選地為35±15g/L基質。層析柱首先以強的緩衝液平衡將pH迅速降至工作範圍，如pH4.5-6.0，優選地為約pH5.5的乙酸鈉，以CS11為例。使用濃的緩衝液之後，在加S200洗脫液於柱子之前，用一種低電導率，即範圍在1-4mSm-1，優選地為2.5-3.5mScm-1，例如CS08的溶液平衡層析柱。所用的線性流率為1.0-8.0cm/min，優選地為3.0-7.0cm/min，本實施例為4.4cm/min。上樣完畢後，層析柱以5-30mM範圍，優選地是15-25mM的四硼酸鈉溶液洗滌，例如用CS10。這導致洗脫白蛋白組分之前，任何含碳水化合物的雜質更強地粘附在層析柱上。用任何範圍在10-20mScm-1的高離子強度的溶液可有效地洗脫，優選地用CS06。當A280/cm達到0.4時開始連續收集洗脫液直至吸收峰降至0.8以下。
因此，在本實施例中，純化步驟的順序是陽離子交換，親和層析，超濾，凝膠滲透(加上回收組分的超濾)和陰離子交換。
用TSK SW3000XL柱，上樣量為25μl的含10.0mg/ml白蛋白的洗脫液，GP高效液相色譜的分析發現從DE-FF柱所得的洗脫液中白蛋白二聚體的含量低於0.1％(w/w)，白蛋白多聚體或聚合體低於檢測水平。實施例3將純化的白蛋白配製成最終產品
本實施例說明將高度純化的白蛋白經濃縮透濾和加工成適當的產品，在此為25％(w/v)的白蛋白。這一過程經過兩個階段實，稱為終末超濾(UF)和製劑。最後的UF開始時將二乙氨基乙基(DEAE)洗脫液(用磷酸調pH7.0±0.3)轉移至最後的UF加料容器中，在保留物和如果有的任何的洗滌物轉移至配製劑容器的中止。含白蛋白的加工流出液隨後在適於用纖維素的或更優選的標稱分子量截流限於10,000的聚醚碸濾膜的超濾系統中進行初級濃縮，透濾和次級濃縮。最初的濃縮步驟使白蛋白濃度增加至約100gL-1，並立即進行對透濾液為至少5倍，優選地至少為7倍的連續的透濾階段，保留物的體積與注射用水體積相當。
在本發明的某些純化過程，如在實施例7中使用固相化的氨基苯基硼酸鹽，胺離子可能在這一步出現。令人吃驚的是，我們發現這些胺離子與白蛋白結合相當緊密，不能通過對水的透濾完全去除。我們發現用鹽溶液透濾是有效的。所用的氯化鈉與白蛋白的比率為0.5％至10％(w/w)，例如1.0％至5％或大約3％。鹽可加在白蛋白保留液中或更通常是加在透濾的水中。對於最終5％(w/v)的製劑來說，可直接從透濾步驟得到約100g/L的溶液。對於最終25％(w/v)的製劑，可從進一步的濃縮(UF)得到約275-325g/L的溶液。最後，所得的溶液轉移至大的產品配製容器。
製劑步驟使白蛋白處於適宜於大量無菌過濾(0.22μm親水性的聚偏二氟乙烯濾膜)和灌裝的合適的化學環境和濃度。分析轉入的溶液以確定白蛋白，鈉和辛酸的濃度。計算這些量並進一步加入必需的一定量的氯化鈉儲存液和丁酸鈉賦形劑及適當級的水以獲得特定的大量製劑。最終的白蛋白濃度可為235-265gL-1(即約25％)，鈉的濃度130-140mM。可製造其它任何可能的白蛋白濃度，但以最低濃度至少4％(w/v)為例。最優選地在4％至25％(w/v)。在加入適當的、方便的、藥學上可接受的賦形劑，如在美國或歐洲藥典中對人白蛋白所說，和稀釋用水後，製劑完成。
最終濃度為每克白蛋白0.08毫摩爾辛酸鈉是理想的。產品是無菌和無熱原的。用TSK SW 3000XL柱的GP高效液相分析檢測，可能會有約1％(w/w)的二聚體白蛋白但無大的多聚體或聚合體。實施例4陽離子交換後直接陰離子交換
在實施例2方法的變化中，步驟的順序會改變，工藝條件中會有一些變化。因此提供另一層析溶液表，如表3。此外，除了凝膠滲透一步外，所有的層析柱是輻流式的。
表3實施例4中的層析溶液全部稱量允許偏差±0.5％
開始的陽離子交換步驟與實施例2中同樣是必需的，但有如下的變化。柱床的流經高度是11.0±1.0cm。層析按下述進行。
SP-FF(Pharmacia)層析柱用4倍柱體積的10-100mM的乙酸鹽，優選地是20-40mM，例如30mM的CS20平衡，上柱的白蛋白溶液流率為每分鐘0.07至0.75倍的柱床體積，優選地是0.3-0.6倍，本實施例是0.5倍柱床體積每分鐘。柱子用8倍柱體積的10-100mM，優選地是30-70mM，例如50mM的乙酸鹽(CS21)洗滌然後用10倍柱體積CS20洗滌，白蛋白用乙酸鹽/辛酸鹽緩衝液(例如40-120，優選地為60-100，即85mM乙酸鹽和2-50，優選地為2-20，即5mM辛酸，如(CS23)洗脫，並用A254/cm值0.6和0.36為標誌開始和停止收集洗脫液。柱子用0.25-3.0M的鹽和0.05-2％的去汙劑(CS24)再用0.1-1.0M氫氧化鈉(CS25)清洗，並貯存在稀釋的(10-50mM)氫氧化鈉(CS26)中。在本實施例中，平衡、上樣和洗滌步驟中的流率為每分鐘0.5倍柱床體積。白蛋白洗脫的流率為每分鐘0.04-0.6倍柱床體積，優選地0.15-0.35，在本實施例中為0.25倍柱床體積/分鐘。預期的重組人白蛋白單體的回收率在44％和66％之間。
白蛋白用辛酸溶液從陽離子交換柱洗脫，成為一種新的從陽離子交換材料上對重組人白蛋白的生物特異的洗脫。pH值與白蛋白的等片點接近以致辛酸鹽的結合引起明顯的整個的電荷不同，例如，pH值至少4.5，優選地pH約為5.5。
