包含組蛋白去乙醯化酶抑制劑的疫苗接種方法

2023-05-21 13:01:16 6

包含組蛋白去乙醯化酶抑制劑的疫苗接種方法
【專利摘要】提供了一種疫苗接種方法。該方法包括給予哺乳動物組蛋白去乙醯化酶抑制劑以及能表達抗原的疫苗，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。
【專利說明】包含組蛋白去乙醯化酶抑制劑的疫苗接種方法
發明領域
[0001]本發明一般涉及疫苗接種方法，且具體來說，涉及這樣的疫苗接種方法，其中將病毒疫苗與組蛋白去乙醯化酶抑制劑共同給予。
[0002]發明背景
[0003]組蛋白去乙醯化酶抑制劑(HDACi)為表觀遺傳的改性劑類藥物，其由於能損害控制基因轉錄所必需的組蛋白修飾而對基因表達具有廣泛的影響。HDACi可以修飾腫瘤細胞內的幹擾素信號轉導，因此可被用作病毒激發劑來增加溶瘤作用。通過加強癌細胞的幹擾素響應的固有缺陷，這些藥物能增加溶瘤病毒的效力，而不會致使正常細胞易感。因此HDACi可以改變先天免疫力來促進病毒溶瘤作用，但還沒有研究過它們在該治療設置中對獲得性免疫應答的影響。[0004]病毒溶瘤作用和癌症免疫療法作為獨立的治療措施展現出臨床療效。越來越多的文獻表明，成功的溶瘤病毒療法依賴於其固有的誘導抗腫瘤免疫力的能力，這導致一些人竟將其界定為一種免疫療法形式。幾種有前景的臨床候選者為經過工程改造以表達免疫刺激性轉基因的病毒。然而，關於刺激免疫系統是否對溶瘤病毒療法具有淨利益仍存在爭議。確實，如果不經意間增強了針對溶瘤載體的免疫應答，這可能會危害病毒複製和損害腫瘤特異性反應的誘導，尤其是當通過諸如抗原競爭(其中外來的病毒抗原將具有顯著的優勢，並且由於較少的溶瘤作用而減少抗原釋放)的機制而以自身抗原為靶標時。因此，將直接的溶瘤作用與免疫療法結合的最佳策略應當旨在增強抗腫瘤免疫和溶瘤病毒複製。
[0005]目前表明溶瘤病毒為抗腫瘤免疫應答的特別有效的加強劑。該治療方法結合了常規的病毒疫苗和溶瘤的病毒疫苗，這兩者都表達相同的腫瘤抗原。採用溶瘤疫苗加強可導致由病毒引起的腫瘤減滅和已激發的動物體內腫瘤特異性CTL (細胞毒性T淋巴細胞)數目的大幅增加。自相矛盾的是，相比沒有腫瘤的動物，該方法實際上可在荷瘤的動物體內產生更大的抗腫瘤免疫應答，因為複製型溶瘤載體在腫瘤內擴增，導致抗原特異性TIL數目非常大幅地增加和一些情形下建立的顱內黑色素瘤的消除。
[0006]包括丙戊酸(VPA)、辛二醯苯胺異羥肟酸(SAHA)和MS-275在內的數種HDACi，當前正作為不同的實體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤的抗癌藥物而進行臨床研究。已在急性骨髓性白血病、T細胞淋巴瘤和腎細胞癌中取得了初步滿意的結果。有趣的是，除了它們的直接抗腫瘤活性，這些HDACi還具有免疫調節特性。例如，已經表明VPA、SAHA和MS-275都能增強癌細胞的免疫原性和免疫識別。
[0007]發明概述
[0008]已經發現HDACi與加強性疫苗的共給予展現出增強效應。
[0009]因此，在本發明的一個方面，提供了疫苗接種方法，其包括給予哺乳動物組蛋白去乙醯化酶抑制劑和能遞送抗原的疫苗的步驟，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。
[0010]在本發明的另一方面，提供了包含疫苗和組蛋白去乙醯化酶抑制劑的組合物。
[0011]參考以下附圖，本發明的這些方面和其他方面在以下的詳細描述中將變得顯而易見。【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1闡述了在接種後I天或5天開始，用PBS、Ad-BHG(陰性對照，IxlO8PFU IM)、Ad-hDCT (TAA 轉基因，IxlO8PFU IM)、Ad-hDCT+VSV_hDCT 或 Ad-hDCT+VSV-hDCT+MS-275 處理的癌症模型的存活曲線(分別為A和B)；
[0013]圖2用圖表闡述了溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予維持腫瘤抗原特異性應答㈧；維持腫瘤抗原特異性抗體應答⑶；維持活化的NK細胞的數目(C);增加IFNy和TNFa的共表達(D);增加在溶瘤疫苗加強後由腫瘤抗原特異性T細胞表達的IFNy的量(E)和TNF a的量(F);以及增加T細胞親和力(G)；
[0014]圖3用圖表闡述了溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予產生了嚴重的淋巴球減少症，這可由外周血中總淋巴細胞計數的減少得到證實，其中總淋巴細胞計數的減少是由於初始CD8+細胞⑶、初始NK細胞(C)、初始T細胞⑶和B細胞(E)的減少；
