一種以黏著斑激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法及應用的製作方法

2023-05-14 02:23:06 2

專利名稱：一種以黏著斑激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域。
背景技術：
儘管手術和放化療可以在最初階段有效地控制許多癌症，但是轉移性腫瘤的疾病 預後很差。腫瘤轉移是癌症患者最常見的死因，其中90%的癌症患者死於惡性腫瘤的轉移。 目前抗腫瘤藥物基本都是以腫瘤生長為靶點，而抑制腫瘤的生長或者促進腫瘤的凋亡或壞 死並不能抑制腫瘤的轉移。抑制腫瘤轉移是提高腫瘤患者生存率的關鍵。因此，研究抗腫 瘤轉移的藥物是目前腫瘤患者所急需，同時也是抗腫瘤藥物研究的難點，目前臨床上尚未 有抗腫瘤轉移藥物。黏著斑激酶(Focal Adhesion Kinase, FAK)是一種非受體型蛋白質酪氨酸激酶， 1992年被鑑定為是一種與癌基因v-Src相關的高度磷酸化的蛋白，它定位在細胞富含整合 素的黏著斑區域[Ding GS等，1987，Clin Ther 9 :345_357]。FAK參與組織和調控細胞黏著 斑結構，並在由整合素(Integrin)介導的細胞信號傳導通路中起關鍵作用，是細胞生存、 生長、增殖和運動等生理功能的重要調控者。FAK與腫瘤細胞增殖與轉移關係密切。有證據表明，FAK在腫瘤細胞的生長增殖 過程起重要作用。例如，在Ifep3細胞中用FRNK( —種內源性的FAK可變剪切轉錄產物、能 夠競爭並抑制FAK的活性)抑制FAK表達，能抑制腫瘤細胞的增殖[Parsons JT等，2003， 116:1409-1416]。FAK首先是從轉染了 v-src癌基因的細胞中分離出來的[Ilic D等， 1995,377:539-544]。到目前為止，FAK被發現在一些不同腫瘤中的表達水平提高，包括 乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、甲狀腺腫瘤、卵巢癌、間充質腫瘤、成神經細胞瘤、胰腺癌、宮頸 癌、骨肉瘤、腎癌、肺癌、消化道癌、腦瘤、黑色素瘤、口腔癌、甲狀腺癌、頭頸癌、肝細胞癌和 急性髓系白血病等[Cary LA 等，1996，J Cell Sci 109 1787-1794 ；Owen JD 等，1999，Mol Cell Biol 19 4806-4818 ；Sieg DJ 等，J Cell Sci 1999,112 2677-2691；Hanks SK 等， 2003, Front Biosci 8 :d982-d996 ；Schlaepfer DD φ, 1999, ProgBiophys Mol Biol 71 435-478 ； 1990，87 :3328-3332 ；Weiner TM 等，1993，Lancet 342 1024-1025 ；Owens LV 等， 1995,Cancer Res 55:2752-2755 ；OwensLV等，1996，Ann Surg Oncol 3 100-105 ；Tremblay L等，1996，Int J Cancer68 :164_171]，而且與不良預後與轉移相關[McCormack SJ等， 1997，0ncogenel5 :265_274 ；Kornberg LJ 等，1998，Head Neck 20 :634_639 ；Kornberg LJ等，1998，Head Neck 20:745-752]。FAK高表達可能是腫瘤發育過程中的早期事件 [Aguirre Ghiso JA等，2002，Oncogene 21:2513—2524 ；Owens LV等，1995，Cancer Res 55: 2752-2755 Judson PL 等，1999，Cancer 86:1551-1556]。另一方面，通過 FRNK 過量表達方 法抑制FAK功能抑制後，導致細胞遷移、侵染和增殖的抑制[Cance WG等，2000，Clin Cancer Res 6 2417-2423 ；Lark AL 等，2003，Clin Cancer Res 9 215~222 ；Gabriel B 等，2004， Anticancer Res24 :921_927]。而用反義核酸處理FAK表達正常的人成纖維細胞，這些細胞 並沒有喪失吸附能力，更沒有走向凋亡。這就表明，FAK的高表達在腫瘤的生長過程中有著重要的作用，FAK蛋白在侵襲性腫瘤的轉移過程中發揮著重要作用。FAK的生物活性作為腫瘤治療的靶點研究證明FAK在多種人類腫瘤細胞中表達 增加，包括鱗狀上皮細胞癌[Li S 等，2008，Adv Cancer Res 101 :45_61 ；Aronsohn MS 等， 2003，Laryngoscope 113 :1944_1948]、結腸癌和乳腺癌[OwensLV 等，1995，Cancer Res 55 2752-2755]以及前列腺癌等[Tremblay L 等，1996，Int J Cancer 68 164-171]，利用 不同方法抑制FAK 的活性或幹擾FAK蛋白的表達，均已表明FAK可以作為腫瘤治療的潛在 靶點。FIP200是一種細胞內蛋白，可以直接與FAK的激酶區域結合，抑制FAK的激酶活性， 從而抑制FAK依賴的細胞伸展和遷移[Abbi S等，2002，Mol Biol Cell 13:3178-3191]。 FAK的另一種剪接形式FRNK，可以與FAK競爭定位於黏著斑，由於FRNK缺乏C-末端的的 催化結構域，從而阻斷FAK-Src信號通路，抑制腫瘤轉移。在MiaPaCa-2細胞中利用針對 FAK的小幹擾RNA(siRNA)降低FAK的表達量，可以降低FAK介導的細胞遷移[Huang YT 等，2005，Anticancer Res 25:2017-2025]。這些都說明FAK具有調控細胞遷移的功能，並 且抑制FAK的功能會對腫瘤細胞的遷移產生重要影響。目前國際上已有針對FAK激酶活 性的小分子抑制劑的報導,包括PF-228和TAE226 [Slack-Davis JK等，2007，J Biol Chem 282 :14845-14852]，兩種小分子都可以抑制細胞遷移，但是與PF-228不同的是TAE226還 能誘導腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞生長。有科學家通過計算機建模的方法從NCI小 分子複合物資料庫中篩選到一種針對FAK蛋白Y397自身磷酸化位點的抑制劑(1，2，4， 5-Benzenetetraamine Tetrahydrochloride)，它能夠顯著抑制腫瘤的生長，為腫瘤治療提 供了新的方法[Golubovskaya VM 等，2008，J Med Chem 51 :7405_7416]。類似的 FAK 磷酸 化抑制劑還有可以抑制人前列腺癌轉移的食用染料木黃酮(Genistein) [Lakshman M等， 2008, Cancer Res 68:2024-2032] ；ATP 競爭型小分子 FAK 抑制劑 PF-562，271 [Roberts WG 等，2008，Cancer Res68 =1935-1944]；可抑制乳腺癌和前列腺癌細胞生長和侵襲的蒲公英 抽提物[Sigstedt SC 等，2008，Int J Oncology 32:1085-1090]；通過抑制 FAK397 位酪氨 酸磷酸化來抑制卵巢癌細胞遷移的候選抗癌藥物曲格列酮(Troglitazone，TGZ) [Yang YC 等，2007，BMC Cancer 7:216]。