一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒及應用的製作方法

2023-05-14 01:34:41 3

專利名稱：一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，適用於測定動物性食品中呋喃唑酮殘留標示物3-氨基-2-惡唑烷酮(簡稱AOZ，下同)的殘留量，屬於免疫化學分析技術領域。
背景技術：
呋喃唑酮又名痢特靈，屬於硝基呋喃類藥物，為人工合成的廣譜抗菌藥，曾作為促生長劑廣泛應用於畜、禽、水產養殖中。毒理學研究發現，呋喃唑酮具有致癌和致突變性。歐盟於1995年將呋喃唑酮列為禁用藥，隨後美國、日本、澳大利亞等國均取消呋喃唑酮在畜禽生產上的使用，中國農業部2002年3月發布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中將呋喃唑酮列為禁用藥。由於呋喃唑酮確實具有很好的預防和治療效果，價格便宜，目前仍在畜、禽、水產養殖中非法使用。因此為了保障動物性食品食用者的健康和擴大動物性食品的貿易往來，加強對動物性食品中呋喃唑酮殘留的檢測是非常必要的。
呋喃唑酮在動物體內很快代謝成AOZ，與組織蛋白結合的AOZ在體內滯留時間長，被視為呋喃唑酮的殘留標示物，所以分析呋喃唑酮殘留通常分析其代謝產物AOZ。目前檢測AOZ殘留的方法有高效液相色譜法(HPLC)，液質聯用(LC-MS)，液質串聯質譜法(LC-MS-MS)和免疫化學分析法(IA)。
常用的儀器法(HPLC、LC-MS、LC-MS-MS)所需儀器價格昂貴，對操作人員的要求較高，難於推廣，不適合高通量的樣品篩選。免疫化學分析法特別是酶聯免疫吸附分析技術(ELISA)具有快速、靈敏度高、操作簡單、專一性好等優點，適合高通量的樣品篩選。近年來國外已開展呋喃唑酮ELISA方法的研究(Cooper KM，Elliott C T，Kennedy D G.Detection of 3-amino-2-oxazolidinone(AOZ)，a tissue-bound metabolite of thenitrofuran furazolidone，in prawn tissue by enzyme immunoassay.Food Additives and Contaminants，2004，21(9)841-848)，但國內外均未見呋喃唑酮ELISA試劑盒專利報導。因此研製呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，具有重要的經濟效益和社會效益。

發明內容
本發明目的在於克服現有技術的缺陷，提供一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒。本試劑盒具有靈敏度高，結構簡單，使用和攜帶方便，可用於動物檢驗檢疫單位對動物源食品中呋喃唑酮殘留的分析檢測。
本發明通過以下技術方案實現一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，它包括盒體、設在盒體內的酶標板、試劑，其中的試劑包含洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶(HRP)標記羊抗兔抗體、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液、3-氨基-2-惡唑烷酮標準溶液和3-氨基-2-惡唑烷酮抗體，在酶標板的每孔內，有包被液包被的能與呋喃唑酮殘留標示物3-氨基-2-惡唑烷酮特異性抗體結合的包被抗原，所說的3-氨基-2-惡唑烷酮抗體是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。
所說的包被抗原是由3-氨基-2-惡唑烷酮與對醛基苯甲酸反應，再與卵清蛋白偶聯的複合物。
所說的人工免疫原是由3-氨基-2-惡唑烷酮與對醛基苯甲酸反應，再與牛血清蛋白偶聯的複合物。
所說的3-氨基-2-惡唑烷酮標準溶液為3-氨基-2-惡唑烷酮與苯甲醛衍生物N-苯亞甲基-3-氨基-2-惡唑烷酮(簡稱PAOZ，下同)。
在本發明的試劑盒中，所述的酶標板由塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成，酶標板用聚苯乙烯製成。
試劑盒中的試劑按照常規配製(朱立平，陳學清，免疫學常用實驗方法.北京人民軍醫出版社，2000)，其中底物顯色A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色B液為四甲基聯苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)，終止液為硫酸溶液或鹽酸溶液，洗滌液為含0.05～0.1％吐溫20的磷酸鹽緩衝液，樣品稀釋溶液為pH 7.4的磷酸鹽緩衝液。
本發明還包括動物可食性組織如肝臟、肌肉樣品預處理方法，將待檢測動物組織經鹽酸水解釋放AOZ，苯甲醛衍生過夜(16h)，最後過MAX柱淨化。
本發明試劑盒採用間接競爭ELISA法，用於檢測動物可食性組織如肝臟、肌肉中AOZ的殘留。其優點是樣品處理簡單，適合高通量的樣品篩選，具有高特異性、高靈敏度、高精確度等特點，最低檢測限達0.1μg/kg。