[0015]圖4用圖表闡述了溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予在維持抗腫瘤應答的同時減少了抗病毒應答； [0016]圖5用圖表闡述了溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予減少了 Treg頻數㈧、增加了腫瘤抗原特異性T細胞與Treg的比值(B)以及減少了 Foxp3表達水平(C)；
[0017]圖6用圖表闡述了由溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予誘導的淋巴球減少症不為品系特異性的，因為Balb/c小鼠內與C57/B6小鼠內發生了類似的總淋巴細胞(A)、初始CD8+T細胞(B)、總NK細胞(C)、CD4+T細胞(D)和B細胞(E)的減少；
[0018]圖7用圖表闡述了 VSV誘導的短暫的淋巴球減少症可被MS-275共給予顯著延長，這可以由總淋巴細胞計數(A)、初始CD4+細胞(B)、CD8+T細胞(C)和B細胞⑶證明。水平虛線表示未處理小鼠的平均計數；
[0019]圖8用圖表闡述了相比單獨給予聚1:C和VSV/MS-275，由聚1:C與MS-275的共給予誘導了淋巴球減少症，這可由總淋巴細胞計數證明；以及
[0020]圖9闡述了 MS-275 (A)和無活性的MS-275類似物⑶的結構。
[0021]發明的詳細描述
[0022]提供了疫苗接種方法，包括給予哺乳動物組蛋白去乙醯化酶抑制劑和適合表達抗原的疫苗，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。
[0023]本文中使用術語「疫苗」是指可誘導針對靶抗原的免疫原性應答的生物製劑。疫苗的實例包括:病毒疫苗、細菌疫苗、蛋白疫苗和核酸疫苗。術語「病毒疫苗」指可誘導針對靶抗原的免疫原性應答的病毒。
[0024]術語「哺乳動物」指人和非人的哺乳動物。
[0025]本發明方法包括給予哺乳動物能遞送或表達抗原的疫苗，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。如本文中所使用，術語「預存免疫力」意欲包括由接種抗原誘導的免疫力，以及由先前暴露於給定抗原造成的哺乳動物內天然存在的免疫力。
[0026]為了建立預存免疫力，本發明方法可以包括用適合誘導針對靶細胞的免疫應答的抗原為哺乳動物接種疫苗的步驟，例如，激發步驟。合適的抗原包括，腫瘤抗原、病毒抗原，且尤其是來源於病毒性病原生物體(如HIV、H印C、FIV、LCMV、伊波拉病毒)的抗原，以及諸如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的細菌性病原體。[0027]在一個實施方案中，抗原為諸如腫瘤相關抗原(TAA)的腫瘤抗原，例如，腫瘤細胞內產生的可引起哺乳動物的免疫應答的物質。這類抗原的實例包括:諸如甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的癌胚抗原；諸如CA-125和間皮素的表面糖蛋白；諸如Her2的致癌基因；諸如多巴色素異構酶(DCT)、GP100和MARTl的黑色素瘤相關抗原；諸如MAGE蛋白和NY-ESOl的癌-睪丸抗原；諸如HPV E6和E7的病毒致癌基因；組織中異位表達的蛋白質，其通常限制於諸如PLACl的胚胎組織或胚外組織。如本領域技術人員所理解的，可以基於待治療的癌症類型，使用本發明方法選擇抗原，因為某一種或多種抗原可能特別適合用於某些癌症的治療中。例如，對於黑色素瘤的治療，可以使用諸如DCT的黑色素瘤相關抗原。本文中使用的術語「癌症」包括任何癌症，包括但不限於，黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤、諸如腦癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和結腸癌的癌以及白血病。 [0028]可以給予抗原本身，或優選地，通過載體(例如彈狀病毒載體、腺病毒(Ad)載體、痘病毒載體或逆轉錄病毒載體)、質粒或負載的抗原呈遞細胞諸如樹突細胞給予。將抗原引入載體中的方法為本領域技術人員所了解。通常，將對載體進行修飾以表達抗原。就這一點而言，可使用已確立的重組技術將編碼所選抗原的核酸併入所選的載體中。
[0029]可用多種方法中的任何一種給予哺乳動物抗原，包括，但不限於:經靜脈給予、肌內給予或鼻內給予。如本領域技術人員所理解的，可通過在合適的載體(諸如鹽水或其它合適的緩衝液)內給予抗原或併入抗原的載體。在用所選的抗原接種疫苗之後，哺乳動物會在免疫應答間隔期內產生免疫應答，例如至少約24小時，優選至少約2-4天或更長，例如至少約I周，且可能延續數月、數年或可能一生。
