利用編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)序列對副溶血弧菌進行檢測、鑑定及計數的方法
2023-05-14 04:04:21
專利名稱:利用編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)序列對副溶血弧菌進行檢測、鑑定及計數的方法
發明詳述發明領域本發明涉及利用基因鑑定、檢驗微生物和病原微生物的領域；特別地，涉及檢驗副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的領域。本發明涉及一種快速鑑定並檢驗在夏季導致食物中毒的副溶血弧菌的方法，因此本發明的領域包括食品加工、公共衛生和臨床實驗室檢驗。
背景技術：
目前在食品衛生管理場所根據生化表型對副溶血弧菌進行檢驗。依據食品衛生檢驗指南，將受試樣品置於TCBS瓊脂基質上孵育及培養，獲得形成不能降解蔗糖的略呈綠色的藍色假定陽性菌落，在此略呈綠色的藍色菌落上進行各種試驗來鑑定其生物化學性質，對其加以驗證。然而，在食品生產管理場所進行這些鑑定生物化學性質的試驗存在許多問題，這是因為這些試驗需要熟練的技術，且耗時耗力。為了彌補這些鑑定生物化學性質試驗的不足，我們努力研發出一種利用基因準確、快速、簡單地檢測並鑑定副溶血弧菌的檢驗方法。
發明內容
到目前為止，已有下述的利用基因檢驗副溶血弧菌的檢驗方法，但是它們存在各種各樣的問題。
例如，有人設計PCR引物，通過鑑定編碼DNA促旋酶β亞基[日本專利公開號(Kokai)NO.09-252783，Applied and Environmentalmicrobiology，Vol.64，No.2，P.681-687]的靶gyrB基因來檢測副溶血弧菌。然而，其引物的製備基於這樣的假設對各菌株gyrB基因的序列分析結果顯示，副溶血弧菌株ATCC 17802和溶藻弧菌株ATCC17749間不同的序列中有部分序列是特異的。換句話說，並不是根據對以gyrB基因序列為基礎的弧菌屬系統發育關係的認識來製備引物，因而其特異性的範圍不明確。利用靶toxR基因進行PCR的檢測方法也見有報導，該基因是控制霍亂弧菌毒素基因的基因，它也存在於副溶血弧菌(Journal of Clinical Microbiology.1999 Vol.37 NO.4，p1173-1177)中。然而，與上述利用gyrB基因的檢測引物類似，通過將該門(phyla)內相距較遠的各株副溶血弧菌和各株霍亂弧菌株的基因序列加以比較，然後假設兩株間有差異的核苷酸序列中的部分序列為副溶血弧菌特異性序列，製備這種PCR引物。因此，這些引物也不是根據對以toxR基因為基礎的弧菌系統發育關係的認識來製備，其特異性的範圍仍不明確。另一方面，也有檢測方法注意到了副溶血弧菌毒素基因[日本專利申請公開號(Kokai)No.4-293486]。人們很久這前就認識到副溶血弧菌分為兩類一類含有在紅細胞膜上鑽孔導致出血(稱為神奈川現象(Kanagawa phenomenon))的毒素(耐熱的直接溶血素TDH)，另一類不含有這種毒素。除了TDH，最近還發現了一種稱為TRH(TDH相關溶血素TRH)的毒素，它與TDH非常相似，不導致神奈川現象但會導致腹瀉(1988Infect Immun.Vol.56，961-965)。已經研製了PCR引物，對編碼導致副溶血弧菌病原性的各毒素的tdh和trh基因進行特異性檢測(日本專利申請公開號(Kokai)No.4-293486)。然而，並非所有的副溶血弧菌組分都含有這樣的毒素基因。實際上環境中的大部分副溶血弧菌都沒有這樣的毒素基因。既然包括這些不含毒素基因的菌株在內的所有副溶血弧菌細胞計數在食品衛生控制時是重要的，食品衛生檢驗指南要求檢驗所有的副溶血弧菌，不論毒素存在與否。相應地，僅注意毒素產生能力的毒素基因檢測方法不符合基於生化試驗的標準方法，因而這樣的檢測方法不宜用作食品衛生管理中的檢測和鑑定方法。綜上所述，現有用於檢測和鑑定副溶血弧菌的引物不夠實用。