從陽離子交換所得的洗脫液直接上樣(即代替如實施例2中親和凝膠滲透之後，但優選地在稀釋之後)在陰離子交換樹脂，其pH4.5-6.5優選約5.5，電導率最好在1.5至5.0mScm-1範圍，例如2.5±0.5mScm-1。這會導致在陽離子交換層析過程中形成的任何二聚體白蛋白在陰離子交換層析的條件下轉變成白蛋白單體。在這一步可獲得約110％白蛋白單體的收率。
更詳細的是，柱床流經高度11.0±1.0cm的二乙氨基乙基瓊脂糖快流柱(Pharmacia)用陽離子交換洗脫緩衝液(CS23)預平衡，然後在以每升基質30.0±10g單體白蛋白上樣之前用乙酸鹽緩衝液(例如CS20)平衡。
柱子然後用如同實施例2中硼酸溶液(CS27)洗滌，如同實施例2洗脫，與陽離子交換柱一樣用鹽/去汙劑(CS24)，氫氧化鈉(CS25)清洗並貯存在稀釋的氫氧化鈉(CS26)。所有步驟的流率為每分鐘0.07至0.75柱床體積，優選地是0.3-0.6，本實施例為每分鐘0.5柱床體積。
從陰離子交換樹脂(如DE-FF)獲得的洗脫液仍含有不純物質並直接用親和基質(如實施例2中所述的Delta藍瓊脂糖)處理。柱床高度從實施例2中的25cm降至11.0±1.0cm，以使在常規操作壓力下能有較高的流率。因此，11.0cm的床高是最佳的，不會負面影響白蛋白的回收或白蛋白的純度。層析柱以乙酸銨(100-300mM，優選地200-275，例如象CS29中250mM)平衡，上樣的白蛋白量按每升基質7.0-14.0g，優選地8.0-12.0g本實施例為10.0±1.0g。操作平衡、上樣和洗滌步驟時的流率為每分鐘0.05-0.30柱床體積，優選地0.15-0.27，本實施例為每分鐘0.25倍柱床體積。所有其它步驟以0.04-0.30操作，優選地0.1-0.25，本實施例為0.20柱床體積/分鐘。通過降低柱床高度所得的流率的上升因四個有利於大規模生產的因素之一而增加了產量並接近於DBA的最大工作能力。由於這種增加的流率對白蛋白的回收或白蛋白的純度未顯出不利影響，因此採用這種較高的流速是可取的。
層析柱用5倍柱體積的乙酸銨緩衝液(CS29)洗滌，白蛋白以強的鹽和磷酸鹽溶液(1.0-3.0M氯化鈉，如1.5-2.5M或2.0M氯化鈉和5-100mM，即在CS30中50mM磷酸鹽)洗脫。
在本變化的方法中洗脫液的pH值從9.2改變為7.0。緩衝液從50mM的乙酸銨改變為50mM的磷酸鈉，優選地因為其緩衝值為pH7.0，以及相對低廉的價格。低pH值的洗脫液導致增加DBA洗脫液中白蛋白單體的回收。低於7.0的pH增加片段的水平，而高於pH7.0，白蛋白單體的回收率下降。pH值，可在5.5-9.0的範圍，優選地為pH7.0。層析柱以如上所述的氫氧化鈉(CS25，CS26)清洗和貯存。
DBA的洗脫液(可選擇用纖維素型濾膜(標稱截流分子量30,000)超濾後得到80-110g/L的白蛋白)然後進行凝膠滲透樹脂，如S-200(HR)處理。S-200所用的緩衝液改變為40mM磷酸鈉pH7.0。這種緩衝液由於價格原因省略了辛酸鈉，而代替以將溶液在透濾(加至濃度1-20mM，優選地為5mM)加入。磷酸鹽使使用的緩衝液具超高的電導率以增加純度。可採用高鹽濃度增加電導率但優選地還是使溶液具緩衝能力。優選地是pH7.0，這是由於這是製劑的理想pH值。
因此，在本實施例中，純化步驟的順序是陽離子交換(以一種與白蛋白特異結合的分子洗脫)，陰離子交換，親和層析和凝膠滲透。
如果開始時白蛋白是pH7.0會對製劑之前的透濾步驟有幫助。白蛋白在最終的洗脫液中比實施例2的方法更濃縮，有助於製劑(實施例3)前的終末超濾步驟。實施例5陽離子交換劑的高鹽洗滌
在本方法的進一步變化中，除了下述外，其餘按照實施例2或4中的方法。白蛋白上樣至陽離子交換柱(例如SP-瓊脂糖凝膠FF，Pharmacia)後，柱子用CS21(50Mm乙酸鈉，pH3.9-4.1，0.6-0.8mScm-1)洗滌，然後，進一步在最終的CS20洗滌之前用乙酸鈉緩衝液(例如10-50mM乙酸鈉、優選地為約27mM，pH3.5-4.5優選地為pH4.0)中含1-3M，優選地為2M的氯化鈉的高鹽緩衝液洗滌。這種更嚴格的洗滌方法導致洗脫液含有的非白蛋白的蛋白水平較低，這對於如果白蛋白來源於酵母發酵也許特別有用。白蛋白按實施例4所述洗脫。高鹽洗滌前降低pH值有助於在洗滌過程中保留柱中的白蛋白，且最後的洗滌也被白蛋白回收達到最大。可能沒有任何一個步驟對於回收的白蛋白的純度有主要的影響。實施例6濃縮從陰離子交換劑獲得的硼酸鹽洗脫液
本實施例中，實施例2或4的方法(經或不經實施例5的變化)作如下的變更。陽離子交換柱的洗脫液稀釋至電導率低於10mScm-1，優選地低於5mScm-1，然後上樣於陰離子交換基質(例如二乙氨基乙基瓊脂糖凝膠FF，Pharmacia)，陰離子交換基質然後用稀釋的四硼酸鹽緩衝液(如25mM的四硼酸鉀或四硼酸鈉)洗滌，這具有使pH上升至約9.2的作用，白蛋白用濃度更高的四硼酸鹽(如80-150mM四硼酸鉀，優選地為110mM四硼酸鉀)洗脫。在實施例2和4中，白蛋白是用20mM四硼酸鹽，100mM氯化鈉洗脫；用80-150mM四硼酸鹽(如33.6g/L)導致洗脫液含碳水化合物雜質如酵母蛋白的含量較低，這是因為在這種條件下，這些物質與陰離子交換基質的親和力上升。使用四硼酸鉀比四硼酸鈉更優選是因為其在室溫下有較高的溶解度。陰離子交換基質的洗脫液同實施列2或4中一樣處理。例如，在實施例4的方法中，直接上樣至親和基質，如Delta藍瓊脂糖(DBA)，如實施例4所述操作。