[0030]為了建立針對抗原的免疫應答，可使用已確立的技術進行使用抗原的接種疫苗。因此，可以以足以產生免疫應答的量給予哺乳動物所選的抗原或表達該抗原的載體。如本領域技術人員所理解的，產生免疫應答所需的量將隨多種因素而不同，包括，例如，所選的抗原、用於遞送抗原的載體和待治療的哺乳動物，例如物種、年齡、大小等。就這一點而言，例如，肌肉內給予小鼠最低至少約IO7PFU的腺病毒載體，或人體內至少約IO9PFU,足以產生免疫應答。
[0031]在另一實施方案中，針對抗原的免疫應答可以是哺乳動物體內天然存在的，並且激發疫苗接種步驟不是誘導免疫應答所必需的。天然存在的針對抗原的免疫應答可以由任何先前的抗原暴露引起。
[0032]一旦在合適的免疫應答間隔期內，在哺乳動物體內產生了針對給定抗原的免疫應答，將適合遞送或表達該抗原的加強疫苗(諸如病毒疫苗或抗原呈遞細胞)連同HDACi給予哺乳動物。
[0033]可以使用標準重組技術，通過將編碼抗原的轉基因併入合適的病毒內，來製備表達所選抗原的病毒疫苗。例如，可以將轉基因併入病毒的基因組中，或作為選擇，可以使用併入轉基因的質粒將轉基因併入病毒內。可用於此的合適的病毒包括溶瘤病毒，以及複製型(例如痘病毒)和非複製型(例如逆轉錄病毒或腺病毒)疫苗載體。本發明方法不具體限於可以被利用的溶瘤病毒，且可以包括能破壞腫瘤同時適合給予哺乳動物的任何溶瘤病毒。本發明方法中可以利用的溶瘤病毒的實例包括:棒狀病毒如水皰病毒，例如水皰性口炎病毒(VSV)和馬拉巴病毒、暫時熱病毒、質型彈狀病毒、核型彈狀病毒和狂犬病毒，以及麻疫病毒、牛痘病毒、皰疫病毒、粘液瘤病毒、細小病毒、新城疫病毒、腺病毒和塞姆利基森林病毒。
[0034]可將表達抗原的病毒以這樣的量與HDACi聯合給予，該量適合增強由預存免疫力產生的免疫應答。在一個實施方案中，以適合溶瘤病毒療法的量將表達腫瘤抗原的溶瘤病毒與有效量的HDACi聯合給予。如本領域技術人員所理解的，每種病毒的量至少隨所選的病毒、所選的HDACi和待治療的哺乳動物而不同。例如，經靜脈注射(IV)給予小鼠的最低IO8PFU的溶瘤VSV足夠用於溶瘤療法。相當的量足夠用於人類。
[0035]可將病毒疫苗連同HDACi —起給予。依照本發明的合適的組蛋白去乙醯化酶抑制劑(HDACi)包括，但不限於:諸如伏立諾他(SAHA)、貝林司他(belinostat) (PXDlOl)、LAQ824、曲古抑菌素A和帕比司他(LBH589)的異羥肟酸；諸如恩替諾特(MS-275)、CI994和莫西司他(mocetinostat) (MG⑶0103)的苯甲醯胺類；環四肽類(如trapoxin B);和縮肽類；親電酮類；以及諸如苯基丁酸和丙戊酸的脂肪酸類化合物。在本方法中給予了哺乳動物治療量的HDACi，例如足以增強針對病毒疫苗的免疫應答的量。可以使用任何合適的給予形式給予HDACi，包括，例如，經口給予、皮下給予、靜脈內給予、腹膜內給予、鼻內給予、經腸給予、局部給予、經舌下腺給予、肌肉內給予、動脈內給予、髓內給予、囊內給予、吸入法給予、經眼給予、經皮給予、經陰道給予或經直腸給予。
[0036]可以依照本發明方法單獨或在組合物內組合在一起給予病毒疫苗和組蛋白去乙醯化酶抑制劑，且還可以與一種或多種藥學可接受的佐劑或載體組合。表述「藥學可接受的」是指用於藥學領域是可接受的，即不為不可接受地具有毒性，或以其他方式不適合給予哺乳動物。藥學可接受的佐劑的實例包括，但不限於，稀釋劑、賦形劑等。為了獲得關於藥物配製的一般性指導，可以參考「Remington，s:The Science and Practice of Pharmacy」，21st Ed., Lippincott Williams&Wilkins, 2005。佐劑的選擇取決於組合物的預期給予方式。在本發明的一個實施方案中，將化合物配製成用於通過輸注或通過皮下注射或靜脈注射給予，並因此將其作為無菌和無熱原形式的水溶液，和任選地緩衝性水溶液或製成等滲溶液。因此，可以在蒸餾水或更可取地，在鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水或5%葡萄糖溶液中給予化合物。使用佐劑制 備用於通過片劑、膠囊劑、錠劑、水或非水液體的溶液或懸浮液、水包油或油包水型液體乳劑、酏劑或糖漿經口給予的組合物，所述佐劑包括:諸如乳糖、葡糖糖和蔗糖的糖類；諸如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉的澱粉；纖維素及其衍生物，包括羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；粉狀黃芪膠；麥芽；明膠；滑石；硬脂酸；硬脂酸鎂；硫酸鈣；諸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油和玉米油的植物油；諸如丙二醇、丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇的多元醇；瓊脂；褐藻酸；水；等滲鹽水和磷酸鹽緩衝溶液。