圖1是本發明的檢測試劑盒直觀示意圖，圖中1--盒體；3--AOZ標準溶液；4--辣根過氧化酶(HRP)標記羊抗兔抗體；5--AOZ抗體液；6--底物顯色A液；7--底物顯色B液；8--終止液；9--洗滌液；10--樣品稀釋液；11--泡沫託架；圖2是本發明的檢測試劑盒中的酶標板直觀示意圖，圖中2--酶標板；圖3是本發明的人工抗原合成路線；圖4是本發明人工抗原紫外掃描圖譜，圖4顯示BSA最大吸收波長為27gnm，CPAOZ-BSA最大吸收波長為292nm，BSA偶聯半抗原後最大吸收波長發生明顯改變；圖5是本發明3-氨基-2-惡唑烷酮抗體與3-氨基-2-惡唑烷酮標準品的間接競爭反應曲線，圖中X軸為3-氨基-2-惡唑烷酮標準品的濃度對數值，Y軸為3-氨基-2-惡唑烷酮標準品對光密度值的抑制百分率。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明，但不限制本發明。
實施例1、抗原、抗體的製備1.1人工抗原(免疫原、包被原)的合成在有磁力攪拌器裝置的100mL燒杯中加入蒸餾水10mL，對醛基苯甲酸3.0g，緩慢滴加N，N-二甲基甲醯胺(DMF)至對醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入AOZ 1.0g，反應2h後過濾，水洗3次得到AOZ與對醛基苯甲酸的反應物3-(4羧基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(簡稱CPAOZ，下同)。取CPAOZ 23.4mg溶於DMF 2mL中，攪拌中加入二環己基碳二亞胺(DCC)27.5mg和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)14.4mg，4℃下磁力攪拌反應過夜。離心後，上清液為A液。稱取牛血清蛋白(BSA)170mg溶於0.1mol/L PBS(pH 8.0)10mL中，加入DMF 1mL，攪拌溶解製備B液。磁力攪拌下，A液逐滴加入到B液中，密封燒杯，4℃下攪拌反應4h。離心後，取上清液，4℃下用PBS(pH7.4)透析3d，每天更換2次PBS，以除去未反應的DMF、DCC、NHS和CPAOZ小分子物質。最後得到無色CPAOZ-BSA(CPAOZ與牛血清蛋白偶聯複合物)溶液，分裝保存於-20℃冰箱中，供免疫用。
在上述步驟中，稱取卵清蛋白(OVA)150mg與CPAOZ 23.4mg反應即得CPAOZ-OVA(CPAOZ與卵清蛋白偶聯複合物)，供包被用。
1.2抗體的製備採用健康雄性體重1.5kg左右的家兔作為免疫動物，以CPAOZ-BSA為免疫原，免疫劑量為0.5～1mg/只。首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合製成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫，共免疫6次，免疫期間監測血清抗體效價及特異性。最後一次免疫不加佐劑。在最後一次免疫7～10天後頸動脈放血，收集兔血清，經硫酸銨分級沉澱得到純化的AOZ多克隆抗體。
實施例2、呋喃唑酮間接競爭檢測方法的建立2.1抗原最佳包被濃度和抗體最佳工作濃度的確定通過方陣滴定試驗確定，以吸光度值約1.0且左右相鄰吸光度差值最大的點為參照點。操作步驟在96孔酶標板上的第1行包被2000μg/L的包被原，第2至第8行依次包被1000、500、250、120、60、30、15μg/L的包被原。4℃過夜，1％卵清白蛋白37℃封閉1小時，洗滌2次，拍幹，在酶標板的第1列至第9列依次加入100μL稀釋倍數為10000、20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000、25600003-氨基-2-惡唑烷酮抗體，第10列加入樣本稀釋液做空白對照，37℃孵育1h，洗滌3次，拍幹，各孔加入100μL底物顯色液，避光顯色15min，加入50μL終止液，用自動酶標儀於450nm波長下測定光密度值(OD值)，結果見表1。
表1本發明試劑盒中抗原最佳包被濃度和抗體最佳工作濃度的確定