然後進行如實施例2或4的凝膠滲透步驟。實施例7固相化的氨基苯基硼酸鹽
從DAB基質所得的洗脫液可在凝膠滲透基質上操作，如Sephacryl S-200(HR)(Pharmacia)，其在一種乙酸銨緩衝液平衡(如10-100mM，優選地約30mM，含有氯化鈉(20-2000mM，優選地為100mM)和辛酸鹽(1-20mM在pH9.0-9.5優選地為9.2時的5M辛酸鹽為優選。)這種緩衝液在下文詳述的最後的層析步驟中有效地將白蛋白交換到合適的溶液中。
S-200步驟操作如下。S-200工作的最低床高是90.0±3cm(如一套3×3cm)。(a)中間體超濾的保留液上樣至柱子。循環並回收產物組分。這一步可重複直至所有原料上樣至柱子。(b)混合的循環組分用上述的超濾濃縮至80-110g重組人白蛋白/升。(c)循環超濾的保留液上樣至同樣的柱子，並收集每個峰的產物組分。重複這一步直至所有原料都上樣至柱子。(d)初級和次級凝膠滲透步驟(a)和(c)的產物組分混合作為S-200的洗脫液。
最後一步包括一去除糖綴合物，如糖蛋白和糖脂，和多聚、寡聚及單體糖。這一步用固相化的氨苯基硼酸(PBA)作為配體。美國專利第4562251號(以參考文獻形式併入本發明描述了製備二硼酸化或單硼酸化的瓊脂糖的適當方法。(1)首先，三嗪以O基與瓊脂糖連接，然後在第二個反應中與3-氨苯基硼酸(APBA)連接。如果三嗪上的X基團被氯取代則形成二取代的樹脂。(2)首先，三嗪與APBA反應產生單或二硼三嗪。其再通過三嗪上的自由氯基團以O基連接到-ONa激活的瓊脂糖以產生單基團或二基團取代的瓊脂糖。本專利中所有的實施例和說明都採用能導致O-連接的ONa激活的瓊脂糖。
較早的專利US 4269605考慮用不同的基質激活方法。包括3-氯-1，2-環氯丙烷活瓊脂糖，在這裡更優選。商品化的基質包括Amicon的PBA 30和Sigma的丙烯珠化的氨基苯基硼酸鹽。
從S-200柱收集的白蛋白經已用S-200工作緩衝液(見上)預平衡的PBA基質層析；在這種情況下，白蛋白並不明顯地與基質結合，而基於碳水化合物的雜質則在通過該柱時被阻滯於柱子從而足以有效地從白蛋白中分離。因此對於白蛋白來說層析處於消極狀態。詳述如下
苯基硼酸鹽基質的流經高度為11.0±1.0cm，用含銨離子(10-50mM)，乙酸鹽(10-50mM)和1.0-10.0mM的辛酸鹽(中CS36-見下表)的緩衝液平衡。柱的上樣量為35±15g重組人白蛋白/升基質。PBA是作為一負效應步驟來進行，因此，收集的產物是上樣期間和隨後以平衡緩衝液洗滌的流出液。所有層析步驟都可以範圍在0.005-0.4柱床體積/min的流率進行。平衡和清洗柱子優選地用較高的流率，如0.19柱床體積/min，而不似上樣和收集白蛋白溶液，其優選地以0.01-0.05；優選地為0.025柱床體積/min。然後，柱子以硼酸緩衝液(如CS37)、鹽(CS38)和苛性鹼(CS25)清洗再貯存在硼酸緩衝液(CS37)。
收集的流出液和洗滌液用磷酸溶液(CS35)調節pH至7.0±0.1。
所用的緩衝液如下
表4實施例7的層析溶液
由於在PBA緩衝液中使用了銨離子，在最後的超濾步驟中使用鹽，如上述實施例3所解釋的那樣是有益。
在一個尤其優選的方法中，各步驟的順序如下
(1)如實施例1中的酵母發酵。
(2)如實施例2中調節濃縮液。
(3)如實施例5中，用高鹽洗滌陽離子交換劑(SP-FF)，再如實施例4所示用白蛋白特異的化合物洗脫白蛋白。
(4)稀釋並以實施例6中所述的用濃縮四硼酸鹽洗脫的陽離子交換。
(5)如實施例4中的親和層析(DBA)。
(6)中間體超濾然後凝膠滲透(S-200)，伴以如實施例7的循環(recycle)超濾。
(7)如實施例7，用固相化硼酸鹽進行層析。
(8)如實施例3中的最終超濾和配製。實施例8固相化苯基硼酸鹽的提前使用
涉及固相化苯基硼酸鹽的步驟可在方法中提前使用，例如一種方法其步驟確定為陽離子交換劑-陰離子交換劑-親和材料-超濾/透濾-固相化苯基硼酸鹽-凝膠滲透。
每步的條件參見實施例4至7，以下除外。DBA洗脫液通過對實施例7中所用的那種乙酸銨的透濾(5倍體積)濃縮至80-110g/L白蛋白，pH調至9.2。濃縮的DBA洗脫液用PBA層析，收集流出液直接用於凝膠滲透(例如S200)柱。由於現在凝膠滲透是最後一步，可在一種適合於製劑步驟的緩衝液如20-130mM(優選地為50-100mM)pH 7.0氯化鈉進行。實施例9根據本發明製備的白蛋白的特徵
本實施例說明根據本發明純化的白蛋白進行純度檢測。除非另有說明，所有進行測試是針對如實施例3所述製劑方法獲得的最終產品白蛋白。重組人白蛋白的糖基化
糖基化蛋白微量分析顯示根據本發明純化的重組人白蛋白不是通過非酶促的糖基化修飾的。微量分析是通過用高碘酸氯化C-1的羥基基團來測定糖基化蛋白的穩定的Amadori產物(AP)形式。高碘酸氧化釋放的甲醛通過在氨中與乙醯丙酮反應而轉變成生色基團，二乙醯基二氫二甲基吡啶(DDL)來定量。DDL在405nm進行比色檢測。
白蛋白批次 Mol己糖/mol蛋白
A 0.092
B 0.116
C 0.090
D 0.132
E 0.060
G 0.04
H 0.01
I 0.07
J 0.07
K 0.05
L 0.740
M 0.70