還可以存在潤溼劑、諸如十二烷基硫酸鈉的潤滑劑、穩定劑、製片劑、崩解劑、抗氧化劑、防腐劑、著色劑和調味劑。在另一實施方案中，可以將組合物配製成乳膏、洗液或藥膏用於局部施用。對於此類局部使用，組合物可以包含諸如甘油三酸酯基質的合適的基質。此類乳膏、洗液和藥膏還可以含有表面活性劑和其它諸如皮膚柔軟劑等的美容用添加劑以及香料。還可以製備氣霧劑，例如，用於經鼻遞送，其中使用合適的推進性佐劑。本發明的組合物還可以作為大丸藥、藥糖劑或糊劑被給予。還可以包括用於經黏膜給予的組合物，包括經口給予、經鼻給予、經直腸給予或經陰道給予用於治療感染(其對這些區域造成影響)。此類組合物通常包含一種或多種合適的無刺激性的賦形劑或載體，包括，例如，可可油、聚乙二醇、栓劑、蠟、水楊酸鹽或其他合適的載體。不管其如何被給予，都還可以加入其他的佐劑至組合物中，這些佐劑，例如，可旨在延長其保存期限。
[0037]本發明方法在哺乳動物中提供了有效的協同性疫苗接種，在所述哺乳動物中，初次免疫應答被損壞，而針對給定抗原的二次免疫應答得到增強，例如相比由病毒疫苗單獨引起的應答，增強了至少約2倍或更多、例如約4倍或更多、例如約6至8倍或更多。對該效應起作用的因素為由該方法引起的選擇性淋巴球減少症，藉此，初始淋巴細胞被所述組合選擇性地耗盡。組蛋白去乙醯化酶抑制劑與疫苗加強劑的組合還減少由針對自身抗原的疫苗接種引起的自身免疫性後遺症，而不會減少諸如此類疫苗接種的抗腫瘤效應的效應。
[0038]在一個實施方案中，提供了增強具有預存免疫力的哺乳動物中針對抗原的免疫應答的方法，其中通過能感染B細胞的載體、通過諸如B細胞的抗原呈遞細胞、通過可誘導I型幹擾素的表達的載體或通過載體與能誘導I型幹擾素表達的藥劑的聯合，例如經靜脈給予，將所述抗原給予哺乳動物，從而完成其中抗原免疫應答得到增強且初次免疫應答被損壞的疫苗接種。術語「預存免疫力」如上所定義且可以如上述所獲得。可以使用該方法增強對任何抗原的免疫力，包括例如，腫瘤抗原、病毒抗原，且尤其是來自病毒性病原生物體(如HIV、HepC, FIV、LCMV、伊波拉病毒)，以及諸如結核分枝桿菌的細菌病原體的抗原。
[0039]如本領域技術人員所理解的，可以使用已確立的重組技術製備載體來表達所選的抗原。用於將抗原遞送至哺乳動物的合適的載體優選包括可誘導I型幹擾素的表達的載體，如，例如，如上所述的棒狀病毒，包括水皰病毒和基於Maraba的病毒。突變的病毒載體也適合用於本發明的方法中。突變的減毒病毒，包括不能複製的形式，用於本發明的方法中特別有利。
[0040]可以將表達抗原的載體與可誘導I型幹擾素的表達的藥劑組合。這類藥劑的實例包括toll樣受體(TLR)配 體或佐劑,包括,但不限於,咪喹莫特、聚肌苷-聚胞嘧啶核苷酸(聚1:C)、CpG 0DN、咪唑喹啉、單磷醯脂A、鞭毛蛋白、FimH和N-乙二醇化的胞壁醯二肽(N-glycolyted muramyldipeptide)。為了獲得其中抗原免疫應答得到增強且初次免疫應答被損壞的疫苗接種，將載體與這樣的量的I型幹擾素誘導劑組合，該量足以誘導幹擾素產生和導致淋巴球減少症。
[0041]一旦製備出表達所選抗原的載體，如上所述，就將其連同HDACi —起給予(例如經靜脈)哺乳動物，用於最佳的免疫力增強。所給予的載體的量同樣隨所選的載體以及哺乳動物而不同。關於預存免疫力，可以在預存免疫力的峰值免疫應答之前或同時，將表達抗原的載體給予哺乳動物。可在預存免疫力激發的效應期之後，最佳地將表達抗原的載體給予哺乳動物來增強預存免疫力。
[0042]參考以下具體實施例描述了本發明的實施方案，不應將這些具體實施例理解為具有限制意義。
實施例
[0043]方法
[0044]小鼠
[0045]雌性、年齡相仿(實驗開始時為8-10周齡)的C57BL/6小鼠購自查爾斯河實驗室(Wilmington, MA)，且圈養在麥克馬斯特大學的中心動物房內的受控環境中，提供了食物和水供自由攝取。所有的動物實驗都得到麥克馬斯特大學動物研究倫理理事會的批准，並遵守加拿大動物飼養協會(Canadian Council on Animal Care guideline)的準則。
[0046]病毒載體
[0047] 複製缺陷型rHuAd5-hDCT載體被刪除了 E1/E3、可表達全長hDCT基因，在293細胞內增殖，且在CsCl梯度上純化。可複製型rVSV-hDCT和rVSV-GFP已有描述(Stojdl etal.(2003).Cancer Cell, 4 (4), 263-275) ? rHuAd5_BHG 和 rVSV_MT 為缺少轉基因的對照載體。
[0048]激發加強方案