結果表明，抗原最佳包被濃度為250μg/L，抗體最佳上作濃度為1∶320000。
2.2抗體最佳反應體積的確定設置4個抗體與藥物的反應體積比(60μL∶40μL、50μL∶50μL、40μL∶60μL、30μL∶70μL)，作間接競爭ELISA，結果見表2。
表2本發明試劑盒中抗體最佳反應體積的確定

結果表明，抗體與藥物的反應體積比為40μL∶60μL時，抗體反應最靈敏。
2.3最佳競爭時間的確定間接競爭ELISA法確定最佳競爭時間。設置0.5μg/L、5μg/L、50μg/L 3個藥物濃度，競爭反應這一步中，將5塊板置於37℃下孵育，經0.5、1、1.5、2、3h分別各取出1塊扳，測其OD值，結果見表3。
表3本發明試劑盒最佳競爭時間的確定(n＝5)

結果表明，不同濃度的藥物經過1h的競爭反應後，OD值不再上升，說明經過1h競爭反應達到平衡狀態，因此最佳競爭時間為1h。
實施例3、本發明呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒的製備3.1本發明酶聯免疫檢測試劑盒的組成本發明的試劑盒主要由盒體(1)、酶標板(2)、6瓶AOZ標準溶液(3)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔抗體(4)、AOZ抗體液(5)、底物顯色A液(6)、底物顯色B液(7)、終止液(8)、洗滌液(9)、樣品稀釋液(10)和泡沫託架(11)組成。
3.2試劑的配製按常規方法製備其中包被稀釋液Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000mL，調至pH9.6；封閉液卵清蛋白0.1g溶於pH7.4PBS 100mL；洗滌液NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，KCl 0.2g，吐溫200.5mL，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000mL，調至pH 7.4；樣本稀釋液NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000mL，調至pH 7.4；底物顯色液(TMB-過氧化氫尿素溶液)其中①底物液A四甲基聯苯胺(TMB)200mg，無水乙醇或二甲亞碸100mL，加雙蒸水至1000mL；②底物液B緩衝液Na2HPO414.60g，檸檬酸9.33g，0.75％過氧化氫尿素6.4mL，加雙蒸水至1000mL，調至pH5.0～5.4；③將底物液A和底物液B按1∶1混合即成TMB-過氧化氫尿素溶液；終止液18mol/L濃硫酸100mL，緩慢滴加到雙蒸水至900mL。
3.3酶標板的製備用包被緩衝液將CPAOZ-OVA稀釋成0.5μg/mL，每孔加入100μL，室溫過夜或37℃孵育4h，傾去包被液，洗滌液洗滌3次，拍幹，然後每孔加入200μL封閉液，37℃孵育1h，傾去孔內液體，洗滌液洗滌3次，拍幹，用鋁膜真空密封保存、備用。
實施例4、本發明的酶聯免疫檢測試劑盒的測定程序4.1測定之前注意事項①使用之前將所有試劑回升至室溫20～24℃；②使用之後立即將所有試劑放回4℃冰箱；③在使用中不要讓微孔乾燥；④在免疫分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，仔細按照推薦的冼板順序操作是免疫測定操作程序的要點；⑤在所有恆溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。
4.2樣品提取淨化①取組織均質物1g，分別加入蒸餾水5mL，1mol/L HCl 0.5mL和10mmol/L苯甲醛(甲醇溶液)100μL，充分振蕩；②置37℃水浴孵育(大約16小時)③分別加入0.1mol/L K2HPO45mL，高氯酸200μL，劇烈振蕩30s，室溫4000r/min離心10min；④取出上清液到另一容器，用5mol/L NaOH調節pH至7.0，準備過MAX柱，分別用甲醇3mL和蒸餾水3mL活化MAX柱，流速控制在1滴/秒，加入上述樣品；⑤用2％的氨水溶液3mL洗滌MAX柱，正壓吹乾，用甲醇溶液3mL洗脫並收集洗脫液，正壓吹乾以便收集完全；⑥40℃氮氣吹乾，向吹乾後的收集瓶中加入樣本稀釋液1mL，渦動30s，作為試樣溶液，供ELISA方法測定。
4.3試劑配製①酶標二抗工作液配製根據每次所需用量，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔抗體(4)和樣品稀釋溶液(10)按1∶10的比例稀釋，混勻；②AOZ抗體工作液配製根據每次所需用量，AOZ抗體液(5)和樣品稀釋液(10)按1∶10的比例稀釋，混勻；③底物混合液配製根據每次所需用量，顯色液A液(6)和顯色液B液(7)按1∶1的比例稀釋，混勻，現配現用；④洗滌液配製；洗滌液(9)和蒸餾水按1∶10的比例稀釋，混勻，置4℃冰箱可保存1月。
4.4測定步驟①取微孔條將足夠標準品和樣品所用數量的孔條插入微孔架，標準品和樣品做兩個平行試驗，記下標準品和樣品的位置；②加標準液或待測樣品加入標準品或處理好的樣品液60μL到微孔中，每孔加入樣品或標準品時注意更換移液器的吸頭；③加抗體加入AOZ抗體工作液40μL到每一個微孔中充分混合，在培養箱孵育1.5小時(37℃)，覆蓋上薄膜(防止蒸發)；④洗滌倒出孔中的液體，洗滌3次並拍幹；⑤加酶標二抗加入酶標二抗工作液100μL到每一微孔中充分混合，在培養箱孵育1小時(37℃)，覆蓋上薄膜(防止蒸發)；⑥洗滌倒出孔中的液體，洗滌4次並拍幹；⑦加底物加入底物混合液100μL到每一微孔中，充分混合併在室溫暗處孵育15分鐘；⑧終止加入反應終止液50μL到每一微孔中；⑨測定在450nm處測量吸光度值，以空氣為空白，必須在加入終止液後60分鐘內讀取吸光值。
4.5結果判斷所獲得的標準品和樣品吸光值的平均值除以第一個標準(0標準)的吸光值再乘以100，以抑制率為縱坐標，AOZ濃度的對數為橫坐標作標準曲線，曲線在0.1～25μg/L範圍內趨近直線，每一個樣品的濃度(μg/kg)可以從校正曲線上讀出。