N 0.96
O0.78
批次為A-K是按實施例2純化的重組人白蛋白。批次為L-O是不同來源的商品化的人血清白蛋白。8批按實施例7純化的重組人白蛋白與人血清白蛋白(0.387±0.012)相比其糖基化水平(0.042±0.018moles/mole)可忽略。低分子量雜質分析原理本分析的目的是使用酸性有機溶劑從重組人白蛋白和人血清白蛋白中去除非共價鍵結合的低分子量雜質(LMC)。可得出一與樣品比較的高效液相色譜的指紋色譜圖。方法-在100μl最終產品(20mg，重組人白蛋白或人血清白蛋白)中依次加入50μl甲酸(98％v/v)，100μl氯仿和50μl乙醇，每次加入後混勻器混勻。樣品在室溫常規混和5分鐘。再加入1ml丙酮(30分鐘，-20℃)使蛋白沉澱。離心使蛋白樣品沉聚，去除上清，用真空旋轉蒸發乾燥。乾燥的樣品重懸於25％乙腈/0.1％三氟乙酸。然後低分子量雜質在用10％-90％線性乙腈梯度的0.1％三氟乙酸(流率＝30μl/min)的ABI PTH C18反相色譜柱(220×2.1mm)中分離。樣品在214nm用Shimadzn紫外檢測儀檢測。結果-對一批商品化的人血清白蛋白和一批根據本發明純化的重組人白蛋白進行比較。在本發明提供的樣品中可見兩個主要的明顯的A214nm峰(Rt分別為31.1和42.8分鐘-見圖2和表9)在2.15分的峰認為是由通過柱的不溶或部分溶解的物質形成，56.5分鐘的大的峰出現在微量的水空白中因而被認為是假象。
表5吸收峰結果另一方面，商品化的人血清白蛋白有更多的峰。
表6吸收峰結果
依據非共價結合的低分子量雜質，本發明的白蛋白的質量明顯高於臨床人血清白蛋白的質量。用數量表示，本發明的白蛋白在10分鐘和55分鐘之間的所有峰的面積約為6.4V.sec，而商品化物質在同樣兩個時間之間的所有峰面積約為39.7V.sec。
對在280nm檢測進行相似的分析，在此情況下按本發明純化的白蛋白的峰面積為0.56V sec，而人血清白蛋白為14.9Vsec。
低分子量雜質的螢光分析(在280nm激活，在350nm檢測)再次表明用本發明純化的白蛋白的全部峰面積低於人血清白蛋白的10％。重組人白蛋白和人血清白蛋白的毛細管區帶電泳。毛細管電泳(CE)是標準十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的一種替代方法，以便定性地比較本發明純的人重組白蛋白和商品化的人血清白蛋白。CE是一種高分辨的電泳技術，它能分離僅能發現少量差別的同樣蛋白的亞群。
方法-人血清白蛋白(Armour)和按本發明純化的重組人白蛋白在20mMPO4/B4O7緩衝液，pH 7.4，20Kev30℃下分離，在ABI 270 CE電泳。本發明的重組人白蛋白在電泳圖上只有單一峰，表明其均一性。相比而言，在商品化的人血清白蛋白樣品中發現有其它的峰，相信這些峰是表明存在諸如含有斷裂的自由巰基或氨基末端降解的白蛋白分子。C-末端分析
重組蛋白質量控制的一個重要方面是預定的一級結構的確定和穩定。材料和方法
胰酶消化人血清白蛋白(商業來源-一個樣品存於-20℃，另一個在30℃12小時)，按本發明純化的重組人白蛋白(存於4℃和30℃6個月)和去除亮氨酸重組人白蛋白(重組人白蛋白去掉C末端亮氨酸的截短型)(每種1mg)用5mM的二硫蘇糖醇(Calbiochem)在37℃下降解120分鐘，然後以存在於溶於0.5M三羥甲基氨基甲烷鹽酸pH 8.0中的6M鹽酸胍中的10mM碘乙醯胺(Sigma)在37℃下烷基化90分鐘。
然後，樣品按1份溶於3份水中並用胰酶37℃消化48小時(TPCK處理的胰酶，購自Sigma，加入3×10μl容量的1mg/ml的溶液過48小時)。肽圖胰酶消化產物用反相(RP)高效液相色譜作圖。高效液相色譜採用使用25cm Pharmacia Super Pac Pep-S色譜柱(5μmC2/C18)的Gilson高效液相色譜系統。所用的洗脫液是A0.1％(v/v)TFA(ABI)水溶液；B0.09％(v/v)TFA溶於70％(v/v)乙腈(Fisons Scientific)，線性梯度超過60分鐘，0.5μl/min。在214nm和280nm處進行紫外檢測。N-末端測序在ABI 477A蛋白測序儀上進行。快原子轟擊-質譜快原子轟擊-質譜用M-Scan Limited，Ascot，UK生產的一種VG Autospec進行。肽合成全長的C末端胰酶降解肽LVAASQAA LGL(分子量(mass)1012)由ABI，Warrington，UK合成；截短的LVAASQALG(分子量899)由Nottinghan大學生物化學系，Nottingham美國，合成。結果
全長的C末端的胰酶酶解的肽(分子量1012)用合成肽作標記顯示在反相高效液相色譜37.5分鐘時洗脫。從人血清白蛋和重組人白蛋白收集這一峰並用N末端測序和快原子轟擊-質譜鑑定。
去除C末端的亮氨酸獲得用合成標記肽確定的顯示在28.5分洗脫的截短的C末端肽(分子量899)。這一洗脫峰從胰酶消化的去亮氨酸的重組人白蛋白分離並用N-末端測序和快原子轟擊-質譜鑑定。在這28.5分鐘的洗脫峰中顯示存在兩種其它的肽，AWAVAR(分子量673)和DLGEENFK(分子量950)。
28.5分鐘的洗脫峰從胰酶消化的，人血清白蛋白(HSA)的反相高效液相色譜中收集。HSA貯存在30℃下12周。去除亮氨酸rHA.rHA(本發明)貯存於4℃下6個月而本發明的rHA貯存於30℃6個月。