除這些檢測方法外，也有報導用其它方法檢測特異性存在於副溶血弧菌中的未知功能的0.76Kb DNA片段(Appl.Environ.Microbiol.61(4)1311-1317)或溶血因子，如tlh(熱不穩定的溶血素Lett ApplMicrobiol 1999.Vol.28，66-70)和σ-VPH(FEMS Microbiol Lett 1990；55(3)339-45)。然而，這些方法中沒有一種方法被證實能可靠的檢測副溶血弧菌，沒有一種方法能夠在評價場所得以準確的應用。
如上所述，沒有一種遺傳檢測方法考慮到細菌「物種(species)」是一個包含遺傳多樣性的總體，並將假定為特定細菌群體成員的菌株的核苷酸序列用作共同序列或代表性序列來設計PCR引物。但是，考慮到分子進化中快速積累的基因突變，尤其是中性突變，最初檢測到的菌株並不總是能檢測到。這是因為引物區的輕微突變會降低引物的適用性，從而使擴增受到抑制。而且，還得擔心可能發生錯誤鑑定。這是因為對密切相關物種間通過種系分析得到差別缺乏考慮，使引物設計缺少足夠的擴增特異性，以至於檢測到原本不是靶菌株的密切相關菌株。
因此，需要製備具有明確的特異性背景、低錯誤鑑定率和足夠實際擴增效率和特異性的高性能、特異性基因擴增引物，對副溶血弧菌進行檢測、鑑定並定量。
為了建立特異性檢測細菌特定種系的基因的方法，需要收集待檢測生物群體及與之種系發育密切關聯的生物群體中儘可能多的核苷酸序列，並加以比較。另外，用於特異性檢測的靶基因需具有足夠多的差異核苷酸序列，使之可以與最鄰近的親緣種屬區別開。因此，靶基因必須具有足夠快的進化速度。
另外，不能使用在水平方向上高頻率伸延、與種系發育相獨立的基因，如副溶血弧菌的毒素基因。本發明中用作靶分子的σ70因子為rpoD基因所編碼，是一種控制對數期細菌基因表達的因子，是細菌生存所必需的蛋白質。因此該因子用於種系分析是適當的，因為它幾乎不沿水平方向伸延(spread horizontally)，同時具有適當的進化速率(Int.J.Syst.Bacteriol.1998；48，813-819，Int.J.Syst.Bacteriol.1999；49，87-95)。
附圖簡述
圖1.基於rpoD基因序列的弧菌屬系統樹。
圖2.基於rpoD基因的來源於食物的副溶血弧菌樣菌落種系分析。
對通過直接測序方法得到的rpoD基因中約800bp的部分序列進行分析後，用鄰位相連法(NJ)構建系統樹。根據生物化學性質分析(依據食品衛生檢驗指南進行一級和二級鑑定試驗)定為副溶血弧菌的菌株描述為V.parahaemolyticus。如圖所示，副溶血弧菌所屬的種系群(phyletic group)表示為V.p，弧菌屬的其它種系群分成C1至C5。此處大腸桿菌株K12和霍亂弧菌的rpoD基因序列在GenBank資料庫中的登錄號為AE000388和AE004138。
圖3.弧菌屬rpoD基因的核苷酸序列在該門中的特異性信息。
本圖顯示了對V.p門和C1至C3(見圖1)的共有序列進行測定，並進行同源性分析後的結果。上方為V.p(副溶血弧菌所屬的門)，下方為C1到3門的共有序列。連續小*號指示的部分為與上方序列相同的序列。連續大·號指示的部分為副溶血弧菌特有的核苷酸。指示符號D＝A或G或T；H＝A或C或T；V＝A或C或G；R＝A或G；Y＝C或T，K＝G或T，M＝A或C，S＝G或C，W＝A或T，及N＝A或G或T或C。
本發明的最佳實施方式我們已研製出一種通過PCR直接測序法來測定編碼RNA聚合酶σ70因子的rpoD基因核苷酸序列的簡單方法[日本專利申請公開號(Kokai)NO.8-256798](表1)。
因此，利用該方法，我們測定了上述表1中所示弧菌屬[購自Institute for Fermentation，Osaka(IFO)]各標準株和副溶血弧菌原種菌株(含有及不合毒素基因的菌株)的rpoD基因核苷酸序列，從而闡明了其種系關係。特別地說，表1中所示的受試菌株在補充有2％NaCl的腦/心融合基質(NISSUI PHARMACEUTICAL Co.，Ltd)上於35℃培養生長過夜。用PUREGENE DNA分離試劑(Gentra SYSTEMS)從1ml培養溶液中提取染色體DNA。以提取出來的DNA為模板，用rpoD擴增通用引物[如日本專利申請公開號(Kokai)NO.8-256798所述的s70SACgACTgACCCggTACgCATgTAYATgMgNgARATgggNACNgT和s70RATAgAAATAACCAgACgTAAgTTNgCYTCNACCATYTCYTTYTT]，通過PCR方法擴增得到長約800bp的rpoD基因片段(位於大腸桿菌株K12的rpoD基因序列上334-1125處，對應於胺基酸序列的112-376處的區域)。