實施例5、本發明試劑盒的靈敏度、特異性、準確度、精密度、穩定性試驗5.1本發明試劑盒的靈敏度試驗以IC50(抑制率為50％對應的藥物濃度)作為本發明檢測試劑盒的靈敏度指標。測定20次標準曲線的IC50值，本發明試劑盒的IC50值為1.26μg/L(表4)。計算20個0μg/L標準液OD值的平均值(X)和標準差(SD)，根據最低檢測限公式Z＝X-3SD，在標準曲線上查出標準品最低檢測限為0.1μg/L。
表4本發明試劑盒的靈敏度試驗

5.2本發明試劑盒的特異性試驗以交叉反應率為指標判定試劑盒的特異性。將AOZ與鄰硝基苯甲醛衍生物3-(2-硝基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(簡稱NPAOZ，下同)、AOZ、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、苯甲醛、四環素、磺胺二甲嘧啶、青黴素、鏈雷素、紅黴素、恩諾沙星、克倫特羅等藥物配成不同的濃度，用試劑盒測定各藥物的IC50值，每個藥物3個復孔，計算其交叉反應率(表5)。

表5本發明試劑盒的特異性試驗

本發明試劑盒除與NPAOZ(5.73％)、呋喃唑酮(6.13％)有交叉反應，與其他藥物無交叉反應，說明本發明試劑盒對PAOZ特異性高，專一性好。
5.3本發明試劑盒的準確度試驗將配製好的AOZ母液(1mg/mL)稀釋成100μg/L，添加到1g組織(豬肉、豬肝、雞肉、雞肝)中使其終濃度為0.4μg/kg、1μg/kg、5μg/kg，每個濃度3個重複，重複5天，按照試劑盒的測定程序，測定各組織中AOZ濃度，並計算回收率和變異係數(表6)。

表6本發明試劑盒的準確度和重複性試驗

豬肝、豬肉、雞肝、雞肉組織中回收率均在55.8％～96.6％，批間變異係數＜20％，表明本發明試劑盒測定結果準確、可靠，重複性好。
5.4本發明試劑盒的精密度試驗按照本試劑盒的操作說明測定標準溶液，每個標準溶液5個復孔，以濃度的抑制率計算變異係數，結果見表7。
表7本發明試劑盒精密度試驗