每種消化產物的洗脫峰隨後用N末端測序和快原子轟擊-質譜(合成標記肽)來分析。
表7用N-末端測序確定的28.5分鐘峰中存在的肽
用快原子轟擊，存在於28.5分洗脫峰的主信號((M+H)+分子離子)如表8所示。
表8在28.5分的吸收峰的離子(M+H)+
在1028和1104的信號可能是碎片的離子；它們不是可通過測序分析檢測的肽。結論
去除亮氨酸的C末端胰酶消化肽在商品化人血清白蛋白檢測到約5-10％(不定量)，但在本發明的重線人白蛋白中，即使30℃保存6個月也不能檢測到。去除亮氨酸的肽不能在30℃貯存12周的人血清白蛋白中檢測到，全長C末端肽在37.5分鐘的洗脫峰(儘管未分離)與其它樣品相比非常弱，顯示可能正處於進一步的C末端降解。
這些結果顯示，按本發明純化的重組人白蛋白有穩定和全長的羧基末端，而以前商業來源提供的人血清白蛋白相比則顯示出異質性。純化的人白蛋白中自由巰基的比色分析導言-Ellmani’s試劑5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)是一種檢測自由巰基如Cys-SH的特異的和靈敏的方法。反應可用在412mm處的光吸收跟蹤監測，其數值可用於計算自由Cys-SH，其可達到每分子重組人白蛋白少於1個殘基水平的。檢測中所用的溶液試劑如下5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)DTNB，Sigma產品，編號D8130TRIS預配的pH晶體pH 8.0，Sigma產品，編號T4753EDTA，二鈉，Sigma產品，編號ED2SS二水磷酸二氫鈉，分析級二水磷酸氫二鈉，分析級緩衝液10.1M(12.1g)Tris-HCl；0.01M(3.72g)EDTA Na2.2H2O，pH8.0、預配的pH晶體。溶於500ml水並定容至正好一升體積。室溫下穩定1個月。緩衝液205M磷酸鈉pH 7.0，二水磷酸氫三鈉(5.45g)3.04g二水磷酸二氫鈉。溶於500ml水，並定容至正好一升體積。室溫穩定一個月。試劑0.01M(39.4mg)DNTP在磷酸緩衝液中。在10ml緩衝液2中溶解。每
日新鮮配製。樣品白蛋白用緩衝液1稀釋至約10.3μM(0.66g/ml)。步驟
1)將分光光度室的溫度設為25℃。2)分別在樣品和對照位置上放入加入1.25ml樣品的比色杯和另一加入1.25ml緩衝液1的10mM的體積減小的比色杯。3)在412nm調零。設置吸收度至0.1AU滿值。4)在對照比色杯中加入50μl DTNB試劑，並用乾淨的塑料攪棒輕微混和。5)在樣品杯中加入50μlDTNB試劑，如上混和。6)立即開始讀取數據(或打開繪圖記錄儀，隨後反應持續10分鐘以上)。7)重複每一樣品，以得到三個重複的值。8)從穩定的吸收衰減外推至零時，並在412nm讀出吸收值(δA412)(圖1)9)用分子消光係數
計算巰基的含量。結果
大量的商品化的人血清蛋白樣品用於檢測自由巰基含量，結果歸納如下
人血清白蛋白自由巰基(mole SH/mol HSA)
1 0.29
2 0.22
3 0.35
4 0.05
5 0.08
6 0.46
7 0.36
這些值比按前述實施例製備的，常規檢測為0.85-0.9mol SH/mol rHA的白蛋白的值明顯較低。用石墨熔爐分光鏡(graphite furnace spectroscopy)檢測人白蛋白中的金屬離子雜質。
標準品和樣品用高溫包被的石墨管中的原子霧化。用下列條件檢測樣品的原子吸收。
鋁的測定採用Perkin Elmer M2100原子吸收分光光度計，Perkin ElmerHGA-700石墨爐，有樣品杯和鋁管陽性燈Perkin Elmer AS-70自動進樣器。試劑為分析純級的硝酸鎂，一種鋁標準溶液(1000 ppm)和分析純級濃硝酸。1.00％w/v硝酸溶液用milli-Q水配製。在自動進樣器中注入15μl鋁標準溶液並以0.20％硝酸溶液稀釋至1500μl。用15μl得到的溶液，然後再用得到的150μl溶液重複該步驟，以得到10ppb(μg/l)鋁溶液。
白蛋白樣品以0.20％硝酸溶液稀釋使得到一在標準曲線範圍內的鋁濃度。通常1∶2稀釋是足夠的。
鎂的測定類似使用Perkin Elmer AS-51閃爍自動加樣器和鎂空心陽極燈。1000ppm的鎂標準溶液用Milli-Q水稀釋得到0.1，0.2，0.5和1.0ppm的標準溶液。在28.5nm處檢測樣品的原子光吸收。
銅、鐵、錳和鋅用同鋁一樣的方法測定，除了鋅用1.0ppb(μg/L)的標準溶液代替10ppb的溶液。金屬離子的濃度以ng/L確定，並與白蛋白的濃度相關(ng金屬離子/g白蛋白)。這些資料列於表9。
表9按本發明製備的白蛋白的雜質分布
濃度(ng/g白蛋白)所有結果以總金屬離子濃度表示。表10顯示商品化人血清白蛋白中相應的金屬離子水平。
表10以ng金屬/克白蛋白計的濃度
可見本發明的產品中鋁的平均水平約為60ng/g而商品化的含155-3190ng/g。同樣，本發明的產品含有平均約948ng/g的鐵(比較現有技術的材料1850-41,200ng/g)，平均2,990ng/g的銅(比較現有技術的材料580-23,840ng/g)，平均1120ng/g的鎂(比較現有技術的材料500-54,000ng/g)，平均2390ng/g的鋅(比較現有技術的材料930-7230ng/g)和平均48ng/g的錳(比較現有技術的材料65至940ng/g)。培養基和長鏈脂肪酸的分析。
