口蹄疫純化疫苗及其製備方法和應用的製作方法
2023-05-13 21:29:46
專利名稱：口蹄疫純化疫苗及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種口蹄疫疫苗及其製備方法，特別涉及一種口蹄疫純化疫苗的製備方法及由該製備方法得到的口蹄疫純化疫苗，還涉及得到的口蹄疫疫苗在製備預防動物口蹄疫藥物中的應用。屬於疫苗製備領域。
背景技術：
隨著家畜集約化養殖水平的提高，尤其是奶牛飼養量的增大，疫苗的輕微副反應，就可帶來巨大的經濟損失，如懷孕牛流產、泌乳牛產奶量下降、乳品質下降等，無任何副反應的疫苗在市場上有巨大的需求空間。現有的口蹄疫滅活疫苗主要存在以下兩個問題1.免疫保護力不穩定，主要表現在免疫後檢測不到中和抗體或者抗體水平很低，或者免疫期較短，只有2 3個月；2.免疫副反應大，主要是下遊生產工藝仍為傳統方法，未經純化處理，疫苗中存在一些培養基和宿主細胞中的雜質及過敏性物質，而且有效抗原含量低。這對口蹄疫的免疫防控工作帶來極大的影響。近些年來，國內外關於疫苗分離純化的研究群雄並起，異軍突起，成績斐然。在人用生物製品中，通過FDA認證的疫苗已有上百種，而正在研製開發中的疫苗達數千種之多，有關疫苗研究的科學論文和專利幾乎都涉及到分離純化技術，近年來這類文獻呈現指數增長態勢。但分離純化技術仍未在獸用疫苗的生產中得到應用。隨著我國畜牧業的發展，人們對獸用疫苗純度和安全性等提出更高要求。疫苗的分離純化主要是去除培養基和宿主細胞中的雜蛋白、肽、核酸及汙染菌和它產生的內毒素，傳統的蔗糖密度梯度離心法、沉澱和過濾技術在疫苗的抗原純化中仍被普遍採用，但絕大部分是簡單分離得到的粗製疫苗，其中抗原含量較低，且可能含有一些雜質和過敏性物質，這些傳統疫苗的處理方法一般均存在純度、活力以及安全性偏低，不適合應用於規模化生產等缺點，滿足不了新疫苗的研製和生產的需要。疫苗的純化以層析法提純最為可靠，目前應用的領域僅限於人用生物製品，如B肝、狂犬、出血熱、流感、小兒麻痺疫苗等少數一些病毒性疫苗的研究和生產中。國內外尚未有用層析技術進行獸用疫苗純化的報導。本項目發明技術的突破，不僅提高我國動物疫苗生產工藝水平和疫苗質量，推動我國獸用疫苗行業的發展，而且將促使我國從疫苗生產大國向疫苗生產強國發展，合乎世界生物製藥發展趨勢，具有廣闊的應用前景。
發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種製備口蹄疫純化疫苗的方法，本發明的一種口蹄疫純化疫苗的製備方法，其特徵在於包括將經過細胞懸浮培養的口蹄疫病毒液中的細胞碎片去除後，濃縮至適當倍數，用硫酸魚精蛋白沉澱去除大部分宿主細胞雜蛋白和核酸，離心，上清液通過聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠柱層析進行洗脫，收集第一個洗脫峰，過濾除菌後滅活，加入佐劑進行乳化，分裝即得。本發明所述的製備方法，其特徵在於具體的包括以下步驟(I)將口蹄疫病毒種毒接種懸浮培養的BHK21細胞，繼續懸浮培養15 28小時；(2)收穫經過BHK21細胞懸浮培養的口蹄疫病毒，通過微孔過濾系統去除細胞碎片，得到微濾液；(3)微濾液濃縮至微濾液原體積的1/10-1/100，得到微濾液的濃縮液；(4)向步驟(3)得到的濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度達到1. Omg/ml 2. 5mg/ml的，室溫(25°C )攪拌0. 5h 2. Oh,靜置作用0. 5h 2. Oh後，5000rpm IOOOOrpm離心15min 60min,棄沉澱,取離心上清,得到濃縮口蹄疫病毒上清液；
·
(5)將聚丙烯醯胺葡凝膠裝入層析柱，用I 2倍柱體積的PH7. 4 8. O的0. OlM的磷酸鹽緩衝液平衡該層析柱，將步驟(4)離心獲得的濃縮口蹄疫病毒上清液加於該聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠上面，待病毒液全部進入凝膠之後，再用PH7. 4 8. O的0. OIM磷酸鹽緩衝液進行洗脫；(6)收集第一個洗脫峰，過濾除菌後用ImM 3mM的BEI 30°C滅活28小時，滅活液經2 10倍稀釋後(用PH7. 4 8. 0的0. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋，具體實施例中有記載)，按1:1重量比加礦物油佐劑乳化，分裝得口蹄疫純化疫苗。