結果表明，本發明試劑盒的板內變異係數＜5％，板內測定結果穩定，精密度高。
5.5本發明試劑盒的穩定性試驗將本發明試劑盒放置4℃和20℃條件下保存，於0、1、2、3、4、5、6、7、8、9月後分別取試劑盒，測定IC50值和最大吸光值，結果見表8。
表8本發明試劑盒的穩定性試驗

注「-」表示未測定表8結果顯示，本發明試劑盒在4℃保存下，最大吸光值和IC50值均在正常波動範圍內。20℃保存下，1個月後，最大吸光值下降到0.6，說明試劑盒中的部分試劑已變質。穩定性試驗表明本發明試劑盒在4℃條件下可保存6個月以上。
實施例5、動物餵養試驗取15頭，45日齡，體重為15.0±2.0kg的品種為「長大」的二元雜交去勢健康仔豬，隨機分為5組。第1組為空白對照組，其餘4組飼餵含100mg/kg的呋喃唑酮7天，於停藥0天、7天、14天、28天分別屠宰3頭，空白對照組分別在停藥0天、7天、28天屠宰1頭，取肝臟、肌肉組織。同一份樣品分別採用本發明試劑盒和高效液相色譜法(HPLC)測定，結果見表9。
表9本發明試劑盒的適用性試驗


停約0天，肌肉和肝臟中AOZ含重為116.9μg/kg、402.2μg/kg，28天後，肌肉和肝臟中AOZ含量為3.6μg/kg、29.2μg/kg，空白肌肉和肝臟的測定值為0.2μg/kg、0.16μg/kg，與儀器方法測定結果一致。測定結果證明了AOZ在體內滯留時間長(超過28天)，並且隨時間的變化AOZ濃度逐漸下降。本發明試劑盒能區分加藥組和空白對照組，說明本發明試劑盒具有測定實際樣品的能力，適用性強，滿足呋喃唑酮零殘留檢測的要求。
權利要求
1.一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，它包括盒體、設在盒體內的酶標板、試劑，其中的試劑包含洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標記羊抗兔抗體、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液，其特徵在於，酶標板的每孔內有包被液包被的能與呋喃唑酮殘留標示物3-氨基-2-惡唑烷酮特異性抗體結合的包被抗原，試劑還包含3-氨基-2-惡唑烷酮標準溶液和3-氨基-2-惡唑烷酮抗體液，所說的3-氨基-2-惡唑烷酮抗體液是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。
2.根據權利要求1所述的一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述的包被抗原是由3-氨基-2-惡唑烷酮與對醛基苯甲酸反應，再與卵清蛋白偶聯的複合物。
3.根據權利要求1所述的一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述的人工免疫原是由3-氨基-2-惡唑烷酮與對醛基苯甲酸反應，再與牛血清蛋白偶聯的複合物。
4.根據權利要求1所述的一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於所述的3-氨基-2-惡唑烷酮標準溶液為3-氨基-2-惡唑烷酮與苯甲醛的衍生物。
5.權利要求1所述的試劑盒在呋喃唑酮殘留分析中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種適用於呋喃唑酮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒及其應用，屬於免疫化學分析技術領域。本發明所提供的試劑盒主要由3－氨基－2－惡唑烷酮(AOZ)特異性抗體、AOZ標準溶液、包被有AOZ與卵清蛋白複合物的酶標板組成。樣品處理經鹽酸水解，釋放AOZ，苯甲醛衍生過夜，MAX柱淨化，採用間接競爭ELISA方法檢測動物可食性組織如肝臟、肌肉中AOZ殘留。本發明的核心技術包括人工抗原的合成、抗體的製備、ELISA方法的建立、ELISA試劑盒的組裝等。本發明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、準確、廉價的優點，能同時快速檢測大批樣品，最低檢測限0.1μg/kg。
文檔編號G01N33/531GK1731185SQ20051008634
公開日2006年2月8日 申請日期2005年9月2日 優先權日2005年9月2日
發明者袁宗輝, 常超, 王玉蓮, 趙春保, 王帥兵, 高愛中, 陳冬梅, 陶燕飛, 伍金娥, 彭大鵬 申請人:華中農業大學