擴增反應用耐熱DNA聚合酶(AmpliTap GoldApplied Biosystems)和GENE MATE熱循環儀(ISC BioExpress)進行。製備50μl含1μg DNA、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、0.01％明膠、0.2mM各種dNTP，2.5U AmpliTaq和1μM各種引物的反應溶液。反應條件為AmpliTap Gold活化(95℃10分鐘)，反應循環40次(94℃1分鐘，56℃1分鐘及72℃1分鐘)，然後進行延伸反應(72℃10分鐘)。所得PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠(Sea Plaque GTG瓊脂糖BioWhittaker Molecular Applications)電泳(0.5×TAE，100V 30分鐘)，然後溴化乙錠染色10分鐘。在紫外線照射下確認產物的存在，把它從膠上切下來，用Wizard PCR Preps DNA純化系統(Promega)純化，從而製備測序反應的模板。用預先加入上述作為通用rpoD基因引物的引物的測序序列[如日本專利申請公開號(Kokai)NO.8-256798所述的s70SACgACTgACCCggTACgCATgTA和s70RATAgAAATAACCAgACgTAAgTT]、ABI PRISM BigDye末端循環測序即用型反應試劑盒(Applied Biosystems)和Gene MATE熱循環儀(ISC BioExpress)進行測序反應。製備含20ng DNA和3.2pmol引物及8μl BigDye末端循環測序即用型反應混合物的反應溶液，使其終體積為20μl。循環測序反應包括92℃加熱10分鐘，然後96℃10秒鐘、58℃或46℃(分別對應於s70SACgACTgACCCggTACgCATgTA和s70RATAgAAATAACCAgACgTAAgTT)5秒鐘、60℃4分鐘，共25個循環。使用ABIPRISM 310基因分析儀(Applied Biosystems)進行核苷酸序列分析。利用ClustalW電腦程式對所獲得的核苷酸序列進行多重對比分析，然後以PHYLIP電腦程式包和Kimura’s 2-參數模型[J.Mol.Evol，(1980)Vol.16，No.2，p.111-20]計算的遺傳距離為基礎，通過鄰位相連法(Mol.Biol.Evol.Vol.4，No.4，406-425)構建系統樹。
結果，在弧菌屬的各菌株中，測定為含毒素基因(tdh或trh)的副溶血弧菌的所有菌株和一株標準株(IFO 12711T)共同組成弧菌屬菌株中一個獨立的單種系群(見圖1)。因此，結果表明屬於該門的細菌應該確定為副溶血弧菌。接下來，對於從食物樣品中分離出來、在TCBS瓊脂基質(NISSUI PHARMACEUTICAL Co.，Ltd)形成副溶血弧菌樣略呈綠色的藍色菌落的64株菌株，利用與標準株相似的步驟測定rpoD基因的核苷酸序列，然後進行種系分析。圖2列出了分析結果。所分析的64株中有11株與上述測定為副溶血弧菌的菌株同屬一門。為了核實基因分析的結果，依據食品檢驗指南所述一級及二級鑑定試驗來進行試驗，以鑑定其生物化學性質。特別地說，一級反應包括氧化酶各參數、TSI基質中的乳糖/蔗糖降解能力、葡萄糖降解時氣體產生能力、硫化氫產生能力、運動能力測定、SIM基質上的吲哚產生能力、吲哚丙酮酸產生能力、運動性確認、賴氨酸脫羧酶活性、伏-波試驗及鹽耐受試驗(0，3，7和10％的NaCl)；二級反應包括ONPG各參數、鳥氨酸脫羧酶活性、精氨酸脫水酶活性及各種糖(阿拉伯糖、麥芽糖、纖維糖、木糖、水楊苷、甘露醇、甘露糖、乳糖和蔗糖)的發酵能力。在一級鑑定試驗中，副溶血弧菌具有下列性質氧化酶，陽性；TSI基質中的乳糖/蔗糖降解能力，無降解；硫化氫，不產生；葡萄糖降解時氣體產生能力，無氣體產生；SIM基質上的吲哚產生能力，陽性；吲哚丙酮酸產生能力，陰性；運動性，陽性；賴氨酸脫羧酶活性，陽性；伏-波試驗，陰性；鹽耐受試驗(0，3，7和10％的NaCl)-，+，+和-。在二級鑑定試驗中，副溶血弧菌具有下列性質ONPG，陰性；鳥氨酸脫羧酶活性，陽性；精氨酸脫水酶活性，陰性；糖發酵能力(阿拉伯糖，陽性；麥芽糖，陽性；纖維糖，陰性；木糖，陰性；水楊苷，陰性；甘露醇，陽性；甘露糖，陽性；乳糖，陰性；蔗糖，陰性)。上述生物化學試驗顯示，對於來源於食物的、屬於副溶血弧菌門的、依據前面的rpoD基因分析而測定為副溶血弧菌的菌株來說，只有11株測定為副溶血弧菌。因此，可通過rpoD基因分析精確地區別和鑑定副溶血弧菌種群。