根據本發明所得的白蛋白和商品化的人血清白蛋白的脂肪酸的特徵通過用酸性溶劑提取和以C170為內對照標準的游離脂肪酸的氣相色譜分析。裝置帶火焰離子檢測器的氣相色譜(如Shimadzu GC9A)；自動進樣器(如Shimadzu AOC 14)；綜合儀/印表機(如Shimadzu(R4A)；HP-FFA 30×0.53mm，1.0μM相層析柱(Hewlett Packard Ltd)；帶有直接注射套筒的Megabore安裝工具盒(用於GcaA的J&W Scientigic 220-1150.)。試劑水(Milli-Q)；二氯甲烷超純溶液(Romil Chemicals.Lougbborongh，Leics)；分析純的三水乙酸鈉(BDH Ltd.Poole)；分析純冰乙酸(BDH Ltd.Poole)；人血清白蛋白溶液(ZenalbTM20，Bio ProduceTs Laboratory，Elstree，Herts)；無水硫酸鈉(分析級)；Sigma的標準脂肪酸。溶液0.5M乙酸鈉緩衝液pH4.5每100ml中乙酸鈉6.13g，乙酸3.30g。游離脂肪酸標準混和物。在不同的玻璃試管中，分別稱取各種脂肪酸5mg。溶解每種脂肪酸於1ml二氯甲烷中，並分別按短鏈脂肪酸(C6-C14)，中等長度鏈脂肪酸(C16-C18)和長鏈脂肪酸(C20-C22∶1)轉移至3個12ml的Pyrex培養管中。在氮氣流中乾燥混和物並用1ml二氯甲烷溶解。將50μl量的混和物轉入標記的玻璃管，氮氣中乾燥，封口並貯存在-20℃。內對照標準溶液1mg/ml十七酸(25.0mg十七酸/25ml二氯甲烷)。步驟
1.加50μl內對照標準溶液於標為6的40ml的Pyrex管。
2.5％的重組人白蛋白加5ml樣品。25％重組人白蛋白用1ml樣品和4ml水。包括一個空白(5ml水)和血清白蛋白樣(1.25ml Zenalb TM20和3.75ml水)。所有的樣準備兩份。
3.所有管中加入2.5ml乙酸鈉緩衝液，然後10ml二氯甲烷。
4.蓋好蓋的管置於機械轉床上室溫2小時。
5.20℃，Sorvall RT 6000B離心機中以3000rpm將所有管離心5分鐘。
6.棄去上層水相，從管底小心轉移下層二氯甲烷相至標記的12ml Pyrex管。蛋白粒可能會妨礙二氯甲烷相的轉移。若出現這種情況加入一滿匙的無水硫酸鈉，蓋上蓋並震蕩。
7.在氮氣流中乾燥二氯甲烷相，並存在-20℃的氮氣中直到分析。
8.安裝毛細管柱，按操作指南設置氣相色譜的下列條件
檢測器火焰離子分光光度計；負載氣體30ml min-1的氮氣；注射體積0.5μl；柱起始溫度70℃；維持時間1.5分鐘；梯度120℃min-1至150℃；梯度24℃min-1至240℃；維持7分鐘；檢測器溫度280℃；Shimadzu GC9A的特殊設置為檢測器範圍10℃；水壓0.5kg/cm2；氣壓0.5kg/cm2；中止時間50分鐘。
9.打開綜合儀(integrator)按操作指南從氣相色譜中記錄數據。
10.使烤箱升溫至245℃，直至獲得穩定的基線。
11.降低烤箱溫度至70℃並讓其平衡。
12.熔化一定量的長鏈、中等長鏈和短鏈脂肪酸標準品。將長鏈脂肪酸溶於1ml二氯甲烷中。將溶液轉入中等長鏈脂肪酸使之溶解。重複操作處理短鏈脂肪酸。
13.注入標準品混和物以確定脂肪酸存留時間。得到的色譜圖應幾乎沒有峰拖尾現象，而存在平滑地緩慢上升的基線伴以適當數量明顯的峰。己酸(C60)應在滯留約6分鐘後洗脫，而順芥子酸(C221)的滯留時間約33分鐘。通過比較標準品樣的色譜圖可確定所有的峰。
14.注入樣品並記錄數據。計算1.從空白樣品確定內對照標準的峰。這將是滯留時間約23.5分鐘的主要的峰。2.用下列公式計算所有樣品的所有整合峰的峰面積比率。
3.通過與標準品比較確定基於滯留時間的重組人白蛋白和人血清白蛋白樣品中的脂肪酸吸收峰。4.使用下列因子將重組人白蛋白和人血清白蛋白樣品所有峰面積率轉換成大致的濃度(μg/g白蛋白)。
濃度(μg/g)＝峰面積率×2005.用脂肪酸分子量和下列公式將確定為脂肪酸的峰從μg/g白蛋白的濃度轉換成mole/mole白蛋白。
實施例的結果顯示一批按實施例2製備的白蛋白(圖4)和商品化的人血清白蛋白(圖5)。儘管兩批蛋白的特徵顯示明顯的區別，但無異常的脂肪酸在前者中被檢測到。正如預料的，二者都顯示大量加入的穩定劑，辛酸鹽(C80)。除此之外，商品化的人血清白蛋白明顯特異含有C160，C161，C180，C181和C182而本發明的白蛋白主要含有C100，C120，C161並偶爾有C140。進一步的實驗顯示，重組人白蛋白最後產品中的C100和C120的水平與用於純化過程後期的辛酸鹽中的這些雜質的水平是一致的。
按實施例7生產的重組人白蛋白的數據如下
表11按本發明方法純化的重組人白蛋白和商品化人
血清白蛋白脂肪酸組成的比較
ND＝未檢測優選地，總的C18脂肪酸的水平不超過辛酸基水平的1.0％(mole/mole)，優選為不超過0.5％。而且，在本發明的白蛋白中，C182，C183和C20脂肪酸的水平通常檢測不到。在商品化的人血清白蛋白中，通常每摩爾白蛋白中有0.4摩爾C10和C20脂肪酸。在本發明的產品中，通常沒有可檢測到的C20脂肪酸且每摩爾白蛋白中只有約0.01和0.02摩爾的C18脂肪酸。顯色分析-5％(w/v)的最終產品的溶液在1cm的比色杯中，測定在350nm，403nm和500nm的光吸收並按每克白蛋白吸收值/升每釐米光程(即AL.·g-1·cm-1)計算。本發明的白蛋白的值如下