[0049]通過肌肉內注射IxlO8Pfu的rHuAd5來激發小鼠。為了加強，在14天的間隔期時經靜脈注射了 IxlO9Pfu的rVSV。對於HDACi處理，將MS-275 (溶於DMSO中且在鹽水中稀釋)與VSV給予共給予，且在隨後的4天，經腹腔注射給予0.1mg0
[0050]癌症模型
[0051]為了建立腦瘤，小鼠接受了顱內注射IxlO3個B16-F10細胞(於IylPBS中)。將小鼠放置在立體定位儀(Xymotech Biosystems Inc, Quebec, Canada)內，並在麻醉下用解剖刀片在頭皮中切個切口，以暴露頭蓋骨。在注射部位穿過頭蓋骨鑽出小的鑽孔。用安裝在10 μ I Hamilton注射器(Hamilton Company, Reno,NV)上的26號針頭，在大腦右半球內的以下位點處(相對於前囪)注射細胞:前0.62mm、側2.25mm和深4.0mm。在I分鐘的時間內注射細胞，並在撤回針頭前將針頭留在原處2分鐘，以使沿著注射通道的回流減到最小。用不鏽鋼夾子閉合頭皮切口，7-10天後去除夾子。
[0052]肽
[0053]通過PepScan Systems (Lelystad, The Netherlands)合成了來自 DCT 的能與H-2Kb結合的免疫優勢肽(DCT18(i_188，SVYDFFVWL)。來自VSV的N蛋白的H_2Kb限制性表位(RGYVYQGL)購自 Biomer Technologies (Hayward, CA) ?
[0054]抗體/四聚物
[0055]將可識別以下靶標的單克隆抗體用於流式細胞術分析:⑶16/⑶32(Fc Block)、CD3(145-2C11)、 CD4(RM4-5)、 CD8(53_6.7)、 IFN-y (XMG1.2)、 TNF-α (ΜΡ6-ΧΤ22)、CD19 (1D3)、B220 (RA3-6B2)、NKl.1 (ΡΚ136)、KLRG-1、CD44(IM7)、CD62L (MEL-14)、CD107a(lD4B)、H-2Kb(AF688.5)和 1-Ab (25-9-17)(購自 BD Biosciences,Mississauga, ON, Canada)和 Foxp3(FJK_16s)(eBioscience, San Diego, CA, USA)。
[0056]抗原特異性T細胞應答的檢測
[0057]在37°C下用肽(I μ g/ml)再次刺激由不同組織製備的單細胞懸液5小時，並在最後4小時的孵育期間加入布雷菲德菌素A (Golgi Plug, I μ g/ml; BD Biosciences)。用Feblock處理細胞並針對表面表達的⑶3和⑶8進行染色。隨後將細胞固定、透化(Cytofix/Cytoperm, BD Biosciences)並針對胞內 IFN-Y 和 TNF-α 進行染色。使用 FACSCanto 用FACSDiva 軟體(BD Biosciences)獲取數據並用 FlowJo 軟體(Tree Star, Ashland, OR)分析。
[0058]T細胞功能親和力測定
[0059]將脾細胞暴露於SVY肽的稀釋系列中，以提供越來越低的濃度。在該刺激過程中用Golgi plug處理細胞，並通過流式細胞術進行評估，以通過如上的胞內染色測量IFN Y。
[0060]DCT特異性抗體的定量[0061]將經工程改造用來表達DCT的U20S細胞塗布在多孔板內並使其生長至匯集。然後將細胞固定並透化。將來自接受處理的小鼠的血清連續稀釋，並用於探測這些固定的單層。孵育後衝洗掉未結合的抗體並用具有螢光標籤的抗小鼠二抗檢測結合的DCT特異性抗體。檢測螢光信號來測量存在於血清中的抗DCT抗體的滴度。
[0062]統計分析
[0063]使用Windows 下的 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)繪圖。對於統計分析，使用了 GraphPad Prism 和 Minitab Statistical Software (MinitabInc.，State College, PA, USA)。如有需要,通過log轉化對數據進行標準化。使用了學生氏雙尾t檢驗、單因素或雙因素ANOVA或一般線性模型來查詢免疫應答數據。在P < 0.05時認為均值間的差異顯著。顯示了均值加標準誤棒。使用Kaplan-Meier法和時序檢驗分析了存活數據。
[0064]結果
[0065]MS-275聯合溶瘤加強劑疫苗顯著改善了治療結果