由於激酶的抑制劑往往缺乏選擇性，因此尋找FAK特異性的 正常細胞激酶抑制劑難度較大；而一些正常細胞也表達FAK，因此利用FAK抑制劑時也會抑 制正常細胞的功能，從而產生副作用。儘管尋找和發現以FAK為靶點的腫瘤轉移抑制藥物 一直作為20多年來國外製藥公司的研究開發熱點，但是由於國外大製藥公司一直以FAK的 激酶抑制劑為研究靶點，迄今尚未獲得突破性進展。FAK除了在腫瘤轉移中有重要作用外，在發育中有重要的作用。FAK參與組織和 調控細胞黏著斑結構，並在由整合素介導的細胞信號傳導通路中起關鍵作用，是細胞生存、 生長、增殖和運動等生理功能的重要調控者。FAK是一種基本各個組織都表達的蛋白，在 發育及正常細胞生命活動過程中具有重要功能，FAK基因敲除的小鼠由於中胚層缺陷而導 致胚胎致死，FAK基因缺失的小鼠胚胎細胞也具有細胞運動缺陷的表型[Ilic D等，1995， Nature 377(6549) :539_544]。例如當FAK基因剔除時，小鼠死於胚胎發育期，其中一個重 要原因是血管發育出現問題。FAK基因敲除的纖維原細胞的黏著位點數目增加，同時表現細 胞運動缺陷[Finnemann SC等，2003，EMBO J 22:4143-4154]。FAK缺陷的細胞在細胞外基 質蛋白移動速度大為降低，同時顯示出對趨化信號和組織接觸信號誘導的遷移變弱[Ilic D等，1995，Nature 377 539-544 ；Owen JD等，1999，Mol Cell Bioll9 4806-4818 ；Sieg DJ等，2000，Nat Cell Biol 2 249-256 ；Sieg DJ等，1999，J Cell Sci 112(16) :2677_2691]。 因此，FAK的低表達也會對生物產生嚴重的影響，導致疾病、甚至死亡。除了 FAK激酶活性之外，能否找到新的調控FAK的方法作為篩選腫瘤轉移抑制 藥物的新途徑？我們及國際上其它研究組的研究結果表明利用RNA幹擾技術調節FAK的 mRNA水平能夠達到抑制腫瘤生長和腫瘤轉移的目的[Sieg DJ等，1999，J Cell Sci 112 2677-2691 ；Li SF等，2007，Mol Ther 15 515-523 ；Huang YT等，2005，Anticancer Res 25: 2017-2025 ；Chen YY 等，2009 May 12, Cancer Sci，Epub ahead of print]。儘管 RNA 幹擾 方法在實驗及動物模型上效果較好，但是由於RNA幹擾治療本質上是一個基因治療，而基 因治療的載體及輸送自上世紀90年代以來缺乏重大突破，因此RNA幹擾治療尚不能實際應 用。因此，能否突破上述抗腫瘤轉移藥物研究中或者以FAK激酶活性為靶點的小分子 藥物篩選系統；或者是以FAK mRNA穩定性為靶點、以RNA幹擾基因治療為手段的治療方法； 或者是以競爭性幹擾FAK蛋白質功能為靶點，以無活性的FAK變異體基因的基因治療為手 段的治療方法？這是研發FAK為靶點的抗腫瘤轉移藥物的關鍵所在。

發明內容
如何避免上述已有的以FAK激酶抑制劑為目標的藥物篩選技術以及基於基因治 療的FAK RNA幹擾方法和FAK抑制性變體基因治療的方案所帶來的不便之處和缺陷，建立 一個以FAK為靶點的藥物篩選技術，為篩選和發現以FAK為靶點的抗腫瘤轉移治療藥物奠 定基礎，這是本發明的根本目的。本發明提供一種以FAK轉錄調控為靶點的藥物篩選方法， 利用該方法可以篩選獲得具有抑制FAK基因轉錄的藥物，但不僅限於篩選藥物。為達到上述目的，本發明的技術方案是在生物信息學分析的基礎上利用分子生物 學方法克隆哺乳類動物的FAK啟動子，將其克隆在報告基因的上遊，構建上述FAK啟動子驅 動的報告基因載體，該載體能夠在腫瘤細胞中高水平表達報告基因。報告基因包括常用的 氯黴素乙醯轉移酶基因、β 「半乳糖苷酶基因、二氫葉酸還原酶基因、螢光酶基因、螢光蛋白 基因。進一步地，一種上述由FAK啟動子驅動的報告基因載體在腫瘤細胞中表達的細胞 模型，利用該細胞模型可以檢測到報告基因的表達水平。進一步地，一種檢測上述細胞模型中報告基因的檢測方法，利用該方法能夠通過 檢測FAK啟動子驅動下的報告基因表達水平，從而獲知FAK啟動子在腫瘤細胞中的活性和 表達水平。進一步地，一種基於上述FAK啟動子驅動的報告基因細胞模型及其報告基因檢測 方法構成的FAK轉錄調控為靶點的篩選技術腫瘤轉移藥物篩選中的應用，利用該方法能夠 篩選獲得調節FAK啟動子活性的藥物。進一步地，一種在腫瘤細胞水平驗證上述藥物調節FAK基因表達的驗證方法，利 用該方法可以確定上述篩選方法的可靠性以及利用上述篩選方法獲得的藥物調節FAK啟 動子活性的真實性。進一步地，利用上述篩選技術獲得的調節FAK啟動子活性藥物的應用。進一步地，利用上述篩選技術獲得的降低FAK啟動子活性藥物在製備抗腫瘤轉移藥物中的應用。進一步地，在生物信息學分析的基礎上利用分子生物學方法克隆哺乳類動物的 FAK啟動子核心區域，將其克隆在報告基因的上遊，構建上述FAK啟動子核心區域驅動的報 告基因載體，該載體能夠在腫瘤細胞中高水平表達報告基因。報告基因包括常用的氯黴素 乙醯轉移酶基因、β 「半乳糖苷酶基因、二氫葉酸還原酶基因、螢光酶基因、螢光蛋白基因。 進一步地，一種上述報告基因載體在腫瘤細胞中表達的細胞模型，利用該細胞模 型可以檢測到報告基因的表達水平。進一步地，一種檢測上述細胞模型中報告基因的檢測方法，利用該方法能夠通過 檢測FAK啟動子核心區域驅動下的報告基因表達水平，從而獲知FAK啟動子在腫瘤細胞中 的活性和表達水平。進一步地，一種基於上述FAK啟動子核心區域驅動的報告基因細胞模型及其報告 基因檢測方法構成的FAK轉錄調控為靶點的篩選技術腫瘤轉移藥物篩選中的應用，利用該 方法能夠篩選獲得調節FAK啟動子活性的藥物。進一步地，一種在腫瘤細胞水平驗證上述藥物調節FAK基因表達的驗證方法，利 用該方法可以確定上述篩選方法的可靠性以及利用上述篩選方法獲得的藥物調節FAK啟 動子活性的真實性。進一步地，利用上述篩選技術獲得的調節FAK啟動子核心區域活性藥物的應用。進一步地，利用上述篩選技術獲得的降低FAK啟動子核心區域活性藥物在製備抗 腫瘤轉移藥物中的應用。進一步地，在生物信息學分析的基礎上利用分子生物學方法克隆哺乳類動物的 FAK啟動子中腫瘤轉移相關關鍵轉錄因子結合核心片段，將其克隆在報告基因的上遊，構建 上述FAK關鍵轉錄因子結合核心片段驅動的報告基因載體，該載體能夠在腫瘤細胞中高水 平表達報告基因。報告基因包括常用的氯黴素乙醯轉移酶基因、β -半乳糖苷酶基因、二氫 葉酸還原酶基因、螢光酶基因、螢光蛋白基因。進一步地，一種上述報告基因載體在腫瘤細胞中表達的細胞模型，利用該細胞模 型可以檢測到報告基因的表達水平。進一步地，一種檢測上述細胞模型中報告基因的檢測方法，利用該方法能夠通過 檢測FAK關鍵轉錄因子結合核心片段驅動下的報告基因表達水平，從而獲知FAK啟動子在 腫瘤細胞中的活性和表達水平。進一步地，一種基於上述FAK關鍵轉錄因子結合核心片段驅動的報告基因細胞模 型及其報告基因檢測方法構成的FAK轉錄調控為靶點的篩選技術腫瘤轉移藥物篩選中的 應用，利用該方法能夠篩選獲得調節FAK啟動子活性的藥物。進一步地，一種在腫瘤細胞水平驗證上述藥物調節FAK基因表達的驗證方法，利 用該方法可以確定上述篩選方法的可靠性以及利用上述篩選方法獲得的藥物調節FAK啟 動子活性的真實性。進一步地，利用上述篩選技術獲得的調節FAK關鍵轉錄因子結合核心片段活性藥 物的應用。進一步地，利用上述篩選技術獲得的降低FAK關鍵轉錄因子結合核心片段活性藥 物在製備抗腫瘤轉移藥物中的應用。
與已有的以FAK激酶活性為靶點的激酶活性抑制劑藥物篩選系統相比；或者與以 FAK mRNA穩定性為靶點、以RNA幹擾進行基因治療的方法相比；或者與以競爭性幹擾FAK蛋 白質功能為靶點、以無活性的FAK變異體基因的基因治療的方法相比較，本發明的特色和 創新之處在於(1)首次發明了一種在FAK啟動子水平(即轉錄水平)調控FAK基因表達的藥物 篩選方法，而且通過腫瘤細胞水平、腫瘤細胞遷移能力、腫瘤動物模型證實了該種方法的可 靠性和可信度。利用該篩選技術能夠篩選獲得抗腫瘤轉移的藥物，從而解決目前抗 腫瘤轉 移藥物篩選和發現的難題。利用本發明的篩選技術可以大規模地從自然界中篩選具有調控 FAK基因表達的藥物，尤其是具有抑制腫瘤轉移的藥物。(2)本專利發明的篩選方法汲取了已有以FAK為靶點的篩選方法的優點、同時又 有效避免了現有篩選的缺點。例如，以FAK激酶活性為靶點的激酶活性抑制劑藥物篩選系 統能夠從應用最廣、使用最方便、自然界含量最豐富的小分子中進行篩選藥物，但是不能篩 選到調控FAK表達或者增加FAK活性的藥物；而FAKmRNA RNA幹擾方法，能夠在FAK基因轉 錄後水平進行幹預和調節，但是只能藉助於基因治療的方法將幹擾RNA或者編碼幹擾RNA 的質粒傳輸到細胞內才能發揮作用，而且無法上調FAK基因的表達水平；而以無活性的FAK 變異體基因的基因治療方法產生與細胞內部FAK競爭、幹擾FAK蛋白質的功能的方法，必須 藉助於基因治療的方法將編碼無活性的FAK變異體基因的質粒傳輸到細胞內才能發揮作 用，而且無法上調FAK的活性和功能。相比之下，本專利發明的方法，具有如下優點①既能夠到達從FAK轉錄水平調控FAK表達水平的目的，又避免了像FAK RNA幹 擾方法一樣最終必須通過基因治療方法來實現的缺點；②能夠像以FAK激酶活性為靶點的激酶活性抑制劑藥物篩選系統一樣，能夠從應 用最廣、使用最方便、自然界含量最豐富的小分子中進行藥物篩選；③能夠方便地篩選獲得調控FAK轉錄水平的藥物，既能夠篩選獲得抑制FAK轉錄 水平的藥物，也能夠篩選獲得上調FAK轉錄水平的藥物。(3)與現有的篩選方法的原理完全不同現有的方法分別是從FAK mRNA穩定性水 平(RNA幹擾方法)，FAK激酶活性(磷酸化抑制劑和激酶抑制劑)，FAK與上遊信號分子的 相互作用及信號傳導阻斷(以FRNK為代表的競爭性FAK變異體)環節發揮作用，而本發明 是從FAK轉錄水平，即FAK啟動子活性水平或FAK mRNA的產生環節為靶點建立篩選方法進 行藥物篩選。因此，本發明建立了一種全新的、以FAK轉錄調控為靶點的藥物篩選方法及其應用。
四

圖1. FAK啟動子分析及報告基因載體示意圖。1A. FAK啟動子核心區驅動的報告基因載體示意圖1、pGL3報告基因載體；2、FAK 啟動子核心區；3、報告基因；IB. FAK啟動子核心區分析l、pGL3_Basic空載體；2、pGL3_Control對照載體；3、 FAK 啟動子區 _842/+43 ；4、FAK 啟動子區 _554/+43 ；5、FAK 啟動子區 _255/+43 ；6、FAK 啟動子區-170/+43 ；7、FAK 啟動子區 _55/+43 ；1C. FAK啟動子核心區轉錄因子結合位點分析。圖2. FAK啟動子腫瘤轉移相關的關鍵轉錄因子結合位點分析。 2A. 1、突變USF結合位點；2、突變-116 NF-κ B結合位點；3、突 變-116/-104NF-K B結合位點；4、突變-116/-104/-46NF-κ B結合位點；5、突變-90位 c-ETS-1結合位點；6、突變-80位GATA-I結合位點；突變鹼基用小寫字母表示；2Β，2Α中FAK啟動子區關鍵轉錄因子結合位點突變對FAK啟動子活性的影響1、 未進行突變的FAK啟動子報告基因對照；2、-116位NF-κ B結合位點突變下報告基因表達；
3、-116/-104位NF-kB結合位點突變下的報告基因表達；4、-116/-104/-46位NF-κ B結 合位點突變下的報告基因表達；5、-90位c-ETS-1結合位點突變下的報告基因表達；6、-80 位GATA-I結合位點突變下的報告基因表達；7、USF結合位點突變下的報告基因表達。圖3.幾種小分子藥物對FAK啟動子活性的影響3Α.不同劑量三氧化二砷幹預24h對FAK啟動子活性的影響1、無三氧化二砷對 照組；2、1 μ M三氧化二砷實驗組；3、5 μ M三氧化二砷實驗組；3Β.不同劑量紫杉醇幹預24h對FAK啟動子活性的影響1、無紫杉醇對照組；2、 20nM紫杉醇實驗組；3、50nM紫杉醇實驗組；4、IOOnM紫杉醇實驗組；3C.不同劑量二萜內酯化合物1幹預24h對FAK啟動子活性的影響1、無二萜內 酯化合物1對照組；2、20nM 二萜內酯化合物1實驗組；3、40nM 二萜內酯化合物1實驗組；
4、80nM二萜內酯化合物1實驗組；3D.不同劑量冬凌草甲素幹預24h對FAK啟動子活性的影響1、無冬凌草甲素對 照組；2、2.7μΜ冬凌草甲素實驗組；3、8. ΙμΜ冬凌草甲素實驗組；3Ε.不同劑量含芪類結構非黃酮類多酚化合物1幹預24h對FAK啟動子活性的影 響1、無含芪類結構非黃酮類多酚化合物1的對照組；2、20nM含芪類結構非黃酮類多酚 化合物1實驗組；3、50nM含芪類結構非黃酮類多酚化合物1實驗組；4、IOOnM含芪類結構非 黃酮類多酚化合物1實驗組。圖4.在腫瘤細胞和腫瘤動物模型體內驗證小分子藥物對內源性FAK基因表達的影響。4A. 二萜內酯化合物1抑制FAK基因的轉錄1、無二萜內酯化合物1對照組；2、 14nM 二萜內酯化合物1實驗組；3、28nM 二萜內酯化合物1實驗組；4、56nM 二萜內酯化合物 1實驗組；5、140nM 二萜內酯化合物1實驗組；4B. 二萜內酯化合物1抑制FAK基因蛋白表達1、無二萜內酯化合物1對照組；2、 14nM 二萜內酯化合物1實驗組；3、28nM 二萜內酯化合物1實驗組；4、56nM 二萜內酯化合物 1實驗組；5、140nM 二萜內酯化合物1實驗組；4C.不抑制FAK基因啟動子活性的冬凌草甲素不影響FAK基因蛋白表達1、無冬 凌草甲素對照組；2、2. 7 μ M冬凌草甲素實驗組；3、8. 1 μ M冬凌草甲素實驗組；4、13. 5 μ M 冬凌草甲素實驗組；5、21. 6μΜ冬凌草甲素實驗組；4D. 二萜內酯化合物1抑制動物體內腫瘤組織FAK基因蛋白表達1、無二萜內酯 化合物1治療的對照組；2、20 μ g/kg體重劑量二萜內酯化合物1治療組；3、50 μ g/kg體重 劑量二萜內酯化合物1治療組；4、200 μ g/kg體重劑量二萜內酯化合物1治療組；
4E.含芪類結構非黃酮類多酚化合物1抑制動物體內腫瘤組織FAK基因蛋白表 達1、無含芪類結構非黃酮類多酚化合物1對照組；2、20nM含芪類結構非黃酮類多酚化 合物1實驗組；3、50nM含芪類結構非黃酮類多酚化合物1實驗組。圖5. 二萜內酯化合物1抑制腫瘤細胞遷移和動物模型體內腫瘤的轉移。5A.傷痕癒合實驗表明二萜內酯化合物1可以抑制腫瘤細胞的遷移1、無二萜內 酯化合物1幹預、不加血清激活的陰性對照組；2、無二萜內酯化合物1幹預、加10%血清激 活的陽性對照組；3、20nM 二萜內酯化合物1幹預、加10%血清激活組；4、40nM 二萜內酯化 合物1幹預、加10%血清激活組；5B.腫瘤轉移動物模型體內二萜內酯化合物1抑制腫瘤在動物體內的轉移1、腫 瘤模型組，無二萜內酯化合物1治療；2、腫瘤模型，20μ g/kg體重劑量二萜內酯化合物1治 療組；3、腫瘤模型，50 μ g/kg體重劑量二萜內酯化合物1治療組；4、腫瘤模型，200 μ g/kg 體重劑量二萜內酯化合物1治療組。圖6.人FAK基因啟動子及其轉錄因子結合位點分析及報告基因表達分析。6A.人FAK基因啟動子區具有和小鼠FAK基因啟動子區類似的轉錄因子結合位 佔.