為了建立能夠只檢測副溶血弧菌組分的遺傳篩選方法，進行下列操作。首先，為了闡明密切相關物種間核苷酸序列的區別，將副溶血弧菌所屬門和其鄰近門的rpoD基因核苷酸序列加以比較，然後鑑定副溶血弧菌中保守但與其他屬於亞弧屬的細菌不同的核苷酸位置。特別地說，測定副溶血弧菌所屬種系群的共有序列，並與C-1至C-3的共有序列相比，其中C-1至C-3是如圖2所示亞弧菌屬的其他細菌種系群，在系統樹中與副溶血弧菌所屬門緊鄰。由此構建種系特異性信息(圖3)。圖中顯示，序列表中SEQ ID1的序列在33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735或798位的核苷酸在副溶血弧菌所屬門中是特徵性的。利用該門中包含這些特徵性核苷酸的特異性序列，可以設計具高特異性的探針及具有高度特異性和極好擴增效率的基因擴增引物。
例如，利用包含15個或更多連續核苷酸、含有與密切相關物種不同的核苷酸的rpoD基因核苷酸序列，引物可以設計成總是包含與密切相關物種不同的核苷酸位置，優選20或更多個核苷酸，更優選不少於20並且不超過40個核苷酸。類似的，利用包含15個或更多連續核苷酸、含有與密切相關物種不同的核苷酸的rpoD基因核苷酸序列，探針可以設計成總是包含與密切相關物種不同的核苷酸位置，優選20或更多個核苷酸，更優選不少於20並且不超過100個核苷酸。
另外，可優選高頻率包含上述與密切相關物種不同的核苷酸的區域來製備引物和探針，如包含259、261、264、267和270為核苷酸的區域，包含141、147和148位核苷酸的區域，包含192、198和204位核苷酸的區域，包含223、229和234位核苷酸的區域及包含594和597位核苷酸的區域。對於引物來說，3』端優選副溶血弧菌特異性的核苷酸。
本發明的基因擴增引物可用於檢測、定量測定或鑑定副溶血弧菌。本發明包括檢測、定量性測定或鑑定副溶血弧菌的試劑盒，該試劑盒包括這些引物和探針及其他試劑的組合。
表1、所用的菌株列表副溶血弧菌 IFO 12711 T溶藻弧菌 IFO 15630 T溶蛋白弧菌 IFO 13287 T海蛹弧菌 IFO 15637 T弧菌屬標準株 8株坎氏弧菌 IFO 15631 T哈氏弧菌 IFO 15634 T鯊魚弧菌 IFO 15632 T塔氏弧菌 IFO 15644 TV89-655 O3K6 TRH+V89-056 O4K8 TDH+V99-157 O1K56 TDH+副溶血弧菌原種株 來源於人的13株 V99-161 O4K11 TDH+V99-177 O4K8 TDH+V99-215 O3K6 TDH+V99-223 O4K9 TDH+來源於食物 不產生毒素的菌株6株從TCBS基質分離的菌株 64株 來源於食物總計 85株實施例現以實施例的方式進一步說明本發明。但是，實施例代表本發明的實施方案，而不對本發明作任何限制。
利用表2所示檢測和鑑定副溶血弧菌的引物，通過PCR方法嘗試對副溶血弧菌的特異性檢測。另外，權利要求
10-15所述引物分別為F1、F2、F5、F6、R1和R2。以如表1所示受試菌株中提取出來的染色體DNA作為模板。表2顯示了所用引物的相關細節。利用ABIPRISM BigDye末端循環測序即用型反應試劑盒(AppliedBiosystems)和Gene MATE熱循環儀(ISC BioExpress)進行擴增反應。製備含0.1μg DNA、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mMMgCl2、0.01％明膠、dNTP(各0.2mM)，2.5U AmpliTaq及引物的反應溶液，使其終體積為20μl。反應條件為用AmpliTap Gold活化(95℃ 10分鐘)、94℃ 1分鐘35～40個循環、退火1分鐘(溫度見表3)、72℃ 1分鐘，然後72℃延伸反應10分鐘。表3列出了引物組合及擴增反應條件。擴增後取5μl反應溶液進行2％瓊脂糖凝膠(瓊脂糖SNIPPON GENE CO.，LTD)電泳(0.5×TAE，100V 30分鐘)，溴化乙錠染色10分鐘，在紫外線照射下確認所擴增的rpoD基因產物的存在與否。