[0066]為了確定MS-275與如W02010/105347A1中描述的激發-加強方案的潛在的協同效應，將侵襲性腦黑色素瘤模型與確定的黑色素瘤相關抗原——多巴色素異構酶(DCT) —起使用，其中DCT由黑色素瘤細胞系B16-F10和正常黑色素細胞(Bridle JI/MT)表達。顱內接種B16-F10細胞後I天或5天，用表達人DCT的重組人5型腺病毒載體(rHuAd5_hDCT)和表達相同抗原的溶瘤重組VSV(rVSV-hDCT)以14天的間隔期相繼處理小鼠。為了增加溶瘤作用，在用rVSV加強的情況下給予MS-275。這也與rVSV的持久性和加強的CTL應答的峰值相符。圖1a和圖1b中的數據表明，未接受處理的動物的平均存活期為15天，這證實該模型的侵襲性具 有小的治療窗。在I天和5天治療模型中，單獨用rHuAd5-hDCT疫苗接種將動物存活期分別延長到了 28和25天的中值。隨後遞送溶瘤疫苗——rVSV-hDCT顯著提高了動物存活期(圖la)。儘管改善了存活率，然而，用激發加強方案處理的多數動物最終都死於腫瘤發展，尤其是在荷5天大的腫瘤的小鼠內(圖1b)，這與以前的觀察結果一致。在遞送rVSV-hDCT時，同時用MS-275治療顯著提高了聯合治療的功效，且在治療啟動時，分別治癒了 85%(n=13)和64%(n=ll)的荷I天大或5天大的腫瘤的小鼠。MS-275單獨對該癌症模型中的功效沒有影響，儘管其在體外可抑制B16-F10細胞生長。
[0067]在MS-275存在時NK細胞和二次腫瘤特異性CTL和抗體應答的幅度得到保持
[0068]該模型中，激發加強疫苗接種的功效與腫瘤特異性CD8+T細胞應答的幅度直接相關。考慮到還沒有研究過溶瘤病毒治療期間HDAC抑制對免疫應答的影響，需要確定該重要的治療組分是否被提高，導致功效的顯著提高。基於先前的觀察結果(其中由rVSV誘導的二次T細胞應答在第5天時達到其峰值並在12天後下降)，在rVSV加強劑疫苗接種後的第5天和第12天，對循環中的DCT特異的、產生IFN-Y的⑶8+T細胞進行了定量。DCT特異性⑶8+T細胞應答的量沒有受到MS-275的影響(圖2a)。平行地，使用細胞內Western印跡分析測量了血漿中的DCT特異性IgG抗體(圖2b)。這些結果揭示出治療的一個以前不受重視的方面；即，腫瘤特異性抗體，像T細胞，被顯著增加。與T細胞類似，二次抗體應答不受MS-275影響。還發現採用rVSV的加強劑疫苗接種增加了能產生IFN-Y並經歷脫粒(基於⑶107a表達)的循環NK細胞的數目，但MS-275對此沒有影響(圖2c)。總之，這些發現表明MS-275的改善的治療效果並不歸因於更高幅度的效應物應答的誘導。[0069]MS-275增加的功效與改善的CTL品質相關
[0070]與單獨的rHuAd5/rVSV相比，加入MS-275增加了共表達TNF- α的CD8+T細胞的頻數(圖2d)及其TNF-α產生(圖2e)和IFN-Y產生(圖2f)的強度。這表明MS-275可以改善活化的CD8+T細胞的品質。較好品質的T細胞通常與和MHC肽複合物的較高親和力同種相互作用相關(ref)。因此，測定了來自用MS-275處理或沒用MS-275處理的小鼠的T細胞的功能親和力。為了獲得用於該分析的足夠多的細胞，使用了脾細胞。將這些細胞暴露於來自DCT的免疫優勢肽的連續稀釋液中(DCT18ch188 ;濃度範圍:1 μ g/ml至10pg/ml)。令人關注的是，當小鼠接受HDACi處理時，5.6倍多的CD8+T細胞可以對最低濃度的肽作出應答(圖2g)。
[0071]在VSV加強劑疫苗接種期間MS-275導致淋巴球減少症
[0072]令人吃驚的是，儘管腫瘤特異性CTL和活化NK細胞的數目沒有受到MS-275處理的影響，然而在接受處理的小鼠體內觀察到了短暫但嚴重的淋巴球減少症(圖3a)。確實，更加密切的檢查表明，MS-275引起了循環中的初始⑶8+T細胞(⑶8*⑶44TD62L+KLRG-D的大量減少(圖3b)，且靜息NK細胞(⑶107a_IFN- Y _)在用MS-275處理期間被大幅減少(圖3c)。此外，在相同的時間點觀察到總⑶4+T細胞減少77%(圖3d)。這些受影響的細胞群在加強的CTL應答的峰值一周後開始恢復，這可能是由於MS-275處理和VSV清除的停止。最引人注意的是，97%的B細胞被清除且它們的恢復比其他細胞群要慢得多(圖3e)。該淋巴球減少效應不依賴於腫瘤的存在(數據沒有顯示)，其也不為品系特異性的(圖6)，這表明其為普遍現象。這些結果揭示出MS-275的新的特性，其允許⑶8+T細胞和抗體的二次擴增，而同時也會清除其他的淋巴細胞群，包括初始T細胞、B細胞和NK細胞。該淋巴球減少環境不僅可以為促進效應細胞的擴增和功能提供更多的實體空間和生長因子，還可以調節針對VSV的免疫應答的結果及其溶瘤效應。
[0073]用HDACi即C1-994獲得了類似的結果。
[0074]圖7闡述了 30天的時間內在小鼠的外周血中測量的總淋巴細胞計數。在處理後30天的時間內測定了每微升血液中的細胞數目。病毒單獨誘導了非常短暫的淋巴球減少症，其通過共給予HDACi藥物(MS-275)可顯著延長，而單獨的藥物具有適度的效應。重要的是，這裡缺少HDAC抑制特性的藥物類似物沒有效果，這表明需要HDAC抑制。這些效應延伸到⑶4+和⑶8+T細胞以及B細胞。
[0075]MS-275損害初次免疫應答的能力促使需要確定其是否可以減弱針對rVSV加強載體的免疫應答。為了評估這一點，在rVSV接種後第7天測量了 CD8+T細胞針對來自rVSV的N蛋白的Kb限制性免疫優勢表位的應答。如圖4a中所顯示，儘管DCT特異性CTL的數目沒有受到MS-275處理的影響，但是rVSV反應性CTLs被顯著減少，這表明MS-275有區別地影響記憶⑶8+T細胞和初始⑶8+T細胞的擴增。
[0076]總之，這些結果表明了將MS-275與基於溶瘤病毒的加強劑疫苗聯合的極大好處，其導致針對腫瘤的集中的免疫應答，同時延遲針對溶瘤病毒的應答，這允許延長的病毒溶瘤作用。
[0077]能誘導i型幹擾素表達的藥劑誘導的淋巴球減少症可被MS-275共給予延長
[0078]通過腹腔內注射，用單一劑量的聚1:C(200yg溶於100 μ I的磷酸鹽緩衝鹽水，Sigma)處理雌性小鼠(8-10周齡C57BL/6)，並用0.1mg的MS-275每天處理一次，處理5天，作為聚1:C聯合MS-275處理組。聚1:C為I型幹擾素表達的經典誘導物。僅用單一劑量的聚1:C處理的小鼠被稱為聚1:C處理組，而用5種劑量的MS-275處理5天的小鼠表示僅用藥物的處理組。從眶周竇採集血液，並用ACK裂解緩衝液裂解血紅細胞。在聚1:C注射後2h、6h、24h、48h、72h和120h時評估外周血淋巴細胞計數(N=3)，如圖8中所示。通過FACSCanto流式細胞分析儀用FACSDiva5.0.2軟體(BD Pharmingen)收集數據，並用FlowJoMac (Treestar, Ashland, OR)進行分析。在沒有病毒時，聚1: C產生了相同的可被藥物延長的淋巴球減少症。因此，藥物在存在幹擾素誘導物的情況下誘導這些效應。
[0079]MS-275降低Tregs、尤其是可表達高水平Foxp3的Tregs,並上調腫瘤細胞上的MHC表達
[0080]模型內由MS-275誘導的淋巴球減少症，尤其是總CD4+T細胞的減少導致需要評估其對CD4+Foxp3+Tregs的直接影響。圖5a中的數據表明在加強劑免疫期間Tregs的數目顯著減少(減少75%)，儘管其看起來比其他細胞群恢復更快(圖3a-e)。這導致DCT特異性CD8+與Treg細胞的比值增加3倍多(圖5b)。顯然，接受MS-275處理的小鼠體內Tregs表達Foxp3的強度顯著偏低(圖5c)，表明藥物可以選擇性地去除具有較強抑制功能的高表達Foxp3的Tregs。總之,這些數據證明了 MS-275可以直接下調Treg活性,至少在溶瘤加強劑疫苗的情況中如此，這允許大量的二次CD8+T細胞應答在嚴格調控較少的環境中發揮功倉泛。
[0081]MS-275預防疫苗誘導的自身免疫性白癜風
[0082]這裡利用的溶瘤疫苗載體可引起非常有效的針對正常黑色素細胞內表達的自身抗原的免疫應答，在用rHuAd5-hDCT和rVSV-hDCT處理的那些小鼠體內引起嚴重的自身免疫性白癜風(圖6，來自4個試驗的每組中的多隻小鼠的代表)。考慮到MS-275共給予顯著減少了那些小鼠體內的Treg頻數，可能會預測到，藥物會加劇該自身免疫病理現象。值得注意的是，通過用MS-275 同時處理幾乎完全消除了由激發加強疫苗接種誘導的系統性白癜風，這與其對抗腫瘤功效的增強形成鮮明對比。這表明藥理學藥物可以在針對自身腫瘤抗原的疫苗接種治療期間實現不需要的自身免疫性後遺症與抗腫瘤免疫力的分離。
[0083]VSV和MS-275的共給予耗盡了骨髓和胸腺內未成熟的淋巴細胞前體
[0084]用VSV的單一尾靜脈注射(1.V.)劑量(2x109PFU VSV溶於200 μ I的磷酸鹽緩衝鹽水)感染小鼠，並用腹腔內注射0.1mg的MS-275，每天注射I次，注射3天來治療，作為VSV聯合MS-275處理組。僅用單一劑量的VSV感染的小鼠被稱為VSV處理組，而用3種劑量的MS-275或MS-275類似物(如圖9中所示)處理3天的小鼠分別為僅用藥物處理組或僅用類似物處理組，初始小鼠沒有接受病毒或藥物處理。VSV注射後3天收集來自胸腺或骨髓(股骨和脛骨)的淋巴細胞(Ν=3)。隨後用抗⑶16/32和通過⑶4/⑶8或B220/IgM的抗體螢光標記的表面標誌物(BD Pharmingen)處理細胞。胸腺(未成熟的T細胞)和骨髓(未成熟的B細胞)中的淋巴細胞前體都被聯合治療耗盡。因此，延長的淋巴球減少症部分是由於可替換外周血中耗盡的淋巴細胞的前體的減少。
[0085]討論
[0086]當結合溶瘤疫苗療法使用時，MS-275(1型HDAC的苯甲醯胺抑制劑)不僅增加了病毒複製和腫瘤內的MHC表達，還對免疫系統的獲得性能力具有極大的影響。該聯合療法引起選擇性的淋巴球減少症，其損害針對溶瘤病毒的細胞和體液免疫應答，同時顯著減少Tregs，從而產生針對腫瘤的集中的和脫阻遏的免疫應答。通過去除不需要的免疫細胞和維持有益的免疫細胞，該組合提供了兩者之優點，其中免疫系統響應治療性病毒的能力受損，但是會繼續攻擊腫瘤，從而極大地加強了治療，在非常具有挑戰性的癌症模型中產生60-80%的持久治癒率。這首次表明抗黑色素瘤功效得到極大增強，而白癜風得到同時且同等的顯著減少。