在本發明中，所述的口蹄疫病毒毒株為口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一種。這是因為本發明的口蹄疫病毒的柱層析純化方法的根據是完整口蹄疫病毒粒子大小，而口蹄疫病毒各型毒株的完整口蹄疫病毒粒子大小是一樣的，因而口蹄疫病毒各種血清型疫苗毒株均可採用本發明的方法進行純化疫苗的製備。在本發明的具體實施例中，所述的口蹄疫病毒毒株為0型口蹄疫毒種0NXC/92株(口蹄疫病毒0型-Asia I型二價滅活疫苗毒種種子批的建立(I)，徐春河等，中國畜牧獸醫學會口蹄疫學分會第i^一次學術研討會會議論文)、亞洲I型毒種Asial/JSL/GSZY/06株(口蹄疫0型、Asia I型二價滅活疫苗的研製與應用，黃炯，獸醫導刊，2009年06期)、0型口蹄疫毒種0R/80株(豬口蹄疫0型滅活疫苗(50)效檢攻毒方式探索，郎洪武等，《中國獸藥雜誌》2004年03期)或0型口蹄疫毒種0/ZK/93-08株(豬口蹄疫0型滅活疫苗0ZK/93株與0ZK/93株+0S/99株免疫效果對比試驗，徐新紅等，飼料與畜牧 規模養豬2010，(9))。所述的毒種——0型口蹄疫毒種0NXC/92株、亞洲I型毒種Asial/JSL/GSZY/06株、0型口蹄疫毒種0R/80株或0型口蹄疫毒種0/ZK/93-08株購買自蘭州獸醫研究所。在本發明的具體實施例中，所述的微孔過濾系統優選孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的濾芯一起聯合使用，或者5微米，I微米和0. 45微米的振動篩一起聯合使用，或者5微米，I微米和0. 45微米中空纖維柱一起聯合使用。在本發明的具體實施例中，步驟(3)中所述的濃縮為使用PEG6000進行病毒沉澱濃縮或者使用截留分子量為6kd-20kd的中空纖維柱或者截留分子量為6kd-20kd的膜包進行濃縮。在本發明的具體實施例中，所述的聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠為組分收集範圍為1.0X104 1. OX IO8球蛋白分子量的高解析度的聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠。更優選為組分收集範圍為1. OX IO4 1. 5X IO6球蛋白分子量的高解析度的聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠。所述的聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠包括但不限於sephacryl S_300、sephacryl S-400或sephacrylS-500。更優選為 sephacryl S-300。硫酸魚精蛋白(貨號p4380)，BEI，均為sigma公司產品；206佐劑購自法國S印pic公司；PEG6000購自AMRESC0公司。空柱XK26 ;凝膠介質填料s印hacryl S-300, sephacrylS-400及s印hacryl S-500均為GE公司產品。本發明所要解決的第二個技術問題是提供由以上所述的製備方法製備得到的口
蹄疫純化疫苗。本發明所要解決的第三個技術問題是提供有本發明方法製備得到的口蹄疫純化疫苗在製備預防動物口蹄疫疾病藥物中的應用。
本發明的口蹄疫純化疫苗的製備方法，通過將口蹄疫病毒接種懸浮培養的BHK21細胞，收穫後去除細胞碎片，適當濃縮後，用硫酸魚精蛋白沉澱去除大部分宿主細胞雜蛋白和核酸，離心，取離心上清作為層析上樣樣品，層析介質聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠經濟高效、處理量大，化學穩定性高，耐受性好，非常適合工業化使用，且成本低，工藝簡單、合理，可有效去除宿主細胞和培養基中的雜質，雜蛋白和核酸去除率大於90%，病毒回收率大於85%，由本發明方法製備得到的口蹄疫純化滅活疫苗安全，免疫性好、性質穩定。
圖1為使用Sepharose 4FF得到的層析圖譜；圖2為使用Sepharose 6FF得到的層析圖譜；圖3為使用DEAE Sepharose得到的層析圖譜；圖4為使用Sephacryl S-500得到的層析圖譜；圖5為使用Sephacryl S-400得到的層析圖譜；圖6為使用S印hacryl S-300得到的層析圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例1牛口蹄疫二價滅活純化疫苗(0NXC株+JSL株)的製備I 材料1.1疫苗毒株製造本品用0型口蹄疫滅活疫苗生產用毒種為0NXC/92株以及亞洲I型口蹄疫滅活疫苗生產用毒種為Asial/JSL/GSZY/06株購買自蘭州獸醫研究所。1. 2化學試劑BHK21細胞為本實驗按照現有常規方法製備，保藏；硫酸魚精蛋白(貨號p4380)，sigma公司產品；206佐劑購自法國S印pic公司。1. 3層析柱與凝膠介質凝膠介質填料sephacryl S-300、空柱XK26均為GE公司
女口
廣叩；1. 4微孔過濾系統孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的濾芯一起聯合使用，上海金科過濾器材有限公司產品。
1. 5濃縮系統截留分子量為IOkd的膜包，德國賽多利斯公司製造。2 方法(I)將口蹄疫病毒種毒0NXC/92株、Asial/JSL/GSZY/06株分別接種懸浮培養的BHK21細胞，繼續培養20小時。 (2)分別收穫經過BHK21細胞懸浮培養的口蹄疫病毒0NXC/92、Asial/JSL/GSZY/06,分別通過孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的濾芯去除細胞碎片，得到口蹄疫病毒0NXC/92、Asial/JSL/GSZY/06 的微濾液。(3)步驟(2)得到的微濾液分別用膜包超濾濃縮系統濃縮至原體積的1/40。(4)分別向步驟(3)得到的微濾液的超濾濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度為1. Omg/ml，室溫攪拌0. 5h，靜置作用Ih後，7000rpm離心30min，棄沉澱， 取離心上清。(5)將sephacryl S-300凝膠裝入層析柱，用2倍柱體積的PH7. 4 8. O的0. OlM的磷酸鹽緩衝液平衡層析柱，將離心獲得的該兩種濃縮口蹄疫病毒液分別各自加於sephacryl S-300凝膠上面，待病毒液全部進入凝膠之後，再用PH7. 4 8. O的0. OlM磷酸鹽緩衝液進行洗脫。(6)分別收集第一個洗脫峰，過濾除菌後分別用3mM的BEI (BEA加0. 2N的氫氧化鈉的作用下環化生成BEI。) 30°C滅活28小時，滅活0NXC/92株和Asial/JSL/GSZY/06株抗原液按1:1體積比混合，用PH7. 4 8. O的0. OlM磷酸鹽緩衝液進行4倍稀釋後，再按I I重量比加206佐劑乳化，分裝得牛口蹄疫二價滅活純化疫苗。實施例2豬口蹄疫O型滅活純化疫苗(0R/80株+0/ZK/93-08株)的製備I 材料1.1疫苗毒株製造本品用口蹄疫毒種為O型口蹄疫滅活疫苗生產用毒種0R/80株和O型口蹄疫滅活疫苗生產用毒種0/ZK/93-08株購買自蘭州獸醫研究所。1. 2化學試劑BHK21細胞為本實驗按照現有常規方法製備，保藏；硫酸魚精蛋白(貨號p4380)，sigma公司產品；206佐劑購自法國S印pic公司。1. 3層析柱與凝膠介質空柱XK26 ;凝膠介質填料sephacryl S-300均為GE公司
女口
廣叩；1. 4微孔過濾系統孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的中空纖維柱一起聯合使用，天津愛生膜過濾技術有限公司產品。1. 5濃縮系統截留分子量為6-10kd的中空纖維柱，天津愛生膜過濾技術有限公司產品。2 方法(I)將口蹄疫病毒種毒0R/80株和0/ZK/93-08株分別接種懸浮培養的BHK21細胞，繼續培養25小時。(2)分別收穫經過BHK21細胞懸浮培養的口蹄疫病毒，通過孔徑為5微米、I微米和0. 45微米的中空纖維柱去除細胞碎片，分別得到口蹄疫病毒種毒0R/80和0/ZK/93-08的微濾液。(3)步驟(2)得到的微濾液分別用中空纖維柱超濾濃縮系統濃縮至原體積的1/60。
(4)分別向步驟(3)得到的微濾液的超濾濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度為2. Omg/ml，室溫攪拌1. 5h，靜置作用0. 5h後，IOOOOrpm離心15min，棄沉澱，取離心上清。(5)將s印hacryl S-300裝入層析柱，用2倍柱體積的PH7. 4 8. O的0. OlM的磷酸鹽緩衝液平衡層析柱，將離心獲得的濃縮口蹄疫病毒離心上清液分別各自加於凝膠上面，待病毒液全部進入凝膠之後，再用PH7. 4 8. O的0. OlM磷酸鹽緩衝液進行洗脫。(6)分別收集第一個洗脫峰，過濾除菌後分別用2. OmM的BEI (BEA加0. 2N的氫氧化鈉的作用下環化生成BEI。)30°C滅活28小時，滅活0R/80株和0/ZK/93-08株抗原按I I體積比混合，用PH7. 4 8. 0的0. OlM磷酸鹽緩衝液進行5倍稀釋後，再按1:1重量比加206佐劑乳化，分裝得豬口蹄疫0型滅活純化疫苗。實施例3豬口蹄疫0型滅活純化疫苗(0R/80株+0/ZK/93-08株)的製備
I 材料1.1疫苗毒株製造本品用口蹄疫毒種為0型口蹄疫滅活疫苗生產用毒種0R/80株和0型口蹄疫滅活疫苗生產用毒種0/ZK/93-08株購買自蘭州獸醫研究所。1. 2化學試劑BHK21細胞為本實驗按照現有常規方法製備，保藏；硫酸魚精蛋白(貨號P4380)，8￡八，均為sigma公司產品;206佐劑購自法國S印pic公司；PEG6000購自AMRESCO 公司。1. 3層析柱與凝膠介質空柱XK26 ;凝膠介質填料sephacryl S-300均為GE公司
女口
廣叩；1. 4微孔過濾系統孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的中空纖維柱一起聯合使用，天津愛生膜過濾技術有限公司產品。2 方法(I)將口蹄疫病毒種毒0R/80株和0/ZK/93-08株分別接種懸浮培養的BHK21細胞，繼續培養28小時。(2)分別收穫經過BHK21細胞懸浮培養的口蹄疫病毒，通過孔徑為5微米、I微米和0. 45微米的中空纖維柱去除細胞碎片，分別得到口蹄疫病毒種毒0R/80和0/ZK/93-08的微濾液。(3)按質量體積百分比(g/ml)計，分別向步驟⑵得到的微濾液中加入NaCl，使得NaCl的終濃度為4% (即每IOOml微濾液中所加入的NaCl質量為4g)，充分溶解後加A PEG6000,使得PEG6000終濃度為8% (即每IOOml微濾液中所加入的PEG6000的質量為8g)，4°C下攪拌混合16h，7000rpm高速離心1. 5h，獲得口蹄疫病毒沉澱，使用TEN緩衝液(0. OlM Tris, 0. OlM EDTA，0.1M NaCl，PH為7. 6-8. 0)重懸病毒沉澱，得到濃縮至原體積的1/80的病毒濃縮液；(4)分別向步驟(3)得到的微濾液的超濾濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度為1. 5mg/ml，室溫攪拌lh，靜置作用0. 5h後，7000rpm離心45min，棄沉澱，取離心上清。(5)將s印hacryl S-300裝入層析柱，用2倍柱體積的PH7. 4 8. O的0. OlM的磷酸鹽緩衝液平衡層析柱，將離心獲得的濃縮口蹄疫病毒離心上清液分別各自加於凝膠上面，待病毒液全部進入凝膠之後，再用PH7. 4 8. O的0. OlM磷酸鹽緩衝液進行洗脫。
(6)分別收集第一個洗脫峰，過濾除菌後分別用2. OmM的BEI (BEA加0. 2N的氫氧化鈉的作用下環化生成BEI。)30°C滅活28小時，滅活0R/80株和0/ZK/93-08株抗原按I I體積比混合，用PH7. 4 8. 0的0. OlM磷酸鹽緩衝液進行7倍稀釋後，再按1:1重量比加206佐劑乳化，分裝得豬口蹄疫0型滅活純化疫苗。實施例4疫苗檢測將實施例1製備得到的牛口蹄疫二價滅活純化疫苗(0NXC株+JSL株)(內部批號2011RD001)用於以下檢測攻擊用毒種為0型口蹄疫毒種0NXC/92株，亞洲I型毒種Asial/JSL/GSZY/06株的同源鼠毒毒株購買自蘭州獸醫研究所。對照疫苗口蹄疫0型、亞洲I型二價滅活疫苗(0NXC株+JSL株)，生產批號20110202，生產日期20110322，為內蒙古必威安泰生物科技有限公司產品。以對照疫苗為參照，在按照現有農業部組織擬定的《口蹄疫0型、亞洲I型二價滅活疫苗製造及檢驗試行規程》進行物理性狀、無菌檢驗、安全檢驗、效力檢驗的基礎上，效力檢驗按照每頭份Iml免疫，同時增加了對奶牛泌乳量的影響的試驗。I物理性狀牛口蹄疫二價滅活純化疫苗物理性狀檢驗結果見表I。表I物理性狀檢驗結果
權利要求
1.一種口蹄疫純化疫苗的製備方法，其特徵在於包括以下步驟將經過細胞懸浮培養的口蹄疫病毒液中的細胞碎片去除後，濃縮至適當倍數，用硫酸魚精蛋白沉澱去除大部分宿主細胞雜蛋白和核酸，離心，上清液通過聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠柱層析進行洗脫，收集第一個洗脫峰，過濾除菌後滅活，加入佐劑進行乳化，分裝即得。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於具體包括以下步驟 (1)將口蹄疫病毒種毒接種懸浮培養的BHK21細胞，繼續懸浮培養15 28小時； (2)收穫經過BHK21細胞懸浮培養的口蹄疫病毒，通過微孔過濾系統去除細胞碎片，得到微濾液； (3)微濾液濃縮至微濾液原體積的1/10 1/100，得到微濾液的濃縮液； (4)向步驟(3)得到的濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度達到1. Omg/ml 2. 5mg/ml,室溫攬祥O. 5h 2. Oh,靜置作用O. 5h 2. Oh後，5000rpm IOOOOrpm離心15min 60min,棄沉澱,取離心上清,得到濃縮口蹄疫病毒上清液； (5)將聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠裝入層析柱，用I 2倍柱體積的PH7.4 8. O的O. OlM的磷酸鹽緩衝液平衡層析柱，將步驟(4)離心獲得的濃縮口蹄疫病毒上清液加於聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠上面，待病毒液全部進入凝膠之後，再用PH7. 4 8. O的O. OlM磷酸鹽緩衝液進行洗脫； (6)收集第一個洗脫峰，過濾除菌後用ImM 3mM的BEI30°C滅活28小時，滅活液經2-10倍稀釋後，按1:1重量比加礦物油佐劑乳化，分裝得口蹄疫滅活疫苗。
3.如權利要求1或2所述的製備方法，其特徵在於所述的口蹄疫病毒毒株為口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一種。
4.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)中所述的微孔過濾系統為孔徑為5微米，I微米和O. 45微米的濾芯一起聯合使用或者孔徑為5微米，I微米和O. 45微米的振動篩一起聯合使用，或者孔徑為5微米，I微米和O. 45微米中空纖維柱一起聯合使用。
5.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)中所述的濃縮為使用PEG6000進行病毒沉澱濃縮或者使用截留分子量為6kd-20kd的中空纖維柱或者截留分子量為6kd-20kd的膜包進行濃縮。
6.如權利要求1或2所述的製備方法，其特徵在於所述的聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠為組分收集範圍為1. OXIO4 1. OXIO8球蛋白分子量的高解析度聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠。
7.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於所述的高解析度的聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠組分收集範圍為1. OX IO4 1. 5X IO6球蛋白分子量。
8.由權利要求1-7任一項所述的製備方法製備得到的口蹄疫純化疫苗。
9.權利要求8所述的口蹄疫純化疫苗在製備預防動物口蹄疫疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種口蹄疫純化疫苗及其製備方法和應用，本發明的製備方法首先用硫酸魚精蛋白沉澱去除大部分宿主細胞雜蛋白和核酸；然後病毒液經濃縮系統濃縮後作為層析上樣樣品。層析介質選用聚丙烯醯胺葡聚糖凝膠進行純化洗脫，收集第一個洗脫峰，過濾除菌後滅活，加入佐劑進行乳化，分裝即得口蹄疫純化疫苗。本發明的製備方法經濟高效、且成本低，工藝簡單、合理，能有效去除宿主細胞和培養基中的雜質，病毒回收率大於85％，蛋白和核酸去除率大於90％，由本發明方法製備得到的口蹄疫純化疫苗安全，免疫性好、性質穩定。
文檔編號C12N7/02GK102988970SQ201110275159
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者徐樹蘭, 張海豔, 李少英, 趙炳武, 辛俊寶, 張澍, 王欽富, 武華 申請人:內蒙古必威安泰生物科技有限公司