波長平均吸收值(n＝10批)
(nm)(L·g-1·cm-1)
3504.74×10-3
4032.12×10-3
5000.58×10-3
總的說來，本發明的白蛋白在所說的三個波長下各自的吸收值不會超過6.0×10-3，2.5×10-3和0.75×10-3。
分析大量的商品化的人血清白蛋白製劑顯示在這些波長下有較高的吸收值(見表12)。
表12現有技術人血清白蛋白製劑的吸收值
SDS還原的聚丙烯醯胺凝膠電泳進行這種分析是顯示重組人白蛋白是由當用一種還原劑(β-巰基乙醇)處理時在SDS還原的聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)上以一條帶(單體)遷移的單一多肽鏈組成。
白蛋白樣品在SDS還原緩衝液(含有2mM乙二銨四乙酸，5％(w/v)SDS和10(v/v)β巰基乙醇的20mMTris-HCl，pH 8.0)中達1mg/ml，煮沸，然後上樣1μl的溶液用SDS均勻的(12.5％)快速膠(Phastgels)(Pharmacia)分離。蛋白帶用考馬斯亮藍R250染色，在Shimadzu CS9000光密度儀中掃描檢測。白蛋白的分離顯示一單一的考馬斯染色帶表明以單體存在的白蛋白組分至少99.9％凝膠滲透高壓液相色譜
本發明方法中主要的實施方案(即陰離子交換步驟是超濾和製劑之前的最後步驟)中，將從陰離交換基質洗脫的濃度為10mg/ml的白蛋白溶液25μl注入ShimadzuLC6A高效液相色譜的TSK3000SWXL柱中。發現產品為至少99.9％的單體。
已配製成25％w/v的根據本發明純化的第二個10mg/ml的白蛋白25μl以同樣的方式分析，發現含有的多聚白蛋白低於0.1％。這一結果表明這裡所述的製劑對純化的白蛋白的多聚體/聚合體含量無影響。雙向凝膠電泳
將2μg用本發明的方法製備的重組人白蛋白用Millipore研究系統進行雙向凝膠電泳。第一向分離是PH3-10的等電聚焦凝膠，然後，用10％聚丙烯醯胺/SDS進行第二向電泳。在考馬斯亮染色的凝膠中，只可見一個點，表明只存在一種蛋白。電子發射質譜
電子發射質譜是用VG Quatto電子發射質譜儀完成的，用馬心肌球蛋白(16951 Da，購自Sigma)校準m/2範圍超過950-1750Da/e。商品化的人血清白蛋白樣品和按本發明純化的重組人白蛋白樣品在分析之前通過採用含梯度三氟乙酸的乙腈的反相高效液相色譜脫鹽。圖6a和b分別顯示本發明的白蛋白和現有技術的人血清白蛋白的質譜圖。後者顯示存在斷裂的自由巰基和N末端降解。
本發明的白蛋白在本測試中可見是完全均一的，換句話說，它只顯示單一明顯的峰，出現在質量約為66441 Da處。長期穩定性
用電泳方法檢測發現在兩年內沒有白蛋白的降解，顯示不存在蛋白酶的活性。
權利要求
1.一種純化白蛋白的方法，該方法包括將相對不純的白蛋白溶液施加到該白蛋白無特異性親和力的因而能結合的層析材料上，以及採用一種對白蛋白有特異性親和力的化合物的溶液從該層析材料上洗脫結合的白蛋白的步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，其中的層析材料是一種陽離子交換樹脂。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中的化合物是一種如辛酸鹽的脂肪酸鹽。
4.一種純化白蛋白的方法，該方法包含將白蛋白溶液用白蛋白可以結合的一種陽離子交換材料進行陽離子交換層析，然後白蛋白可以結合的一種陰離交換材料進行陰離子交換層析的步驟。
5.一種根據權利要求4所述的方法，其中從陽離子交換材料洗脫的白蛋白在進行所說的陰離子交換層析之前依次用親和層析、超濾和凝膠滲透中的一種或幾種方法處理。
6.一種根據權利要求4所述的方法，其中從陽離子交換材料洗脫的白蛋白適用於所說的陰離子交換材料不需任何除稀釋外的中間步驟處理。
7.一種純化白蛋白的方法，包括步驟
(a)在白蛋白將與陽離子交換材料結合的條件下，將白蛋白通過陽離子交換基質。
(b)從所說的基質中洗脫含白蛋白的陽離子交換洗脫液。
(c)將所說的洗脫液通過包含有白蛋白結合化合物的親和基質。
(d)從所說的基質中洗脫含白蛋白的親和基質洗脫液。
(e)將所說的洗脫液通過一種凝膠滲透基質以獲得富集白蛋白的組分，這一步可任意地在超濾之後進行。
(f)將所說的白蛋白富集的組分在白蛋白將結合陰離子交換基質的條件下通過該基質；並
(g)從所說的陰離子交換基質中洗脫純化的含白蛋白的產品。
8.一種純化白蛋白的方法，包含步驟
(a)在白蛋白將結合陽離子交換基質的條件下，將白蛋白溶液通過該基質；
(b)從該基質洗脫包含白蛋白的陽離子交換洗脫液；
(c)在白蛋白將與陰離子交換基質結合的條件下，將陽離子交換洗脫液通過該基質；
(d)從陰離子交換基質中洗脫含有白蛋白的陰離子交換洗脫液；
(e)將陰離子交換洗脫液通過一種包含一種白蛋白結合化合物的親和基質；
(f)從該親和基質中洗脫含白蛋白的親和基質洗脫液；
(g)將親和基質洗脫液通過凝膠滲透基質以得到一種富含白蛋白的組分。