^ \\\ 6B.人FAK基因啟動子核心區分析及報告基因表達分析1、pGL3-Basic空載體； 2、人FAK啟動子區-1104/+47驅動的報告基因；3、人FAK啟動子區-516/+47驅動的報告基 因。圖7.小分子藥物對人FAK啟動子活性及蛋白表達表達的影響。7A. 二萜內酯化合物1對人胰腺癌細胞系Capan-IFAK蛋白表達的影響1、無二萜 內酯化合物1對照組；2、40nM二萜內酯化合物1實驗組；3、80nM二萜內酯化合物1實驗組；7B. 二萜內酯化合物1對人胰腺癌細胞系SW1990FAK蛋白表達的影響1、無二萜 內酯化合物1對照組；2、40nM二萜內酯化合物1實驗組；3、80nM二萜內酯化合物1實驗組； 4、160nM 二萜內酯化合物1實驗組；7C. 二萜內酯化合物1對人FAK啟動子活性的影響1、無二萜內酯化合物1處理 組；2、40nM 二萜內酯化合物1實驗組；3、80nM 二萜內酯化合物1實驗組；7D.紫杉醇對人FAK啟動子活性的影響1、無紫杉醇處理組；2、20nM紫杉醇實驗 組；3、50nM紫杉醇實驗組；7E.含芪類結構非黃酮類多酚化合物1對人FAK啟動子活性的影響1、人FAK啟 動子報告基因，無含芪類結構非黃酮類多酚化合物1對照組；2、20nM含芪類結構非黃酮類 多酚化合物1實驗組；3、50nM含芪類結構非黃酮類多酚化合物1實驗組；4、100nM含芪類結 構非黃酮類多酚化合物1實驗組。
五具體實施例方式實施例1 1.小鼠FAK啟動子報告基因載體構建利用TRANSFAC資料庫和生物信息學方法分析和預測小鼠FAK基因啟動子及其轉 錄因子結合位點，在此基礎上獲得小鼠FAK啟動子及其核心序列。設計相應的PCR引物，化 學合成上下遊引物(上遊引物為5，-CGGCTAAGGATCTCCTGTGACCGTGA-3，；下遊引物為5，-CAGCGCAGAGCTCTACGCCTGCGCAG-3』，以提取的小鼠基因組為模板，用PCR的方法擴增得到小 鼠FAK啟動子序列。PCR反應的條件為94°C熱變性1分鐘，60°C退火1分鐘，72°C延伸1分 鍾，共進行25個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收後進行Kpn I/Sma I雙酶切，報告基 因載體pGL3-BasiC也進行Kpn I/Smal I雙酶切，使用T4DNA連接酶將兩條雙酶切回收片 段進行連接，連接產物轉化大腸桿菌ToplO菌株感受態細胞，用限制性內切酶酶切及PCR法 篩選陽性克隆，得到質粒pGL-FAKp，經過DNA序列測序分析驗證序列的正確性。2.細胞轉染及報告基因測定 (1)細胞轉染利用本實驗室製備的M-PEI作為轉染試劑進行細胞轉染[LiS等， 2007,Molecular Therapy 15(3) 515-523 ；Dong W等，2007，Int J Mol Sci8 81-102 ；Dong W 等，2006，Acta Biochim Biophys Sin 38(11) :780_787]。M_PEI/DNA 的複合物轉染細胞實 驗具體步驟如下轉染前24小時，取處於對數生長期的細胞，胰酶消化後以每孔1 X IO5個 細胞接種於24孔板，每孔加Iml完全培養液，將培養板移入培養箱培養，當細胞匯合度達到 70%時，除去培養液，換成400 μ 1不含抗生素的DMEM培養液(含10%新生牛血清)，對於 需要轉染的每孔細胞，需要配置用於製備M-PEI/DNA的複合物，即分別將3μ gM-PEI和1 μ g 質粒(可能為幾個質粒的混合物)用PBS稀釋成50μ 1，然後將稀釋後的50μ 1 M-PEI滴加 至稀釋後的50 μ 1質粒溶液中混勻，室溫靜置10-15分鐘，將體積為100 μ 1的轉染複合物 (100 μ 1 PBS, 1 μ g質粒，3 μ gM-PEI)，加入待轉染的細胞的培養液中，混勻後，37°C，C02培 養箱培養4小時後每孔補加500 μ 1完全培養液，繼續培養24小時，收取細胞，根據雙螢光 素酶測定試劑盒的說明書要求裂解細胞，測定報告基因的強度。(2)報告基因測定報告基因測定均採用雙螢光素酶報告基因體系，待測報告基 因載體上的報告基因為火蝴蝶螢光素酶(Butterfly luciferase)，與待測報告基因載體共 轉的作為內參的載體PRL-SV40的報告基因為海腎螢光素酶(Renilla luciferase) 0在計 算待測報告基因數值時，利用內參載體的海腎螢光素酶的值作為內標，排除不相關因素的 幹擾，最後得到的是相對的報告基因值(RLU)。3. MTT法確定藥物篩選的濃度B16F10小鼠黑色素瘤細胞(購自ATCC)在含10 %新生牛血清的DMEM(含100U/ ml青黴素和100yg/ml鏈黴素)中，並放置37°C，5% C02的培養箱中生長。將細胞消化計 數利用DMEM培養液稀釋為5X 104cell/ml的濃度，並分裝接種96孔細胞培養板，100 μ 1/ 孔，培養箱中培養24h，分別將幾種藥物利用DMEM培養液稀釋至相應的藥物濃度(100 μ 1 體積)，加入相應的細胞培養孔中，每組6個復孔，繼續培養18h後，吸去培養液，每孔加入 100 μ 1含有5 μ g MTT的DMEM培養液，繼續培養3_4h，吸去培養液，每孔加入100 μ 1DMS0， 搖振混勻充分溶解後，利用酶標儀在570nm處測定吸收值，計算細胞抑制率，抑制率計算公 式抑制率％ = {(對照組OD值-處理組OD值)/ (對照組OD值)} X 100 %。4.藥物篩選操作過程同2.細胞轉染及報告基因測定。利用本實驗室研究製備的M-PEI作為 轉染試劑進行細胞轉染，轉染反應後，37°C，C02培養箱培養4h後每孔補加500 μ 1完全培 養液，繼續培養24h，然後根據要求用各種藥物進行幹預處理，繼續培養18h後，收取細胞， 根據雙螢光素酶測定試劑盒的說明書要求裂解細胞，測定報告基因的值。5.篩選獲得的藥物對FAK基因轉錄和蛋白的影響
(1)細胞mRNA提取所有物品均提前用DEPC處理並滅菌(或購買的RNase free 產品)。將細胞消化計數後分裝於六孔細胞培養板，置細胞培養箱培養，待細胞生長至 70% -80%密度後，加藥進行幹預處理，繼續培養18h時間後，PBS洗滌一次。加入1ml Trizol，用移液槍吹打至細胞完全溶解。室溫放置5min。加入200 yl的氯仿/ml Trizol, 振蕩15秒後室溫放置2-3min，然後於4°C，12000g離心15min。吸取上層(約400 yl)，轉移 至另一新印pendorf管中，加入500iil異丙醇，混勻，放置lOmin，4°C，12000g離心lOmin。 可見RNA沉澱。棄去上清，加入1ml 75%乙醇洗滌沉澱，7500g離心5min，在空氣中晾乾RNA 沉澱，加入30 u 1 DEPC處理的DDW溶解，測定RNA濃度及純度，取一部分立即進行逆轉錄， 剩餘RNA凍存於-70°C，備用。(2)RNA逆轉錄採用20 u 1逆轉錄體系，將提取的模板RNA約2 i g與5Xbuffer 4u l,2u 1 dNTP(lOmM), 1 U 1 oligo (dT) 18 (10 u M), RNaselnhibitor liU，逆轉錄酶 Rever-Tra Ace- a-1 u 1，混勻後 30°C 10 分鐘，42°C水浴反應 30 分鐘。98°C 10 分鐘。(3)半定量PCR:取逆轉錄的cDNA作為模板，以GAPDH為內標，採用其引物進行 PCR，調整模板的使用量，然後利用調整後的模板同時擴增FAK基因和GAPDH基因，以GAPDH 為參照，觀察加藥處理對FAK基因RNA轉錄水平的影響。PCR採用20 yl PCR反應體系 2u llOXTaq buffer，2 yl dNTPs,2u 1 Mg2+，1 yl 上遊引物，1 yl 下遊引物，1 yl cDNA 模 板，0. 5ii 1 rTaqpolymerase，用 DDW 補足到 20ii 1。PCR 條件94°C熱變性 4min，94°C變性 40s，55°C退火40s，72°C延伸40s，循環數為20-32個，最後72°C延伸7min。PCR產物進行
瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀測儀下觀察，拍照記錄。所用特異性引物為FAK上遊引物5，-ACTCATCGAGAGATCGAGATGG-3』 ；下遊引物 5，-GCCCTAGCATTTTCAGTCTTGC-3，；GAPDH 上遊引物5，-AACGACCCCTTCATTGAC-3，；下遊引 物5』 -TCCACGACATACTCAGCAC-3，。(2) Western Blot 將B16F10細胞置於6孔細胞培養板生長至70-80%密度，根據 要求加不同劑量藥物進行處理，繼續培養18h後，收取細胞，用預冷的PBS將細胞沉澱洗滌 一次後，加入適量細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑，Roche公司)懸浮混勻，冰上放置30min 後，4°C，12000rpm離心15min，吸取上清，利用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白濃度， 調整蛋白濃度，加入4X loading buffer並在沸水浴中煮樣5min，樣品置於_20°C保存備 用。按照分子克隆中的配方配製12% SDS-PAGE gel，通過測定的樣品蛋白含量計算， 使各組樣品上樣量保持一致，上樣量為80 u g。濃縮膠採用80伏恆壓進行壓縮，分離膠採 用120伏電壓分離，然後使用半乾法將SDS-PAGE膠中蛋白轉印至PVDF(p0lyVinylidene fluoride)膜上，10伏恆壓電轉2-3h。轉印結束後可用麗春紅S (0.5% ponceaus S in 1% acetic acid)對膜進行染色，可以看到紅色的蛋白條帶，也可以根據預染Marker確定轉印 效率。然後將轉印後的膜放在新鮮配製的5%脫脂奶粉(PBST配製)中進行封閉，4°C封閉 過夜或者室溫作用lh。封閉結束後，根據抗體說明用含5%脫脂奶粉的PBST溶液稀釋一抗 (primary antibody)至最佳工作濃度，將膜包被於一抗中室溫孵育lh或置於4°C作用過 夜。然後將膜用PBST置於搖床上輕輕搖蕩洗滌5次，每次5-lOmin。洗滌完成後包被二抗， 將HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗用含5%脫脂奶粉的PBST溶液按1 2000稀釋，與 膜共同孵育lh，同樣以PBST洗滌5次，每次5-lOmin。最後，按照產品說明配製發光底物溶液(ECL化學發光底物)滴加於PVDF膜上，室溫放置l-2min，用濾紙將多餘發光液吸乾，將 膜用保鮮膜包被後放入壓片夾移入暗房，取X光片置於膜上曝光l-5min後，衝洗膠片，根據 曝光條帶判斷蛋白的表達結果。6.小鼠背部皮下腫瘤模型製備取指數生長期的B16F10細胞，經胰酶消化後，用PBS於800Xg離心洗滌2次。 計數後用PBS懸浮至濃度為5X106cell/ml，然後每隻小鼠右側背部皮下經皮下注射 100 uL(5X 105cell)，一周左右，原位腫瘤大小生長至3m3左右，將小鼠分成4組，每組8隻。 分別用PBS、按每公斤體重給不同劑量的藥物，經腹腔注射給藥，每天注射一次，共治療15 天。從開始治療後每三天測量腫瘤大小，並按下列公式計算腫瘤體積0. 5236XL1X (L2)2， 其中L1為腫瘤長軸，L2為腫瘤短軸。治療第15天，處死小鼠。分離並切除腫瘤組織製備， 取部分於4%甲醛溶液中固定備用。7.免疫組化分析實驗動物標本取樣後浸泡於4%甲醛溶液中不少於24h，石蠟包埋，切片。然後通過以 下步驟進行免疫組化①烤片約1. 5h。二甲苯脫蠟，5minX2次；用100% -95% -80% -70%酒精梯度水 化每次2-3min ；溫熱水(60°C左右)衝洗。②用檸檬酸緩衝液高溫高壓進行抗原修復，加熱置高壓鍋噴氣後lmin關，自然冷 卻到室溫。③用PBST洗片三次，擦乾邊緣，用油筆沿組織切片外緣畫圈，用羊血清封閉液室 溫封閉30min。用抗體稀釋液稀釋一抗(FAK抗體1 200)。④PBST衝洗片子後包被一抗，37 °C，2h或4°C過夜。⑤PBST衝洗3-5次，擦乾邊緣。包被二抗，37°C，45min。⑥PBST洗三次。擦乾邊緣。DAB顯色，顯微鏡鏡檢顯色情況，放入水中終止顯色。 用流水衝洗片子5min。⑦用蘇木精染核5min後溫水衝洗返藍，用1 % HC1-酒精分化ls，衝洗洗去浮色， 衝洗至顏色適中，玻片透亮。⑧烤乾，並封片。顯微鏡下觀察、拍照並長期保存。8.細胞遷移及腫瘤轉移實驗(1)傷口癒合實驗將處於對數生長期的B16F10細胞用胰酶消化製備成單細胞懸 液，以2-3 X 105cell/500 u 1/孔的標準接種24孔板，37°C，5% C02的條件下培養過夜，然後 將細胞培養液換為無血清的DMEM培養液，37°C,5%C02的條件下飢餓24h，200 u 1 pipette tip劃痕，PBS洗，更換為含有10% FBS的DMEM培養液繼續培養，36h小時後觀察遷移到劃 痕區的細胞，記數分析。(2)細胞遷移實驗細胞預處理將處於對數生長期的B16F10細胞消化製備成單 細胞懸液，以2-3X105cell/500iil/孔的標準接種24孔板，37°C，5% C02的條件下培養 過夜，然後將細胞培養液更換為無血清的DMEM培養液，37°C，5% C02的條件下飢餓24h，然 後根據要求加相應濃度的藥物預處理3h，預處理完成後，以胰酶分別消化各組細胞，計數備 用。細胞遷移實驗利用Transwell Cell Culture System的方法進行。在Trans-well外室 加入0. 6ml含有10% FBS的DMEM(根據實驗組設計要求，有的加入相應濃度的藥物)。將計數後的細胞用無血清的DMEM稀釋成濃度為lX106/ml的細胞懸液，在內室接種0. 1ml。在 37°C,5% C02條件下培養24小時，吸去內室液體，用棉籤輕輕地擦去膜上表面的細胞後，整 個Trans-well在10% formalin中室溫固定30分鐘，結晶紫染色20分鐘[1%結晶紫，含 2%乙醇的lOOmM硼酸buffer (pH9. 0)]，水洗三遍，然後在X 100顯微鏡下拍照計數(5個視
野/膜)。9.凝膠阻滯實驗(EMSA)(1)探針設計根據生物信息學和上述實驗中獲得的轉錄因子結合位點 突變分析的結果，可知-116/-104附近NF-kB結合位點、-90附近c_ETS_l結合位 點、-158/-152附近USF結合位點突變後對FAK啟動子報告基因的影響較大，因 此選取以上三個位置對應的區域，合成探針USF-160-140 :5，引物5，-TCTCCTG TGACCGTGAGGGAC-3，，3，引物:5，-GTCCCTCACGGTCACAGGAGA-3，；c-ETS-1-96-77 :5，引物 5，-TCGTCATCCCGGAACAGCGC-3，，3，引物5，-GCGCTGTTCCGGGATGACGA-3，；NF_kB_ 120-96 :5， 引物5，-CCTGGGGCGGCCACAGGGGCCACCT-3，，3，引物5，-AGGTGGCCCCTGTGGCCGCCCCAGG-3，。(2)探針標記採用螢光素標記的方法，即將各組探針的5』引物分別合成兩份，其 中一份在5』端標記螢光素FAM(與下遊引物退火配對後用作標記探針)，另一份不標記(與 下遊引物退火配對後用作競爭探針)。(3)探針退火將探針用超純水(DDW)溶解至濃度為50pm/yl，並計算出質量濃 度，每組探針上下遊引物各加IP g，採用20iU體系，體系結構如下2iil 20XSSC,lug 5，引物，lPg 3，引物，用DDW將體積補至20 ill。退火條件在PCR儀上進行，95°C 5min， 25°C lh ；各組競爭冷探針也採用同樣條件進行退火配對。(4)細胞核抽提PBS洗滌B16F10細胞2次，然後用細胞刮刮取細胞，重懸於 400 ill Buffer A，冰上放置30min，4°C，800 X g離心lOmin，去上清，收集細胞核，沉澱重懸 於40iU Buffer C，冰上放置30min，4°C，12000rpm離心15min，吸取上清，即為核蛋白部 分，採用考馬斯亮藍法(Bradford)進行蛋白定量，_70°C保存備用。(5)Western-blot 將上述製備的細胞核蛋白，取一部分製備電泳樣品。按照分子 克隆中的配方配製12% SDS-PAGE凝膠，通過測定的樣品蛋白含量計算，使各組樣品上樣量 保持一致，上樣量為60 u g左右核蛋白。濃縮膠採用80伏恆壓進行壓縮，分離膠採用120伏 電壓分離，然後使用半乾法將SDS-PAGE膠中蛋白轉印至PVDF(polyvinylidene fluoride) 膜上，10伏恆壓電轉2-3h。轉印結束後根據預染Marker確定轉印效率。然後將轉印後的 膜放在新鮮配製的5%脫脂奶粉(PBST配製)中進行封閉，4°C封閉過夜或者室溫作用lh。 封閉結束後，根據抗體說明用含5%脫脂奶粉的PBST溶液稀釋一抗(primaryantibody)至 最佳工作濃度，將膜包被於一抗中室溫孵育lh或置於4°C作用過夜。然後將膜用PBST置於 搖床上輕輕搖蕩洗滌5次，每次5-lOmin。洗滌完成後包被二抗，將HRP (辣根過氧化物酶) 標記的二抗用含5%脫脂奶粉的PBST溶液按1 2000稀釋，與膜共同孵育lh，同樣以PBST 洗滌5次，每次5-lOmin。最後，按照產品說明配製發光底物溶液(ECL化學發光底物)滴加 於PVDF膜上，室溫放置l-2min，用濾紙將多餘發光液吸乾，將膜用保鮮膜包被後放入壓片 夾移入暗房，取X光片置於膜上曝光l-5min後，衝洗膠片，根據曝光條帶判斷蛋白含量。(6)EMSA反應配製4. 5 %非變性聚丙烯醯胺凝膠，膠厚度為1. 5mm,體積為 20ml 的配方為30% Acrylamide mix, 3. 0ml ；5XTBE，2. 0ml ；Waterl4ml ；10% 過硫酸銨，
13150 u 1 ； TEMED, 15 y 1。待配製的膠凝固後，先預電泳2h，電泳緩衝液為含甘油的0. 5XTBE溶液，預 電泳的同時準備核蛋白與探針的反應物。在500 ill Eppendorf管中進行探針和蛋白的結合反應，反應體系 lXBindingbuffer，核蛋白10 y g，0. 05pm標記探針，2u g poly (dl-dC)，若冷探針競爭組需 加入100倍量的非標記探針，補DDW至總體積10 ill。 不同探針使用的Binding buffer 探針 c-ETS-1 和 USF 所用的 Bingding buffer 為50mM Tris-HCl,pH7. 9,12. 5mM MgC12, ImM EDTA, ImM DTT，20%甘油，0. 5mM PMSF ；探針 NF-kB 所用的 Bingding buffer 為10mM Tris-HCl, pH7. 5，ImM MgC12，0. 5mM EDTA，0. 5mM DTT,50mM NaCl，4%甘油，1 % BSA。反應混合物準備好後，在4°C避光結合45分鐘，然後將樣品直接加載到已經預電 泳2小時的4. 5%非變性聚丙烯醯胺凝膠，以0. 5XTBE/1%甘油為電泳緩衝液，80V電泳 45min，直到溴酚蘭條帶遷移至泳道2/3處，取下凝膠板採用typhoon進行螢光分析。10. FAK啟動子區主要轉錄因子結合位點突變後報告基因表達質粒的構建及其轉 錄活性分析根據已經鑑定獲得的FAK啟動子核心序列為-170/+44，構建的FAK啟動子核心序 列報告基因載體命名為8P :pGL3-170/+44。利用TRANSFAC資料庫和生物信息學方法分析 和預測小鼠FAK基因啟動子區的轉錄因子結合位點，利用分子生物學的方法構建轉錄因子 結合位點突變的FAK啟動子突變體，並將其插入pGL3-BasiC載體中，獲得FAK啟動子突變 體報告基因載體。FAK啟動子突變體報告基因載體分別命名為:l(158/152USFm) ； 2 (116NF-kBm)； 3(116/104NF-kBm) ；4 (116/104/46NF_kBm) ；5 (90c_ETSlm) ；6 (80GATAlm)。構建方法如下(1)合成 DNA 片段:-158/-152-USFdm-5 :5，-cCGGCTAAGGATCTgtaagcgCatcttGG _3，；-158/-152-USFdm-3 :5，-GTCCCaagatGcgcttacAGATCCTTAGCCGggtac-3，；退火後替換 PGL3-170/+44載體中啟動子核心序列酶切位點Kpn I和Eco0109I之間的序列。(2)合成 DNA 片段:-116-NFkBm-5 :5，-GACCCAGGCCTAGTCCGCAGACCCatatGCGGtaA CAGGGGCCACCTCGTCATCCCGGAACAGCGCTATCCGC-3』 ；-116-NFkBm-3 :5』 -GGATAGCGCTGTTCCGG GATGACGAGGTGGCCCCTGTtaCCGCatatGGGTCTGCGGACTAGGCCTGG-3，；在突變的 NF_kB 位點處 引入一個Nde I內切酶位點，將以上序列送上海Invitrogen生物公司合成，退火後替換 PGL3-170/+44載體中啟動子核心序列酶切位點Eco0109I和Sac II之間的片段；(3)在 2 的基礎上構建 3，合成序列-104-NFkBm-5 :5，_tatGCGGtaACAtGcagCAgaT CGTCATCCCGGAACAGCGCTATCCGC-3 』 ；-104-NFkBm-3 5 』 -GGATAGCGCTGTTCCGGGATGACGAtcTGctg CaTGTtaCCGCa-3'；退火後替換2載體中啟動子核心序列酶切位點Nde I和Sac II之間的 序列；(4)在 3 的基礎上構建 4，合成序列-46-NFkBm-5 5『-CTGattcACACagTACTAGGAGC CGGGCGCGCCGGACTGCTCTGCGCAGGCGCGGTCCGCACTGCGCAGGCGTAGAGCT-3 』 ； -46-NFkBm_3 5 』 -CTA CGCCTGCGCAGTGCGGACCGCGCCTGCGCAGAGCAGTCCGGCGCGCCCGGCTCCTAGTActGTGTgaatCAG-3』；退 火後替換載體N2上啟動子區酶切位點Pvu II和Sac I之間的序列；(5)合成 DNA 片段:-90-cETSlm-5 5，-GACCCAGGCCTAGTCCGCAGACCCTGGGGCGGCCACA
14GGGGCCACCTCGTCATCtgtacgCAGCGCTATCCGC-3，；-90-cETSlm-3 :5』 -GGATAGCGCTGcgtacaGATGA CGAGGTGGCCCCTGTGGCCGCCCCAGGGTCTGCGGACTAGGCCTGG-3，；退火後替換 pGL3_170/+44 載體 中啟動子核心序列酶切位點Eco0109I和Sac II之間的片段；(6)合成 DNA 片段:-80-GATAlm-5 5，-GACCCAGGCCTAGTCCGCAGACCCTGGGGCGGCCACA GGGGCCACCTCGTCATCCCGGAACagcgtaagCCgc-3，；-80-GATAlm-3 5『-GGcttacgctGTTCCGGGATGA CGAGGTGGCCCCTGTGGCCGCCCCAGGGTCTGCGGACTAGGCCTGG-3，；退火後替換 pGL3_170/+44 載體 中啟動子核心序列酶切位點Eco0109I和Sac II之間的片段以上DNA序列中的突變鹼基都用小寫字母表示。獲得的FAK啟動子突變體報告基 因的活性測定採用上述「2.細胞轉染及報告基因測定」中的方法進行。11.尾靜脈注射被動腫瘤轉移動物模型將處於對數生長期的B16F10細胞消化製備成單細胞懸液，血球計數板計數，計算 細胞總量，800g離心lOmin，去掉上清培養液，利用PBS輕輕重懸離心洗滌一次，然後用PBS 將細胞重懸，使細胞密度為2. 5X106/ml，放置於冰上備用。將處理好的細胞從尾靜脈注射 C57BL6小鼠(6-8wk)，0. 2ml/鼠(即5 X 105細胞/鼠)。給藥處理在注射細胞後的第三 天經腹腔注射給藥相應的劑量，於注射細胞後第15天，麻醉處死小鼠，解剖觀察肺部腫瘤 轉移情況，摘除肺臟，拍照後，計數轉移到肺和淋巴結的腫瘤結節數。實施例2:1.人基因組DNA提取將處於對數生長期的人胰腺癌細胞SW1990消化、分裝35mm培養皿，置37°C，5% C02條件下的細胞培養箱培養過夜，待細胞密度生長至約80-90%，PBS洗滌2次，用細胞刮 收取細胞，離心收集細胞沉澱，按照基因組提取試劑盒說明書要求提取基因組，提取的基因 組用超純水溶解後，-20°C保存備用。2.擴增FAK啟動子序列，構建報告基因載體在實施例1中小鼠FAK啟動子的理論及實驗分析的基礎上，利用TRANSFAC數據 庫和生物信息學方法分析和預測人FAK基因啟動子及其轉錄因子結合位點，設計擴增人 FAK啟動子的引物，構建兩個載體，序列分別對應啟動子區為+47至-1104(pGL-FAKl)、+47 至-516(pGL-FAK2)；構建載體pGL-FAKl所用引物序列為(上下遊引物分別引入Kpn I、Bgl II內切酶 位點)Primer 1 :5，-CTAGGTACCcatttccgaccacaaggttg_3，，對應於人 FAK 啟動子區-1104 至-1085 區域；primer R :5，-cggACATCTcgcttcctcccacgcctcac-3，，對應於人 FAK 啟動子 區+27至+47區域；pGL-FAK2所用引物序列為(上下遊引物分別引入Kpn I、Bgl II內切 酶位點):Primer 2 :5，-CTAGGTACCcagcgggcgtccaactc-3，，對應於人 FAK 啟動子區-516 至-497 區域；Primer R :5，-cggACATCTcgcttcctcccacgcctcac_3，，對應於人 FAK 啟動子區 +27至+47區域。PCR 體系(50 ill 體系):2XGC buffer I,25u 1 ；LA Taq,0. 5u 1(2. 5U) ； 4dNTP mixture，8 ill ；上遊引物，1 yl ；下遊引物，1 P 1 ；模板，；DDW補足體積至50 yl。反應程序:94°C,lmin ；94°C，30sec ；60°C，30sec ；30cycles，72°C，2min。PCR反應結束後，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外下觀察條帶， 切下目的條帶，凝膠回收試劑盒回收目的條帶，酶切與同樣經酶切回收的載體pGL3-BasiC連接，常規轉化大腸桿菌ToplO，挑取單克隆，PCR鑑定，並進行序列測定。3.細胞培養與轉染人胚腎細胞HEK293(購自ATCC)和人胰腺癌細胞SW1990、Capan_l在含10%新生 牛血清的DMEM(含100U/ml青黴素和100 y g/ml鏈黴素)中，並放置37°C，5% C02的培養 箱中生長。將對數生長期的細胞消化計數利用DMEM培養液稀釋為2X105cell/ml的濃度， 並分裝接種24孔細胞培養板，500 u 1/孔，培養箱中培養過夜，待細胞密度生長至70%左 右，將所需質粒利用本實驗室製備的轉染試劑轉染細胞，具體方法同第一章，待轉染12h後 可以根據要求用藥物進行幹預。4.關鍵轉錄因子對人FAK啟動子驅動的報告基因的調控作用分析在實施例1中小鼠FAK啟動子及其關鍵轉錄因子轉錄分析的基礎上，利用 TRANSFAC資料庫和生物信息學方法分析和預測人FAK啟動子區轉錄因子結合位點，重點考 察考察驗證USF1、PEA3、NF-kB以及ER a四個轉錄因子對人FAK基因啟動子驅動的報告 基因的調控作用，採用人胚腎細胞HEK293為細胞模型，將轉錄因子(或幹擾質粒、抑制子 等)與報告基因質粒共轉染細胞，質粒成分按照(報告基因質粒0. 6 y g ；轉錄因子質粒 0.2ug ；內參質粒PRL-SV40 0. 2ug)/孔的量轉染，24h後收集細胞，測定報告基因。5.報告基因測定報告基因測定均採用雙螢光素酶報告基因體系，待測報告基因載體上的報告基因 為火蝴蝶螢光素酶(Butterfly luciferase)，與待測報告基因載體共轉的作為內參的載體 PRL-SV40的報告基因為海腎螢光素酶(Renilla luciferase) 0在計算待測報告基因數值 時，利用內參載體的海腎螢光素酶的值作為內標，排除不相關因素的幹擾，最後得到的是相 對的報告基因值(RLU)。6.藥物篩選操作過程同2.細胞轉染及報告基因測定。利用本實驗室研究製備的M-PEI作為 轉染試劑進行細胞轉染，轉染反應後，37°C，C02培養箱培養4h後每孔補加500 yl完全培 養液，繼續培養24h，然後根據要求用各種藥物進行幹預處理，繼續培養18h後，收取細胞， 根據雙螢光素酶測定試劑盒的說明書要求裂解細胞，測定報告基因的值。7. Western blot 將生長狀態良好的Capan-1和SW1990細胞消化，分裝24孔細胞培養板，培養過夜 後，加藥處理18h，每組設三個復孔，收集細胞，預冷的PBS洗滌一次，細胞裂解液重懸，冰上 裂解30min，4°C，12000 Xg離心lOmin，收集上清，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，製備電泳樣 品。配製10%SDS-PAGE gel，通過測定的樣品蛋白含量計算，使各組樣品上樣量保持一致， 上樣量為80 u g。濃縮膠採用80伏恆壓進行壓縮，分離膠採用120伏電壓分離，然後使用半 幹法將SDS-PAGE膠中蛋白轉印至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上，10伏恆壓電轉 2_3h。轉印結束後可用麗春紅S(0. 5% ponceaus S in 1% acetic acid)對膜進行染色， 可以看到紅色的蛋白條帶，也可以根據預染分子量Marker確定轉印效率。然後將轉印後的 膜放在新鮮配製的5%脫脂奶粉(PBST配製)中進行封閉，4°C封閉過夜或者室溫作用lh。 封閉結束後，根據抗體說明用含5%脫脂奶粉的PBST溶液稀釋一抗(primary antibody)至 最佳工作濃度，將膜包被於一抗中室溫孵育lh或置於4°C作用過夜。然後將膜用PBST置於 搖床上輕輕搖蕩洗滌5次，每次5-lOmin。洗滌完成後包被二抗，將HRP (辣根過氧化物酶)標記的二抗用含5%脫脂奶粉的PBST溶液按1 2000稀釋，與膜共同孵育lh，同樣以PBST 洗滌5次，每次5-lOmin。最後，按照產品說明配製發光底物溶液(ECL化學發光底物)滴加 於PVDF膜上，室溫放置l-2min，用濾紙將多餘發光液吸乾，將膜用保鮮膜包被後放入壓片 夾移入暗房，取X光片置於膜上曝光l-5min後，衝洗膠片，根據曝光條帶判斷蛋白的表達結果。通過對10多種哺乳動物的FAK基因啟動子的生物信息學分析發現，哺乳動物的 FAK基因啟動子的轉錄因子結合位點高度保守。在此基礎上，本發明首先以小鼠FAK啟動子 為模型進行了分析。利用TRANSFAC資料庫和生物信息學方法分析和預測小鼠FAK基因啟動 子及其轉錄因子結合位點，發現小鼠FAK基因啟動子位於-1455/+256約1700多bp的區域 內，然後逐漸從5，和3，兩端向內缺失，5，從-1455分別缺失到-842、-554、-255、-170、-55、 +28，3』則從+256逐漸缺失到+43，然後將以上啟動子區域分別克隆在報告基因表達載體中 (圖1A)，通過檢測報告基因的活性(即表達水平)來獲知啟動子的轉錄活性的強度。圖1 給出了部分實驗結果。結果表明FAK啟動子最大活性必須區域在-170/+43區域(圖1B)。 經TRANSFAC資料庫生物信息學分析，FAK啟動子核心區域含有USF、NF- k B、ETS等與腫瘤 相關的轉錄因子結合位點(圖1C)。本發明曾分別嘗試了多種常用的報告基因系統，包括氯黴素乙醯轉移酶基因、 半乳糖苷酶基因、二氫葉酸還原酶基因、螢光酶基因、螢光蛋白基因等。在下面的結果
中，給出了採用雙螢光素酶報告基因體系測定的數據。在該系統中，待測報告基因載體上的 報告基因為火蝴蝶螢光素酶(Butterfly luciferase)，與待測報告基因載體共同轉染、作 為內參的載體PRL-SV40的報告基因為海腎螢光素酶(Renilla luciferase)。在計算待測 報告基因數值時，利用內參載體的海腎螢光素酶的值作為內標，有效排除不相關因素的幹 擾(諸如轉染效率引發的數據幹擾、藥物對細胞的毒性而導致細胞死亡造成的數據幹擾等 其他系統難以排除的幹擾)，最後得到的是相對的報告基因值(RLU)，獲得的數據較為準確 和真實，明顯優於其它報告基因系統。在上述小鼠FAK啟動子研究的基礎上，本發明利用生物信息學方法對FAK啟動子 腫瘤轉移相關的關鍵轉錄因子結合位點進行分析，然後將其中關鍵轉錄因子結合位點分 別進行突變(圖2A)，尤其是USF結合位點、-116位NF-k B結合位點、-116/-104位兩個 NF-k B結合位點、-116/-104/-46位三個NF-K B結合位點、-90位c-ETS-1結合位點、-80位 GATA-1結合位點等，驗證各轉錄因子在FAK啟動子功能中的作用。為了反應在腫瘤細胞中 關鍵轉錄因子對FAK啟動子活性的影響，本發明特地使用了具有高轉移能力的黑色素瘤細 胞B16F10作為篩選細胞模型，結果發現(圖2B):與腫瘤轉移相關的轉錄因子USF、NF-kB 以及c-ETS-1在高轉移腫瘤細胞中對FAK基因表達具有較強的調控作用。發明人還用EMSA 實驗證明了在腫瘤細胞中，以上轉錄因子確實結合在FAK啟動子的相應結合位點上。在明確了 FAK基因啟動子及其與腫瘤轉移相關的關鍵轉錄因子及結合位點後，本 發明利用上述在腫瘤細胞中表達的由FAK啟動子或其核心序列或其關鍵轉錄因子結合位 點片段驅動的報告基因構成的篩選方法進行FAK基因轉錄調控為靶點的藥物篩選。為了證 明該篩選方法的可信度，本發明中特地挑選了三個公認的臨床抗腫瘤藥物作為對照，它們 分別是全世界臨床一線抗腫瘤藥物紫杉醇(圖3B)、來源於中醫、中國首先在臨床上發明使 用的抗腫瘤藥物三氧化二砷(圖3A)、以及來源於中共黨民間草藥的抗腫瘤藥物冬凌草甲素(圖3D)。從圖3中可見儘管上述三種藥物都是在臨床上療效顯著的抗腫瘤藥物，但是 它們都不具有調控FAK轉錄的功能，這與它們在臨床上並沒有報導具有抗腫瘤轉移功能是 一致的。所以抗腫瘤活性(目前主要指抗腫瘤生長或者誘導腫瘤細胞死亡)並不等於抗腫 瘤轉移活性，這一點在圖3結果中非常明顯。本發明利用上述在腫瘤細胞中表達的由FAK啟動子或其核心序列或其關鍵轉錄 因子結合位點片段驅動的報告基因構成的篩選方法對天然產物進行了 FAK基因轉錄調控 為靶點的藥物篩選。本發明中篩選的天然產物主要由兩個來源一種是中藥雷公藤來源的 天然產物、另一種是中藥虎杖來源的天然產物。其中選用雷公藤來源的天然產物的一個原 因在於上述不具有抗腫瘤轉移活性的抗腫瘤藥物紫杉醇和冬凌草甲素都是二萜類化合 物，其中紫杉醇是四環二萜類化合物，而雷公藤中富含二萜類化合物。本發明試圖通過篩選 雷公藤來源的天然產物看看是否有可能在二萜類化合物中發現以FAK轉錄調控為靶點的 藥物。經過大量的篩選工作，本發明最後從雷公藤來源的天然產物中發現兩個二萜化合物 具有較好的調控FAK啟動子轉錄活性的功能。發明人對其中活性最強的一個進行了較深入 研究(圖3C)，譜學分析等表明該化合物為二萜內酯結構化合物，分子量約為360左右，本發 明中稱為二萜內酯化合物1。另一個雷公藤來源的FAK轉錄抑制劑二萜化合物2正在結構 分析中。發明人通過大量的篩選工作，又從中藥虎杖來源的天然產物中發現了一個含芪類 結構非黃酮類多酚化合物(含芪類結構非黃酮類多酚化合物1)能夠顯著抑制FAK啟動子 轉錄活性(圖3E)，其分子量約為230左右。在上述實驗中，為了避免藥物劑量過大導致細 胞死亡使得報告基因的表達無法準確檢測，發明人首先對各種待試藥物進行預實驗，使得 所用的藥物劑量不會導致被檢測的含報告基因的細胞出現較多死亡，這樣進一步保證了所 得數據的真實可靠。在篩選過程中，發明人也獲得個別能夠增強FAK啟動子活性的化合物。一般認為如果化合物能夠抑制FAK的基因轉錄，就一定能夠降低FAK蛋白質的表 達、影響FAK的生物功能，從而抑制細胞的轉移。這是目前FAK研究中基本成為公認的事實， 本發明專利第二部分技術背景中列舉的大量文獻都證實了這一點。但是為了謹慎起見，發 明人對於篩選到的調控FAK啟動子轉錄活性的化合物按照「FAK基因一FAK蛋白一細胞一 動物模型」的標準研究途徑進行了細緻研究，目的既是為了驗證篩選到的化合物的確切功 能和活性，同時也是對上述傳統觀點的進一步驗證。圖4結果表明，具有FAK轉錄抑制活性的二萜內酯化合物1確實能夠顯著抑制腫 瘤細胞內內源性FAK基因的轉錄(圖4A)和FAK蛋白表達(圖4B)，而且當荷瘤小鼠經體 內經二萜內酯化合物1給藥治療後也可以抑制腫瘤組織FAK基因的表達(圖4D)。與此類 似，具有FAK轉錄抑制活性的含芪類結構非黃酮類多酚化合物1也能夠顯著抑制腫瘤細胞 內內源性FAK基因的表達(圖4E)。與此相對照，不抑制FAK啟動子活性的藥物冬凌草甲素 則不能抑制腫瘤細胞內內源性FAK蛋白表達水平。以上數據充分證明篩選獲得的具有FAK 轉錄抑制活性的化合物對於報告基因的幹預效果與對內源性FAK基因表達影響的結果是 一致的，因此，構建的表達FAK啟動子及其核心序列或者關鍵轉錄因子結合位點片段驅動 的報告基因的細胞可以作為篩選抑制FAK基因表達藥物的技術和方法。發明人進一步用實驗證明，具有FAK轉錄抑制活性的二萜內酯化合物1能夠進而 抑制腫瘤細胞的遷移(圖5A)以及腫瘤在動物體內的轉移(圖5B)。圖3和圖4的結果顯示利用幹預啟動子報告基因的方法篩選得到的二萜內酯化
18合物1由於能夠抑制內源性FAK基因的轉錄(圖3)和蛋白表達(圖4)，從而能夠通過抑 制FAK基因的表達來抑制腫瘤細胞在體外的遷移、並且能夠呈劑量依賴性地顯著抑制腫瘤 在動物體內的轉移，而且其使用劑量在細胞水平只需幾十nM，在動物模型上只需幾十微克 /公斤體重。因此二萜內酯化合物1具有很好地作為抗腫瘤轉移的應用前景。本發明篩選 獲得的另一個具有FAK轉錄抑制活性的含芪類結構非黃酮類多酚化合物1在實驗中也表現 出相似的活性和功能。這從一個側面反映出本專利法發明的一種以黏著斑激酶轉錄調控為 靶點的藥物篩選方法的高效性、可靠性和可行性。同時以上結果也再次證實了如果化合物 能夠抑制FAK的基因轉錄，就一定能夠降低FAK蛋白質的表達、影響FAK的生物功能，從而 抑制細胞的轉移的觀點。由於上述篩選方法主要是基於小鼠FAK啟動子，發明人通過對10多種哺乳動物 的FAK基因啟動子的生物信息學分析發現，哺乳動物的FAK基因啟動子的轉錄因子結合位 點高度保守。為此，發明人分別選用了大鼠、兔、人等不同進化階段的哺乳動物的FAK基因 啟動子進行了類似的研究，獲得了相似的結果。發明人呈現了人FAK啟動子的實驗結果，證 明小鼠FAK啟動子從關鍵轉錄因子到功能高度保守。圖6A顯示人FAK基因啟動子區具有 和小鼠FAK基因啟動子區類似的轉錄因子結合位點。人FAK基因啟動子核心區分析表明 人FAK啟動子核心序列位於-516/+47之間，而小鼠FAK啟動子區位於_554/+43之間。經 TRANSFAC資料庫分析，人FAK啟動子核心區域同樣含有USF、NF_ k B、ETS (又稱PEA3)等與 腫瘤相關的轉錄因子結合位點(圖6A)。而且發明人將上述轉錄因子表達質粒和人FAK啟 動子報告基因質粒共同轉讓細胞後，報告基因活性顯著增強；將上述轉錄因子抑制型圖變 體基因表達質粒和人FAK啟動子報告基因質粒共同轉讓細胞後，報告基因活性顯著下降。 這充分說明上述轉錄因子在人FAK基因啟動子與小鼠FAK基因啟動子一樣，都扮演重要的 轉錄調控作用。如果將像二萜內酯化合物1對小鼠FAK啟動子及其內源性FAK蛋白質表達 有抑制作用一樣，二萜內酯化合物1對人胰腺癌細胞系Capan-IFAK蛋白表達具有顯著的抑 製作用(7A) ；二萜內酯化合物1對不同的人胰腺癌細胞系SW1990中FAK蛋白的表達也有 顯著的抑制作用，而且也呈現出劑量依賴關係(7B)。用報告基因分析二萜內酯化合物1對 人FAK啟動子活性的影響，結果同樣顯示二萜內酯化合物1呈劑量依賴性地抑制人FAK啟 動子的轉錄。像紫杉醇對小鼠FAK啟動子沒有作用一樣，抗癌藥物紫杉醇對人FAK啟動子 活性沒有影響。利用小鼠FAK啟動子篩選獲得的另一種具有抑制FAK啟動子活性的含芪類 結構非黃酮類多酚化合物1對人FAK啟動子活性也表現出顯著的、劑量依賴性的抑制活性。 以上結果充分表明小鼠FAK的篩選結果對人FAK具有相同的作用，FAK基因表達調控的方 式在從小鼠到人的哺乳動物是保守的。綜上所述，本發明提供了一種以黏著斑激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法，利 用該方法能夠高效、可靠、可信地篩選獲得具有調控FAK轉錄活性的化合物，尤其重要的是 能夠用來篩選抑制腫瘤轉移的化合物，從而製備抑制腫瘤轉移的藥物。這是本發明與現有 技術的最明顯的區別。
一種以黏著斑激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法及應用.ST25
SEQUENCE LISTING
南京大學
常州靶標生物醫藥研究所有限公司 一種以黏著斑激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法及應用
200910034654. 5
200910034654. 5
2009-09-07
1
PatentIn version 3.3
1
502
DNA
人種(Homo sapiens) 1
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一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法，其特徵是由含有FAK啟動子及其核心片段驅動的報告基因的表達載體在腫瘤細胞中表達報告基因，利用該細胞模型檢測報告基因表達水平。
2.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法的含有FAK 啟動子及其核心片段驅動的報告基因的表達載體，其特徵是含有來源於哺乳動物的FAK啟 動子及其核心片段，FAK啟動子是指包含FAK啟動子的DNA片段，FAK啟動子核心片段是指 包含FAK啟動子中FAK關鍵轉錄因子結合位點的片段。
3.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法的含有FAK 啟動子及其核心片段驅動的報告基因的表達載體，其特徵是能夠產生被FAK啟動子及其核 心片段驅動的、能被檢測的報告基因編碼的蛋白質。
4.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法的含有FAK 啟動子及其核心片段驅動的報告基因的表達載體構建，其特徵是在生物信息學分析的基礎 上利用分子生物學方法克隆哺乳類動物的FAK啟動子及其核心片段，將其克隆在報告基因 的上遊，構建上述FAK啟動子及其核心片段驅動的報告基因載體，該表達載體能夠在腫瘤 細胞中高水平表達報告基因。
5.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法，其特徵是 通過該方法檢測藥物處理後FAK啟動子及其核心片段驅動下的報告基因表達水平，評價藥 物對FAK啟動子的調控和對FAK介導的細胞功能的影響。
6.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法在篩選調控 FAK啟動子活性的藥物中的應用。
7.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法在篩選能夠 製備治療腫瘤轉移藥物中的應用。
8.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法篩選獲得的 具有抑制FAK啟動子活性的二萜內酯化合物1在製備調控FAK活性藥物中的應用。
9.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法篩選獲得的 具有抑制FAK啟動子活性的二萜內酯化合物1在製備治療腫瘤轉移藥物中的應用。
10.根據權利要求1所述的一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法篩選獲得 的具有抑制FAK啟動子活性的含芪類結構非黃酮類多酚化合物1在製備調控FAK活性藥物 和製備治療腫瘤轉移藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，具體涉及一種以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物篩選方法，該篩選方法主要由含有FAK啟動子及其核心片段驅動的報告基因的表達載體在腫瘤細胞中表達報告基因，利用該細胞模型檢測報告基因表達水平，評價藥物對FAK啟動子的調控和對FAK介導的細胞功能的影響。利用本發明能夠篩選以FAK激酶轉錄調控為靶點的藥物，篩選獲得的化合物具有用於製備抗腫瘤轉移藥物的應用前景。
文檔編號C12Q1/02GK101845481SQ20091003465
公開日2010年9月29日 申請日期2009年9月7日 優先權日2009年9月7日
發明者華子春, 唐波, 李淑鋒, 黃啟來 申請人:南京大學;常州靶標生物醫藥研究所有限公司