利用4種正義引物和2種反義引物的共8種引物組合，篩選受試菌株。這樣，只有屬於確定為副溶血弧菌門的DNA顯示陽性結果(表4)。
表2用於特異性檢測副溶血弧菌的引物引物 序列 長度 位置a方向F1 agarcttcgtctgactgatt 20 129-148 正義F2 aagaagacctagaagatgat 20 251-270 正義F5 cagcwgcgccaaccgcgact 20 185-204 正義F6 ctgarctgtctgaarctcaa 20 215-234 正義R1 gttaccagtgaatagggca 19 609-591 反義R2 attcgttaccagtgaatagg 20 613-594 反義a.指SEQ所代表之核苷酸序列中從5』端起始的位置。
表3用於特異性檢測副溶血弧菌之引物的PCR條件PCR條件正義引物 反義引物 擴增產物(bp)退火溫度(℃) 循環數 引物濃度(mM)F1 R1 483 58 35 0.1F2 R1 361 56 40 0.1F5 R1 427 64 40 0.1F6 R1 397 60 35 0.1F1 R2 485 58 40 0.1F2 R2 365 60 40 0.5F5 R2 431 60 40 0.1F6 R2 401 56 40 0.1
表4利用特異性檢測副溶血弧菌的引物的PCR結果
表4利用特異性檢測副溶血弧菌之引物的PCR結果
表4利用特異性檢測副溶血弧菌之引物的PCR結果
工業適用性就檢測的準確性來說，本發明的rpoD基因引物和探針是優秀的。這是因為它們的設計基於對副溶血弧菌種系關係的徹底認識，通過這種認識對如何提高特異性進行了研究。因此，在細菌不從食物中分離及同屬細菌物種共存的條件下，rpoD基因引物和探針用於直接檢測有著巨大優勢。
序列表說明SEQ ID No.s 9～12為引物。
於2001年8月3在日本專利局提交、要求享有優先權、專利申請號為2001-235806的說明書內容，包括權利要求
書和附圖，在該說明書中引入作為參考。
序 列 表110Nichirei Corporation120副溶血弧菌的鑑定130PH-1546-PCT140
141
16012170PatentIn Ver.2.12101211807212DNA213副溶血弧菌4001actcgcraag gcgaaatcga catcgcaaaa cgcattgaag aaggtattaa ccaagttcaa 60tcgtctgttg ctgaataccc tggcactatt ccttacatcc tagagcaatt tgataargtt 120caggcagaag arcttcgtct gactgattta atctctggct ttgtagatcc tgacgctgac 180gatacagcwg cgccaaccgc gactcacatc ggttctgarc tgtctgaarc tcaattagaa 240gaggaagacg aagaagacct agaagatgat gaagaragcg atgacgattc agatgaytcr 300gaagaagatg taggtattga yccagagctr gcgcttgaga aattcaacca gctacgcagc 360acataccaaa atcttcagct agcgatcaat gagtacggct acgacagccc gaaagcaacc 420gttgctaacg aaatgatgct rgacgtattc aaagaattcc gtctaacacc aaaacagttc 480gaccacctag tgaacgaact tcgyacwgca atggatcgcg ttcgtactca agaacgtttg 540atcatgaagt ctgtggttga atacggcaaa atgccgaaga aatcgttyat tgccctattc 600actggtaacg aatcaagtga tgcatggcta gacgagatcc tmgcatctga caagccatac 660gctgagaaaa tcaaacgtaa cgaagaagag atccgtcgtt caatckckaa gttaaaaatg 720attgaagaag agacatmtct aaacgtacar aacattaaag acatcagccg tcgcatgtct 780atcggtgaag cgaaagcacg ccgtgcg 8072102211807212DNA213人工序列220