9.一種根據權利要求6或8所述的方法，其中在陽離子交換步驟白蛋白的洗脫使用一種含有對白蛋白有特異親和力的化合物的緩衝液。
10.一種根據權利要求9所述的方法，其中的化合物是一種辛酸鹽。
11.一種根據權利要求9或10所述的方法，其中在陽離子交換步驟中白蛋白在洗脫之前用高鹽溶液洗滌。
12.一種根據任一前述權利要求所述的方法，其中白蛋白是用一種含50-200mM硼酸鹽的緩衝液從陰離子交換劑中洗脫。
13.一種根據任一前述權利要求所述的方法，其中經或不經中間處理步驟獲得的白蛋白在含有一種將選擇性結合糖綴合物和多糖的固相化的化合物的樹脂上進行層析。
14.一種根據權利要求13所述的方法，其中的化合物是氨基苯基硼酸(PBA)。
15.一種根據任一前述的針對特異親和層析的權利要求的方法，其中親和層析使用一種包含固相化的、白蛋白特異的染料的樹脂。
16.根據權利要求15所述的方法，其中的染料是一種Cibacron藍型染料。
17.一種根據權利要求16所述的方法，其中的染料是通過一間隔基團固相化在樹脂上。
18.一種根據權利要求17所述的方法，其中的間隔基團是α，ω-二氨基-(C1-6-直鏈烷基)基團。
19.一種根據任一前述權利要求所述的方法，其中在陽離子交換步驟之前，白蛋白溶液通過加入辛酸鹽至終濃度為約1至10mM並調節pH至約4.0-5.0而調整。
20.一種根據前述任一權利要求所述的方法，其中得到的最終的含白蛋白的溶液再通過超濾膜超濾以得到白蛋白濃度至少約每升80克白蛋白的超濾保留液並用至少相當於該保留液5倍體積的水透濾該超濾保留液。
21.一種根據任一前述權利要求所述的方法，其中最初的白蛋白溶液是通過在發酵培養基中培養用編碼白蛋白核苷酸順序轉化的酵母得到的酵母培養基，而其中的酵母表達並分泌白蛋白。
22.一種根據權利要求21所述的方法，其中所說發酵培養基是不含金屬螯合劑。
23.一種根據權利要求21或22所述的方法，其中在培養基施加於陽離子交換材料之前，酵母從發酵培養基中分離。
24.一種純化白蛋白的方法，該方法包括將相對不純的白蛋白接觸含有硼酸或其鹽的層析材料和從白蛋白溶液中分離該材料以獲得純化的白蛋白的步驟。
25.一種根據權利要求24所述的方法，其中的白蛋白溶液含有糖綴合物和/或多糖。
26.一種根據權利要求25所述的方法，其中糖綴合物和/或多糖包括酵母糖蛋白。
27.一種根據權利要求24至26中任一條所述方法，其中的硼酸是氨基苯基硼酸或其鹽。
28.一種根據權利要求27所述的方法，其中的氨基苯基硼酸固相化在一種瓊脂糖凝膠上。
29.一種根據權利要求24至28中任一條所述的方法，其中的白蛋白溶液用乙酸根離子、氯離子、辛酸根離子和銨離子中的一種或多種緩衝。
30.一種根據權利要求29所述的方法，其中的溶液含10-100mM乙酸根離子，10-100mM銨離子，20-200mM氯離子和1-20mM辛酸根離子並且pH值9.0-9.5。
31.一種根據任一前述權利要求所述的方法，其中純化的白蛋白進一步純化和/或製劑以便可用於人靜脈給藥。
32.一種純化白蛋白溶液的方法，包括將該溶液與一種相反離子溶液接觸以從白蛋白中將銨離子置換出並能從溶液中去除的步驟。
33.一種根據權利要求32所述的方法，其將相反離子溶液加入到白蛋白溶液並通過透析去除銨離子。
34.一種根據權利要求32所述的方法，其中相反離子溶液通過半透膜從白蛋白溶液中分離，並通過透濾去除銨離子。
35.一種根據權利要求32所述的方法，其中銨離子通過凝膠滲透層析從溶液中去除。
36.一種根據權利要求32至35中任一條所述的方法，其中的相反離子溶液是含有鈉離子的溶液。
37.一種純化白蛋白溶液的方法，該方法包含在一種含有銨離子的緩衝液中將該溶液與層析材料接觸，通過根據權利要求32與36中任一條所述的方法隨後去除銨離子以獲得純化的白蛋白產品，這也可任選在進一步純化或製劑步驟之後。
38.一種根據權利要求37所述的方法，其中層析材料包含固相化的硼酸根離子。
39.一種純化含有由特定分泌白蛋白的微生物產生的約45KD的白蛋白片段(1-403至1-409)的白蛋白溶液的方法，該方法包含將白蛋白溶液與對白蛋白有特異親和性的固相化染料接觸，並在洗脫白蛋白時將45KD的片段留在染料上的步驟。
40.一種根據權利要求39所述的方法，其中的染料如權利要求13-15任一條所定義。
全文摘要
提供一種製備含極低水平或基本去除色素金屬離子,人源蛋白,宿主蛋白,白蛋白片斷,白蛋白多聚體或聚合體和病毒,而且基本無糖基化,較高程度的巰基並帶有一完整的羧基末端的白蛋白的技術。該技術包括將白蛋白(優選地是轉化酵母表達和分泌的)通過正型陽離子交換層析然後再通過正型陰離子交換層析。也可能採用其它的步驟,如超濾,凝膠滲透層析,結合白蛋白的親和層析(如使用藍染料)和結合雜質的親和層析(如使用一種氨基苯基硼酸樹脂)。還公開了採用一種與白蛋白有親和力的化合物,從一種與白蛋白有非特異親和力的物質上洗脫白蛋白,如同用相反的離子去除銨離子的方法。
文檔編號A61P17/02GK1191545SQ9619582
公開日1998年8月26日 申請日期1996年2月29日 優先權日1995年5月25日
發明者安德魯·R·古迪, 達雷爾·斯利普, 亨德裡克·范厄克, 史蒂芬·貝雷曾科, 約翰·R·伍德羅, 理察·A·詹森, 帕特裡夏·C·伍德, 史蒂芬·J·伯頓, 艾倫·V·夸克 申請人:達爾塔生物工藝有限公司