[0087]總之，將溶瘤疫苗療法與HDACi聯合，以損害先天免疫力並介導抗病毒獲得性免疫力和抗腫瘤獲得性免疫力的顯著改變。通過延遲抗病毒應答同時將免疫應答集中到腫瘤上，病毒溶瘤作用得到延長、抗腫瘤功效得到增強且自身免疫後遺症得到減少。
[0088]本文中參考的所有文獻都通過弓丨用併入。
【權利要求】
1.一種疫苗接種方法，包括給予哺乳動物組蛋白去乙醯化酶抑制劑和能遞送抗原的疫苗，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述抗原選自:腫瘤抗原、來自病毒性病原體的抗原和來自細菌性病原體的抗原。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述腫瘤抗原選自:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA 125、Her2、多巴色素異構酶(DCT)、GP100、MARTU MAGE 蛋白、NY-ESOl、HPV E6 和HPV E7。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述抗原來自選自以下的病原生物體:HIV、HepC,FIV、LCMV、伊波拉病毒和結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述組蛋白去乙醯化酶抑制劑選自:異羥肟酸、苯醯胺類、環四肽類、縮肽類、親電酮類和脂肪酸類化合物。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述異羥肟酸選自:伏立諾他(SAHA)、貝林司他(PXDlOl)、LAQ824，曲古抑菌素A和帕比司他(LBH589);所述苯甲醯胺類選自:恩替諾特(MS-275)、CI994和莫西司他(MGCD0103);所述環四肽類為trapoxin B ;且所述脂肪酸類化合物可以為苯基丁酸或丙戊酸。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗為表達抗原的病毒疫苗。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述病毒疫苗為溶瘤病毒。
9.如權利要求8所 述的方法，其中所述溶瘤病毒選自:棒狀病毒、麻疹病毒、牛痘病毒、皰疫病毒、粘液瘤病毒、細小病毒、新城疫病毒、腺病毒和塞姆利基森林病毒。
10.如權利要求8所述的方法，其中所述溶瘤病毒為選自以下的水皰病毒:水皰性口炎病毒(VSV)、馬拉巴病毒、暫時熱病毒、質型彈狀病毒、核型彈狀病毒和狂犬病毒。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗可誘導I型幹擾素的表達。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗為抗原呈遞B細胞。
13.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗與可誘導I型幹擾素的表達的藥劑聯合給予。
14.一種組合物，其包含疫苗和組蛋白去乙醯化酶抑制劑。
15.如權利要求14所述的組合物，其中所述疫苗為病毒疫苗。
16.如權利要求14所述的組合物，其中所述疫苗可誘導I型幹擾素。
17.如權利要求14所述的組合物，其中所述組蛋白去乙醯化酶抑制劑選自:異羥肟酸、苯甲醯胺類、環四肽類、縮肽類、親電酮類和脂肪酸類化合物。
18.如權利要求17所述的組合物，其中所述異羥肟酸選自:伏立諾他(SAHA)、貝林司他(PXDlOl)、LAQ824，曲古抑菌素A和帕比司他(LBH589);所述苯甲醯胺類選自:恩替諾特(MS-275)、CI994和莫西司他(MGCD0103);所述環四肽類為trapoxin B ;且所述脂肪酸類化合物可以為苯基丁酸或丙戊酸。
19.如權利要求14所述的組合物，其還包含可誘導I型幹擾素的表達的藥劑。
20.如權利要求19所述的組合物，其中所述藥劑選自:toll樣受體配體、咪喹莫特、聚肌苷-聚胞嘧啶核苷酸(聚1:C)、CpG 0DN、咪唑喹啉、單磷醯脂A、鞭毛蛋白、FimH和N-乙二醇化的胞壁醯二肽。
【文檔編號】A61K35/76GK103619350SQ201280020513
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年3月9日 優先權日:2011年3月11日
【發明者】布萊厄姆·布利多, 布萊恩·利克蒂, 萬永紅, 簡-西蒙·蒂厄羅, 昌塔爾·勒梅, 約翰·貝爾 申請人:麥克馬斯特大學, 渥太華醫院研究所