223人工序列的描述除溶血弧菌外的水生弧菌的共有序列
4002actcgcgaag gcgaaatcga catcgcaaaa cgtattgaag aaggtattaa ccaagttcaa 60tcgtctgttg ctgaataccc wggyacdaty ccrtacatyc ttgagcartt tgayaargtw 120caagcwgaag aaytdcgtct wacwgacctw atytcwgght ttgthgaycc wgaygchgay 180gayacvrcwg chccracrgc racrcacaty ggttctgarc tractgaatc tcagytagaa 240gawgaagayg awgaagacgt tgatgamgac gaagawrgyg aygayrrykm wgatgahdcw 300gargaagatg twggtatyga yccwgarytd gcgctwgaga aattcaacca rctacgcagy 360acvtaycaaa aycttcaryt wgcaatcaac garyacggyt ayravagycc kaaagcracm 420gtwgcwaayg arwtgatgct agacgtatty mrmgarttyc gtctracrcc waaacagtty 480gaycacytag traaygaayt rcgyacnkcd atggatcgyg ttcgtacwca agarcgyytg 540atcatgaark cwryngttga atacggcaaa atgccgaaga aatcrttyat ygcrctgtty 600acwggyaayg aatcwashga wgcwtggytr gatgarrtyy twkcwtcwga yaagccatac 660gctgaraara tyaaacgtar cgaagaagar atycgycgyt caatcrctaa rctaaaratg 720attgarrahg aracytmtct rammgtwcar aacatyaaag acatcagccg tcgyatgtmt 780atcggtgaag craaagmkcg ycgtgck 807210321120212DNA213副溶血弧菌4003agarcttcgt ctgactgatt 20210421120212DNA213副溶血弧菌4004aagaagacct agaagatgat 20210521120212DNA213副溶血弧菌4005cagcwgcgcc aaccgcgact 20210621120212DNA
213副溶血弧菌4006ctgarctgtc tgaarctcaa 20210721119212DNA213副溶血弧菌4007gttaccagtg aatagggca 19210821120212DNA213副溶血弧菌4008attcgttacc agtgaatagg 20210921144212DNA213人工序列4009acgactgacc cggtacgcat gtayatgmgn garatgggna cngt 442101021123212DNA213人工序列40010acgactgacc cggtacgcat gta 232101121144212DNA213人工序列40011atagaaataa ccagacgtaa gttngcytcn accatytcyt tytt 44
2101221123212DNA213人工序列40012a tagaaa taa ccagacgtaa gtt 2345/5
權利要求
1.SEQ ID NO1所表示的基因片段，該片段可用於設計特異性基因擴增引物或探針，包括序列表中SEQ ID NO1的編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)中的，為副溶血弧菌組群所特有的，第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
2.一種基因擴增引物，它包含由15或更多個連續核苷酸組成的鏈，或其相應的互補鏈，所述核苷酸包括序列表中SEQ ID NO1的編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)中的，為副溶血弧菌組群所特有的，第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
3.權利要求
2的基因擴增引物，它使用高頻率地包含權利要求
2中列舉的副溶血弧菌所特有的位置的區域。
4.權利要求
3的基因擴增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第259、261、264、267和270位核苷酸的鏈，或其互補鏈。
5.權利要求
3的基因擴增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第141、147和148位核苷酸的鏈，或其互補鏈
6.權利要求
3的基因擴增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第192、198和204位核苷酸的鏈，或其互補鏈。
7.權利要求
3的基因擴增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第223、229和234位核苷酸的鏈，或其互補鏈。
8.權利要求
3的基因擴增引物，其包含一條含有序列表中SEQ IDNO1的第594和597位核苷酸的鏈，或其互補鏈。
9.權利要求
2的基因擴增引物，其中3』端的核苷酸為副溶血弧菌特有的核苷酸，其位置是權利要求
2中列舉的位置。
10.權利要求
2的基因擴增引物，其包括5』-agarcttcgtctgactgatt-3』，或其相應的互補鏈。
11.權利要求
2的基因擴增引物，其包括5』-aagaagacctagaagatgat-3』，或其相應的互補鏈。
12.權利要求
2的基因擴增引物，其包括5』-cagcwgcgccaaccgcgact-3』，或其相應的互補鏈。
13.權利要求
2的基因擴增引物，其包括5』-ctgarctgtctgaarctcaa-3』，或其相應的互補鏈。
14.權利要求
2的基因擴增引物，其包括5』-gttaccagtgaatagggca-3』，或其相應的互補鏈。
15.權利要求
2的基因擴增引物，其包括5』-attcgttaccagtgaatagg-3』，或其相應的互補鏈。
16.一種檢測、定量測定或鑑定副溶血弧菌的方法，該方法利用了權利要求
2-15中任一項的引物。
17.一種試劑盒，其包含權利要求
2-15中任一項的引物。
18.一種檢測、定量測定或鑑定副溶血弧菌的探針，它包含15或更多個連續核苷酸，這些核苷酸包括序列表中SEQ ID NO1的編碼RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)中的，為副溶血弧菌組群所特有的，第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
專利摘要
製備用於檢測、定量測定或鑑定副溶血弧菌的高性能、特異性基因擴增引物，該引物錯誤鑑定率低，在實際應用中具有足夠高的擴增效率及擴增特異性。發明人測定了弧菌屬各標準株和副溶血弧菌原種菌株(含有及不含毒素基因的菌株)的rpoD基因核苷酸序列；闡明了其種系關係，並鑑定了其中的特徵性核苷酸，因而能夠設計包含它們且具有高度特異性的探針，及具有高度特異性和良好擴增效率的基因擴增引物。
文檔編號C12N9/12GKCN1564872SQ02819672
公開日2005年1月12日 申請日期2002年8月1日
發明者小泉雄史, 山本敏, 伊藤武, 中川弘 申請人:株式會社日冷導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan